CN116286342A - 一种类人脑皮质芯片、3d打印类人脑皮质的方法及应用 - Google Patents

一种类人脑皮质芯片、3d打印类人脑皮质的方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种生物3D打印快速构建类人脑皮质器官芯片的方法及其应用。包括微流控芯片的制备方法、类人脑皮质水凝胶的制备、类人脑皮质的打印三部分。微流控芯片包括混流通道层，液池层、微孔阵列层、类人脑皮质培养层、培养基回收层五层结构。类人脑皮质水凝胶由明胶、海藻酸盐、透明质酸组成。通过悬浮浴挤出打印的方式，将类人脑皮质直接打印在微流控芯片中，封装得到类人脑皮质器官芯片。本发明克服了传统细胞培养的缺点，通过生物3D打印直接在器官芯片中原位构建具有三层结构相互联结的大尺度类人脑皮质，通过灌流培养，模仿脑脊液循环，利于物质交换、维持细胞活性、细胞分化诱导，可广泛用于脑疾病的药物研发。

Description

一种类人脑皮质芯片、3D打印类人脑皮质的方法及应用
技术领域
本发明涉及微流控芯片领域，尤其涉及类人脑皮质芯片及生物3D打印快速构建类人脑皮质的方法及应用。
背景技术
本发明背景技术中公开的信息旨在增加对本发明总体背景的理解，而该公开不应必然被视为承认或以任何形式暗示该信息已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
器官芯片是近年来干细胞研究领域取得的一个突破性进展，它是一种在载玻片大小的芯片上构建的器官生理微系统，包含活体细胞、组织界面、生物流体和机械力等器官微环境关键要素。器官芯片技术作为一种新型技术受到越来越多的关注，在生命科学、药物研究、个性化医疗和毒性预测等领域有着广泛的应用前景。
在专利CN201811226234.2中，公开了一种适用于生物组织培养及实时监测的系统和方法，包括：生物3D打印机、器官芯片、连接底座、驱动系统和辅助系统；所述器官芯片通过所述连接底座与所述驱动系统相连；所述生物3D打印机用于构建生物3D打印类组织；所述器官芯片用于放置培养基和生物3D打印类组织，培养所述生物3D打印类组织；所述连接底座用于放置器官芯片，并与驱动系统相连；所述驱动系统用于驱动所述培养基在所述器官芯片内流动；所述辅助系统用于监测生物3D打印类组织的状态；所述器官芯片主体还包括：硬质顶层、微流道层、透明底层、传感芯片，所述微流道层设置在所述硬质顶层和所述透明底层之间，所述传感芯片与器官芯片主体的培养基接触；所述硬质顶层包括至少一个培养室、气体通道、顶面凹槽、底面凹槽、检测区域；所述底面凹槽用于放置所述微流道层；所述微流道层包括至少一个培养室、微流道、驱动凹槽、储液凹槽、分割凹槽、栅栏状阀门；所述微流道将所述至少一个培养室、驱动凹槽、储液凹槽、分割凹槽连接起来；所述栅栏状阀门将所述分割凹槽隔断开；其中，所述转运单元与所述硬质顶层中的至少一个培养室、所述微流道层中的至少一个培养室匹配。
但是，上述专利构建的芯片结构复杂，实际应用困难，且无法支持培养基的更新，容易造成有毒物质的积累，难以支持长期培养。最为关键的，该专利所述的打印方法及器官芯片无法支持软组织、特别是类人脑皮质的打印。
人大脑皮质具有弹性模量低、耗散高的特点，且神经细胞对于生存环境的要求尤为苛刻。制备一种综合性能良好的类人脑皮质生物墨水仍是生物3D打印的难点。
发明内容
为解决现有技术中存在的问题，本发明提供了一种类人脑皮质芯片、3D打印类人脑皮质的方法及应用。本发明主要设计了一种类人脑皮质芯片，并结合生物3D打印方法直接在芯片中原位打印具有三层结构的类人脑皮质。
具体地，本发明提供了下述的技术特征，以下技术特征的一个或多个的结合构成本发明的技术方案。
在本发明的第一方面，本发明提供了一种类人脑皮质器官芯片，该芯片由上而下包括混流通道层、液池层、微孔阵列层、类人脑皮质培养层、培养基回收层；相邻层之间通过密封圈密封，
所述的混流通道层包括培养基输入口、混流通道、第一盲孔和培养基回收口；
所述的液池层包括培养基蓄液池、第一通孔和第二通孔；其中培养基输入口用于输入培养基，混流通道将不同组分的培养基混合均匀，通过盲孔和第一通孔将混合好的培养基输入到液池层的培养基蓄液池；
所述的微孔阵列层上设有第三通孔；
所述的类人脑皮质培养层包含培养室、第四通孔和微孔阵列；培养室为类人脑皮质培养室；所述的培养基从培养室经所述的微孔阵列层流入培养基回收层；使培养基缓慢通过；
所述的培养基回收层设置培养基回收池和第二盲孔，培养基回收池底部具有坡度，培养基依次经过第二盲孔、第四通孔、第三通孔、第二通孔通过培养基回收口进行回收完成循环。
优选的，上述培养基回收池11底部坡度为1°。
优选的，所述类人脑皮质芯片材质为普通平板玻璃。
优选的，五层结构之间夹有同等外形橡胶密封圈，用于各层间的密封。
优选的，微孔阵列层6下方覆盖有PET多孔膜，用于缓冲培养基对类人脑皮质的压力。
第二方面，本发明基于所述的类人脑皮质器官芯片，还提出了一种在类人脑皮质器官芯片中原位生物3D打印类人脑皮质的方法，将培养基回收层与类人脑皮质培养层使用螺柱连接起来后固定在打印平台上，在培养室中注入明胶支撑浴，将载细胞生物墨水存储在生物3D打印机的针筒中，使用生物3D打印机直接将类人脑皮质原位打印在所述培养室的明胶支撑浴中；打印结束后原位封装芯片，然后灌流培养基，进行培养。
进一步的，芯片在组装前，使用120℃高温高压灭菌类人脑皮质芯片。
作为进一步的技术方案，在打印结束后，使用刮刀刮去多余的明胶支撑浴，依次安装微孔阵列层、液池层、混流通道层；将培养基接入到培养基输入口；将芯片放置于培养箱中培养。
作为进一步的技术方案，上述的生物墨水组分为海藻酸盐、明胶和透明质酸。
作为进一步的技术方案，所述生物墨水的制备方法包括以下步骤：分别将海藻酸盐、明胶、透明质酸分别加入缓冲液中溶解，再将细胞均匀分散到墨水中。
作为进一步的技术方案，所述生物墨水的具体制备方法如下：
第一步：将海藻酸酸钠溶解在1×PBS中，在设定温度下搅拌设定时间，使用超声分散仪进行脱气处理，得到海藻酸盐溶液；
第二步：将明胶、透明质酸溶解在1×PBS中，在设定温度下搅拌设定时间，使用超声分散仪进行脱气处理，得到明胶复合溶液；
第三步：使用紫外光照射海藻酸盐前体溶液设定时间灭菌，在设定温度环境下使用过滤器过滤灭菌明胶复合溶液；
第四步：在设定温度下将海藻酸盐溶液与明胶复合溶液按1:1混合得到生物墨水，将细胞分散在墨水中。
第三方面，基于上述的打印方法，本发明还提供了一种利用所述的类人脑皮质的3D打印方法得到的类人脑皮质，由三层相互联结的结构组成，其中底层为细胞纵向密集排布的组织板，中间层为稀疏的神经纤维束，底层为横向密集排布的神经组织板。
第四方面，本发明还提供了一种所述的类人脑皮质在神经药物筛选中的应用。
第五方面，本发明还提供了一种所述的生物墨水在用于修复神经损伤的材料或在类人脑皮质制备中的应用。
本发明中提供的一个或多个技术方案，至少具有如下技术效果或优点：
1、本发明提出的类人脑皮质芯片，使用双层多孔膜隔开培养室模仿了人脑颅腔结构，外接流动培养基可提供低剪切应力促进类人脑皮质成熟；芯片体积小，加工成本低，应用方便。
2.通过悬浮浴打印方法直接在器官芯片中原位构建出具有复杂结构的类人脑皮质，打印后可以直接封装灌注培养，培养基流动模拟脑脊液循环，具有长期培养的能力。整个打印过程在细胞适宜的温度范围内进行。且本发明中的类人脑皮质生物墨水具有可调的弹性模量及孔隙率，支持神经细胞的生存。
3.在培养过程中，本发明的类人脑皮质芯片可以通过改变培养基组分研究药物对于类人脑皮质的作用，可广泛用于人脑皮质层的医学研究，对药物筛选有着重要意义。
4.本发明打印的类人脑皮质由三层互联的结构组成，真实的模仿了真实人大脑皮质的多层结构，所述的器官芯片具有培养大尺度类人脑皮质的能力。
附图说明
构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本申请的进一步理解，本申请的示意性实施例及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定。以下，结合附图来详细说明本申请的实施方案，其中：
图1为本发明类人脑皮质芯片结构示意图；
图2为本发明类人脑皮质芯片爆炸图；
图3为本发明类人脑皮质的结构示意图；
图4(a)为打印结构显微图像及免疫荧光染色后第一天细胞状态，
图4(b)为打印结构显微图像及免疫荧光染色后第七天细胞状态；
图5为打印结构的CCK8染色结果。
图中：1混流通道层、2混流通道、3盲孔、4液池层、5第一通孔、6微孔阵列层、8类人脑皮质培养层、10培养基回收层；11培养基回收池，12螺栓；13盲孔、14第四通孔、15微孔阵列、16第三通孔、17第二通孔、19培养基回收口、20培养基输入口。
具体实施方式
下面结合具体附图和实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“及/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
实施例1
本实施例公开了一种类人脑皮质芯片，该芯片的材质为普通平板玻璃，大小为50mm×30mm×11mm，且芯片在使用前需要在120℃下高温高压灭菌20min。
如图1、图2所示，类人脑皮质芯片上下依次层叠组装五层结构：混流通道层1、液池层4、微孔阵列层6、类人脑皮质培养层8、培养基回收层10，特别的，五层结构之间夹有同等外形橡胶密封圈，用于各层间的密封。
所述混流通道层1包括培养基输入口20、混流通道2，盲孔3、培养基回收口19；其中培养基输入口20用于输入培养基，混流通道2将不同组分的培养基混合均匀，通过盲孔3将混合好的培养基输入到培养基蓄液池18；
所述液池层4设有培养基蓄液池18、第二通孔17和第一通孔5。盲孔3经过第一通孔5与培养基蓄液池18连通。所述微孔阵列层6连通培养基蓄液池18与类人脑皮质培养层8，使培养基缓慢通过；
所述类人脑皮质培养层8包含培养室9、第四通孔14和微孔阵列15，培养室9为类人脑皮质培养室。
培养基由混流通道层1的培养基输入口20汇入，经混流通道2，于盲孔3、第一通孔5处流入液池层4，液池层4中的培养基经过微孔阵列层6流入类人脑皮质培养层8。
特别的，微孔阵列层6上下表面附有多孔弹性薄膜，用以缓冲培养基对类人脑皮质的冲击力。
培养基在经过类人脑皮质培养层8后，经由微孔阵列15流入培养基回收层10，在经由盲孔13、第四通孔14、第三通孔16、第二通孔17、培养基回收口19被回收。
特别的，上述的培养基回收池11底部坡度为1°。
优选的，所述类人脑皮质芯片材质为普通平板玻璃。
基于上述的芯片，本实施例还提供了一种生物3D打印制备类人脑皮质的方法，如下：首先，如图3所示，本实施例中的类人脑皮质由三层结构组成，大小为30mm×20mm×3mm，类人脑皮质共三层，类人脑皮质的底部一层为横向排列的神经纤维，中间一层为竖直的神经纤维束，顶部一层为纵向排列的神经纤维束。使用挤出式打印机将其打印至上述的芯片内，具体的打印方法如下：
首先将类人脑皮质器官芯片进行高温高压灭菌，120℃下20min烘干。
设置打印机低温平台的温度为15℃。将载细胞生物墨水转移至打印机针筒中，针筒温度设置为26℃，将墨水孵育10min。
将类人脑皮质培养层8与培养基回收层10使用螺柱12固定在一起，放置在生物3D打印机的低温平台上。将实施例1中制备的明胶支撑浴灌注在类人脑皮质培养层8的培养室9中。在规划完成打印路径后，直接将类人脑皮质打印到器官芯片中。
特别的，打印中使用的针头规格为25G，层高设置为0.2mm，打印速度为100mm/min，移动速度为900mm/min，回轴速度为2000mm/min，Brim Width为1mm，Brim speed为100mm/min，打印压力为30kpa。
打印结束后，使用刮刀刮去多余的支撑墨水，依次安装微孔阵列层6、液池层4、混流通道层1。将含有10％(w/v)胎牛血清，1％(w/v)青霉素/链霉素的培养基接入到培养基输入口20，将芯片放置于37℃，5％CO2的培养箱中培养。
进一步的，上述的载细胞生物墨水，是以海藻酸盐、明胶、透明质酸为单体组成的复合溶液，对应的制备方法如下：
第一步：将海藻酸酸钠溶解在1×PBS中，在37℃～40℃下搅拌2h，使用超声分散仪进行脱气处理，得到海藻酸盐溶液；
第二步：将明胶、透明质酸溶解在1×PBS中，在37℃下搅拌1h，使用超声分散仪进行脱气处理，得到明胶复合溶液；
第三步：使用260nm紫外光照射海藻酸盐前体溶液24h灭菌。在40℃环境下使用0.22μm过滤器过滤灭菌明胶复合溶液；
第四步：在37℃下将海藻酸盐溶液与明胶复合溶液按1:1混合得到生物墨水，以1×106ml-1的密度将细胞分散在墨水中。
在本实施例中，载细胞生物墨水的制备具体如下：
制备载细胞水凝胶前体溶液：
称取0.5g海藻酸钠粉末，溶解在10ml的1×PBS缓冲液中，使用磁力搅拌器以920r/min的速度搅拌2h，搅拌的同时将溶液加热至40℃(并保持在此温度)直至海藻酸盐完全溶解，得到5％(w/v)的海藻酸盐溶液。接下来使用超声波清洗器对海藻酸钠溶液脱气2min，然后转移至透明玻璃瓶中使用260nm紫外光照射24h灭菌。灭菌结束后转移至4℃环境下保存。
称取1.2g明胶粉末、4mg透明质酸，溶解在10ml 1×PBS中，使用磁力搅拌器以700r/min的速度搅拌1h，搅拌的同时将溶液加热至37℃(并保持在此温度)直至溶剂完全溶解，得到明胶复合溶液。搅拌完成后使用超声波清洗器脱气2min，使用0.22um过滤器过滤灭菌。
将制备好的海藻酸盐溶液和明胶复合溶液加热至40℃，以1：1的比例混合，使用漩涡振荡器混合均匀，墨水保持在40℃待用。
选择NE-4C小鼠神经干细胞，细胞在含有10％胎牛血清、1％青霉素/链霉素的培养基中培养。将培养物保持在37℃，5％CO2的加湿培养箱中，每隔一天换一次培养基。在配置生物墨水前，将细胞消化，计数细胞密度为3×106ml-1。按生物墨水中1×106ml-1的细胞密度吸取2ml细胞悬液，离心。吸取6ml生物墨水前体溶液吹散均匀细胞，配置成载细胞生物墨水。
进一步的，上述的明胶支撑浴在本实施例中的制备方法如下：
量取50ml超纯水，称取2.5g明胶颗粒，0.5g CaCl2颗粒，使用磁力搅拌器以700r/min搅拌1h，搅拌的同时将溶液加热至37℃。搅拌完成后使用超声波清洗器脱气2min，得到5％(w/v)明胶溶液。将明胶溶液转移至50ml离心管中，在4℃下孵育24h等待明胶固化。称取3g CaCl2颗粒，溶解在300ml超纯水中配置成1％(w/v)CaCl2溶液。接下来将固化好的明胶胶体切成10mm3的方块放入破碎机中，加入3倍体积的1％(w/v)CaCl2溶液，以10000r/min的速度破碎60s的到明胶颗粒溶液。使用离心机在2000g的离心力下离心明胶颗粒溶液，去除上清液。再次加入3倍体积的1％(w/v)CaCl2溶液，离心清洗明胶颗粒，得到明胶支撑浴。
实施例2
本实施例基于实施例1，进行细胞毒性实验，具体过程如下：
将载细胞生物墨水转移至打印机针筒中，针筒温度设置为26℃，将墨水孵育10min后进行打印。打印平台温度设置5℃，针头规格为22G，层高0.3mm，打印速度100mm/min，移动速度为900mm/min，打印压力为16kpa，打印三层网格结构，打印的尺寸为12.0mm×12.0mm，层高为0.3mm，间距1mm×1mm。
打印结束后使用1×PBS清洗支架2次，将支架转移至含有10％(w/v)胎牛血清，1％(w/v)青霉素/链霉素的培养基中培养。培养物放置在37℃，5％CO2的培养箱中。
在培养的1、3、5、7天使用活/死染色试剂盒对细胞活性进行分析。使用倒置荧光显微镜进行观测，如图4所示，使用ImageJ对活死、细胞进行计数。计算得到打印完成后细胞的存活率在96％以上，打印过程对细胞几乎没有影响，随着培养时间的延长，细胞保持着高的存活率，并且可以显著看到细胞大量增殖。
在培养的1、3、5、7天使用CCK8试剂盒测试了细胞的增殖状况。如图5所示，在打印后第一天和第三天的测试显示吸光度并没有太大的变化，细胞数量大致保持不变，这主要是由于打印过程细胞外环境的变化。第5天和第7天的测试显示吸光度出现了大幅增长，细胞大量增殖。这表明打印过程不会对细胞的状态造成不可逆的损伤，并且使用的生物材料具有很好的细胞相容性，能够支持细胞的增殖与迁移。
实施例3
将类人脑皮质器官芯片进行高温高压灭菌，120℃下20min烘干。在类人皮质芯片中打印类人脑皮质，一共构建A、B、C三个类人脑皮质芯片。将类人脑皮质芯片A的一个输入口连接微蠕动泵，泵入完全培养基培养，另一输入口用PDMS小塞塞住。将类人脑皮质芯片B的一个输入口连接到另一个微蠕动泵上，泵入添加了10ng/ml浓度神经生长因子(NGF)的完全培养基，另一输入口用PDMS小塞塞住。将类人脑皮质芯片C的一个输入口连接到另一个微蠕动泵上，泵入添加了10ng/ml浓度NGF的完全培养基，另一输入口通入气体，气压波形为方波，频率为60次/分。
在培养的第14天将器官芯片中的类人脑皮质取出。将类人脑皮质切片后进行免疫荧光染色，使用ImageJ对神经干细胞的突触长度进行测量，探究神经生长因子及压力对突触网络形成的作用。

Claims (10)

1.一种类人脑皮质器官芯片，其特征在于，该芯片由上而下包括混流通道层、液池层、微孔阵列层、类人脑皮质培养层、培养基回收层，相邻层之间通过密封圈密封；
所述的混流通道层包括培养基输入口、混流通道、第一盲孔和培养基回收口；
所述的液池层包括培养基蓄液池、第一通孔和第二通孔；其中培养基输入口用于输入培养基，混流通道将不同组分的培养基混合均匀，通过盲孔和第一通孔将混合好的培养基输入到液池层的培养基蓄液池；
所述的微孔阵列层上设有第三通孔；
所述的类人脑皮质培养层包含培养室、第四通孔和微孔阵列；培养室为类人脑皮质培养室；所述的培养基从培养室经所述的微孔阵列层流入培养基回收层；使培养基缓慢通过；
所述的培养基回收层设置培养基回收池和第二盲孔，培养基回收池底部具有坡度，培养基依次经过第二盲孔、第四通孔、第三通孔、第二通孔通过培养基回收口进行回收完成循环。
2.根据权利要求1所述的类人脑皮质器官芯片，其特征在于：所述的微孔阵列层下方覆盖有PET多孔膜。
3.在权利要求1-2任一所述的类人脑皮质器官芯片中原位生物3D打印类人脑皮质的方法，其特征在于，将培养基回收层与类人脑皮质培养层使用螺柱连接起来后固定在打印平台上，在培养室中注入明胶支撑浴，将载细胞生物墨水存储在生物3D打印机的针筒中，使用生物3D打印机直接将类人脑皮质原位打印在所述培养室的明胶支撑浴中；打印结束后原位封装芯片，然后灌流培养基，进行培养。
4.如权利要求3所述的类人脑皮质的3D打印方法，其特征在于，打印结束后，去除多余的明胶支撑浴，依次安装微孔阵列层、液池层、混流通道层；将培养基接入到培养基输入口；将芯片放置于培养箱中培养。
5.如权利要求4所述的类人脑皮质的3D打印方法，其特征在于，所述的类人脑皮质生物墨水组分为海藻酸盐、明胶和透明质酸。
6.如权利要求5所述的类人脑皮质的3D打印方法，其特征在于，所述类人脑皮质生物墨水的制备方法包括以下步骤：分别将海藻酸盐、明胶、透明质酸分别加入缓冲液中溶解，再将细胞均匀分散到墨水中。
7.如权利要求6所述的类人脑皮质的3D打印方法，其特征在于，所述类人脑皮质生物墨水的具体制备方法如下：
第一步：将海藻酸酸钠溶解在1×PBS中，在设定温度下搅拌设定时间，使用超声分散仪进行脱气处理，得到海藻酸盐溶液；
第二步：将明胶、透明质酸溶解在1×PBS中，在设定温度下搅拌设定时间，使用超声分散仪进行脱气处理，得到明胶复合溶液；
第三步：使用紫外光照射海藻酸盐前体溶液设定时间灭菌，在设定温度环境下使用过滤器过滤灭菌明胶复合溶液；
第四步：在设定温度下将海藻酸盐溶液与明胶复合溶液按1:1混合得到生物墨水，将细胞分散在生物墨水中。
8.利用权利要求3-7任一所述的类人脑皮质的3D打印方法得到的类人脑皮质，其特征在于，由三层相互联结的结构组成，其中底层为细胞纵向密集排布的组织板，中间层为稀疏的神经纤维束，底层为横向密集排布的神经组织板。
9.权利要求8所述的类人脑皮质在神经药物筛选中的应用。
10.权利要求6所述的类人脑皮质的3D打印方法中的生物墨水在用于修复神经损伤的材料或在类人脑皮质制备中的应用。
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