CN109456934B - 一种三维肾小球模型的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种三维肾小球模型的制备方法，属于生物技术领域。尤其涉及一种具有仿生肾小球三维结构的微流控的体外肾小球模型的制备和仿生肾小球功能模拟。本发明制备的三维肾小球模型，能够模拟多种仿肾小球的三维结构微环境，如肾小球球状结构、血管状通道和可模拟卷曲微血管表面结构的微凸起结构等。本发明制备方法中涉及了基于微流控的有纺锤型结节的中空凝胶纤维制备方法、凝胶表面微凸起结构的制备方法和稳定可控的凝胶材料流通装置搭建方法，并结合细胞共培养技术，成功构建了具有一定的仿生肾小球屏障功能的三维肾小球模型。本发明制备的三维肾小球模型可作为构建高通量的肾脏药物筛选/疾病模型的研究平台。
Description
技术领域
本发明涉及一种三维肾小球模型的制备方法，属于生物技术领域。
背景技术
慢性肾病近年来已逐渐成为全球致死率增长最快的疾病之一。根据世界卫生组织2012年的数据统计，全球每100000人中有12.2人因慢性肾病死亡。慢性肾病给社会带来了沉重的负担，并逐渐成为了现阶段的重大生命健康挑战难题之一。
组成肾脏并实现肾脏过滤功能的基本单位被称为肾单位，包括肾小球、肾小囊和肾小管。血浆通过肾小球滤过膜过滤生成原尿。正常功能的肾小球滤过膜能够保证分子量大于60kDa的分子大都保留在血浆内。早期肾脏损伤的主要表现为蛋白尿、血尿和肾小球滤过率下降等，这都与肾小球滤过膜结构的损伤和屏障功能的破坏密切相关。因而研究肾小球屏障功能的作用机制及其损伤机制对于慢性肾病的研究至关重要。
传统肾脏功能及疾病研究主要通过动物实验和细胞培养进行研究。但是动物实验不仅成本昂贵，还涉及人道主义问题，另外，利用动物实验进行研究难以调节和监控特定影响因子造成的影响。而普通细胞培养方法缺乏体内生理环境的刺激及细胞间相互作用。仿真组织和器官的关键生理环境的不足，可能导致细胞生理功能的丢失。除此之外，普通细胞培养仅能提供细胞层面的信息，这对于了解肾小球过滤功能的变化非常有限。因此，在体外建立更加有效的肾小球模型是慢性肾病研究的重要基础。
为模拟更接近体内真实环境的仿生组织，微流控芯片技术逐渐发展起来。微流控芯片技术是在微米量级空间对流体进行精确操控的一种科学与技术。利用微流控芯片技术，引入生物材料，可实现精确仿真关键的组织、器官生理特征，构建模拟接近体内真实环境的仿生组织，从而为生物体的研究提供了一种相对简单而有效的途径。
仿生肾小球芯片的研发近几年也成为了国内外研究的热点。但是已报道的肾小球芯片大多基于肾小球滤过膜二维单层膜结构的实现和模拟，迄今为止尚未见成功模拟出肾小球三维拓扑结构的器官模型的研究。
发明内容
本发明的目的是提出一种三维肾小球模型的制备方法，具体涉及一种具有仿生肾小球三维结构且可长期灌流的体外肾小球模型的制备，以开发反映肾小球结构和功能的器官模型，并实现其芯片化，用于对肾脏疾病的研究和新药筛选。
本发明提出的三维肾小球模型的制备方法，包括以下步骤：
(1)制备含碳酸钙的有纺锤型结节的中空凝胶纤维，过程如下：
(1-1)搭建一个凝胶纤维制备系统，该制备系统包括一个共轴微流控装置(1)、一个旋转装置(2)和一个水池(3)，所述的水池(3)中盛有摩尔浓度为0.1-0.2摩尔/升的氯化钙溶液(5)，所述的共轴微流控装置(1)垂直固定在氯化钙溶液(5)的上方，共轴微流控装置(1)的底端与氯化钙溶液面的距离约为0.5-2毫米，旋转装置(2)位于氯化钙溶液(5)的上方、盛放氯化钙溶液(5)的水池(3)的一侧，旋转装置(2)的旋转面垂直于氯化钙溶液面，共轴微流控装置(1)下方、水池3底部的侧面设置一个旋转轴(6)；
(1-2)制备碳酸钙颗粒与海藻酸钠溶液的混合液，混合液中，碳酸钙颗粒的质量体积浓度为0.1-0.2克/毫升，海藻酸钠溶液的质量体积浓度为1％-3％；
(1-3)向共轴微流控装置(1)的内层入口(8)引入摩尔浓度为0.1-0.2摩尔/升的氯化钙溶液，流速为5-30微升/分钟；向共轴微流控装置1的外层入口(9)引入步骤(1-2)的混合液，流速为40-100微升/分钟；内层溶液和外层溶液在共轴微流控装置(1)的出口通道(7)中形成层流，层流界面发生交联反应形成凝胶纤维；将共轴微流控装置(1)的出口生成的纤维牵引至旋转轴(6)，使纤维经过旋转轴(6)后通过旋转装置(2)进行收集，得到含碳酸钙的有纺锤型结节的中空凝胶纤维4；
(2)在步骤(1)制备的含碳酸钙的有纺锤型结节的中空凝胶纤维(4)的纺锤型结节表面上制备微凸起结构：
将步骤(1)制备的含碳酸钙的有纺锤型结节的中空凝胶纤维(4)放入10％-30％的盐酸溶液中10-30秒，含碳酸钙的有纺锤型结节的中空凝胶纤维(4)中的碳酸钙与盐酸反应，生成二氧化碳气体，使纺锤型结节表面形成微凸起结构，得到结节表面具有微凸起结构的中空凝胶纤维(15)，将该结节表面具有微凸起结构的中空凝胶纤维(15)在去离子水中清洗数次后，保持于去离子水中并放入真空干燥箱中抽真空，除气，最后将结节表面具有微凸起结构的中空凝胶纤维(15)放入摩尔浓度为0.1-0.2摩尔/升的氯化钙溶液中保存备用；
(3)将结节表面具有微凸起结构的中空凝胶纤维(15)组装到流通装置：
该流通装置包括底板(10)和无底孔板(11)，所述的无底孔板(11)上开有三个通孔(12)，所述的底板(10)上开有三个凹槽(13)，三个凹槽(13)的深度与含有微米级中空通道凝胶材料(15)的出入口处厚度相等，三个凹槽(13)之间通过微通道(14)相互连接；所述的底板(10)和无底孔板(11)相对固定，无底孔板(11)上的通孔(12)与底板(10)上的凹槽(13)位置相对；
在底板(10)的微通道(14)中加入聚二甲基硅氧烷预聚物，在凹槽(13)中加入去离子水或氯化钙溶液；将结节表面具有微凸起结构的中空凝胶纤维(15)放入底板(10)中，如图5所示，使结节表面具有微凸起结构的中空凝胶纤维(15)的两端处于微通道(14)中；在无底孔板(11)的底部涂抹聚二甲基硅氧烷预聚物，将所述已装有结节表面具有微凸起结构的中空凝胶纤维(15)的底板(10)与无底孔板(11)对接组装，并用夹子将二者夹紧；在流通装置的各孔中加满去离子水或氯化钙溶液，随后把整个流通装置放入烘箱中烘烤1-3小时使聚二甲基硅氧烷预聚物聚合交联；将组装在流通装置中的结节表面具有微凸起结构的中空凝胶纤维(15)的两端多余的部分剪去，从而保证通道出入口处于开放状态，即得到装载有凝胶纤维的流通装置；
(4)利用步骤(3)制备的装载有凝胶纤维的流通装置，在结节表面具有微凸起结构的中空凝胶纤维(15)的外表面制备肾小球足细胞屏障，包括以下步骤：
(4-1)配置第一肾小球足细胞培养基：在杜尔伯科改良伊格尔/F12培养基中加入胎牛血清和干扰素，使得胎牛血清的体积浓度为10％，干扰素的浓度为10U/毫升；配置第二肾小球足细胞培养基：在杜尔伯科改良伊格尔/F12培养基中加入胎牛血清，使得胎牛血清的体积浓度为10％；
(4-2)对装载有凝胶纤维的流通装置进行灭菌和孵育预处理：除去步骤(3)中制备的装载有凝胶纤维的流通装置中的液体，在装载有凝胶纤维的流通装置的各孔内加入浓度为75％的乙醇，浸泡24小时，以对装载有凝胶纤维的流通装置进行灭菌处理，随后将装载有凝胶纤维的流通装置中的乙醇除去，用去离子水清洗3-5次，在装载有凝胶纤维的流通装置各孔中加入含有0.005摩尔/升氯化钙的第一肾小球足细胞培养基，孵育4-10小时；
(4-3)制备足细胞悬浮液：
将肾小球足细胞放入第一肾小球足细胞培养基中，在体积浓度为5％的二氧化碳的氛围中、33℃条件下培养，每2天更换一次第一肾小球足细胞培养基，当培养的肾小球足细胞密度为70％-80％时，除去第一肾小球足细胞培养基，用磷酸盐缓冲液冲洗肾小球足细胞两次，加入质量浓度为0.05％-0.25％的胰酶溶液，使胰酶溶液覆盖在肾小球足细胞上，在37℃保持1-3分钟；向肾小球足细胞中再加入第一肾小球足细胞培养基，第一肾小球足细胞培养基的加入量为胰酶溶液的2-3倍，晃动数次，使肾小球足细胞脱离容器而悬浮于第一肾小球足细胞培养基和胰酶的混合液中，得到第一肾小球足细胞悬浮液；对第一肾小球足细胞悬浮液进行离心处理，转速为700-1500转/分钟，时间为5分钟，除去上清液，重新加入1毫升第一肾小球足细胞培养基，得到第二肾小球足细胞悬浮液；利用血球计数板测定第二肾小球足细胞悬浮液中肾小球足细胞密度，并计算肾小球足细胞数目，再以700-1500转/分钟离心处理5分钟，除去上清液,再次加入第一肾小球足细胞培养基，使细胞密度为4-8×106个/毫升，得到第三肾小球足细胞悬浮液；
(4-4)制备肾小球足细胞屏障：
吸除装载有凝胶纤维的流通装置的各孔中的液体，向装载有凝胶纤维的流通装置的中间孔中的结节表面具有微凸起结构的中空凝胶纤维(15)上加入30微升步骤(4-3)中制备的第三肾小球足细胞悬浮液，使装载有凝胶纤维的流通装置倒置，在体积浓度为5％的二氧化碳氛围中、33℃下培养1-2小时，当肾小球足细胞贴附在结节表面具有微凸起结构的中空凝胶纤维(15)的表面时，使得流通装置正置；再在装载有凝胶纤维的流通装置的各孔中加入第一肾小球足细胞培养基，在体积浓度为5％二氧化碳的氛围、33℃下培养，培养过程中每天更换第一肾小球足细胞培养基，培养1-2周；当肾小球足细胞增殖并覆盖结节表面具有微凸起结构的中空凝胶纤维(15)表面时，将培养基更换为第二肾小球足细胞培养基，在体积浓度为5％的二氧化碳的氛围中、38℃下培养，每天更换第二肾小球足细胞培养基，肾小球足细胞将逐渐分化，在结节表面具有微凸起结构的中空凝胶纤维(15)外表面上形成肾小球足细胞屏障；
(5)在步骤(4)的结节表面具有微凸起结构的中空凝胶纤维(15)的内表面制备内皮细胞屏障，以得到三维肾小球模型，包括以下步骤：
(5-1)准备内皮细胞悬浮液：
将内皮细胞放入内皮细胞培养基中，在体积浓度为5％的二氧化碳的氛围中、37℃条件下培养，每2天更换一次内皮细胞培养基，当培养的内皮细胞密度为80％-90％时，除去内皮细胞培养基，用磷酸盐缓冲液冲洗内皮细胞两次，加入质量浓度为0.05％-0.25％的胰酶溶液，使胰酶溶液覆盖在内皮细胞上，在37℃保持1-5分钟；向内皮细胞中再加入内皮细胞培养基，内皮细胞培养基的加入量为胰酶溶液的2-3倍，晃动数次，使内皮细胞脱离容器而悬浮于内皮细胞培养基和胰酶的混合液中，得到第一内皮细胞悬浮液；对第一内皮细胞悬浮液进行离心处理，转速为700-1500转/分钟，时间为5分钟，除去上清液，重新加入1毫升内皮细胞培养基，得到第二内皮细胞悬浮液；利用血球计数板测定第二内皮细胞悬浮液中内皮细胞密度，并计算内皮细胞数目，再以700-1500转/分钟离心处理5分钟，除去上清液,再次加入内皮细胞培养基，使内皮细胞密度为25-50×106个/毫升，得到第三内皮细胞悬浮液；
(5-2)制备内皮细胞屏障以得到三维肾小球模型：
将装载有凝胶纤维的流通装置的两端孔内的培养基除去，各加入4-10微升第三内皮细胞悬浮液，在体积浓度为5％的二氧化碳的氛围中、37℃下培养1-2小时，当内皮细胞贴附在结节表面具有微凸起结构的中空凝胶纤维(15)的内表面上时，再在装载有凝胶纤维的流通装置的两端孔内加入内皮细胞培养基，进行培养，每天分别更换装载有凝胶纤维的流通装置中两端孔内的内皮细胞培养基和中间孔内的第二肾小球足细胞培养基，4-6天后，内皮细胞将长满结节表面具有微凸起结构的中空凝胶纤维(15)的内表面，形成内皮细胞屏障；从而在结节表面具有微凸起结构的中空凝胶纤维(15)的内表面和外表面分别形成内皮细胞屏障和肾小球足细胞屏障，得到三维肾小球模型。
本发明提出的三维肾小球模型的制备方法，其优点是：
1、利用本发明方法制备的三维肾小球模型，是目前首例具有肾小球三维拓扑结构的体外仿生模型，能够模拟肾小球中多种三维结构微环境，如肾小球球状结构、血管状通道、和可模拟卷曲微血管表面结构的微凸起结构等。
2、利用本发明方法制备的三维肾小球模型，将三维凝胶纤维的制备技术、凝胶纤维的流通技术和细胞共培养技术结合起来，实现了内皮细胞在血管状通道中与足细胞在仿肾小球表面结构上的三维仿生共培养，因此能够实现肾小球的高仿生模拟，为肾脏体外研究提供了高仿生的平台。
3、本发明的三维肾小球模型制备方法中涉及的基于孔板的流通装置，可以用于对肾小球滤过功能进行评价，并且可实现高通量的流通，除此之外，装置中的加液和取液操作，可以直接使用已有的已经商业化的自动化孔板移液设备来实现，还可减少试验人员工作量。因此适用于高通量的药物筛选和病理生理研究。
附图说明
图1是本发明方法中涉及的凝胶纤维制备系统的结构示意图。
图2是图1所示的凝胶纤维制备系统中共轴微流控装置的结构示意图。
图3是本发明方法中的流通装置的结构示意图。
图4是图3所示的流通装置中底板的俯视图。
图5是装载有凝胶纤维的流通装置示意图。
图1-图5中，1是共轴微流控装置，2是旋转装置，3是水池，4是含碳酸钙的有纺锤型结节的中空凝胶纤维，5是氯化钙溶液，6是旋转轴，7是共轴微流控装置的出口通道，8是共轴微流控装置的内层入口，9是共轴微流控装置的外层入口，10是底板，11是无底孔板，12是通孔，13是凹槽，14是微通道，15是结节表面具有微凸起结构的中空凝胶纤维。
具体实施方式
以下结合附图，详细介绍本发明提出的三维肾小球模型的制备方法，包括以下步骤：
(1)制备含碳酸钙的有纺锤型结节的中空凝胶纤维，过程如下：
(1-1)搭建一个凝胶纤维制备系统，其结构如图1所示，该制备系统包括一个共轴微流控装置1、一个旋转装置2和一个水池3，所述的水池3中盛有摩尔浓度为0.1-0.2摩尔/升的氯化钙溶液5，所述的共轴微流控装置1垂直固定在氯化钙溶液5的上方，共轴微流控装置1的底端与氯化钙溶液面的距离约为0.5-2毫米，旋转装置2位于氯化钙溶液5的上方、盛放氯化钙溶液5的水池3的一侧，旋转装置2的旋转面垂直于氯化钙溶液面，共轴微流控装置1下方、水池3底部的侧面设置一个旋转轴6；所述共轴微流控装置1的结构如图2所示。
(1-2)制备碳酸钙颗粒与海藻酸钠溶液的混合液，混合液中，碳酸钙颗粒的质量体积浓度为0.1-0.2克/毫升，海藻酸钠溶液的质量体积浓度为1％-3％；
(1-3)向共轴微流控装置1的内层入口8引入摩尔浓度为0.1-0.2摩尔/升的氯化钙溶液，流速为5-30微升/分钟；向共轴微流控装置1的外层入口9引入步骤(1-2)的混合液，流速为40-100微升/分钟；内层溶液和外层溶液在共轴微流控装置1的出口通道7中形成层流，层流界面发生交联反应形成凝胶纤维；将共轴微流控装置1的出口生成的纤维牵引至旋转轴6，使纤维经过旋转轴6后通过旋转装置2进行收集，得到含碳酸钙的有纺锤型结节的中空凝胶纤维4；
(2)在步骤(1)制备的含碳酸钙的有纺锤型结节的中空凝胶纤维4的纺锤型结节表面上制备微凸起结构：
将步骤(1)制备的含碳酸钙的有纺锤型结节的中空凝胶纤维4放入10％-30％的盐酸溶液中10-30秒，含碳酸钙的有纺锤型结节的中空凝胶纤维4中的碳酸钙与盐酸反应，生成二氧化碳气体，使纺锤型结节表面形成微凸起结构，得到结节表面具有微凸起结构的中空凝胶纤维15，将该结节表面具有微凸起结构的中空凝胶纤维15在去离子水中清洗数次后，保持于去离子水中并放入真空干燥箱中抽真空，除气，最后将结节表面具有微凸起结构的中空凝胶纤维15放入摩尔浓度为0.1-0.2摩尔/升的氯化钙溶液中保存备用；
(3)将结节表面具有微凸起结构的中空凝胶纤维15组装到流通装置：
流通装置的结构如图3和图4所示，该流通装置包括底板10和无底孔板11，所述的无底孔板11上开有三个通孔12，所述的底板10上开有三个凹槽13，三个凹槽13的深度与含有微米级中空通道凝胶材料15的出入口处厚度相等，三个凹槽13之间通过微通道14相互连接；所述的底板10和无底孔板11相对固定，无底孔板11上的通孔12与底板10上的凹槽13位置相对。
在底板10的微通道14中加入聚二甲基硅氧烷预聚物，在凹槽13中加入去离子水或氯化钙溶液；将结节表面具有微凸起结构的中空凝胶纤维15放入底板10中，如图5所示，使结节表面具有微凸起结构的中空凝胶纤维15的两端处于微通道14中；在无底孔板11的底部涂抹聚二甲基硅氧烷预聚物，将所述已装有结节表面具有微凸起结构的中空凝胶纤维15的底板10与无底孔板11对接组装，并用夹子将二者夹紧；在流通装置的各孔中加满去离子水或氯化钙溶液，随后把整个流通装置放入烘箱中烘烤1-3小时使聚二甲基硅氧烷预聚物聚合交联；将组装在流通装置中的结节表面具有微凸起结构的中空凝胶纤维15的两端多余的部分剪去，从而保证通道出入口处于开放状态，即可得到如图5所示的装载有凝胶纤维的流通装置；
(4)利用步骤(3)制备的装载有凝胶纤维的流通装置，在结节表面具有微凸起结构的中空凝胶纤维15的外表面制备肾小球足细胞屏障，包括以下步骤：
(4-1)配置第一肾小球足细胞培养基：在杜尔伯科改良伊格尔/F12培养基中加入胎牛血清和干扰素，使得胎牛血清的体积浓度为10％，干扰素的浓度为10U/毫升；配置第二肾小球足细胞培养基：在杜尔伯科改良伊格尔/F12培养基中加入胎牛血清，使得胎牛血清的体积浓度为10％；
(4-2)对装载有凝胶纤维的流通装置进行灭菌和孵育预处理：除去步骤(3)中制备的装载有凝胶纤维的流通装置中的液体，在装载有凝胶纤维的流通装置的各孔内加入浓度为75％的乙醇，浸泡24小时，以对装载有凝胶纤维的流通装置进行灭菌处理，随后将装载有凝胶纤维的流通装置中的乙醇除去，用去离子水清洗3-5次，在装载有凝胶纤维的流通装置各孔中加入含有0.005摩尔/升氯化钙的第一肾小球足细胞培养基，孵育4-10小时；
(4-3)制备足细胞悬浮液：
将肾小球足细胞放入第一肾小球足细胞培养基中，在体积浓度为5％的二氧化碳的氛围中、33℃条件下培养，每2天更换一次第一肾小球足细胞培养基，当培养的肾小球足细胞密度为70％-80％时，除去第一肾小球足细胞培养基，用磷酸盐缓冲液冲洗肾小球足细胞两次，加入质量浓度为0.05％-0.25％的胰酶溶液，使胰酶溶液覆盖在肾小球足细胞上，在37℃保持1-3分钟；向肾小球足细胞中再加入第一肾小球足细胞培养基，第一肾小球足细胞培养基的加入量为胰酶溶液的2-3倍，晃动数次，使肾小球足细胞脱离容器而悬浮于第一肾小球足细胞培养基和胰酶的混合液中，得到第一肾小球足细胞悬浮液；对第一肾小球足细胞悬浮液进行离心处理，转速为700-1500转/分钟，时间为5分钟，除去上清液，重新加入1毫升第一肾小球足细胞培养基，得到第二肾小球足细胞悬浮液；利用血球计数板测定第二肾小球足细胞悬浮液中肾小球足细胞密度，并计算肾小球足细胞数目，再以700-1500转/分钟离心处理5分钟，除去上清液,再次加入第一肾小球足细胞培养基，使细胞密度为4-8×106个/毫升，得到第三肾小球足细胞悬浮液；
(4-4)制备肾小球足细胞屏障：
吸除装载有凝胶纤维的流通装置的各孔中的液体，向装载有凝胶纤维的流通装置的中间孔中的结节表面具有微凸起结构的中空凝胶纤维15上加入30微升步骤(4-3)中制备的第三肾小球足细胞悬浮液，使装载有凝胶纤维的流通装置倒置，在体积浓度为5％的二氧化碳氛围中、33℃下培养1-2小时，当肾小球足细胞贴附在结节表面具有微凸起结构的中空凝胶纤维15的表面时，使得流通装置正置；再在装载有凝胶纤维的流通装置的各孔中加入第一肾小球足细胞培养基，在体积浓度为5％二氧化碳的氛围、33℃下培养，培养过程中每天更换第一肾小球足细胞培养基，培养1-2周；当肾小球足细胞增殖并覆盖结节表面具有微凸起结构的中空凝胶纤维15表面时，将培养基更换为第二肾小球足细胞培养基，在体积浓度为5％的二氧化碳的氛围中、38℃下培养，每天更换第二肾小球足细胞培养基，肾小球足细胞将逐渐分化，在结节表面具有微凸起结构的中空凝胶纤维15外表面上形成肾小球足细胞屏障；
(5)在步骤(4)的结节表面具有微凸起结构的中空凝胶纤维15的内表面制备内皮细胞屏障，以得到三维肾小球模型，包括以下步骤：
(5-1)准备内皮细胞悬浮液：
将内皮细胞放入内皮细胞培养基中，在体积浓度为5％的二氧化碳的氛围中、37℃条件下培养，每2天更换一次内皮细胞培养基，当培养的内皮细胞密度为80％-90％时，除去内皮细胞培养基，用磷酸盐缓冲液冲洗内皮细胞两次，加入质量浓度为0.05％-0.25％的胰酶溶液，使胰酶溶液覆盖在内皮细胞上，在37℃保持1-5分钟；向内皮细胞中再加入内皮细胞培养基，内皮细胞培养基的加入量为胰酶溶液的2-3倍，晃动数次，使内皮细胞脱离容器而悬浮于内皮细胞培养基和胰酶的混合液中，得到第一内皮细胞悬浮液；对第一内皮细胞悬浮液进行离心处理，转速为700-1500转/分钟，时间为5分钟，除去上清液，重新加入1毫升内皮细胞培养基，得到第二内皮细胞悬浮液；利用血球计数板测定第二内皮细胞悬浮液中内皮细胞密度，并计算内皮细胞数目，再以700-1500转/分钟离心处理5分钟，除去上清液,再次加入内皮细胞培养基，使内皮细胞密度为25-50×106个/毫升，得到第三内皮细胞悬浮液；
(5-2)制备内皮细胞屏障以得到三维肾小球模型：
将装载有凝胶纤维的流通装置的两端孔内的培养基除去，各加入4-10微升第三内皮细胞悬浮液，在体积浓度为5％的二氧化碳的氛围中、37℃下培养1-2小时，当内皮细胞贴附在结节表面具有微凸起结构的中空凝胶纤维15的内表面上时，再在装载有凝胶纤维的流通装置的两端孔内加入内皮细胞培养基，进行培养，每天分别更换装载有凝胶纤维的流通装置中两端孔内的内皮细胞培养基和中间孔内的第二肾小球足细胞培养基，4-6天后，内皮细胞将长满结节表面具有微凸起结构的中空凝胶纤维15的内表面，形成内皮细胞屏障；从而在结节表面具有微凸起结构的中空凝胶纤维15的内表面和外表面分别形成内皮细胞屏障和肾小球足细胞屏障，得到三维肾小球模型。
本发明制备方法中涉及的流通装置，可置于一个定时反复倾斜的仪器上，使流通装置的入口置于出口下方倾斜，则入口液体会逐渐流入出口，待大部分液体都进入出口后，反向倾斜，则液体从出口通过凝胶通道回到入口。利用仪器实现如此反复倾斜，则可实现结节表面具微凸起结构的中空凝胶纤维或肾小球模型的长时间自动化的流通。本发明的上述流通装置中，无底孔板上的通孔和底板上的凹槽，以三个为一组，在一个装置内可以设置一组或多组甚至几十组，因此在一个装置上可以使一个或多个甚至几十个肾小球模型同时实现流通。若使用商业化的孔板，如24孔板，96孔板，384孔板等，则可直接使用已有的已经商业化的自动化孔板移液设备来实现加液和取液，可降低试验人员工作量。
本发明方法制备的肾小球模型，可模拟肾小球的滤过功能：在组装了肾小球模型的流通装置的的入口和出口孔中加入含带有荧光标记的分子(如白蛋白分子)的溶液，利用上述可定时反复倾斜的仪器实现长时间自动化流通，数小时后，取组装了肾小球模型的流通装置的中间孔中液体，测定其荧光强度，则可计算得到肾小球模型中屏障的滤过功能，从而为药物筛选/疾病模型构建提供滤过功能评价指标。
Claims (1)
1.一种三维肾小球模型的制备方法，其特征在于该制备方法包括以下步骤：
(1)制备含碳酸钙的有纺锤型结节的中空凝胶纤维，过程如下：
(1-1)搭建一个凝胶纤维制备系统，该制备系统包括一个共轴微流控装置(1)、一个旋转装置(2)和一个水池(3)，所述的水池(3)中盛有摩尔浓度为0.1-0.2摩尔/升的氯化钙溶液(5)，所述的共轴微流控装置(1)垂直固定在氯化钙溶液(5)的上方，共轴微流控装置(1)的底端与氯化钙溶液面的距离为0.5-2毫米，旋转装置(2)位于氯化钙溶液(5)的上方、盛放氯化钙溶液(5)的水池(3)的一侧，旋转装置(2)的旋转面垂直于氯化钙溶液面，共轴微流控装置(1)下方、水池(3)底部的侧面设置一个旋转轴(6)；
(1-2)制备碳酸钙颗粒与海藻酸钠溶液的混合液，混合液中，碳酸钙颗粒的质量体积浓度为0.1-0.2克/毫升，海藻酸钠溶液的质量体积浓度为1％-3％w/v；
(1-3)向共轴微流控装置(1)的内层入口(8)引入摩尔浓度为0.1-0.2摩尔/升的氯化钙溶液，流速为5-30微升/分钟；向共轴微流控装置(1)的外层入口(9)引入步骤(1-2)的混合液，流速为40-100微升/分钟；内层溶液和外层溶液在共轴微流控装置(1)的出口通道(7)中形成层流，层流界面发生交联反应形成凝胶纤维；将共轴微流控装置(1)的出口生成的纤维牵引至旋转轴(6)，使纤维经过旋转轴(6)后通过旋转装置(2)进行收集，得到含碳酸钙的有纺锤型结节的中空凝胶纤维(4)；
(2)在步骤(1)制备的含碳酸钙的有纺锤型结节的中空凝胶纤维(4)的纺锤型结节表面上制备微凸起结构：
将步骤(1)制备的含碳酸钙的有纺锤型结节的中空凝胶纤维(4)放入10％-30％的盐酸溶液中10-30秒，含碳酸钙的有纺锤型结节的中空凝胶纤维(4)中的碳酸钙与盐酸反应，生成二氧化碳气体，使纺锤型结节表面形成微凸起结构，得到结节表面具有微凸起结构的中空凝胶纤维(15)，将该结节表面具有微凸起结构的中空凝胶纤维(15)在去离子水中清洗数次后，保持于去离子水中并放入真空干燥箱中抽真空，除气，最后将结节表面具有微凸起结构的中空凝胶纤维(15)放入摩尔浓度为0.1-0.2摩尔/升的氯化钙溶液中保存备用；
(3)将结节表面具有微凸起结构的中空凝胶纤维(15)组装到流通装置：
该流通装置包括底板(10)和无底孔板(11)，所述的无底孔板(11)上开有三个通孔(12)，所述的底板(10)上开有三个凹槽(13)，三个凹槽(13)的深度与结节表面具有微凸起结构的中空凝胶纤维(15)的出入口处厚度相等，三个凹槽(13)之间通过微通道(14)相互连接；所述的底板(10)和无底孔板(11)相对固定，无底孔板(11)上的通孔(12)与底板(10)上的凹槽(13)位置相对；
在底板(10)的微通道(14)中加入聚二甲基硅氧烷预聚物，在凹槽(13)中加入去离子水或氯化钙溶液；将结节表面具有微凸起结构的中空凝胶纤维(15)放入底板(10)中，使结节表面具有微凸起结构的中空凝胶纤维(15)的两端处于微通道(14)中；在无底孔板(11)的底部涂抹聚二甲基硅氧烷预聚物，将所述已装有结节表面具有微凸起结构的中空凝胶纤维(15)的底板(10)与无底孔板(11)对接组装，并用夹子将二者夹紧；在流通装置的各孔中加满去离子水或氯化钙溶液，随后把整个流通装置放入烘箱中烘烤1-3小时使聚二甲基硅氧烷预聚物聚合交联；将组装在流通装置中的结节表面具有微凸起结构的中空凝胶纤维(15)的两端多余的部分剪去，从而保证通道出入口处于开放状态，即得到装载有凝胶纤维的流通装置；
(4)利用步骤(3)制备的装载有凝胶纤维的流通装置，在结节表面具有微凸起结构的中空凝胶纤维(15)的外表面制备肾小球足细胞屏障，包括以下步骤：
(4-1)配置第一肾小球足细胞培养基：在杜尔伯科改良伊格尔/F12培养基中加入胎牛血清和干扰素，使得胎牛血清的体积浓度为10％，干扰素的浓度为10U/毫升；配置第二肾小球足细胞培养基：在杜尔伯科改良伊格尔/F12培养基中加入胎牛血清，使得胎牛血清的体积浓度为10％；
(4-2)对装载有凝胶纤维的流通装置进行灭菌和孵育预处理：除去步骤(3)中制备的装载有凝胶纤维的流通装置中的液体，在装载有凝胶纤维的流通装置的各孔内加入浓度为75％的乙醇，浸泡24小时，以对装载有凝胶纤维的流通装置进行灭菌处理，随后将装载有凝胶纤维的流通装置中的乙醇除去，用去离子水清洗3-5次，在装载有凝胶纤维的流通装置各孔中加入含有0.005摩尔/升氯化钙的第一肾小球足细胞培养基，孵育4-10小时；
(4-3)制备足细胞悬浮液：
将肾小球足细胞放入第一肾小球足细胞培养基中，在体积浓度为5％的二氧化碳的氛围中、33℃条件下培养，每2天更换一次第一肾小球足细胞培养基，当培养的肾小球足细胞密度为70％-80％时，除去第一肾小球足细胞培养基，用磷酸盐缓冲液冲洗肾小球足细胞两次，加入质量浓度为0.05％-0.25％的胰酶溶液，使胰酶溶液覆盖在肾小球足细胞上，在37℃保持1-3分钟；向肾小球足细胞中再加入第一肾小球足细胞培养基，第一肾小球足细胞培养基的加入量为胰酶溶液的2-3倍，晃动数次，使肾小球足细胞脱离容器而悬浮于第一肾小球足细胞培养基和胰酶的混合液中，得到第一肾小球足细胞悬浮液；对第一肾小球足细胞悬浮液进行离心处理，转速为700-1500转/分钟，时间为5分钟，除去上清液，重新加入1毫升第一肾小球足细胞培养基，得到第二肾小球足细胞悬浮液；利用血球计数板测定第二肾小球足细胞悬浮液中肾小球足细胞密度，并计算肾小球足细胞数目，再以700-1500转/分钟离心处理5分钟，除去上清液,再次加入第一肾小球足细胞培养基，使细胞密度为4-8×106个/毫升，得到第三肾小球足细胞悬浮液；
(4-4)制备肾小球足细胞屏障：
吸除装载有凝胶纤维的流通装置的各孔中的液体，向装载有凝胶纤维的流通装置的中间孔中的结节表面具有微凸起结构的中空凝胶纤维(15)上加入30微升步骤(4-3)中制备的第三肾小球足细胞悬浮液，使装载有凝胶纤维的流通装置倒置，在体积浓度为5％的二氧化碳氛围中、33℃下培养1-2小时，当肾小球足细胞贴附在结节表面具有微凸起结构的中空凝胶纤维(15)的表面时，使得流通装置正置；再在装载有凝胶纤维的流通装置的各孔中加入第一肾小球足细胞培养基，在体积浓度为5％二氧化碳的氛围、33℃下培养，培养过程中每天更换第一肾小球足细胞培养基，培养1-2周；当肾小球足细胞增殖并覆盖结节表面具有微凸起结构的中空凝胶纤维(15)表面时，将培养基更换为第二肾小球足细胞培养基，在体积浓度为5％的二氧化碳的氛围中、38℃下培养，每天更换第二肾小球足细胞培养基，肾小球足细胞将逐渐分化，在结节表面具有微凸起结构的中空凝胶纤维(15)外表面上形成肾小球足细胞屏障；
(5)在步骤(4)的结节表面具有微凸起结构的中空凝胶纤维(15)的内表面制备内皮细胞屏障，以得到三维肾小球模型，包括以下步骤：
(5-1)准备内皮细胞悬浮液：
将内皮细胞放入内皮细胞培养基中，在体积浓度为5％的二氧化碳的氛围中、37℃条件下培养，每2天更换一次内皮细胞培养基，当培养的内皮细胞密度为80％-90％时，除去内皮细胞培养基，用磷酸盐缓冲液冲洗内皮细胞两次，加入质量浓度为0.05％-0.25％的胰酶溶液，使胰酶溶液覆盖在内皮细胞上，在37℃保持1-5分钟；向内皮细胞中再加入内皮细胞培养基，内皮细胞培养基的加入量为胰酶溶液的2-3倍，晃动数次，使内皮细胞脱离容器而悬浮于内皮细胞培养基和胰酶的混合液中，得到第一内皮细胞悬浮液；对第一内皮细胞悬浮液进行离心处理，转速为700-1500转/分钟，时间为5分钟，除去上清液，重新加入1毫升内皮细胞培养基，得到第二内皮细胞悬浮液；利用血球计数板测定第二内皮细胞悬浮液中内皮细胞密度，并计算内皮细胞数目，再以700-1500转/分钟离心处理5分钟，除去上清液,再次加入内皮细胞培养基，使内皮细胞密度为25-50×106个/毫升，得到第三内皮细胞悬浮液；
(5-2)制备内皮细胞屏障以得到三维肾小球模型：
将装载有凝胶纤维的流通装置的两端孔内的培养基除去，各加入4-10微升第三内皮细胞悬浮液，在体积浓度为5％的二氧化碳的氛围中、37℃下培养1-2小时，当内皮细胞贴附在结节表面具有微凸起结构的中空凝胶纤维(15)的内表面上时，再在装载有凝胶纤维的流通装置的两端孔内加入内皮细胞培养基，进行培养，每天分别更换装载有凝胶纤维的流通装置中两端孔内的内皮细胞培养基和中间孔内的第二肾小球足细胞培养基，4-6天后，内皮细胞将长满结节表面具有微凸起结构的中空凝胶纤维(15)的内表面，形成内皮细胞屏障；从而在结节表面具有微凸起结构的中空凝胶纤维(15)的内表面和外表面分别形成内皮细胞屏障和肾小球足细胞屏障，得到三维肾小球模型。
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