JPH0398571A - 細胞培養器および細胞培養方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は多孔質炭素膜を有する細胞培養器及び該多孔質
膜を用いた細胞培養方法に関する。

〔従来技術と詐仔寄〕

近年、微生物、植物及び動物の細胞を培養した有用産物
の生産が医薬、農薬、診断薬、食品等の工業で盛んに行
なわれている。壕た、これら細胞を担体上または担体内
に固定して、生物変換器や人工臓器として利用する方法
も種凌報告されている。

膜を用いた細胞培養方法としては、Ｋ１ｆＡＺ］！：Ｋ
等により中空糸膜を利用した動物細胞の培養が報告（　
８ｃｉｅｎｃｅ　，　ｖｏｗ　１７８　ｐ　６５　，　
１９７２　）されて以来数多くの報告がある。

膜を用いた細胞培養方法は、膜によう区分けされたいず
れか一方の領域に細胞を存在せしめ、膜壁の膜厚方向に
開いた微少な孔を通して細胞の生存、増殖、分化等Ｋ必
要な各種栄養物質、酸素などを供給し、１た、細胞の代
謝により生或した老廃物や代謝生産物の除去および回収
を拡散筐たは中空糸内外に与えた圧力差によう生じる液
体の流れに同伴して、極めて容易にコントローμ出来る
優れた方法である。

この結果、細胞の高密度培養が可能となう、細胞濃度、
生産物濃度、生産物の生産性を飛躍的に高めることが出
来る。

従来の中空糸法細胞培養では、セルロースアセテート膜
（特公昭５４−６６３４号）、ポリスｐホン膜（特開昭
６２−１５０６７８号）、ポリオレフイン膜（特開昭６
３−１７６８５号）などを用いた細胞培養が報告されて
いる。これらの多孔質膜は、耐蒸気殺菌性や細胞の接着
性、増殖性にかいて充分でないため、本発明者等はポリ
エチレン又はポリプロピレンの改良された中空糸を用い
た細胞培養方法（特願昭６３−１６７１１５号）を提案
した。

多孔質膜を用いた細胞培養に》いては、培養細胞は多孔
質膜上に付着、増殖し、相互に連結した組織体様構造を
示すことが知られている。

特に中空糸に付着して多層状にたり組織体様に増殖した
細胞は通常使用されているトリデシン処理の様な方法で
は、中空糸から細胞を剥離し、個々の単一細胞に分離す
ることは容易でなく、小型細胞培養器から大型細胞培養
器へのスケールアップが一般に難しい。

これらの欠点を改良する方法の一つとして、スケーμア
ップでの植継ぎ回数を少なくするため細胞培養器への細
胞接種濃度を少なくして、一期に大型細胞培養器で培養
する方法が考えられている。

〔発明が解決しようとする課題〕

しかし、培養器への細胞接種量が少ない場合には、細胞
増殖の誘導期が極端に長くなるか、細胞の生育が全く認
められないことが多く、実質的に細胞培養を行うことは
困難であった。

かかる状況に鑑み、本発明は細胞接種量の少ない状態に
釦いても、細胞増殖の阻害が少なく、細胞の増殖性の高
い多孔質炭素膜を有する細胞培養器および細胞培養方法
を提供するものである。

〔課題を解決するための手段〕

本発明に使用する多孔質炭素膜は実質的に炭素元素より
構或される多孔質膜であれば本発明の効果を示すことが
出来るがその炭素含有率は例えば７５重量バーセント以
上であることが望ましい。

その細孔径ぱ、培養液の十分な流れが得られ、細胞が漏
れ々い程度の孔径であれば良く、孔の形状も特に限定さ
れないが、各細孔の孔径の平均値はおよそ［ｌＬ０１〜
５μｍ程度、好壕しくは１１１〜２μｍ程度のものが用
いられる。

１た、細孔容積率及び膜厚も同様に、培養液の十分な流
れが得られ、実用上充分な強度が保てる範囲で良く、細
孔容積率が１０〜８０優程度、膜厚が２〜２５０μｍ程
度のものが適している。

本発明に釦ける炭素膜とは、中空糸状、平膜状、管状膜
等の任意の形態のものを用いることが出来るが、中空糸
状膜は接触面積が大きく、中空糸膜面に存在する連通し
た微細孔構造部を通して、実質的に充分に、均一に栄養
物や酸素などを供給したう、細胞生産物、老廃物等を容
易に除去出来、かつ、日詰壕りによる性能低下が少々い
という点から好ましい。その製造法の例としては、特願
平１−６０６４８号をあげることが出来る。

多孔質炭素膜を使用した細胞培餐器を使用した場合にか
ける細胞増殖が優れている理由については定かではない
が、多孔質炭素膜が培養液中に存在するか、筐たは、培
養初期に細胞代謝により生産される生育阻害物質を吸着
除去することにより細胞の増殖が円滑に行われるものと
予想される。

１た、本発明で用いられる細胞培養器は、通常は容器本
体と多孔質炭素膜を有し、該多孔質炭素膜により、区分
けされた一方の空間に少なくとも１つの細胞接種のため
の細胞添加口を、又他方の空間に、１ク壕たは複数個の
被培養細胞の栄養物、酸素の供給口を有し、前記のいず
れか一方の空間と連通ずる部分に被培養細胞の生産物１
たは老廃物の除去口を有するものであり、代表例として
第１図に示すものを例示できるが、その形状は特に限定
されない。

第１図は多孔質炭素中空糸膜２の両端をポツテイング材
で固定したものであう、中空糸の中空部につながる空間
に連通した端部導管３，３′は栄養物や酸素の供給、老
廃物の除去用に用いることができる。

又、側部導管４，４′は培養開始時の細胞の導入口であ
う、培養が長時間行われて細胞濃度が高まった時はここ
から老廃物や死亡した細胞を含有する培養液を抜くこと
ができる。

本発明の方法で用い得る細胞装置の一例を第２図に示す
。

第２図は第１図の細胞培養容器を用いて構或した細胞培
養装置の例であり、ここでは細胞を注入した後に側部導
管４，４′をエンドキャップで封鎖している例を示して
＞ｐ、細胞培養の初期や高濃度培賽を行わないときはこ
の方式でよい。高濃度培養の場合は端部導管の一方３′
を封鎖して残シの端部導管５から入った培養液を側部導
管４，４′から抜くようにしてこれを培養液貯槽７に戻
すようにしてもよい。生きている細胞は膜に付着してい
てはがれることはないが、死亡した細胞ははがれかちて
くるので、これを炉過してＦ液を培養液貯槽７に戻すの
が好ましい。

本発明で用いる培養にかいては、無機塩類、アミノ酸類
、糖類、脂肪酸類、ビタミン類、補酵素類、核酸塩機類
、ホμモン類、アμブミン、トフンスフエリン、その他
の種々の細胞の生長因子、血清中の或分等の水溶液を培
養液として用い、目的とする細胞を培養する。

本発明によって培養される細胞としては、付着性細胞が
好１しいが、例えばアフリカミドリザμ腎細胞（　Ｖｅ
ｒＯ　　細胞）、上皮細胞（９４０Ｃ３）、マウス繊維
芽細胞（３Ｔ３）、チャイニーズハムスター卵細胞（　
ＯａＯ　）、チャイニーズハムヌター肺繊維芽細胞（Ｖ
−　７　９　）、子宮頚部癌細胞（　Ｈｅｌａ　）、　
ヒト２倍体細胞（Ｗエー３８）などがあげられる。

また、浮遊性細胞としては、例えばリンパ球細胞、骨髄
腫細胞、白血球細胞など、および、これらと他の細胞と
の細胞融合によって得られる雑種細胞（ハイブリドーマ
）などが挙げられる力ヨ、これらの細胞にレいても付着
培養可能な細胞株が好１しい。

本発明の培豊方法をさらに具体的に説明すると、細胞添
加口と培養液の出入口の少なくとも一つを膜を隔てて有
する容器を用い、その一方の空間に細胞を添加し、該細
胞の生育に必要な栄養物や酸素を供給しあるいは該細胞
の代謝により生或した生産物、老廃物の除去を膜壁を通
して行なうことによシ、細胞を培養することができる。

中空糸膜を用いた場合には、中空糸膜の外側に細胞を置
き、中空糸膜の内側（中空部）に培養液を流通あるいは
循環させるか、あるいは培養液を膜の内側から外側へ、
又はその逆に流通あるいは循環させることによって培養
すること８６　＠本方法を実施することによう、容易に
栄養物や酸素を供給し、あるいは該培養細胞の生産物釦
よび老廃物を除去することが出来る。

（夾施例） 以下、実施例を用いて本発明を説明するが、本発明はこ
れらの実施例で限定されるものではない。

なか、多孔質炭素中空糸膜の細孔分布構造はＯＡＲＬＯ
　Ｉ！ｆＲＢＡ　社製ボレシメーター２００を用いて測
定し、細孔径は円筒換算径として求めた。

細孔容積率は、多孔質膜中の細孔部の容積分率で示した
。

実施例１ アクリロニトリＩｖ（以下ＡＮと略記する）９８モ／Ｌ
／４、メタクリル酸（以下ＭＡ▲と略記する）２モｆｉ
／４から構戒される比粘度ａ．２４のＡ　Ｎ　／　Ｍ　
Ａ　Ａ共重合体（１）６０部とメチμメタクリレート（
以下ＭＭＡと略記する）９９七μ嘔、アクリμ酸メチ／
Ｉ／（以下ＭＡと略記する）１モ／Ｌ／４カら構或され
る比粘度（Ｌ２１のＭ　Ｍ　Ａ　／　Ｍ　Ａ共重合体で
ある熱分解性共重合体色）４０部との混合溶液を調製し
た。

なか、溶剤はジメ千〃ホμムアミド（以下！）ＭＩＦと
略記する）を用い、重合体濃度２６重量嘔とし、混合溶
液は温度６０℃に保持し脱泡した。

外形２．０■φ、内径１．５−φの鞘部とｔＯ■φの心
部よ９なる、鞘心型ノズルの鞘部よシ調整した混合溶液
を心部よう空気を１０■の水注圧でそれぞれ吐出し、空
気中を５一走行させた後、ＤＭＩＦ７０重量懺水溶液、
２℃の温度の凝固浴に導き紡糸し、凝固させ、次いで６
０℃の温水中で洗浄と２．８倍の延伸を施した。次いで
、９８℃の熱水中で２倍延伸した。この全延伸倍率５．
６倍の繊維を１６０℃の熱ローμを通して乾燥して、重
合体ブレンド系中空糸を製造した。

この中空糸を、長さ５０ｗのステンレススチーμ製の枠
にセットして定長で２３０℃の温度、空気雰囲気中で３
時間処理し耐炎化した。次いで窒素ガス雰囲気中で常温
から８００℃渣で５０分、ａＯＯ℃で２０分炭素化処理
して孔化して、本発明の炭素繊維系多孔質中空糸膜を製
造した。

この中空糸膜は内径が３８０μｍ，膜厚が５　０　ｐｍ
であう、また、水銀圧入法で測定した微細孔の平均細孔
径は１．２μｍ１細孔容積率は４３４であった。

該多孔質中空炭素繊維１００本を集束してポリカーボネ
ート製円筒容器（ａ４Ｘ１５０箇）に充填し、中空糸端
部の開口状態を保持するように、ウレタン樹脂で両端を
固定して、第１図に示すような細胞培養器１を作戒した
。

本細胞培養器を１２０℃、３０分の蒸気滅菌後、７０４
エタノー〃にて湿潤化し、滅菌蒸留水で十分に洗浄した
後、別に蒸気滅菌したシリコンチューブ５によう培養液
貯槽７と連結し、第２図に示すような細胞培養装置を作
製した。

この細胞培養器の中空糸外側空間部に付着性細胞である
チャイニーズハムスター肺繊維芽細胞由来のｖ−７９を
添加して培養した。細胞接種量は６Ｘ１０”個、培養液
は１０４ウＶ胎児血清添加ＭＢＭ培地１ｔを培養液貯槽
７に入れ、培養液貯槽には１０嘔００，添加空気をフイ
ルタ一８を介して少量ずつ導入してププリングさせた。

培養は、ｖ−７９細胞を側部導管４より注入し、培養器
を振盪して細胞を均一に分散させ、３時間放置した後、
装置全体を３７℃の恒温槽中に設置し、ボンプ６によう
培養液を０．５ｗｊ／ｈｒ　で循環させながら卦こなっ
た。なＤ１培養液は５日毎に新しい培養液と交換した。

培養開始後１４日後にダμベツコのＰＢＳＨで洗浄後培
養容器を壊し、中空炭素繊維を取り出した。

中空炭素繊維に付着している細胞をα１Ｎ苛性ソーダ溶
液で溶解し、抽出されたＤＮＡｆｉをＢｕｒｔｏｎ　　
法により測定し、予め作或して卦いた検量線より、細胞
数を算出した結果、細胞数は１．２Ｘ１０’個であった
。

比較例１ ポリエチレン多孔質中空糸（細孔の幅住８５５μｍ，　
　内径２７０μｍ）１００不七果デしてボリカーボネー
ト製円筒容器（８φ×１５０ｍ）に充填し、ウレタン樹
脂をボツテイング剤として両端を固定した細胞培養器を
製作した。

細胞培養器をエチレンオキサイドガス殺菌後、７０係エ
タノーμにて親水化した後、滅菌蒸留水で充分洗浄した
。

本細胞培養器を用いて実施例１と同様にして細胞培養装
置を作製し、上記と同様にしてＶ一７９細胞の培養を行
った結果、細胞数は７×１０４個であった。

〔発明の効果〕

以上述べた様に本発明の細胞培養器訃よび細胞培養方法
は、多孔質炭素膜を用いているため、他の素材からなる
膜に較べ細胞の付着、増殖性が優れているのみならず、
細胞接種量が少ない場合にかいても細胞増殖性が高いた
め細胞培養開始時の細胞接種量を大幅に低減させること
が可能となシ、細胞培養のスケールアップが容易に行え
るという特徴を有する。

【図面の簡単な説明】

第１図は細胞培讐器の１例を示す模式断面図であう、第
２図は細胞＠養器を用いた細胞培養装置の１例を示す図
である。 １：容器本体、２：多孔質炭素中空糸膜、３：端部導管
、４：側部導管、５：シリコンチューブ、６：チューブ
ポンプ、７：培養液貯槽、８：フイμター

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）多孔質炭素膜を有する細胞培養器。 （２）多孔質膜の水銀圧入法で測定される微細孔の平均
   細孔径および細孔容積率がそれぞれ ０．０１〜５μｍ、および１０〜８０％である請求項第
   １項記載の細胞培養器。 （３）多孔質炭素膜が中空炭素繊維膜である請求項第１
   項又は第２項記載の細胞培養器。 （４）容器本体及び該容器本体内に収納された多孔質炭
   素膜を有し、多孔質炭素膜によつて区分けされた一方の
   空間に連通する細胞添加口、他方の空間に連通する栄養
   物、酸素の供給口及び前記いずれか一方の空間に連通す
   る細胞生産物又は老廃物の除去口を有する請求項１〜３
   記載の細胞培養器。 （５）多孔質炭素膜を用いる細胞培養方法。 （６）容器本体及び該容器本体内に収納された多孔質炭
   素膜を有し、多孔質炭素膜によつて区分けされた一方の
   空間に連通する細胞添加口、他方の空間に連通する栄養
   物、酸素の供給口及び前記いずれか一方の空間に連通す
   る細胞生産物又は老廃物の除去口を有する細胞培養器を
   用いて、細胞添加口から一方の空間に被培養細胞を注入
   し、供給口から多孔質炭素膜を介して栄養物と酸素を供
   給し、次いで除去口から被培養細胞の生産物及び又は老
   廃物を除去する細胞培養方法。 （７）多孔質炭素膜の水銀圧入法で測定される微細孔の
   平均細孔径及び細孔容積率がそれぞれ０．０１〜５μｍ
   、１０〜８０％である請求項第５項又は６項記載の細胞
   培養方法。 （８）多孔質炭素膜が中空炭素繊維膜である請求項第５
   〜７項記載の細胞培養方法。