CN107523483A - 检测肿瘤干细胞成球能力和迁移运动能力的装置及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种检测肿瘤干细胞成球能力和迁移运动能力的装置和方法，所述装置包括下室和上室，在所述下室和上室之间设置有过滤室，过滤室的底面形成第二有机材料膜，第二有机材料膜的孔径为20‑50um；所述上室的底面形成第一有机材料膜，第一有机材料膜的孔径为8‑12um。所述方法是将肿瘤干细胞重悬于DMEM培养基后转入上室内，下室中加入干细胞培养基，温箱培养后，滤过室洗涤、染色、显微镜下观察计数。本发明巧妙地将肿瘤细胞成球实验和Transwell侵袭迁移实验融合，同一装置既可验证干细胞的成球能力又可验证干细胞的侵袭迁移能力，提高了实验的成功率和效率。
Description
技术领域
本发明设计细胞学装置，具体是一种检测肿瘤干细胞成球能力和迁移运动能力的装置及方法。
背景技术
肿瘤干细胞对肿瘤的存活、增殖、转移及复发有着重要作用。从本质上讲，肿瘤干细胞通过自我更新和无限增殖维持着肿瘤细胞群的生命力；肿瘤干细胞的运动和迁徙能力又使肿瘤细胞的转移成为可能。因此肿瘤干细胞常常存在于缺氧小生境、血管小生境、侵袭小生境中，可以长时间处于休眠状态并具有多种耐药分子而对杀伤肿瘤细胞的外界理化因素不敏感，导致肿瘤复发、迁移，以致难以治愈。可见肿瘤干细胞是一群既具有自我更新能力又具有较强的侵袭迁移的细胞，而目前的实验均只能单方面证明肿瘤干细胞的自我更新能力或侵袭迁移能力。肿瘤细胞的成球实验（成球大小及数目）和Transwell侵袭迁移实验分别是衡量肿瘤细胞干性及迁移运动能力的金标准，但均具有缺陷性。
在经典的肿瘤干细胞成球实验中，将肿瘤细胞放在干细胞培养基中培养，通常第二天即可观察到细胞球形成（具体成球时间依细胞类型而定）。通过显微镜下观察细胞球直径与个数来判断该细胞在该环境中的自我更新能力。然而形成的细胞球可能并未具有高侵袭迁移能力，并非所谓的具有高运动迁移能力的干细胞，即出现假阳性结果。而在经典的Transwell侵袭迁移实验中，对于多见的贴壁细胞，常用且普遍采用的是将细胞种在Transwell小室，在血清或趋化因子的诱导下细胞穿过小室薄膜并在小室底面贴壁生长，然后进行经典染色操作（结晶紫或DAPI）去计数穿过小室的细胞数量。然而对于干细胞因其悬浮生长的特点，不贴壁，所以在经典的实验操作过程中极易造成细胞球的丢失（随着下室培养基一起倒掉），实验结果也就毫无说服力。尽管大多数文献报道通过对下室培养基中悬浮细胞数目计数来观察细胞的侵袭迁移能力，但其可行性及利用率（细胞数量少误差大，丢失多，不易观察等缺陷）远远低于贴壁细胞Transwell实验；有些学者则运用血清或人脐静脉上皮细胞共培养来趋化干细胞向下室运动，但其均可导致干细胞分化而影响实验结果的准确性。
发明内容
本发明就是为了解决经典的干细胞成球实验和Transwell侵袭迁移实验只能单方面检测肿瘤干细胞成球能力或迁移运动能力的问题，所提出的一种检测肿瘤干细胞成球能力和迁移运动能力的装置及方法。
本发明是按照以下技术方案实现的。
一种检测肿瘤干细胞成球能力和迁移运动能力的装置，包括下室和上室，在所述下室和上室之间设置有过滤室，过滤室的底面形成第二有机材料膜，第二有机材料膜的孔径为20-50um；所述上室的底面形成第一有机材料膜，第一有机材料膜的孔径为8-12um。
进一步的，所述上室为上端开口的圆台型结构，其上缘均布多个弧形缺口且沿上室的外圆周壁均布多个挂件，弧形缺口与挂件交错分布。
进一步的，所述过滤室为上端开口的圆台型结构，其上缘向外形成凸台。
进一步的，所述第二有机材料膜的孔径为20um。
进一步的，所述第一有机材料膜的孔径为8um。
一种检测肿瘤干细胞成球能力和迁移运动能力的方法，包括以下步骤：
a.将成球的肿瘤干细胞消化成单个细胞，并用PBS缓冲液洗涤后重悬于DMEM培养基；
b.将肿瘤干细胞重悬于DMEM培养基后转入检测肿瘤干细胞成球能力和迁移运动能力装置的上室内，下室中加入干细胞培养基；
c.温箱培养48-72小时后弃去培养基，取下滤过室用PBS缓冲液洗涤；
d.用多聚甲醛固定后，结晶紫或DAPI染色，PBS缓冲液洗涤，轻拭过滤室底面水分，干燥后，在倒置显微镜下观察、拍照和计数。
进一步的，所述步骤b中干细胞培养基的成分为DMEM/F12培养基+ 20μg/L 表皮细胞生长因子+20μg/L成纤维细胞生长因子+2%B27细胞培养添加剂。
进一步的，所述步骤d中多聚甲醛的固定时间为10-20min，结晶紫或DAPI的染色时间为5-10min。
进一步的，所述步骤b中上室的底面形成第一有机材料膜，第一有机材料膜的孔径为8-12um。
进一步的，所述步骤c中过滤室的底面形成第二有机材料膜，第二有机材料膜的孔径为20-50um。
本发明获得了如下的有益效果。
经典的干细胞成球实验和Transwell侵袭迁移实验分别单独证明了肿瘤干细胞的成球能力和侵袭迁移能力，容易出现假阳性结果；另一方面，肿瘤干细胞为悬浮细胞，传统的 Transwell侵袭迁移实验只对贴壁细胞有效，对悬浮细胞不具有可行性（无法收集计数），而用血清或其他趋化因子可导致干细胞分化而影响结果的真实性。本发明创造性的将干细胞成球实验与Transwell侵袭迁移实验融合，相互取长补短，根据干细胞成球前与成球后的直径差别，使用滤过膜收集穿过上室并成球的干细胞，下室加入干细胞培养基既可以趋化上室干细胞向下室迁移又可以诱导干细胞成球避免干细胞分化。本发明克服了现有方法无法真实地检测悬浮干细胞的侵袭迁移能力的缺陷，并与成球实验结合，达到同一装置下既能验证干细胞的成球能力又能验证干细胞的侵袭迁移能力的目的。本发明是对肿瘤干细胞成球能力及侵袭迁移能力检测的高效、简便、快速、节约成本的方法，实验结果准确可靠，具有广阔的应用前景。
附图说明
图1是本发明的结构示意图；
图2是本发明100倍倒置显微镜下观察U87细胞结晶紫染色图；
图3是本发明100倍倒置显微镜下观察U251细胞结晶紫染色图；
图4是本发明100倍倒置显微镜下观察对照组与敲低Notch1组U87和U251胶质瘤干细胞结晶紫染色对比图；
图5是本发明对照组与敲低Notch1组U87和U251胶质瘤干细胞穿过上室的干细胞球面积对比图。
其中： 1.下室； 2.上室；
3.过滤室； 4.第一有机材料膜；
5.第二有机材料膜； 6.挂件；
7.弧形缺口； 8.凸台。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
如图1所示，一种检测肿瘤干细胞成球能力和迁移运动能力的装置，包括下室1和上室2，在所述下室1和上室2之间设置有过滤室3，过滤室3的底面形成第二有机材料膜5；所述上室2的底面形成第一有机材料膜4。
所述上室2为上端开口的圆台型结构，其上缘均布多个弧形缺口7且沿上室2的外圆周壁均布多个挂件6，弧形缺口7与挂件6交错分布。
所述过滤室3为上端开口的圆台型结构，其上缘向外形成凸台8。
上室2底面外径为9.62mm，上室2上端开口处的外径为9.88mm，上室底面到滤过室3底面的距离为3.09mm，到下室1底面的距离为6.18mm；滤过室3上端开口处的内径为9.80mm，外径为9.81mm，滤过室3底面内径为9.66mm，外径为9.67mm（与上室2相嵌合）；下室1底面、上端开口处的内径均为9.74mm（与滤过室3相嵌合），内部高度不低于6.18mm（能容纳500ul液体且与滤过室3相嵌合）。
本发明装置的上室2、下室1和过滤室3所用材料与Transwell小室相同。
细胞球直径50-250um，上室2底部的第一有机材料膜4为聚碳酸酯膜，孔径8-12 um（根据肿瘤细胞直径选择不同膜孔径），过滤层3底部的第二有机材料膜5为聚碳酸酯膜，孔径为20-50um(根据成球大小选择不同膜孔径)。
一种检测肿瘤干细胞成球能力和迁移运动能力的方法，包括以下步骤：
a.将成球的肿瘤干细胞消化成单个细胞，并用PBS缓冲液洗涤后重悬在DMEM培养基中备用；
b.将本发明装置放入24孔板中，将数目为105（以具体细胞成球及侵袭迁移能力而定）的肿瘤干细胞重悬于300ul的DMEM培养基中并转入肿瘤干细胞成球及侵袭迁移装置的上室2内，下室1中加入500ul干细胞培养基（DMEM/F12+ 20μg/L EGF+20μg/L bFGF+2%B27）（DMEM/F12培养基+ 20μg/L 表皮细胞生长因子+20μg/L成纤维细胞生长因子+2%B27细胞培养添加剂）；
c.待温箱培养48-72小时后将装置取出，弃去培养基，取下滤过室3，用PBS洗涤3次；
d.用多聚甲醛固定10min后，结晶紫或DAPI染色5min，PBS缓冲液洗涤3次（由上往下洗涤，细胞在上层面），用棉签轻拭滤过室3底面水分，待干燥后，在100倍倒置显微镜下观察并拍照，随机选择5个视野，对细胞进行计数，实验重复3次，计算平均每视野内的细胞球数及细胞球直径。细胞球数与细胞球直径的乘积即细胞球面积可反映肿瘤干细胞侵袭迁移能力及自我更新能力。如图2、3所示，U87细胞和U251细胞均穿过上室2并在过滤室3上聚集成球（细胞球总面积=平均细胞面积*细胞个数，图2中U87细胞球总面积≈2500*23=57500 um2；图3中U251细胞球总面积≈18000*7=126000 um2）。
Notch1是Notch通路的受体，其可以通过接受表达Notch受体的细胞信号而被激活，并介导其下游信号通路如PI3K/AKT/mTOR等，调控肿瘤细胞的生物学行为，Notch1被发现在肿瘤干细胞中高度富集，并可维持肿瘤细胞干性和自我更新能力。
本发明通过对U87、U251细胞系慢病毒转染Notch1 RNA 敲低Notch1，研究Notch1对于胶质瘤细胞的侵袭迁移能力和自我更新能力的影响。图4、5表明（细胞球面积比较采用两独立样本t检验。***：p<0.001，**：p<0.01），通过敲低Notch1可以显著降低胶质瘤细胞的迁移能力及成球能力（U87，P<0.001；U251，P<0.001）。
Claims (10)
1.一种检测肿瘤干细胞成球能力和迁移运动能力的装置，包括下室（1）和上室（2），其特征在于：在所述下室（1）和上室（2）之间设置有过滤室（3），过滤室（3）的底面形成第二有机材料膜（5），第二有机材料膜（5）的孔径为20-50um；所述上室（2）的底面形成第一有机材料膜（4），第一有机材料膜（4）的孔径为8-12um。
2.根据权利要求1所述的一种检测肿瘤干细胞成球能力和迁移运动能力的装置，其特征在于：所述上室（2）为上端开口的圆台型结构，其上缘均布多个弧形缺口（7）且沿上室（2）的外圆周壁均布多个挂件（6）弧形缺口（7）与挂件（6）交错分布。
3.根据权利要求1所述的一种检测肿瘤干细胞成球能力和迁移运动能力的装置，其特征在于：所述过滤室（3）为上端开口的圆台型结构，其上缘向外形成凸台（8）。
4.根据权利要求1所述的一种检测肿瘤干细胞成球能力和迁移运动能力的装置，其特征在于：所述第二有机材料膜（5）的孔径为20um。
5.根据权利要求1所述的一种检测肿瘤干细胞成球能力和迁移运动能力的装置，其特征在于：所述第一有机材料膜（4）的孔径为8um。
6.一种检测肿瘤干细胞成球能力和迁移运动能力的方法，其特征在于：包括以下步骤：
a.将成球的肿瘤干细胞消化成单个细胞，并用PBS缓冲液洗涤后重悬于DMEM培养基；
b.将肿瘤干细胞重悬于DMEM培养基后转入检测肿瘤干细胞成球能力和迁移运动能力装置的上室（2）内，下室（1）中加入干细胞培养基；
c.温箱培养48-72小时后弃去培养基，取下滤过室（3）用PBS缓冲液洗涤；
d.用多聚甲醛固定后，结晶紫或DAPI染色，PBS缓冲液洗涤，轻拭过滤室（3）底面水分，干燥后，在倒置显微镜下观察、拍照和计数。
7.根据权利要求6述的一种检测肿瘤干细胞成球能力和迁移运动能力的方法，其特征在于：所述步骤b中干细胞培养基的成分为DMEM/F12培养基+ 20μg/L 表皮细胞生长因子+20μg/L成纤维细胞生长因子+2%B27细胞培养添加剂。
8.根据权利要求6述的一种检测肿瘤干细胞成球能力和迁移运动能力的方法，其特征在于：所述步骤d中多聚甲醛的固定时间为10-15min，结晶紫或DAPI的染色时间为5-10min。
9.根据权利要求6述的一种检测肿瘤干细胞成球能力和迁移运动能力的方法，其特征在于：所述上室（2）的底面形成第一有机材料膜（4），第一有机材料膜（4）的孔径为8-12um。
10.根据权利要求6述的一种检测肿瘤干细胞成球能力和迁移运动能力的方法，其特征在于：所述过滤室（3）的底面形成第二有机材料膜（5），第二有机材料膜（5）的孔径为20-50um。
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