CN110241085B

CN110241085B - 一种npm1敲除的人膀胱癌t24/ddp细胞株

Info

Publication number: CN110241085B
Application number: CN201811475818.3A
Authority: CN
Inventors: 张曼; 罗陈烁; 赵嫚; 谢清; 雷婷
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2018-03-09
Filing date: 2018-12-04
Publication date: 2022-07-01
Anticipated expiration: 2038-12-04
Also published as: CN110241085A

Abstract

本发明提供一种慢病毒感染人膀胱癌细胞株敲除内源性基因，并成功建立稳转细胞株。具体为NPM1‑shRNA慢病毒感染T24/DDP细胞株沉默NPM1（核仁磷酸蛋白1）表达，成功建立T24/DDP‑NPM1^ko细胞株。本发明通过研究证实T24/DDP‑NPM1^ko细胞株可稳定沉默NPM1表达并传代。与阴性对照相比，沉默NMP1后的T24/DDP‑NPM1^ko细胞株中NPM1蛋白表达水平显著下降，细胞增殖能力显著抑制，细胞迁移力增高，细胞周期停滞于S期。

Description

一种NPM1敲除的人膀胱癌T24/DDP细胞株

技术领域

本发明涉及慢病毒感染人膀胱癌细胞株敲除内源性基因并建立稳转细胞株，具体为NPM1-shRNA慢病毒感染T24/DDP细胞株沉默NPM1（核仁磷酸蛋白1）表达，成功建立细胞株T24/DDP-NPM1^ko。

背景技术

膀胱癌又称膀胱尿路上皮癌，是泌尿系统最常见的恶性肿瘤之一,其中90%为移行细胞癌。2017 年美国预计膀胱癌的新发病例和死亡人数分别约79030例和16870例。膀胱癌进展是一个多因素涉及、多基因参与、多步骤形成以及多途径变化的过程，膀胱癌易耐药性、易复发性是影响其临床疗效最关键的两大特点。术后膀胱癌的复发率可高达70%。

临床上常采用局部灌注化疗药物如阿霉素和顺铂的方法治疗术后膀胱癌以预防其复发。早期监测膀胱癌复发与否，积极进行有效的干预是提高膀胱癌治愈率的有效手段。目前，监测膀胱癌复发的方式主要靠膀胱镜和尿液脱落细胞检查，但反复的膀胱镜检查不仅加重了病人的痛苦和经济负担，而且其并对于微小的原位乳头状肿瘤的检出灵敏度低，易漏诊。尿液脱落细胞检查标本收集便捷，但漏诊率可达50%。膀胱癌中异常高表达的蛋白可以提示膀胱癌预后较差，应用其监测膀胱癌的恶化情况并及时进行根治手术能够使得复发率降低至25%～40%，但这些标志物受到肿瘤浸润程度和伴发症状的影响，对于肿瘤的监测的灵敏度和特异度不足以成为膀胱癌监测的明确指标，因此，寻找有良好的灵敏度和特异度的膀胱癌生物学标志物，具有极大的临床意义。

核仁磷酸蛋白（nucleophosmin, NPM1蛋白）是一种主要定位于核仁，可在核仁与胞浆之间穿梭的核磷蛋白，本实验室前期研究也已经发现，侵袭性膀胱癌细胞复发且对化疗药物的耐药性增强时NPM1在膀胱癌细胞表达上升，提示NPM1可以作为一个重要的膀胱癌细胞的预后指标。为了进一步证实NPM1对其他类型的耐药膀胱癌细胞生物学行为的影响，本研究比较了基因和蛋白水平上膀胱移行细胞癌T24细胞及其顺铂耐药的T24/DDP细胞的NPM1表达，并应用慢病毒介导的RNA干扰技术敲低了高表达细胞系中NPM1基因，观察其对膀胱癌细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭能力的影响，为探讨NPM1在膀胱癌发病机制中的功能作用和作为膀胱癌临床治疗靶点的可能性提供前期实验数据。本发明提供了NPM1-siRNA慢病毒转染人膀胱癌细胞株T24/DDP敲除内源性基因并建立稳转细胞株T24/DDP-NPM1^ko的应用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种慢病毒感染人膀胱癌细胞株敲除内源性基因并成功建立稳转细胞株。其分类命名为耐顺铂T24 NPM1敲除细胞株，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为中国北京中国科学院微生物研究所，保藏时间为2018年12月03日，保藏编号为CGMCC NO:16899。

优选地，所述人膀胱癌细胞株为T24/DDP细胞株。

优选地，所述内源性基因为NPM1。

优选地，构建含有碱基序列SEQ ID NO:1(ggaatgttat gataggacat a)重组表达载体，慢病毒感染宿主细胞T24/DDP建立稳转细胞株。

优选地，所述建立稳转细胞株为T24/DDP-NPM1^ko。

优选地，所述细胞株可稳定沉默NPM1表达并传代。

优选地，所述沉默NMP1后的T24/DDP-NPM1^ko细胞株中NPM1蛋白表达水平显著下降，细胞增殖能力显著抑制，细胞迁移率增高，细胞周期停滞于S期。

发明人首先对人膀胱癌细胞系T24和耐药细胞系T24/DDP分别进行复苏、培养、传代、冻存及耐药性的维持。将NMP1-shRNA慢病毒感染T24/DDP，沉默NMP1表达，建立稳转T24/DDP-NPM1^ko细胞株，应用荧光及免疫印迹检测，稳转细胞株中NPM1表达下降，转染率达到100%，表明T24/DDP-NPM1^ko细胞株建立成功。通过免疫印迹、划痕实验、侵袭实验、流式细胞技术等研究T24/DDP-NPM1^ko的侵袭、迁移及对细胞周期、凋亡的影响。

本发明通过研究证实沉默NMP1后的T24/DDP-NPM1^ko细胞株中NPM1蛋白表达水平均显著下降，细胞增殖能力显著抑制，细胞迁移率增高，细胞周期停滞于S期。

为让本发明的上述和其它目的、特征和优点能更明显易懂，下文特举较佳实施例，并配合附图，作详细说明如下。

附图说明

图1是NMP1基因及蛋白水平在T24和T24/DDP中的差异表达。A为基因表达水平，B为蛋白表达水平，两者均在T24/DDP细胞中表达升高。

图2是NPM1-shRNA慢病毒感染T24/DDP，沉默NPM1表达，转染率达100%，成功建立T24/DDP-NPM1^ko细胞株。

图3是T24/DDP-NPM1^ko与T24/DDP细胞迁移影响的差异。

图4是T24/DDP-NPM1^ko与T24/DDP细胞侵袭影响的差异。

图5是T24/DDP-NPM1^ko与T24/DDP细胞凋亡影响的差异。

图6是T24/DDP-NPM1^ko与T24/DDP细胞周期影响的差异。

具体实施方式

实施例1 细胞的复苏、培养、传代、冻存与耐药性的维持

从液氮灌中取出细胞冻存管，迅速放入37℃水浴箱中晃动，使其尽快溶化，用75％的酒精棉球消毒冻存管的管壁及管口，用移液器将细胞转入到15ml离心管中，同时加入3ml培养基， 800rpm离心5分钟，弃上清，加入1ml含18％胎牛血清的RPMI1640培养基重新混悬细胞，使细胞吹散成单细胞悬液，移入培养瓶中培养，加入4ml培养基，放入37℃、5％CO2孵箱中培养。观察细胞长满培养瓶时予以传代。人膀胱癌细胞株T24用含有15%FBS、0.8ug/mlDDP的RPMI1640 培养液培养于37 ℃、5% CO2 饱和湿度培养箱内；当细胞生长融合成单层时，用0.25%胰蛋白酶消化并传代培养。人膀胱癌细胞株T24/DDP 用含有20%FBS、0.8ug/mlDDP的RPMI1640 培养液培养于37 ℃、5% CO2 饱和湿度培养箱内；当细胞生长融合成单层时，用0.25%胰蛋白酶消化并传代培养。

实施例2 实时荧光定量PCR检测

在细胞的对数生长期，采用Trizol说明书中步骤抽提细胞总RNA，RNA逆转录获得cDNA，采用SYBR Green荧光染料，参照试剂盒说明配制PCR反应体系，每组设置三个复孔。PCR反应：95℃ 2 min，95℃ 15 S，60℃ 30 S，68 ℃1 min，共40个循环。GAPDH作为反应内参，上游引物：5'-CTACAATGAGCTGCGTGTGGC-3'，下游引物：5'-CAGGTCCAGACGCAGGATGGC-3'，NPM1上游引物：5'-TGGTGCAAAGGATGAGTTGC-3'，下游引物：5'-GTCATCATCTTCATCAGCAGC-3'，记录各实验孔的Ct值，目的基因的相对表达量。所有实验重复三次。F=2-ΔΔCt。ΔCt=ΔCt目的基因－ΔCt内参基因；ΔΔCt=ΔCt实验组－ΔCt对照组；2-ΔΔCt表示目的基因相对于对照组的表达倍数。如图1所示，A为NPM1分别在T24和T24/DDP细胞株中基因表达水平，B为蛋白表达水平，两者均在T24/DDP细胞中表达升高。

实施例3NPM1-shRNA慢病毒感染T24/DDP细胞，建立稳转细胞株T24/DDP-NPM1^ko

将处于对数期生长的T24/DDP细胞以1×103个细胞/ml的浓度接种入96孔板中，待融合度达到30%-50%左右时，迅速加入稀释病毒液100μl/孔，培养8-16小时后更换为正常培养基。感染72-96小时后，观察GFP表达情况，必要时可进行传代。将重组细胞株加入含2μg/mL Puromycin，10%胎牛血清的RPMI-1640培养基，2～3天更换一次筛选培养基，筛选培养2个月。经免疫荧光确认稳转成功后，进行单克隆筛选、分离和培养，建立稳转细胞株T24/DDP-NPM1^ko。如图2A所示，与对照及空载组相比，转染NPM1-shRNA的细胞株的荧光强度为满视野，感染率为100%。应用western blot对感染效率进行验证。细胞感染72h后加入RIPA蛋白裂解液提取总蛋白并进行12%的SDS-PAGE电泳，电压12V转膜60 min，5%脱脂奶粉室温封闭2 h，加入1：1000一抗NPM1，β-actin 4℃孵育过夜。PBST漂洗3次，每次20min，加入1：1000二抗，室温孵育90 min，PBST漂洗，DAB显色。如图2B和2C所示，应用western blot验证，单克隆建立稳转细胞株的敲除NPM1效率更高，优于单纯NPM1-shRNA慢病毒感染。

实施例4 划痕和transwell实验检测细胞迁移与侵袭能力

24孔板在操作前紫外照射30 min（超净台内）。在24孔板中接种约3×104 个感染后的细胞；第2天更换低浓度血清培养基，使用划痕仪根据说明书形成划痕；使用PBS轻轻漂洗2 遍，加入低浓度血清培养基。放入37 ℃ 5% CO2 培养箱培养，分别培养24、48 h后取出，荧光显微镜拍照。根据划痕后的图片，计算各组细胞迁移率。如图3所示，与空载相比，T24/DDP-NPM1^ko细胞株的迁移率明显增强。在24孔板Transwell上室中接种200ul 含3％FBS培养基的3×10⁵/ml感染后细胞，下室加入500 µl 10％FBS培养基，避免产生气泡。于37℃、5% CO2 饱和湿度培养箱内孵育24h后，用棉签擦去上室内的细胞，用 PBS 小心洗涤一次，10%甲醇溶液固定细胞 15分钟，用0.1%结晶紫染色20分钟。轻轻甩去染色液，用PBS洗涤各孔，晾干，400倍显微镜下计数10个视野内的细胞数。如图4所示，T24/DDP-NPM1^ko细胞株的侵袭率性明显增强。

实施例5 流式细胞术检测细胞周期与凋亡

收集分组感染的细胞，用冰PBS洗涤细胞沉淀2次，采用1×binding buffer以1*10^6cells/ml浓度重悬细胞，取细胞悬液100 μl（10^5细胞），加入5ul Annexin V-PE 染液，和5ul 7-AAD染液室温避光15 min 后，加400ul 1X的结合缓冲液到每管里。在1小时内用流式细胞仪上机检测。如图5所示，T24/DDP-NPM1^ko细胞株的凋亡增加。离心收集细胞，弃上清，用预冷PBS洗细胞两次，加入预冷70%乙醇，于4℃固定过夜或-20℃长期固定，离心收集细胞，以1mL的PBS洗细胞一次，加入PI/RNase 染液0.5ml， 4℃避光孵育30分钟，在1小时内用流式细胞仪上机检测。如图6所示，T24/DDP-NPM1^ko细胞株被阻滞在S期。

虽然本发明已以较佳实施例披露如上，然其并非用以限定本发明，任何所属技术领域的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，当可作些许的更动与改进，因此本发明的保护范围当视权利要求所界定者为准。

序列表

<110> 张曼

<120> 一种NPM1敲除的人膀胱癌T24/DDP细胞株

<150> 201810192483.8

<151> 2018-03-09

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> NPM1-shRNA 序列(NPM1-shRNA )

<400> 1

ggaatgttat gataggacat a 21

Claims

1.慢病毒感染人膀胱癌细胞株敲除内源性基因并建立的稳转细胞株，其特征在于，其保藏编号为CGMCC NO:16899。

2.根据权利要求1所述的稳转细胞株，其特征在于，所述人膀胱癌细胞株为T24/DDP细胞株。

3.根据权利要求1所述的稳转细胞株，其特征在于，所述敲除内源性基因为NPM1。

4.根据权利要求1所述的稳转细胞株，其特征在于，构建含有碱基序列SEQ ID NO:1重组表达载体，慢病毒感染宿主细胞T24/DDP建立稳转细胞株。

5.根据权利要求4所述的稳转细胞株，其特征在于，所述建立稳转细胞株为T24/DDP-NPM1^ko。

6.根据权利要求5所述的稳转细胞株，其特征在于，所述细胞株可稳定沉默NPM1表达并传代。

7.根据权利要求5所述的稳转细胞株，其特征在于，所述T24/DDP-NPM1^ko细胞株中NPM1蛋白表达水平显著下降，细胞增殖能力显著抑制，细胞迁移力增高，细胞周期停滞于S期。