CN102181397A - 一种喉鳞癌软骨侵袭模型 - Google Patents

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本发明公开了一种喉鳞癌软骨侵袭模型，其包括喉鳞癌侵袭体外实验模型、喉鳞癌软骨侵袭半离体试验模型和喉鳞癌软骨侵袭体内试验模型。以聚碳酸脂微孔滤膜封闭Transwell小室杯底；人工重建基底膜Matrigel涂在滤膜上；待Matrigel形成凝胶状后，将Transwell小室放入培养孔中，用紫外线照射2h杀菌备用；下室加入含10%小牛血清的RPMI1640培养基，喉鳞癌Hep-2细胞均匀加入上室，培养后轻轻拭去杯底部Matrigel胶和未浸润的细胞，乙醇固定，结晶紫染色；计数穿膜细胞数并取其平均值，以穿膜细胞的相对数目代表侵袭力。该发明能够有效的建立喉鳞癌软骨侵袭模型，探讨喉鳞癌对软骨的侵袭机制，对预防喉鳞癌转移、复发以及选择有效的个性化治疗方案起到极大作用。

Description

一种喉鳞癌软骨侵袭模型
技术领域
本发明涉及一种喉鳞癌软骨侵袭模型，属于肿瘤侵袭转移体外实验模型技术领域。
背景技术
目前，喉癌是头颈部常见的恶性肿瘤之一，严重危害人类健康。由于喉部周围有致密的结缔组织膜包围，静脉化疗药物很难达到病灶，经多年临床观察放疗的疗效亦不佳，因此目前喉癌的治疗仍以手术切除为主。然而由于喉部具有重要的生理功能，部分患者术后的呼吸、吞咽和发声等功能受到严重影响，给生活带来诸多不便。尽管如此，仍有部分患者死于复发和转移。喉癌中绝大部分属于鳞状细胞癌，其发病率逐年上升，成为危害人类健康的重大疾病之一。喉鳞癌早期治疗效果好，喉功能可保留，且5年生存率可高达90%。但临床上常发现存在周围组织浸润，尤其是侵袭累及喉软骨的病例很容易出现转移和复发，喉鳞癌一旦复发治疗效果则很差，5年生存率常低与60%。因此，建立喉鳞癌软骨侵袭模型，探讨喉鳞癌对软骨的侵袭机制，对预防喉鳞癌转移、复发以及选择有效的个性化治疗方案有着重要的意义。目前尚未见有关喉癌软骨侵袭模型的相关报道。
发明内容
针对上述现有技术的不足之处，本发明提供一种喉鳞癌软骨侵袭模型，能有效的解决上述现有技术存在的问题。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案是：公开一种喉鳞癌软骨侵袭模型，其包括喉鳞癌侵袭体外实验模型、喉鳞癌软骨侵袭半离体试验模型和喉鳞癌软骨侵袭体内试验模型。
作为优选，所述喉鳞癌侵袭体外实验模型的构建方法为：
第一步：以聚碳酸脂微孔滤膜封闭Transwell小室杯底；
第二步：人工重建基底膜Matrigel按1∶5比例用无血清RPMI-1640 稀释后取100μL均匀地涂在滤膜上；
第三步：待Matrigel形成凝胶状后，将Transwell小室放入24 孔板细胞培养孔中，用紫外线照射2 h 杀菌备用；
第四步：下室加入含10%小牛血清的RPMI1640 培养基，喉鳞癌Hep-2细胞均匀加入上室，37℃条件下培养24h；
第五步：培养后轻轻拭去杯底部Matrigel胶和未浸润的细胞，乙醇固定，结晶紫染色；
第六步：光镜下观察并随机选取4个视野，计数穿膜细胞数并取其平均值，以穿膜细胞的相对数目代表侵袭力。
作为优选，所述喉鳞癌软骨侵袭半离体试验模型的构建方法为：
第一步：取裸鼠喉软骨置于Transwell小室下层与10%小牛血清的RPMI1640 培养基共培养；
第二步：各实验组喉鳞癌Hep-2细胞置上层；
第三步：培养后轻轻拭去杯底部Matrigel胶和未浸润的细胞，乙醇固定，结晶紫染色；
第四步：光镜下观察并随机选取4个视野，计数穿膜细胞数并取其平均值，以穿膜细胞的相对数目代表侵袭力。
作为优选，所述喉鳞癌软骨侵袭体内试验模型的构建方法为：
第一步：将喉鳞癌Hep-2细胞注射于裸鼠耳廓软骨膜下；
第二步：观察不同模型移植瘤生长情况，定时记录移植瘤体积和裸鼠体重的变化；
第三步：裸鼠耳廓皮下移植瘤成瘤1周后处死裸鼠，连同耳廓软骨及瘤体组织一并取下；
第四步：经过生理盐水冲洗，甲醛固定后，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，浸蜡包埋后连续切片，厚度为5μm，50℃蒸馏水中展片，捞片于涂有蛋白甘油的载玻片上，50℃烘箱内烤片备用；
第五步：通过苏木精-伊红染色和甲苯胺蓝染色观察喉鳞癌Hep-2细胞对耳廓软骨组织的侵袭情况。
与现有技术相比，该发明带来的有益效果为：该发明能够有效的建立喉鳞癌软骨侵袭模型，探讨喉鳞癌对软骨的侵袭机制，对预防喉鳞癌转移、复发以及选择有效的个性化治疗方案起到极大作用。
附图说明
图1为本发明喉鳞癌细胞Transwell小室穿膜情况；
图2为Transwell小室半离体侵袭试验模型。
具体实施方式
下面结合附图及具体实施例对本发明作进一步的详细说明。
作为本发明的一种实施例，该喉鳞癌软骨侵袭模型包括喉鳞癌侵袭体外实验模型、喉鳞癌软骨侵袭半离体试验模型和喉鳞癌软骨侵袭体内试验模型。
其中，所述喉鳞癌侵袭体外实验模型的构建方法为：
第一步：以聚碳酸脂微孔滤膜封闭Transwell小室杯底；
第二步：人工重建基底膜Matrigel按1∶5比例用无血清RPMI-1640 稀释后取100μL均匀地涂在滤膜上；
第三步：待Matrigel形成凝胶状后，将Transwell小室放入24 孔板细胞培养孔中，用紫外线照射2 h 杀菌备用；
第四步：下室加入含10%小牛血清的RPMI1640 培养基，喉鳞癌Hep-2细胞均匀加入上室，37℃条件下培养24h；
第五步：培养后轻轻拭去杯底部Matrigel胶和未浸润的细胞，乙醇固定，结晶紫染色；
第六步：光镜下观察并随机选取4个视野，计数穿膜细胞数并取其平均值，以穿膜细胞的相对数目代表侵袭力。如图1所示，图1为本发明喉鳞癌细胞Transwell小室穿膜情况。
如图2所示，其中，所述喉鳞癌软骨侵袭半离体试验模型的构建方法为：
第一步：取裸鼠喉软骨置于Transwell小室下层与10%小牛血清的RPMI1640 培养基共培养；
第二步：各实验组喉鳞癌Hep-2细胞置上层；图2为Transwell小室半离体侵袭试验模型的示意图。
第三步：培养后轻轻拭去杯底部Matrigel胶和未浸润的细胞，乙醇固定，结晶紫染色；
第四步：光镜下观察并随机选取4个视野，计数穿膜细胞数并取其平均值，以穿膜细胞的相对数目代表侵袭力。
其中，所述喉鳞癌软骨侵袭体内试验模型的构建方法为：
第一步：将喉鳞癌Hep-2细胞注射于裸鼠耳廓软骨膜下；
第二步：观察不同模型移植瘤生长情况，定时记录移植瘤体积和裸鼠体重的变化；
第三步：裸鼠耳廓皮下移植瘤成瘤1周后处死裸鼠，连同耳廓软骨及瘤体组织一并取下；
第四步：经过生理盐水冲洗，甲醛固定后，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，浸蜡包埋后连续切片，厚度为5μm，50℃蒸馏水中展片，捞片于涂有蛋白甘油的载玻片上，50℃烘箱内烤片备用；
第五步：通过苏木精-伊红染色和甲苯胺蓝染色观察喉鳞癌Hep-2细胞对耳廓软骨组织的侵袭情况。
实施例1：饲养裸鼠，将Hep-2细胞注射于裸鼠耳廓软骨膜下，种植喉鳞癌Hep-2细胞使之生长，复制喉癌裸鼠动物模型。实验组每日观察肿瘤，治疗过程中裸鼠置层流架中继续饲养到实验设计时间。实验过程中，每天定时观察各组裸鼠精神状态、活动、饮食，测量其体重及瘤体积变化。裸鼠耳廓皮下移植瘤成瘤1周后处死裸鼠，剥离肿瘤，测量净体积及重量，取部分肿瘤组织置于液氮保存，其余制成蜡块备用。电镜观察肿瘤超微结构变化，检测肿瘤血管生成情况的变化。连同耳廓软骨及瘤体组织一并取下，经过生理盐水冲洗，甲醛固定后，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，浸蜡包埋后连续切片，厚度为5 μm，50℃蒸馏水中展片，捞片于涂有蛋白甘油的载玻片上，50℃烘箱内烤片备用。进一步通过苏木精-伊红染色和甲苯胺蓝染色观察Hep-2细胞对耳廓软骨组织的侵袭情况。
以上对本发明所提供的喉鳞癌软骨侵袭模型进行了详尽介绍，本文中应用了具体个例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想；同时，对于本领域的一般技术人员，依据本发明的思想，在具体实施方式及应用范围上均会有改变之处，对本发明的变更和改进将是可能的，而不会超出附加权利要求所规定的构思和范围，综上所述，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。

Claims (4)

1.一种喉鳞癌软骨侵袭模型，其特征在于：包括喉鳞癌侵袭体外实验模型、喉鳞癌软骨侵袭半离体试验模型和喉鳞癌软骨侵袭体内试验模型。
2.根据权利要求1所述的一种喉鳞癌软骨侵袭模型，其特征在于：所述喉鳞癌侵袭体外实验模型的构建方法为：
第一步：以聚碳酸脂微孔滤膜封闭Transwell小室杯底；
第二步：人工重建基底膜Matrigel，按1∶5比例用无血清RPMI-1640 稀释后取100μL均匀地涂在滤膜上；
第三步：待Matrigel形成凝胶状后，将Transwell小室放入24 孔板细胞培养孔中，用紫外线照射2 h 杀菌备用；
第四步：下室加入含10%小牛血清的RPMI1640 培养基，喉鳞癌Hep-2细胞均匀加入上室，37℃条件下培养24h；
第五步：培养后轻轻拭去杯底部Matrigel胶和未浸润的细胞，乙醇固定，结晶紫染色；
第六步：光镜下观察并随机选取4个视野，计数穿膜细胞数并取其平均值，以穿膜细胞的相对数目代表侵袭力。
3. 根据权利要求1所述的一种喉鳞癌软骨侵袭模型，其特征在于：所述喉鳞癌软骨侵袭半离体试验模型的构建方法为：
第一步：取裸鼠喉软骨置于Transwell小室下层与10%小牛血清的RPMI1640 培养基共培养；
第二步：各实验组喉鳞癌Hep-2细胞置上层；
第三步：培养后轻轻拭去杯底部Matrigel胶和未浸润的细胞，乙醇固定，结晶紫染色；
第四步：光镜下观察并随机选取4个视野，计数穿膜细胞数并取其平均值，以穿膜细胞的相对数目代表侵袭力。
4. 根据权利要求1所述的一种喉鳞癌软骨侵袭模型，其特征在于：所述喉鳞癌软骨侵袭体内试验模型的构建方法为：
第一步：将喉鳞癌Hep-2细胞注射于裸鼠耳廓软骨膜下；
第二步：观察不同模型移植瘤生长情况，定时记录移植瘤体积和裸鼠体重的变化；
第三步：裸鼠耳廓皮下移植瘤成瘤1周后处死裸鼠，连同耳廓软骨及瘤体组织一并取下；
第四步：经过生理盐水冲洗，甲醛固定后，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，浸蜡包埋后连续切片，厚度为5μm，50℃蒸馏水中展片，捞片于涂有蛋白甘油的载玻片上，50℃烘箱内烤片备用；
第五步：通过苏木精-伊红染色和甲苯胺蓝染色观察喉鳞癌Hep-2细胞对耳廓软骨组织的侵袭情况。
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