CN116802268A - 用于血小板生成的3d多孔结构的用途 - Google Patents

用于血小板生成的3d多孔结构的用途 Download PDF

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Abstract

提供一种用于体外血小板大规模生成的方法和装置。该方法使用血小板生成装置，血小板生成装置包括可旋转床反应器，其被配置为含有多孔材料用以从巨核细胞大规模生成血小板。

Description

用于血小板生成的3D多孔结构的用途
技术领域
本发明涉及体外血小板生成。具体地，本发明公开了一种从巨核细胞(MK)大规模生成血小板的方法和装置。
背景技术
血小板是小的无核血细胞，其功能是阻止出血。由于某些疾病、治疗或重大出血后使得其血小板数较低(血小板减少症)的病人需要进行血小板输血–这是一种拯救生命的产品。目前，唯一的来源是血液捐献。尽管如此，由于血小板只有五天的保质期，医院库存需要持续更新，而在已开发国家经常出现短缺问题(大约20％)(疫情传播、恶劣天气、假期期间等)，而在新兴国家有超过一半的需求无法得到满足。短缺议题可能导致错误配型的输血，可能造成输血效果不佳或不良事件，包括异体免疫反应。任何这类事件，对于需要血小板输血的脆弱患者群体在管理上是实质的难题，这与较长的住院时间、较高的住院成本和较低的存活率有关。体外生成血小板以用于治疗应用是一种吸引人的替代方案，但仍然是一项重大的技术挑战，尤其是关于在面向工业生产过程中的可扩展性。
血小板起源于成熟的巨核细胞。成熟的巨核细胞是在骨髓中发生的过程的结果，所述过程涉及多能造血干细胞向MK祖细胞的定型、这些祖细胞的增殖和分化、它们的多倍体化和它们的成熟。通过动态过程，成熟MK的细胞质形成长假足伸长(被称为前血小板)通过血管环境，以释放成盘形的血小板到窦状血管中。已经确立，血小板生成的“器官”不仅由骨髓构成，还包括肺部，其中MK可以流动依赖的方式直接在肺微循环中生成这些伸长物(等人；“肺是血小板生源的地点和造血祖细胞的储备库”；自然。2017年4月6日；544(7648):105–109)。已经进行许多设计专用于血小板生成的生物反应器的尝试。
基于骨髓环境模型的生物反应器通常有两个区域：一个是播种MK的地方，另一个是收集血小板的地方。从骨髓(MK区域)到血流(血小板区域)的动态途径被以不同方式模仿。
在2011年，Balduini及其团队报告了一种3D系统，这是第一个以研究MK迁移、附着到窦状血管、前血小板形成和血小板释放为目标的骨髓环境空间重建(Pallotta等人；“使用丝基血管针对巨核细胞和功能性血小板生成体外研究的三维系统”；组织工程：部分C方法。2011；17(12):1223-32)。丝微管(壁厚50μm±20μm以匹配前血小板长度，孔径2μm-8μm以允许前血小板)以从家蚕(Bombyx mori)茧纯化出的生物源蛋白聚合体此丝质纤维蛋白制备，然后涂上SDF1-α(一种化学趋化因子)和被不同蛋白所稀释的基底胶(温韦伯氏因子(VWF)、纤维蛋白原(FBG)或I型胶原)。来自脐血(CB)造血干细胞(HSCs)的3·105MK悬浮液被添加在胶原I凝胶准备物(模拟成骨区位)和被涂布的丝管外壁(模拟血管区位)之间的界面。在16小时的孵育后，7％±2％的植入MK通过微管壁延伸出前血小板(与VWF和FBG的组合)，并且大约200万个血小板在32μL/mL的流速(剪切速率～40/s)下被收集在于微管中输注的溶液中。在2015年，通过将丝管(壁厚50μm±20μm和孔直径22μm±4μm)嵌入被以ECM蛋白功能化的丝海绵(连接的孔从100μm到500μm直径范围)中以完全重建人类骨髓区位环境的生理状态，3D系统被改善(Di Buduo等人；“可编程3D丝骨髓区位用于体外血小板生成和巨核细胞生成病理学模拟”；血液。2015；125(14):2254-2264)。总共2.5·105成熟的源自CB的MK被植入到功能化的丝海绵中。16小时后，所述系统允许MK向血管迁移，黏附到外壁，24小时后前血小板被延伸进入微管的腔室中。通过在微管中以60/s的剪切速率输注培养基，血小板(140万)被回收。使用ECM组件来功能化多孔丝，诸如I型胶原、纤维蛋白、纤连蛋白、IV型胶原或层黏连蛋白，而微管则以纤连蛋白、IV型胶原和层黏连蛋白功能化。最近，同一团队(Di Buduo等人；“用于工程化骨髓结构和功能的模块化流动腔室”；生物材料。2017；146:60-71)开发了一种简化的系统，所述系统由一个模块化的矩形流动腔室组成，所述腔室固定住丝海绵(3.4×20×5mm；孔直径370μm±115μm)，所述丝海绵以细胞外基质成分功能化，所述细胞外基质嵌入在中央腔室中，所述中央腔室与入口和出口连接以允许系统输注。3-4·105个源自CB的成熟MK在功能化的丝支架中被植入24小时。在此期间后，当持续8小时以～90μL/分钟输注培养基时(即，平均壁剪切速率为1.9s-1)，流动允许血小板样微粒脱离并在出口处被收集。即使所述系统被描述为旨在扩大血小板生成，但所述出版物并未公开任何有关此目标的表现。此系统被进一步用作预测病人对药物反应的微型化骨组织模型，将干细胞(造血或诱导多能)，即MK的前驱体，植入在丝海绵中(Di Buduo等人；“微型化3D骨髓组织模型用于评估患者对血小板生成素受体激动剂的反应”；eLife 2021；10:e58775)。15天或更长时间后，允许干细胞扩展并分化为MK，少量(4·105)的血小板被生成。最后，Tozzi等人建议通过在丝海绵(孔径从117μm±4.9μm到126μm±3.7μm)中重新引入功能化通道(直径1mm)来改进此简化系统(Tozzi等人；“多通道丝海绵模拟骨髓血管区位用于血小板生成”；生物材料。2018；178:122-133)。大约1.5·106个CD41+CD42b+源自CB的MK被逐滴植入丝支架中(丝中有190MK/mm3)并培养36小时，直到在海绵中形成前血小板。然后，以10μL/分钟的流速输注6小时，允许在通道腔体内收集0.8-4.5·106的血小板。将通道添加到简化系统的原因是要重建骨髓的不同环境，即在海绵、空通道的壁和空通道之间引入不同的流动和剪应力。当流动被引入系统中时，在通道内观察到均匀的流动，而支架内的流动可以忽略不计，并且通道壁和丝海绵之间的剪切值有明显的转变。值得注意的是，生物反应器的设计避免了支架和生物反应器壁之间的“边缘流动”。所有这些丝装置集成了多个连续的生成步骤-植入MK以达到最终阶段的成熟(假足伸长)以形成前血小板，生成并收集血小板，使得用于规模放大的每个步骤的优化变得更加困难。例如，MK细胞在多孔材料中的植入密度是有限的，因为MK需要空间来延伸前血小板(Tozzi中190MK/mm3)，由此需要大量的材料。在Tozzi中，需要～1.3m3的丝海绵来生成3·1011个血小板，这是每次输血给病人的剂量，由此也需要大量的培养基和用于功能化丝海绵的产品。堆迭多个装置并不能解决大量所需消耗品，并使工业化变得复杂。
Avanzi等人也描述一个从干细胞生成血小板的整合系统(WO 2012/129109A2(纽约血液中心公司)2012年9月27日)。最后一步包含了一系列的血小板释放腔室。每个血小板释放腔室分为上腔室和下腔室，上腔室含有3D基质或支架(孔约在2μm到6μm之间，涂布了能够刺激前血小板形成和血小板释放的因子)，下腔室用于收集血小板。如同之前的系统，MK被植入在支架上。在此，两个独立的流动分别施加在上腔室和下腔室，以再次重建血管区位中MK成熟为前血小板的最后步骤以及血液流动中的血小板生成。上腔室中的前血小板形成和下腔室中的血小板收集进行大约1到2天。即使此系统在每个植入MK所收集的血小板数量上具有前景，通过腔室仅可植入少量MK(1·105)，释放出1到3.3·106个血小板(Avanzi MP等人；"新颖生物反应器和培养方法驱动从干细胞中生成血小板的高产率"；输血.2016；56(1):170-178)。
在2018年，Shepherd等人考虑建立结构逐渐改变的胶原支架，这不仅提供MKs结构支撑，还具有基于不同细胞大小的筛选能力(在上部区域中对最大细胞的高度可得，而在底部区域中对最大的细胞较不可得)(Shepherd JH等人；"应用于从源自人类多能干细胞的巨核细胞的血小板体外生成的结构逐渐变化的胶原支架：提高产量和纯度"；生物材料。2018；182:135–144)。MK细胞植入密度与先前系统在相同范围(在5mL的培养液中，向胶原支架中载入4·105个MK)，用于隔夜培养(19小时以上)。留在生物反应器中的每个巨核细胞所生成的血小板数量是29.2±15，但考虑所有引入装置的MK时，所述血小板数量则较低。另外，还对所生成的血小板的质量表达了担忧。
微流体装置也被提出，模仿骨髓血管内皮细胞的多孔结构。
Nakagawa等人公开了两种微流体生物反应器(Nakagawa等人；"生物反应器中的两种差异流动促使从源自人类多能干细胞的巨核细胞生成血小板"；实验性血液学。2013；41(8)：742-748)。在这些系统中，特定方向的流动对被困在多孔结构中的巨核细胞施加压力。第二种流动(主流动)被用于在多孔结构的出口处创造剪切应力以释放血小板。植入的MK数量较低(1.2·105)，每个植入的MK所生成的血小板数量也少于1。
Thon等人描述了一种2通道然后变为3通道的生物反应器，其具有培养基通道与上通道或下通道之间的壁，所述壁上穿刺有缝隙(0.1μm到20μm)(WO 2014/107240 A1(布里格姆和妇女医院公司)2014年7月10日；Thon等人；"血小板生物反应器芯片"；血液。2014；124：1857-1867；WO 2015/153451A1(布里格姆和妇女医院公司)2015年10月8日)。引入培养基通道的MK被推过间隙，其中它们被困住并接触到上通道和下通道的流动，使它们暴露于剪切应力。在此系统中，剪切速率范围较高(100-2500/s)，与先前系统相比，剪切速率的峰值出现在间隙连接处。在2小时中，每个巨核细胞的PLT产率为30，但引入系统的MK浓度较低，为1.9×104±1.3×104MK每ml，这是由于每个装置的缝隙/间隙数量有限。为了克服低容量的问题，系统被修改，如WO 2017/044149 A1(布里格姆和妇女医院公司)2017年3月16日所公开的，通过将"MK通道"(入口通道)和"血小板"通道(出口通道)之间的缝隙/间隙替换为形成微流体路径的可渗透膜(孔径在3μm和10μm之间)，至少将多个通道中的至少一个横向收缩，以允许对MK的压力和剪切应力进行解联接，并考虑并行的多个入口/出口通道。血小板从第一小时开始生成，在24小时的生成期间血小板数量会增加。然后，每个通道中都添加了重新流通流体的可能性，并且通过将通道拉长成S形或通过调整重新创建两种环境(巨核细胞储存容器和血小板储存容器)的单个储存容器生物反应器上的膜来增加膜的表面积(WO2018/165308 A1(血小板生物生成公司)2018年9月13日)。在所有这些改进中，原理都是相同的：膜孔的尺寸小于MK，以防止它们穿过膜，并且每个装置可以处理的MK数量受膜中可用的孔数量的限制。由此，所述系统通过堆迭多个装置来放大规模(WO 2020/018950 A1(血小板生物生成公司)23.01.202)。
最后，在2018年，Eto和合作者提出了新的培养系统，其没有两个隔室(US2021/0130781 A1(ETO等人)2021年5月6日；Ito等人；“湍流激活血小板生物生成以实现临床规模的体外生成”；细胞。2018；174(3)：636-648)。基于在小鼠骨髓上进行的体内观察，他们假设湍流是血小板释放的关键物理因素，除了剪切应力。他们开发了液体培养生物反应器，其中包括两个混合叶片，所述混合叶片固定在与电源轴水平的角度处，并且相互垂直。叶片重复上下往复运动，产生湍流、剪切应力和涡流。剪切速率在任何大小的生物反应器中都低于60/s。在含有组合试剂的基础培养基中，以1·105或2·105个imMKCL/mL，使从由诱导多能干细胞(iPSC)产生的不死化细胞系(imMKCL)衍生的MK在此生物反应器中进行了6至7天的成熟培养。以生物反应器中的8L，他们成功得到了1000亿个血小板。此液体培养方法允许更高量的MK被处理，但仍然是混合了MK成熟步骤和生成步骤，需要低初始浓度的MK。
超越骨髓生物模拟和更符合肺血管中的血小板生成的其他装置被开发出来。
Dunois-Lardé等人示出，人类成熟的MK在VWF表面上暴露于高剪切速率下，会导致细胞改变，造成在20分钟内释放出血小板(Dunois-Lardé等人；“将人类巨核细胞暴露于高剪切速率加速血小板生成”；血液。2009；27 8月27日；114(9)：1875-83)。然后，Blin等人开发了用于从引入微流体装置的MK体外生成血小板的快速方法(2小时)，所述装置由在并行微通道中分布的VWF涂布微柱的宽阵列组成，其中应用了独特的流动(Blin等人；“血小板生成器官的微流体模型：超越骨髓生物模拟”；科学报告。6，21700(2016))。在高剪切速率下，自由浮动的MK锚定在柱上，伸长为前血小板，然后释放血小板。悬浮液在装置中再循环，以便给未遇到柱的MK提供新的锚定机会。这个纹理表面由通道壁上的3D图案定义为平面中的六角形阵列盘，并且是一维阵列的柱(WO 2015/075030A1(PLATOD)，2015年5月28日)。为了克服因为堵塞的风险，在通道入口处更高密度的锚定的MK阻止处理高MK浓度的问题，提议在通道入口处从柱到柱的更大空间，以及更进入装置中更狭窄的空间(WO 2016/180918 A1(PLATOD)，2016年11月17日)。令人惊讶的是，在使用这种微柱多通道装置的实验中，增加微柱的高度，旨在为MK锚定提供额外的表面，并没有造成更高的血小板产率，而且它并没有允许增加输入MK的浓度/体积。
Kumon等人改造了弯曲形状的3D微通道，其高度沿流动路径逐渐减小，以捕获各种大小的MKs(Kumon等人；“使用三维微通道的芯片上血小板生成”；2018IEEE微机电系统(MEMS).2018:121-124)。被捕获的MK暴露于微通道中的流体力下，从而生成血小板。在这样的系统中，将通道的高度降低到5μm将迅速导致装置堵塞。
单流微流体系统提供了在非常短的期间同步生成血小板的可能性，但一个议题是，当大幅增加通道数量或堆叠装置以实现工业化生成时，每个通道中应用的高剪切速率需要不现实的大泵。
当考虑以合理的成本放大血小板生成规模时，最好的系统是能够处理大体积高浓度细胞的系统，这反过来又允许使用低量的培养基，并获得大量的血小板。血小板产率是另一个重要参数，但是对于相同生物反应器而言，(Ito等人；“湍流激活血小板生物生成以实现临床规模的体外生成”；细胞。2018；174(3)：636-648)，会根据许多其他因素而变化(例如，细胞类型、克隆、培养基等)。
发明内容
本发明涉及一种从巨核细胞中大规模生成血小板的方法和血小板生成装置。特别地，装置包括包括可旋转床反应器，所述可旋转床反应器含有多孔材料，所述装置被用于在短时间期间大规模生成血小板。
根据本发明的方法，可以在大约15分钟的短时间期间生成血小板。血小板生成可以持续长达12小时，优选地长达4小时。
如欧洲专利申请EP 21155887所公开的多孔结构，它们在此通过引用合并，包括巨孔材料。因此，多孔结构用作流动的障碍，并能够用作MK的锚定点。多孔结构为MK提供用于贴附的支架，同时当受到剪切应力时，保留足够的开放空间(孔)供MK伸长。当MK伸长时，然后它就形成血小板。多孔结构可以有一个孔密度的梯度，目的是增加血小板的生成。以此方式，就可以防止所有巨核细胞只根据流动方向贴附在微结构的入口处，并且由此最大化巨核细胞对多孔结构的占用。
据此，在本发明的实施例中，多孔材料被定义为含有孔(空洞、通道、间隙等)的材料。多孔结构可以是自然的或人造的。多孔材料可以是有机材料、无机材料、聚合物(塑料)、金属，陶瓷和非晶体。多孔材料可以包括两种或两种以上的材料的结合。多孔材料可以由一个含有孔的实体制成，或者可以是由几个颗粒、珠子、纤维或元素堆积在一起的组合。这些颗粒的组合形成巨孔结构，其中颗粒之间的空间构成孔。颗粒可以被粘合、熔合或胶粘在一起，或者它们可以只是紧邻靠近。多孔材料可以根据它们的结构有不同的其他命名：泡沫、纤维、气泡状泡沫材料、晶格或填充珠子。
在本发明的实施例中，多孔材料可以有不同的孔尺寸；也叫孔宽(直径)这是孔的两个相对壁的距离；从1μm到10μm，优选地从50μm到1μm。大部分的多孔材料可以有相同的孔尺寸或构成一个梯度的一个范围的孔尺寸(即不同的孔尺寸)。大部分的多孔材料可以由相同的材料或两种或更多种材料构成，其具有相同的孔尺寸或具有不同的孔尺寸。
在本发明的实施例中，多孔材料的孔可以是半闭合的或开放的，优选是开放的并且相互连接(通过孔或连接孔)，即没有尽端路或囊状(呈囊或袋的形状)。孔可以有不同的形状，例如漏斗形、圆柱形、不规则、墨水瓶形状或类似形状)。孔的截面形状可以是卵形的或多边形的(规则的或不规则的、平滑的或直的、凹的或凸的)。多孔材料的孔可以是有序的或不规则的排列或两者的混合。多孔材料可以用不同的方法制备。
在本发明的实施例中，多孔材料可以根据其孔隙率(总孔体积Vp与表观体积V的比率)基于单位体积的孔数分类为低孔隙率、中孔隙率或高孔隙率。一般而言，低孔隙率和中孔隙率的多孔材料具有闭合的孔。孔隙率可以从20％扩展到99.9％，优选地从80％扩展到99.9％。
在本发明的实施例中，多孔材料可以是刚性的或弹性的。一个更刚性的结构，由此在流动压力下变形较小，可以作为对MK抵抗流动剪切应力的更强的锚。
在本发明的实施例中，多孔材料可以涂布有对巨核细胞有亲和力的配体，例如，(i)温韦伯氏因子(VWF)或其功能变体，(ii)包含VWF片段的多肽，(iii)纤维蛋白原，(iv)纤连蛋白，(v)层粘连蛋白，(vi)IV型胶原蛋白，(vii)III型胶原蛋白，(viii)I型胶原蛋白，和(ix)玻连蛋白。
在一个实施例中，多孔材料通过以VWF或其功能变体的溶液进行培养被涂布。典型地，用于涂布固体相的VWF浓度在5μg/mL和100μg/mL之间。优选地，VWF的浓度在20μg/mL和40μg/mL之间。例如，多孔材料可以使用选自由重组野生型VWF或突变的VWF多肽所组成的群组的功能变体涂布，所述多肽在大肠杆菌或哺乳动物细胞中表达，作为单体或二聚体多肽。
在本发明的实施例中，血小板生成装置包括含有细胞悬浮液的容器，以及含有多孔材料的床反应器，其中床反应器被配置为当浸入细胞悬浮液中时旋转。例如，多孔材料包括棉纤维(100％有机棉)，所述棉纤维被切割成与床反应器可用空腔的尺寸相对应的薄层。
在本发明的实施例中，床反应器包括中空体，所述中空体包括从基板延伸到顶板的外周壁，从而在其间形成空腔以容纳多孔材料。
床反应器进一步包括通孔，所述通孔被设置在床反应器的中心处，从顶板延伸到基板，以便协助通过床反应器的流体流动(例如，细胞悬浮液的流动)。以此方式，细胞悬浮液能够经由通孔从床反应器的顶板和底板进入床反应器。
优选地，床反应器具有对称形状，例如，圆柱形状。
容器被配置为被顶板(头盖)封盖，从而形成腔室。例如，所述腔室被配置为被清空以产生被控制的气体组成。
床反应器被配置为能够附接到由转子控制的转子轴。例如，转子轴被配置为穿过在头盖中形成的中心孔。替代地，转子轴被配置为能够通过轴联接机构与头盖联接。
床反应器被配置为通过设置在床反应器的顶板上的连接器与转子轴连接。连接器中的开口被配置为引导细胞悬浮液的流动经由通孔进入床反应器。
细胞悬浮液可以直接添加到放置头盖之前的容器中。替代地，细胞悬浮液能够通过头盖中的开口被引入。
头板被配置为使用例如通过将头板夹紧在容器上的方式而被固定在容器上。
进一步，可以使用蠕动泵或其他流通泵将细胞悬浮液倒入或抽入容器中。
容器进一步被配置为被套住使用冷却或加热的夹套，以控制其中细胞悬浮液的温度。
床反应器包括由网状材料制成的外壁。替代地，外壁包括数个开口。
床反应器可以进一步包括内壁，其设置在中空体内并在其上形成多个开口。
容器可以以进一步包括设置其中的挡板，以确保流动通过床反应器的流通。
床反应器与容器的体积比例可以从仅大于1:1高至1:100，优选为从1:2至1:20。
例如，床反应器可以容纳多达28cm3的多孔材料，并被配置为装入500mL的容器中。特别地，此多孔材料与容器体积的比例被发现到有良好匹配。一般来说，也可以使用更高量的多孔材料。如果是这样，容器的体积也可以扩大。由此，能够选择除了28cm3的多孔材料和500mL的容器以外的其他值。
床反应器被配置为旋转，例如，可达1000rpm。
每立方毫米多孔材料的巨核细胞密度可以在10·103MK/mm3到100·106MK/mm3的范围内，优选在100·103MK/mm3到10·106MK/mm3的范围内。
在本发明的实施例中，使用血小板生成装置进行大规模生成血小板的方法可以包括以下步骤：
-将细胞悬浮液(即，含有成熟巨核细胞的溶液)添加到血小板生成装置的容器中；
-将多孔材料引入到血小板生成装置的床反应器中；
-将床反应器安装到转子轴上；
-将床反应器放入血小板生成装置的容器中；
-可选地，将容器以头盖封闭以便于维持被控制的气氛；
-以预定的速度旋转床反应器；以及
-可选地，收集细胞和血小板悬浮液的样品，例如，以固定期间，用以计数和特征化血小板和MK。
在本发明的实施例中，“细胞悬浮液”用于本发明的方法，例如，可以通过以下步骤获得：
-提供选自HSC(例如，来自脐带、周边血液或骨髓)、改造过的HSC或选自由胚胎干细胞、改造过的胚胎干细胞、诱导的多能干细胞和改造过的诱导多能干细胞组成的群组的干细胞；
-培养干细胞，即扩展细胞并将扩展的细胞分化为MK。
在本发明的实施例中，将多孔材料引入床反应器的步骤包括将床反应器的整个体积以块状形式填充。替代地，多孔材料被布置成数层几百微米的组合，其中多孔材料可以通过设置在床反应器内的中间壁来分隔，例如，与顶板和底板平行。例如，在容器的体积未被层状的多孔材料填充的情况下，床反应器可以被填充物填充，例如，塑料填充物，从而只通过层状多孔材料建立流动。
附图说明
下本发明将参考附图以示例的方式进行描述。
它显示在
图1A、1B：具有两种不同配置的大规模血小板生成装置的示意图：1A)穿过头盖中的孔的转子轴连接至床反应器；1B)经由轴联接机构联接至顶盖的转子轴连接至床反应器。
图2A-2C：2A)床反应器的3D示图。2B-2C)填充有多孔材料的床反应器的截面示图。箭头显示通过床反应器中心处的通孔的流动方向。2B)和2C)分别表示填充有块状多孔材料和层状多孔材料的床反应器。
图3A、3B：联接至下游分选装置的血小板生成装置的示意图。3A)下游分选装置通过管子和泵连接。3B)下游分选装置直接连接至血小板生成装置的容器。
图4：小规模血小板生成装置的示意图。采用聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)微机械加工而成的6.6mm×35.5mm×0.1mm空腔。
图5A-5C：用于实验的床反应器中的多孔材料的布置的示意图。5A)床反应器的横截面图，其中仅两层薄层多孔材料(例如棉花)被放置在床反应器的中间高度；5B)没有多孔材料的床反应器的横截面图；5C)填充有对称放置在床反应器中的两层多孔材料的床反应器的俯视截面图。
图3：实验结果指出，在生成实验开始时血小板数量的增加：大规模设置中床反应器的旋转速度对多孔材料的影响，并与包括多孔材料的小规模设置进行比较(平均值+/-SEM；n＝2)。
图4：实验结果指出，与具有多孔材料的小规模设置相比，具有多孔材料的大规模设置中血小板产率(在血小板生成开始时血小板最高数量与MK CD41/CD42+数量相比)增加(平均值+/-SEM；n＝2)。
图5：实验结果显示，在900rpm的旋转速度下，具有多孔材料的小规模设置和不具有多孔材料的大规模设置中血小板数量比较。
图6A、9B：激活时血小板的表征。在具有多孔材料的小规模生成设置和大规模生成设置中的生成终点时血小板的比较(平均值+/-SEM；n＝2)。
具体实施方式
为了生成血小板，巨核细胞(MK)最初是源自受限于巨核系列的造血祖细胞。
巨核细胞生成的主要信号是血小板生成素(TPO)、TPO受体激动剂或TPO模拟肽。TPO对于诱导骨髓内祖细胞分化为最终的巨核细胞表型是必须的。其他的用于巨核细胞分化的分子信号包括例如GM-CSF、IL-3、IL-6、IL-11、Flt-3配体、SCF。
MK祖细胞可以通过体外培养获得。
本文使用的术语“细胞悬浮液”表示含有通过体外培养获得的准备生成血小板的成熟MK的溶液。此细胞悬浮液也可以含有MK祖细胞、前血小板和血小板。
优选地，用于本发明方法中的所述“细胞悬浮液”是通过以下步骤获得的：
a)提供干细胞，例如选自HSC(例如，来自脐带、周边血液或骨髓)、改造过的HSC或选自由胚胎干细胞、改造过的胚胎干细胞、诱导的多能干细胞和改造过的诱导多能干细胞组成的群组的干细胞；
b)培养所述干细胞，即扩增细胞并使扩增的细胞分化为MK。
图1A和1B指示用于大规模生成血小板的血小板生成装置10、10'(即反应器)。
如图2B和2C所示，血小板生成装置10、10'包括被配置为含有细胞悬浮液14的容器12和被配置为容纳多孔材料30的床反应器16。
在安装状态下，床反应器16位于容器12中。
容器12可以用头板或头盖18封盖，从而形成腔室20。这样，可以控制腔室内的空气成分。例如，空气成分由5％的CO2组成。
为了控制细胞悬浮液14的温度，可以用冷却或加热夹套22套住容器12。替代地，任何其他适合的温度控制单元能够被用于控制温度。
例如，具有流通水热调节在37℃的夹套容器被使用。
细胞悬浮液14被直接添加到放置头盖18之前的容器12中。替代地，细胞悬浮液可以通过头盖18中的开口被引入。
进一步，能够使用蠕动泵或其他流通泵将细胞悬浮液14倒入或泵送到容器12中。
在实验结束时，能够使用容器底部处的排出口(未显示)将现在也含有生成的血小板的细胞悬浮液14从容器12中排出。
替代地，包括血小板的细胞悬浮液14能够通过插入容器12的管子从容器中抽出。
床反应器16被配置为浸入到细胞悬浮液14中。
床反应器16被配置为附接到由转子26控制的转子轴24上。以此方式，床反应器16能够以高速旋转。
如图1A所指出，转子轴24可以穿过头盖18中的一个中心孔。替代地，转子轴24可以通过轴联接机构27与头盖18联接。在此情况下，头盖没有中心孔。
例如，头盖能够通过夹紧工艺被固定在容器上。
图2A表示床反应器16的3D示图。图2B和2C分别表示填充有块状多孔材料30和层状多孔材料30的床反应器16的截面图。箭头显示流动方向。
床反应器16包括中空体，所述中空体包括从底板延伸到顶板的外周壁，使得在其间形成一个空腔以容纳多孔材料。
床反应器16进一步包括通孔，所述通孔被设置在床反应器的中心，并从顶板延伸到底板，以便促进如图2B和2C中箭头所示的经过此处的流动。
床反应器16被配置为通过被设置在顶板处的连接器25与转子轴24连接。连接器25中的孔洞允许流动穿过连接器25进入床反应器16的中心处通孔。
图2A表示床反应器16的外周外壁是由网状材料制成。替代地，外壁可以包括数个开口32。开口32的设置允许细胞悬浮液14与被容纳在床反应器16中的多孔材料30之间有更好的接触。
如图2B和2C所示，床反应器16可以进一步包括被设置在中空体内的内壁，所述内壁具有多个开口36，所述多个开口36形成于所述内壁上。通过允许当床反应器16旋转时，流动通过床反应器16流通，这可以进一步增强多孔材料和细胞悬浮液的接触。以此方式，床反应器的旋转诱导通过床反应器的径向流动。
在床反应器中设置中心通孔(从而允许流动从床反应器的顶部和底部侧面进入中心)，以及在内壁和外周外壁上的开口32、36确保了流动的路径，所述流动进入床反应器的中心处并在穿过多孔材料时径向离开床反应器。这反过来又通过床反应器16的所有高度造成最佳的流动分配。这种效果在圆柱形的床反应器中进一步提高。
为了保持腔室20的无菌，转子轴24也能够通过磁性轴的联接与床反应器16连接。
挡板28被设置在容器12中，以防止当以高速使床反应器16旋转时生成旋转和漩涡。这确保了流体通过床反应器16的流通。
当细胞悬浮液14径向穿过多孔材料30时，MK能够附着到多孔材料的微结构上。
被捕捉在多孔材料中的MK将受到剪切应力和/或拉力的作用。在剪切应力下，MK的细胞质伸长并形成血小板。转速越高，通过多孔材料的流速越高，造成的剪切应力越大。
通过多孔材料30的流速也与多孔材料的水压阻力成正比。
随着血小板被生成，它们会被释放到细胞悬浮液14中，并由流动携带，自由地在容器12中流通。
MK附着到多孔材料上，其通过细胞表面与多孔材料或其涂层(例如，归因于在其表面处的整联蛋白)的结合，或者被捕捉到多孔材料的空隙中。
MK的附着可以是是永久的或者可以不是永久的。MK可以从多孔材料中脱离，并在再次通过多孔材料时重新附着。
多孔材料30可以如图2B所示以块体形式填充床反应器16的整个体积。替代地，它可以如图2C所示被布置成数层的组合，每层几百微米，由中间壁34隔开，或者不由中间壁34隔开。
中间壁34的存在，虽然减少了床反应器16中用于多孔材料30的可用空间，但造成了额外的壁剪切速率。
床反应器16能够被放大规模以增加血小板产量。容器12将相应地放大规模以适应大床反应器16。优选地，床反应器能够具有从1mm3至多达1m3的体积。容器12必须足够大以适应床反应器，但它也能够更大。
床反应器和容器的体积比能够从仅大于1:1高至1:100，优选为1:2至1:20。
例如，床反应器16能够容纳多达28cm3的多孔材料30，并且能够适应500mL的容器12。
床反应器越大，惯性就越大，所以它能够达到的最大转速就越低。优选地，28cm3的床反应器可以旋转到高达1000rpm。
为了优化每个MK的血小板产率，每立方毫米的多孔材料中的MK密度需要在10·103MK/mm3到100·106MK/mm3的范围内，优选是在100·103MK/mm3到10·106MK/mm3的范围内。
如果床反应器和容器的体积比仅大于1:1，细胞悬浮液可以含有10·103MK/mL到100·106MK/mL。替代地，如果床反应器和容器的体积比是1:100，细胞悬浮液可以含有0.1·103MK/mL到多达1·106MK/mL。
归因于床反应器的高速旋转，细胞悬浮液以高速率通过多孔材料重新流通，最大化了MK附着到多孔材料和形成血小板的机会。以此方式，能够在有限的时间内进行血小板的生成。
从细胞悬浮液被引入到容器中并且床反应器开始旋转的那一刻起，血小板短至15分钟就被生成，而生成能够持续长达12小时，优选为4小时。
血小板的生成随着时间的推移而增加。这能够通过采样细胞悬浮液并以流式细胞仪或任何细胞计数器进行血小板计数来监测。随着时间的推移，血小板数量会增加，并且MK数量会减少。
血小板能够被以批量工艺生成或是以连续工艺生成。实际上，随着血小板生成的进行，MK数量会减少，能够向容器中添加更多的MK。
多孔材料可能是有机材料、无机材料、聚合物(塑料)、金属、陶瓷和非晶体。它们可以由两种或更多种材料的结合构成。根据它们的结构，多孔材料可以具有不同的另外命名：泡沫、纤维、泡沫状的材料、格栅或填充珠。
多孔材料可以具有不同的孔径，从1μm到10mm，优选从50μm到1mm。
大部分的多孔材料可以有相同的孔尺寸或构成一个梯度的一个范围的孔尺寸。大部分可以由相同的材料或两种或更多种材料的结合构成，其具有相同的孔尺寸或具有不同的孔尺寸。
例如，多孔材料是由100％的棉纤维制成的。
多孔材料可能被覆盖有对巨核细胞具有亲和力的配体，例如，(i)温韦伯氏因子(VWF)或其功能变体，(ii)包含VWF片段的多肽，(iii)纤维蛋白原，(iv)纤连蛋白，(v)层粘连蛋白，(vi)IV型胶原蛋白，(vii)III型胶原蛋白，(viii)I型胶原蛋白，和(viii)玻连蛋白。
多孔材料通过以VWF或其功能变体的溶液进行培养被涂布。典型地，用于涂布固体相的VWF浓度在5μg/mL和100μg/mL之间。优选地，VWF的浓度在20μg/mL和40μg/mL之间。
进一步，多孔材料可以使用选自由重组野生型VWF或突变的VWF多肽所组成的群组的VWF的功能变体涂布，所述多肽在大肠杆菌或哺乳动物细胞中表达，作为单体或二聚体多肽。
有利的是，旋转床反应器允许在无菌条件下工作。例如，所述反应器是无菌的。
根据本发明的生成多孔材料的方法可以包括对多孔材料的灭菌步骤。这个灭菌步骤可以在封闭反应器腔室之前或之后发生。
根据本发明的血小板生成装置可以进一步包括以下选择性手段，诸如：
(a)在血小板生成装置上游的上游分选器和/或混合器，用于富集具有巨核细胞的悬浮液并使所述巨核细胞悬浮液的细胞浓度均匀化，
(b)可选地来自血小板生成装置下游的分选器，用于通过从巨核细胞或其他细胞残留物中分选出血小板来纯化出流出悬浮液，
(c)可选地来自血小板生成装置下游的血小板浓缩器，用于浓缩出流出悬浮液。
上游分选器的使用(即巨核细胞分选器)可以有利于获得在MK族群方面均匀的悬浮液，并获得用于工业生成血小板的一致的产率和质量。特别是，上游分选器包括分离MK和血小板以及其他细胞残留物的装置。如下所述的常规细胞分选器能够用作下游分选器(例如血小板细胞分选器)，允许从10％到大约100％的预定义比例中获得MK富集的细胞悬浮液。
在血小板生成装置的出口处，流出物中含有生成的血小板，但它可能还含有裸露的细胞核和/或完整的MK。由此，将用于分离生成的血小板的装置放在血小板生成装置下游可以是有利的。常规的细胞分选器装置可以被使用，诸如洗脱转子或用于分离术技术的减少白血球过滤器。下游分选器也可以是用于大规模工业过滤的过滤装置，诸如膜过滤器、切向流过滤装置，诸如中空纤维或旋转过滤器。
分离步骤能够在血小板生成结束时发生，也可以在生成过程中的不同期间发生，或者在血小板生成期间的连续模式中进行。在血小板生成期间将血小板与MK分离，允许在它们形成时提取生成的血小板，从而防止它们在血小板生成装置中停留过久，这可能会影响它们的质量。
在批量过程模式中，下游分选器可以独立于血小板生成装置。在血小板生成结束时，使用泵将细胞和血小板悬浮液转移到细胞分选器装置。
在半连续或连续的过程中，下游分选器装置可以通过管子或管道与血小板生成装置的容器相连。
图3A显示下游分选器装置38，它通过管子40和泵42与容器12相连。在这种情况下，细胞和血小板悬浮液通过下游分选器装置38流通，并且在细胞分选器装置中分离出来的MK被重新引入到容器12中。
图3B显示另一种配置，下游分选器装置38直接与血小板生成装置10、10’连接，无需使用泵。在这种配置中，床反应器的旋转诱导被用于转移细胞和血小板悬浮液到细胞分选器装置的流动移位。
在血小板生成装置的出口或分选器的出口，流出悬浮液可以会被浓缩，以达到适合人体注射的血小板浓度。常规的细胞浓缩器装置可以被使用，诸如血液透析或切向流过滤装置。血小板被洗涤，以去除细胞培养基，然后血小板被重新悬浮于储存溶液中，诸如血小板添加溶液(PAS)，如PAS-A、PAS-B、PAS-C、PAS-D、PAS-E或PAS-G(Ashford等人；“血小板添加溶液的标准术语”；国际输血医学期刊；第98卷，第4期，(2010)。页577-578)，无论是否添加人类血浆。
本发明将鉴于以下非限制性示例进一步理解，这些示例仅供说明目的，并且也与附图相关。
示例
材料与方法
CD34+细胞培养与分化
通过免疫磁性技术(Miltenyi Biotec，巴黎，法国)从人类脐带血(CB)中分离出CD34+细胞，如同先前报告的(Poirault-Chassac等人，“Notch/Delta4信号抑制人类巨核细胞终末分化”；2010；血液12月16日；116(25):5670)。CD34+细胞在6孔培养板(Sarstedt，83.3920.500)，在37℃、5％ CO2的湿润环境中，使用完全培养基培养，所述完全培养基由Iscove改良的Dulbecco培养基(IMDM；Gibco生命科技，31980022)补充15％ BIT 9500血清替代品(干细胞科技，09500)，α-单硫代甘油(Sigma-Aldrich，M6145-25ML)和脂质体(3L-a-磷脂酰胆碱二棕榈酰(P0763-250MG)，胆固醇(C3045-5G)和油酸(O3880-1G)；SigmaAldrich以及来自PanReac的牛血清白蛋白(BSA)分离物V(A2244.0050))所组成。人类重组的干细胞因子(SCF)(6.25U/mL；Miltenyi Biotec，130-096-696)、白介素-3(IL-3)(10U/mL；Miltenyi Biotec，130-095-068)和血小板生成素肽激动剂(TPO)(10nM；由SigmaAldrich合成)于第0天就加入培养基。在第6天，细胞被离心并在补充了50nM TPO和0.5U/mLSCF的新鲜完全培养基中重新悬浮另外5至7天。
用于血小板生成的小规模设置
小规模生成装置
小规模血小板生成装置在所有示例中都作为对照(图4)。它是尺寸为6.6mm×35.5mm×0.1mm的、在聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)中微机械加工的空腔。所述空腔以PMMA制成的盖子封闭。所述空腔内填充有多孔材料，它具有一个入口和一个出口，所以它能够被连接到用于让细胞悬浮液通过多孔材料流通的蠕动泵。
小规模生成系统架构
细胞悬浮液被放入固定在一个轨道混合器(IKA MS3基本型)上的50mL尖底离心管，至少以300rpm旋转。蠕动泵(IPC8，ISMATEC，德国)用于让细胞悬浮液流过血小板生成装置。入口和出口管子都通到含有细胞悬浮液的相同容器中，导致MK重新流通。所述容器以有弹性的0.57mm ID管子(Tygon ST R-3607，Idex健康与科学，德国)连接到小规模装置的入口和出口。细胞悬浮液在0.94mL/分钟的速率下通过小规模装置流通2小时。小规模血小板生成的整个设置都由气体控制器(盒子，生命成像服务，瑞士)封闭在温度调控在37℃的腔室内。在血小板生成过程中，会定期以微量移液吸管从尖底离心管中收集细胞和血小板悬浮液样品，用于血小板和MK的计数和表征。
大规模血小板生成设置
大规模血小板生成装置是带夹套的500mL玻璃挡板容器(容器V2，Spinchem，瑞典)，所述玻璃挡板容器中放置有28cm3床反应器(RBR S2，Spinchem，瑞典)并且附接到转子轴(转子IKA RW 20数字)。转子能够达到1000rpm的转速。头盖具有其中有所述转子轴穿过的中心孔，头盖被夹紧在容器上。气体混合单元(CO2 Biobrick，生命成像服务，瑞士)在腔室中提供了以22L/小时的速率流动的含5％CO2的空气。绕在容器周围的夹套连接到设定为37℃的温度控制单元(Colora)，所述温度控制单元使经过温度调控的水通过夹套。
以多孔材料填满这整个28cm3的床反应器，将允许在生成过程中让多孔材料中的28·1011MK的浓度高达100·106MK/mm3。在这种情况下，MK的悬浮液在500mL的容器中的浓度高达的5.6·109MK/mL。
床反应器能够定制以容纳薄层多孔材料，以便研究多孔材料数量对血小板生成的影响。
在两个实验中，两个体积为179.61mm2×0.2mm的多孔材料薄层被放置在床反应器的中间高度(图5A)。床反应器的其余部分以塑料插入物填满，使流动只能流过多孔材料薄层。多孔材料薄层形状为四分之一圆形，并在床反应器中对称地放置，如床反应器的垂直截面图所示(图5C)。因此，多孔材料的总量高出小规模血小板生成装置中多孔材料的总量3.2倍。
在另一个实验中，上述的床反应器没有使用多孔材料(图5B)。在血小板生成过程中，会定期收集细胞和血小板悬浮液样品，用于血小板和MK计数和表征。只有在样品收集期间，才会短暂地中断转子，并使用移液吸管进行样品收集。
多孔材料的制备
棉纤维(100％有机棉)被剪成薄层，与小规模和大规模装置的空腔相应的尺寸。
蛋白质表面处理
用于涂覆多孔材料的人类温韦伯氏因子(VWF)是Wilfactin(LFB，Les Ulis，法国)。它在磷酸盐缓冲液(PBS1X)中被稀释到40μg/mL，所述缓冲液不含钙和镁离子，并在小规模装置中输注到细胞悬浮液中，或者注入在多孔材料片体上，所述多孔材料片体旨在应用于大规模反应器。小规模装置和所述多孔材料片体在湿润腔体中4℃下孵育过夜。
细胞悬浮液的制备
在11、12或13天的培养后，将细胞从6孔板中收集，转移到50mL的试管中。细胞浓度由手动计数估计(使用马拉赛兹细胞计数室)。从这个初始细胞悬浮液中，收集5mL的体积，转移到50mL的试管中，用于小规模生成设置。因为大规模设置中棉纤维的量高出小规模设置中棉纤维的量的3.2倍，因此我们的目标是在用于大规模设置的细胞悬浮液中较高的约3.2倍的绝对细胞数。因此，据此调整细胞悬浮液，并补充IMDM(Gibco生命科技，31980022)，以达到200mL的体积，用于大规模血小板生成装置。
收集血小板的表征方法
使用流式细胞仪BD萤光Accuri C6 PLUS(BD生物科学，Le Pont de Claix，法国)对收集的血小板进行表征。血小板表面特异性抗原以荧光异硫氰酸酯(FITC)-结合抗人CD41(αIIb)和R-藻红蛋白(PE)-结合抗人CD42b(GPIbα)(两者来自Beckman Coulter，Villepinte，法国)进行分析。以荧光结合单克隆抗体在室温(RT)的黑暗中孵育血小板20分钟。使用FITC小鼠IgG1(Beckman Coulter)、PE小鼠IgG1(BioLegend，圣地亚哥，加州，美国)执行对照。血小板被定义为获得的事件，即(i)小于7μm(基于前向散射特性和校正珠(来自Spherotech，利伯蒂维尔，伊利诺州，美国)的闸控)和(ii)CD41和CD42b标记的双阳性(CD41+/CD42b+)。
使用FITC-结合抗人激活αIIbβ3(PAC1克隆)(BD生命科学)和别藻蓝蛋白(APC)抗人CD62P(BD生命科学)评估收集的血小板的激活，并在生成结束时收集血小板(小规模设置为120分钟，大规模设置为180分钟)。在自制的Tyrode's缓冲液中激活血小板(140mM NaCl，1mM MgCl2，10mM HEPES，1mg/mL牛血清白蛋白，5.5mM葡萄糖，2mM CaCl2 pH以NaOH调整到7.4)并与PAC1-FITC、CD62P-APC和CD42b-PE在黑暗中RT下孵育30分钟。激活是以(i)40μM凝血酶受体激活肽-6([TRAP-6],Bachem，布本多夫，瑞士)加100μM腺苷二磷酸([ADP]，MerckSigma Aldrich，圣路易斯，密苏里州，美国)，或(ii)佛波醇-12-肉蔻酯-13-乙酯([PMA]，Merck Sigma Aldrich)。使用Arg-Gly-Asp-Ser([RGDS]，Merck Sigma Aldrich)、PE小鼠IgG1(BioLegend)和APC小鼠IgG1(Biolegend)进行对照。
结果
在同一天连续进行了两次实验，用以研究大规模设置中旋转速度的影响，并将大规模设置与小规模设置进行比较，两者均使用了多孔材料。在第一次实验中，引入到大规模设置中的悬浮液中MK CD41/CD42+的总数量为8.10·106，而小规模设置中的总数量为9.89·105，相对应地，在第二次实验中，大规模设置中的总数量为9.82·106，小规模设置中的总数量为1.15·106。在大规模设置中，反应器床首先以500rpm旋转60分钟，随后以900rpm旋转2小时。旋转速度的提高引起较高的通过多孔材料的流动速率。增加反应器床的旋转速度造成血小板产量的增加(图6)：在60分钟内，与500rpm相比，900rpm的平均血小板产量高出1.94倍。在大规模设置中，在900rpm的2小时实验期间，血小板的数量持续增加，而在小规模设置中，产量在60至90分钟之间达到最高，然后维持于高点。当考虑到每个设置生成的血小板的最大数量，即生成产率，即在实验开始时引入的MK CD41/CD42+数量与生成的血小板数量的比例，大规模设置比小规模设置高出6倍(图7)。
第三次实验比较了具有多孔材料的小规模装置和未含任何多孔材料的大规模装置中的血小板产量。以此方式，可以间接地使用相同的小规模对照来评估在反应器床中添加多孔材料是否有益。引入到大规模设置中的MK CD41/CD42+悬浮物的总数量为10.78·106，即与先前实验中的数量范围相同，而小规模设置中的数量为3.41·106。在大规模设置中，反应器床以900rpm旋转。在120分钟的时间内，与小规模装置相比，大规模设置中的血小板产量略高(图8)，但两种设置之间的差异远小于在大规模设置中添加了多孔材料的先前实验中观察到的差异。
在前两次实验结束时(小规模设置为120分钟，大规模设置为180分钟)，收集的血小板被以TRAP6+ADP或是以PMA刺激。激活终点，诸如P-选择素的表面表达(图9A)和与PAC1结合的纤维蛋白原受体αIIbβ3的激活(图9B)被监控。与基线(未刺激)相比，来自两种设置的血小板通过增加它们的P-选择素表达(对CD62P的阳性反应)和纤维蛋白原受体的激活(对PAC1的阳性反应)都对刺激作出反应。另外，对于这两种激活标记，与小规模设置相比，观察到具有多孔材料的大规模设置中生成的血小板的激活能力更好，这突出了大规模设置中生成的血小板的更高质量。

Claims (21)

1.一种用于从巨核细胞大规模生成血小板的装置(10，10')，包括：
容器(12)以及设置于其中的可旋转床反应器(16)，
其中，所述床反应器(16)被配置为含有多孔材料(30)并浸入被容纳在所述容器(12)内的悬浮细胞(14)中。
2.根据权利要求1所述的装置(10，10')，其中，所述细胞悬浮液(14)包括包括成熟的巨核细胞的溶液，并且其中所述多孔材料(30)包括泡沫、纤维、3D打印的多孔结构、编织的滤网、非编织的滤网、微载体、凝胶或水凝胶或填充珠。
3.根据权利要求1或2所述的装置(10，10')，其中，所述床反应器(16)包括设置于所述床反应器(16)中心的通孔，所述通孔用于促使所述细胞悬浮液(14)的流动通过床反应器(16)。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的装置(10，10')，其中，所述床反应器(16)包括中空体，所述中空体包括从基板延伸至顶板的外周外壁，并且其中所述外周外壁包括开口(32)或由网状材料制成，优选为所述中空体具有圆柱形状。
5.根据权利要求4所述的装置(10，10')，其中，所述床反应器(16)进一步包括多个内壁，所述多个内壁被设置于所述中空体内并从所述基板延伸至所述顶板，其中，所述多个内壁中的每个都包括在其上形成的多个开口(36)。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的装置(10，10')，其中，所述容器(12)被配置为以头盖(18)封盖形成腔室(20)，优选为所述腔室(20)被配置为可以清洗。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的装置(10，10')，其中，所述床反应器(16)被配置为经由连接器25附接到转子轴(24)，其中，所述连接器(25)包括多个孔洞，所述多个孔洞用于促使所述细胞悬浮液(14)进入所述床反应器(16)。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的装置(10，10')，其中，所述头盖(18)包括开口，所述开口用于将细胞悬浮液加入容器(12)。
9.根据权利要求8的装置(10，10')，其中，所述装置进一步包括泵，所述泵用于将所述细胞悬浮液(14)抽入所述容器(12)中，优选为所述泵包括蠕动泵。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的装置(10，10')，其中，所述容器(12)进一步被配置为可以被套住使用冷却或加热夹套。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的装置(10，10')，其中，所述床反应器(16)被配置为旋转高达1000rpm。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的装置(10，10')，其中，所述床反应器(16)进一步包括中间壁(34)，所述中间壁(34)被配置为设置在被布置于所述床反应器(16)中的多孔材料的多个层之间。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的装置(10，10')，其中，所述容器(12)包括设置其中的挡板(28)。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的装置(10，10')，其中，所述床反应器和所述容器的体积比率从1:1变化到高达1:100，优选为从1:2变化到1:20。
15.根据权利要求1至14中任一项所述的装置(10，10')，其中，所述床反应器(16)包括高达28cm3的多孔材料，并且优选地，被配置为适合500mL的容器。
16.根据权利要求1至15中任一项所述的装置(10，10')，其中，每立方毫米的多孔材料中的巨核细胞密度在10·103MK/mm3至100·106MK/mm3的范围内，优选在100·103MK/mm3至10·106MK/mm3的范围内。
17.根据权利要求1至16中任一项所述的装置(10，10')，其中，所述多孔材料被涂覆有对巨核细胞有亲和力的配体，优选地所述配体包括温韦伯氏因子或其功能变体、包括温韦伯氏因子片段的多肽、纤维蛋白原、纤连蛋白、层粘连蛋白、IV型胶原蛋白、III型胶原蛋白、I型胶原蛋白或玻连蛋白。
18.一种使用根据权利要求1至17中任一项所述的血小板生成装置(10，10')大规模生成血小板的方法，包括：
-将细胞悬浮液(14)添加入到所述血小板生成装置(10，10')的容器(12)中；
-将多孔材料(30)引入到所述血小板生成装置(10，10')的床反应器(16)中；
-将所述床反应器(16)安装到转子轴(24)上；
-将所述床反应器(16)放入所述血小板生成装置(10，10')的容器(12)中；
-可选地将所述容器(12)以头盖(18)封闭以维持受控制的氛围；
-将所述床反应器(16)旋转到预定的速度；和
-可选地收集所述细胞和血小板悬浮液的样品用以计数和表征所述血小板和MK。
19.根据权利要求18所述的方法，其中，所述方法进一步包括通过以下步骤获得所述细胞悬浮液(14)：
-提供选自HSC、改造过的HSC或选自由胚胎干细胞、改造过的胚胎干细胞、诱导的多能干细胞和改造过的诱导多能干细胞组成的群组的干细胞；和
-培养干细胞以扩增细胞并使扩增的细胞分化为MK。
20.根据权利要求18或19所述的方法，其中，将所述多孔材料(30)引入所述床反应器(16)的步骤包括以所述多孔材料(30)的块体填充所述床反应器的整个体积。
21.根据权利要求18或19所述的方法，其中，将所述多孔材料(30)引入所述床反应器(16)的步骤包括将所述多孔材料(30)布置成数层的组合，每层几百微米，优选地，所述多孔材料的层被设置在所述床反应器(16)内的中间壁(34)分隔开。
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