CN117757627A - 器官芯片、器官芯片培养平台及其培养方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及器官芯片、器官芯片平台及其培养方法和应用，属于微流控技术和生物技术领域。本发明所提供的器官芯片可模拟体内环境，有助于细胞的培养及分换；通过将器官芯片、进液装置、高通量蠕动泵、框架装置、废液装置组装。构建得到了器官芯片培养平台，可使细胞处于动态培养环境中，适合多细胞有界面的培养，并提升了细胞的分化和矿化能力。所述的器官芯片和器官芯片平台可应用于建立骨重建系统中，且为骨类疾病的体外病理研究后续相关药物研发提供新思路。
Description
技术领域
本发明涉及器官芯片、器官芯片平台及其培养方法和应用，属于微流控技术和生物技术领域。
背景技术
微流控器官芯片，通常是一种多通道，包含可连续灌流腔室的3D细胞培养装置。微流控系统需要将带有微通道的芯片和流体驱动系统集成一体，方便研究人员利用芯片开展相关实验。器官芯片的本体是由研究人员按照所要模拟的实体器官的特点按照一定比例搭建的，其次是器官芯片可以通过共培养模型，引入流体状态下类似于生理环境的剪切应力并添加细胞分泌物等各种仿生手段来模拟细胞在人体内的微环境。总的来说，器官芯片可模拟体内生理学和病理学，用于体外疾病建模、药物筛选和精准医学。微流控芯片因为诸多优势，如高通量，高精确度和灵敏度，样本和试剂的消耗量少，检测时间短等，在医疗诊断、运动竞技、食品安全、环境监测等诸多领域得到广泛应用。新药研发是一项漫长又艰难的路程，在医药界有着广为流传的“双十定律”，即一项能够推向市场的新药的问世，需要花费制药公司至少十年和十亿美金的成本。目前人们普遍采用的临床前实验模型是培养皿或者动物实验，但这些模型都具有一定的缺陷导致研究失败，常规的细胞培养皿或者孔板这类2D静态培养方式，它们很难反应出细胞在人体内真实的生长状态，因为细胞只能在2D平面上静止的排列，缺乏血液的流动和细胞间的相互作用，无法形成组织或体内细胞所具有的相应功能。而动物实验也因为和人的种属差异和高成本以及一些伦理问题受到许多质疑。因此制药公司需要在临床前实验中寻找更科学的预测模型来降低药物研究的失败率。而微流控芯片由于其微米级的尺度和人体细胞的尺度接近，同时可以驱动流体进行动态操控实现对细胞的动态培养，使细胞的生长状态更接近人体内的生理环境，器官芯片能够体外模拟器官从而实现器官的关键生理功能，帮助研发人员测试新药的毒性和疗效，了解新药靶标的生物机制，并为研发人员提供新的疾病研究视角，因此基于微流控技术的器官芯片被认为是有望替代2D培养以及部分替代动物实验的一种有希望的体外培养模型，用于候选药物的验证、药物药理和毒理作用研究等。
发明内容
发明要解决的问题
目前用于细胞培养的模型，例如培养皿或动物实验均有一定的缺陷，难以用于体外细胞培养并展开相关的研究。
用于解决问题的方案
[1].一种器官芯片，其包含上基板和下基板，上基板、下基板的相对面上分别设置上通道、下通道；
所述上通道包括上交流段、从上交流段两端引出的上延伸段；
所述下通道包括下交流段、从下交流段两端引出的下延伸段；
上交流段、下交流段共线相贴，上交流段和下交流段的贴合面上设有分隔膜；上延伸段、下延伸段以交流段为基准，轴对称设置；
所述上延伸段的末端分别设置有第一贯通孔和第二贯通孔，使得所述上通道的两端通过第一贯通孔和第二贯通孔与上基板远离分隔膜的一侧表面连通；
所述下延伸段的末端分别设置有第一下通孔和第二下通孔，且所述第一下通孔和第二下通孔与所述下基板远离分隔膜的一侧表面不连通；
所述上基板设置有第三贯通孔和第四贯通孔，第三贯通孔和第四贯通孔均贯通上基板，所述第三贯通孔和第四贯通孔分别与第一下通孔和第二下通孔相对应。
[2].根据[1]所述的器官芯片，其特征在于，所述上延伸段、下延伸段在同一基板上的投影呈现为：顶角落在交流段端部的V形。
[3].根据[1]或[2]所述的器官芯片，其特征在于，所述第一贯通孔和第二贯通孔与第一下通孔和第二下通孔之间均不对应。
[4].根据[1]～[3]任一项所述的器官芯片，其特征在于，所述上交流段和下交流段分别占上通道和下通道的至少50％；优选为60％、70％、80％或90％。
[5].根据[1]～[4]任一项所述的器官芯片，其特征在于，所述上基板和下基板的基底材质为聚二甲基硅氧烷；
可选地，所述分隔膜为多孔膜，优选为PET多孔膜；
可选地，所述上通道和下通道内含有Matrigel基质胶；优选地，Matrigel基质胶的浓度为10μl/ml。
[6].一种器官芯片培养平台，其特征在于，所述器官芯片培养平台包含进液装置、高通量蠕动泵、框架装置、如[3]～[5]任一项所述的器官芯片和废液装置。
[7].根据[6]所述的器官芯片培养平台，其特征在于，所述进液装置、高通量蠕动泵、框架装置、如[3]～[5]任一项所述的器官芯片和废液装置通过导管依次连接；
可选地，导管经所述蠕动泵后，与所述器官芯片的第一贯通孔和第三贯通孔连接，进而分别与上通道和下通道连接；
可选地，所述废液装置通过导管与所述器官芯片的第二贯通孔和第四贯通孔连接，进而分别与上通道和下通道连接。
[8].一种利用器官芯片培养细胞的方法，其特征在于，使用[6]或[7]所述的器官芯片培养平台对细胞进行培养；
可选地，所述方法包括以下步骤：
接种细胞的步骤：将细胞按照2～8×106个细胞/ml的密度分别接种至所述器官芯片的上通道和下通道中，优选为5×106个细胞/ml，
细胞培养的步骤：将培养液按照1～60μl/min的速度分别灌注入上通道和下通道中，优选为30～50μl/min，更优选为40μl/min；
可选地，所述培养液中含有金属离子，优选地，所述金属离子包括钙离子、镁离子、锌离子、正三价铁离子、铜离子和锶离子中的至少一种；优选为锶离子，更优选地，锶离子的浓度为2.4mmol/L。
[9].根据[8]所述的方法，其特征在于，所述细胞选自成骨细胞、骨细胞、前体成骨细胞、巨噬细胞、骨髓间充质干细胞、内皮祖细胞、骨祖细胞和单核细胞中的至少一种；
可选地，将所述成骨细胞、骨细胞、前体成骨细胞、巨噬细胞、骨髓间充质干细胞、内皮祖细胞、骨祖细胞和单核细胞中的任意两种细胞分别接种至上述器官芯片的上通道和下通道中。
[10].如[1]～[5]任一项所述的器官芯片，或如[6]或[7]所述的器官芯片培养平台在建立骨重建系统中的应用；
可选地，与所述骨重建相关的细胞包括成骨细胞、骨细胞、前体成骨细胞、巨噬细胞、骨髓间充质干细胞、内皮祖细胞、骨祖细胞和单核细胞中的至少一种。
发明的效果
本发明提供的器官芯片可以模拟体内环境，利于细胞的培养和分化；通过构建包含器官芯片的器官芯片平台，通过新鲜培养液的不断输入及废弃培养液的排除，可使细胞处于动态的培养环境，并且满足多细胞有界面的培养，允许相关介质和生长因子进行交换且细胞不直接接触，与传统二维培养相比，和静态三培培养相比，提升了细胞的分化、矿化能力。本发明提供的器官芯片和器官芯片培养平台可应用在建立骨成重建系统中，具备装置简单、操作灵活、高通量、可控性强、成本低等优势，为骨类疾病的体外病理研究后续相关药物研发提供了新思路。
附图说明
图1为基于微流控技术的模拟体内骨微环境用以研究骨重建的器官芯片培养平台示意图。
图2为基于微流控技术的模拟体内骨微环境用以研究骨重建的器官芯片培养平台高分子基芯片和框架示意图。
图3为基于微流控技术的模拟体内骨微环境用以研究骨重建的器官芯片培养平台高分子基芯片组件示意图；A为器官芯片各组件示意图；B为器官芯片在下基板上的投影示意图。
图4为模塑法制备满足骨重建的器官芯片培养的剪切应力要求的运算仿真结果示意图。
图5建立骨重建模型有无流体情况下成骨细胞粘附分析；A：无流体和有流体表面细胞粘附形态的显微镜图像；B：粘附周长分析；C：细胞活力。
图6为细胞排列取向分析图；A：免疫荧光染色观察细胞网络状结构；B：用器官芯片进行细胞培养的不同排列方向的细胞占比；C：Transwell进行细胞培养的不同排列方向的细胞占比。
图7为ALP实验分析不同培养模型对MC3T3-E1细胞成骨分化的影响图；Control组代表MC3T3-E1细胞在传统细胞培养皿中无Sr2+干预培养；2D组代表在传统细胞培养皿中有Sr2+干预下培养细胞；Transwell组代表在Sr2+干预下使用Transwell培养细胞；OOC组代表在Sr2+干预下通过器官芯片进行细胞培养。
图8为不同方式培养3天和7天的成骨相关基因的qPCR分析；A：培养3天时各组细胞中qPCR分析结果；B：培养7天时各组细胞中qPCR分析结果。
图9为茜素红染色图；A：Transwell组染色结果图；B：OOC组染色结果图；C：茜素红定量；Control组代表MC3T3-E1细胞在传统细胞培养皿中无Sr2+干预培养；Transwell组代表在Sr2+干预下使用Transwell培养细胞；OOC组代表在Sr2+干预下使用器官芯片进行细胞培养。
图10为不同稀释浓度的基质胶对细胞生长的影响，A、B、C中Matrigel的浓度分别为10μl/ml、20μl/ml、40μl/ml。
附图标记说明
1 进液装置
2 导管
3 高通量蠕动泵
4 框架装置
5 废液装置
6 器官芯片
7 枪头
8 卡钳
9 第一贯通孔
10 第二贯通孔
11 第三贯通孔
12 第四贯通孔
13 上基板
14 分隔膜
15 下基板
16 交流段
16-1 上交流段
16-2 下交流段
17 上通道
18 第一上延伸段
19 第二上延伸段
22 下通道
23 第一下延伸段
24 第二下延伸段
25 分隔膜上的孔
具体实施方式
以下将详细说明本发明的各种示例性实施例、特征和方面。在这里专用的词“示例性”意为“用作例子、实施例或说明性”。这里作为“示例性”所说明的任何实施例不必解释为优于或好于其它实施例。
另外，为了更好地说明本发明，在下文的具体实施方式中给出了众多的具体细节。本领域技术人员应当理解，没有某些具体细节，本发明同样可以实施。在另外一些实例中，对于本领域技术人员熟知的方法、手段、器材和步骤未作详细描述，以便于凸显本发明的主旨。
如无特殊声明，本说明书中所使用的单位均为国际标准单位，并且本发明中出现的数值，数值范围，均应当理解为包含了工业生产中所不可避免的系统性误差。
本说明书中，使用“可以”表示的含义包括了进行某种处理以及不进行某种处理两方面的含义。
本说明书中，所提及的“一些具体/优选的实施方案”、“另一些具体/优选的实施方案”、“实施方案”等是指所描述的与该实施方案有关的特定要素(例如，特征、结构、性质和/或特性)包括在此处所述的至少一种实施方案中，并且可存在于其它实施方案中或者可不存在于其它实施方案中。另外，应理解，所述要素可以任何合适的方式组合在各种实施方案中。
本说明书中，应当了解，所附附图并非按比例地绘制，而仅是为了说明本发明的基本原理的各种特征的适当简化的画法。本文所公开的本发明的具体设计特征包括例如具体尺寸、方向、位置和外形将部分地由具体所要应用和使用的环境来确定。
在所附多个附图中，同样的或等同的部件(元素)以相同的附图标记标引。
在本发明的描述中，需要说明的是，术语“中心”、“纵向”、“横向”、“上”、“下”、“前”、“后”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“顶”、“底”、“内”、“外”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。
本说明书中，使用“数值A～数值B”表示的数值范围是指包含端点数值A、B的范围。
本说明书中，术语“器官芯片(Organ-on-chip，OOC)”，也称为微生理系统或“组织芯片”，是一种通过微芯片制造方法制造的微流体细胞培养设备。
以下对于本发明的技术方案进行详细说明：
本发明提供了一种基于微流控技术的模拟体内骨微环境用以研究骨重建的器官芯片以及包含该器官芯片的培养平台，该平台由进液装置、高通量蠕动泵、框架装置，高分子基芯片、废液装置五部分组成。进液装置由离心管和维持细胞生长分化所需的细胞培养液构成，用来给细胞培养装置提供液体微环境原材料；高通量蠕动泵作为培养系统的动力装置，采用电力驱动方式通过导管为细胞源源不断输送培养液，该蠕动泵共有六个通道，可一次性同时开启为六块芯片输送培养液并带走代谢废物；可折叠框架装置以支撑固定高分子基芯片，将芯片顶端与蠕动泵表面置于同一水平面，使芯片通道内液面相平，防止因导管重力产生的压强差在芯片通道内部产生气泡，为细胞培养造成伤害；高分子基芯片以固化型聚合物聚二甲基硅氧烷(Polydimethylsiloxane,PDMS)和聚对苯二甲酸乙二醇酯(polyethylene glycol terephthalate，PET)膜作为制作材料，以模塑法制作带有一定形状和尺寸的微通道芯片，并通过氧等离子体表面改性键合而自上而下的组装在一起，在芯片通道内加入Matrigel基质胶以模拟体内骨微环境中的细胞外基质，并选用小鼠前体成骨细胞MC3T3-E1和小鼠前体破骨细胞Raw264.7作为基础细胞在器官芯片中共培养，并利用含一定浓度的Sr2+条件培养基加以干预，以此构建骨重建模型，为骨类疾病的发病机制和药物治疗提供新的培养平台；本系统的建立为体外药物筛选提供了更接近人体模型的平台，为骨类疾病新药研发提供了新思路，并且其具有装置简单，操作灵活，高通量，可控性强，成本低等优势。
<器官芯片>
根据本发明的一些实施方案中，提供了一种器官芯片，其包含上基板和下基板，上基板、下基板的相对面上分别设置上通道、下通道；所述上通道包括上交流段、从上交流段两端引出的上延伸段；所述下通道包括下交流段、从下交流段两端引出的下延伸段。
在一些实施方案中，所述上交流段、下交流段共线相贴，上交流段和下交流段的贴合面上设有分隔膜；进一步地，上延伸段、下延伸段以交流段为基准，轴对称设置。
在一些实施方案中，所述上延伸段的末端(即，上交流段两端引出的两段上延伸段的末端，也即，上延伸段远离上交流段的一端)分别设置有第一贯通孔和第二贯通孔，使得所述上通道的两端通过第一贯通孔和第二贯通孔与上基板远离分隔膜的一侧表面连通。
在一些实施方案中，所述下延伸段的末端(即，下交流段两端引出的两段下延伸段的末端，也即，下延伸段远离下交流段的一端)分别设置有第一下通孔和第二下通孔，且所述第一下通孔和第二下通孔与所述下基板远离分隔膜的一侧表面不连通。
在一些具体的实施方案中，所述上延伸段和下延伸段在同一基板上的投影呈现为：顶角落在交流段端部的V形。
在一些具体的实施方案中，所述上延伸段包括第一上延伸段和第二上延伸段，下延伸段包括第一下延伸段和第二下延伸段；所述第一上延伸段与第一下延伸段组成V形组合通道，位于交流段的一端；所述第二上延伸段与第二下延伸段组成交流段另一端的V形组合通道。在一些可选的实施方案中，所述第一上延伸段和第二上延伸段分别与上交流段成45°夹角；所述第一下延伸段和第二下延伸段分别与下交流段成45°夹角。
在一些实施方案中，在器官芯片中，即，当上基板、分隔膜和下基板形成器官芯片时，第一贯通孔和第二贯通孔与第一下通孔和第二下通孔之间均不重叠(即，位置相互不对应)。
在一些实施方案中，所述上基板还设置有第三贯通孔和第四贯通孔，第三贯通孔和第四贯通孔均贯通上基板，所述第三贯通孔和第四贯通孔分别与第一下通孔和第二下通孔相对应。
所述第一贯通孔、以及第三贯通孔和第一下通孔分别用于向器官芯片中的上通道和下通道递送细胞培养液，例如第一贯通孔通过导管与进液装置连接，通过导管上设置的蠕动泵，将进液装置中的细胞培养液经第一贯通孔递送至上通道中。又如，第三贯通孔通过导管与进液装置连接，由于第三贯通孔与第一下通孔位置对应，通过导管上设置的蠕动泵，可将进液装置中的细胞培养液经第三贯通孔和第一下通孔递送至下通道中。
所述第二贯通孔、以及第四贯通孔和第二下通孔分别用于将器官芯片中的上通道和下通道中的代谢废物递送至废液装置，例如第二贯通孔通过导管与废液装置连接，将器官芯片中的上通道中的代谢废物经第二贯通孔递送至废液装置。又如，第四贯通孔通过导管与废液装置连接，将器官芯片中的下通道中的代谢废物经第二下通孔、第四贯通孔递送至废液装置。
在一些实施方案中，考虑到交换效率，所述上交流段和下交流段分别占上通道和下通道的至少50％(可以理解，50％指的是，上通道和下通道沿水平方向，即，上基板、下基板、分隔膜设置/放置的方向上的截面面积的50％)，优选为60％、70％、80％或90％。
在一些实施方案中，上通道和下通道用于培养不同的细胞。如后文将详述的，由于设置的分隔膜，上通道和下通道中培养的细胞在非直接接触的条件下共培养，以模拟体内微环境，尤其是体内骨微环境。
在一些可选的实施方案中，所述分隔膜为多孔膜，任何可保证细胞在膜上附着的同时能够交换上、下通道的流体物质、保证细胞不能通过通道而直接接触、营养物质可自由交换的多孔膜均可用于本发明。根据所构建的模型不同，选择的细胞不同，可以选择适合的多孔膜。示例性地，所述多孔膜为PET多孔膜，作为优选的，所述PET多孔膜的孔径不大于8um、厚度为23um、孔隙率为4×106，进一步优选孔径为0.4um、厚度为23um、孔隙率为4×106的PET多孔膜。
在一些具体的实施方案中，所述上基板尺寸为35mm×15mm×3mm，下基板尺寸为35mm×15mm×1mm；上交流段：长：20mm，宽1mm，深1mm；贯通孔：R＝0.75mm，深3mm；下交流段：长：20mm，宽1mm，深0.5mm；下通孔：R＝0.75mm，深0.5mm。
在一些优选的实施方案中，所述上基板和下基板的基底材质为聚二甲基硅氧烷。
在一些优选的实施方案中，所述上通道和下通道内含有Matrigel基质胶。通过Matrigel基质胶可形成具有生物活性的3D基质，从而模拟体内细胞基底膜的结构、组成、物理特性和功能，能够使体外细胞很好地附着于上述分隔膜上，并有利于体外细胞的培养和分化。示例性地，所述Matrigel基质胶的浓度为5～15mg/ml，进一步优选为10mg/ml。
<器官芯片培养平台>
根据本发明的一些实施方案，提供了一种器官芯片培养平台，所述器官芯片培养平台包含进液装置、高通量蠕动泵、框架装置、上述的器官芯片和废液装置。
在本发明中，进液装置用于存储维持细胞生长分化所需的细胞培养液，其用于细胞培养装置(即器官芯片)提供液体微环境原材料。对于进液装置的种类没有特殊的限制，可以是任何可以存储细胞培养液的容器，在一些实施方案中，进液装置可以是离心管，例如市售的15mL离心管、50mL离心管。在一些具体的实施方案中，离心管是封闭可拆盖的离心管。
在本发明中，对于蠕动泵没有特殊的限制，例如可以是任何可以运输液体的装置，例如调速型蠕动泵、流量型蠕动泵、分配型蠕动泵、定制型蠕动泵等。蠕动泵作为器官芯片培养平台的动力装置，采用例如电力驱动方式通过导管为从进液装置向器官芯片提供细胞培养液。
在一些实施方案中，进液装置通过导管与蠕动泵连接，进而连接器官芯片，从而通过蠕动泵，将进液装置中的细胞培养液经导管进入器官芯片，用于培养。
根据所培养细胞的不同，可以使用一个进液装置或多个培养装置。
在一些具体的实施方案中，导管经蠕动泵后，与器官芯片的第一贯通孔和第三贯通孔连接，分别与上通道和下通道连通。
在一些优选的实施方案中，蠕动泵为高通量蠕动泵，例如Mastterflex公司生产的型号78001-36的低流速高精度泵，该蠕动泵共有六个通道，可一次性同时开启为六块器官芯片输送培养液并带走代谢废物，提高效率。
在一些实施方案中，所述器官芯片位于框架装置上，所述框架装置的高度可调节，进而实现器官芯片高度的调节；示例性地，所述框架装置可以展开或折叠来调节高度。在一些优选实施方案中，通过调节框架装置的高度，使得放置于框架装置上的器官芯片的顶端与所述高通量蠕动泵在同一水平面，防止流体重力对细胞造成冲击、或因导管重力产生的压强差在芯片通道内部产生气泡，对细胞培养造成伤害。
在本发明中，废液装置用于容纳器官芯片中培养细胞的代谢废物。在本发明中，废液装置的种类没有特别的限制，例如可以是任何适合容纳液体的容器，示例性的，烧杯、废液缸等等。在一些优选的实施方案中，所述废液装置为封闭性装置，防止与外界空气接触以使细胞受到污染。
在一些具体实施方案中，废液装置通过导管与第二贯通孔和第四贯通孔连接，进而分别连接上通道和下通道。
在一些实施方案中，在使用器官芯片培养平台进行培养时，细胞培养液由进液装置，通过导管，经第一贯通孔，进入上通道，对作为上通道中的细胞的培养基，培养后，通过导管，经第二贯通孔流动至废液装置中。
类似地，在一些实施方案中，在使用器官芯片培养平台进行培养时，细胞培养液由进液装置，通过导管，经第三贯通孔，第一下通孔，进入下通道，对作为下通道中的细胞的培养基，培养后，通过导管，经第四贯通孔、第二下通孔流动至废液装置中。
在一些任选的实施方案中，所述进液装置、高通量蠕动泵、框架装置、器官芯片和废液装置通过导管连接。在一些实施方案中，为了模拟体内骨微环境，所述导管的内径可确保细胞正常通过即可；示例性地，所述导管的内径不大于0.25mm。
在一些可选的实施方案中，导管上还包含卡钳，可确保导管与蠕动泵的紧密连接，从而使液体的流动更为顺畅；优选地，每个导管上包含至少1个卡钳，更优选地，每个导管上包含至少2个卡钳。
<器官芯片培养方法>
根据本发明的一些实施方案，提供了一种利用器官芯片培养细胞的方法，其使用上述的器官芯片培养平台对细胞进行培养，具体包括以下步骤：
接种细胞的步骤：将细胞按照2～8×106个细胞/ml的密度分别接种至所述器官芯片的上通道和下通道中，优选为5×106个细胞/ml的密度。
细胞培养的步骤：将培养液按照35～45μl/min的速度分别灌注入上通道和下通道中，优选为40μl/min，在此持续灌注的速度下所产生的剪切应力为0.8～3Pa，更能满足模拟人体生理条件的骨细胞培养条件。
在一些实施方案中，在所述细胞培养的步骤中，所述培养液中还含有金属离子以促进成骨细胞分化和骨形成，例如，钙离子、镁离子、锌离子、正三价铁离子、铜离子、锶离子等均在在成骨细胞分化和骨形成过程中起到关键作用，有助于骨钙素的合成和分泌，以及骨基质的矿化。进一步地，对于所述金属离子，在培养细胞的体系中需要根据实际的细胞培养方案找到合适的浓度，其在一定的浓度下对成骨细胞分化具有促进作用，但过高的浓度可能会产生细胞毒性，影响成骨细胞的功能。在本发明一些示例性的实施方案中，所述培养液中含有锶离子(Sr2+)，使得细胞在含有一定浓度Sr2+的流体粘度范围内培养；优选地，Sr2+的浓度为2～5mM，更优选为2～3mM。
进一步地，将细胞在CO2培养箱中在5％ CO2、37℃条件下进行培养。
在一些实施方案中，所述细胞包括成骨细胞、骨细胞、前体成骨细胞、巨噬细胞、骨髓间充质干细胞、内皮祖细胞、骨祖细胞和单核细胞等。在一些具体的实施方案中，将所述成骨细胞、骨细胞、前体成骨细胞、巨噬细胞、骨髓间充质干细胞、内皮祖细胞、骨祖细胞和单核细胞中的任意两种细胞分别接种至上述器官芯片的上通道和下通道中。在一些示例性的实施方案中，所述骨髓间充质干细胞具有分化为成骨细胞的潜能，所述内皮祖细胞具有分化为成骨细胞的潜能，所述骨祖细胞具有分化为成骨细胞或破骨细胞的潜能，所述单核细胞具有分化为破骨细胞的潜能。
在一些优选的实施方案中，将所述成骨细胞、骨细胞、前体成骨细胞、巨噬细胞、骨髓间充质干细胞、内皮祖细胞、骨祖细胞和单核细胞中的任意两种细胞分别接种至上述器官芯片的上通道和下通道中。
进一步地，将成骨细胞、骨细胞、前体成骨细胞、具有分化为成骨细胞潜能的骨髓间充质干细胞、具有分化为成骨细胞潜能的内皮祖细胞和具有分化为成骨细胞潜能的骨祖细胞中的任一种接种至上通道或下通道中，将巨噬细胞、前体破骨细胞、具有分化为成骨细胞潜能的骨髓间充质干细胞、具有分化为破骨细胞潜能的骨祖细胞和具有分化为破骨细胞潜能的单核细胞中的任一种接种至另一通道中。在一些示例性的实施方案中，所述前体成骨细胞为MC3T3-E1细胞，所述巨噬细胞为Raw264.7细胞。
在一些任选的实施方案中，在对细胞培养前对上述器官芯片进行灭菌，首先将芯片放入75％乙醇中浸泡过夜，之后再将芯片通风处理8小时确保乙醇挥发干净，再使用紫外照射2小时灭菌，最后将芯片存放在培养皿内并放于超净台中，再在超净台中将进液装置、高通量蠕动泵、器官芯片、废液装置依次利用导管连接。
<器官芯片、器官芯片培养平台的应用>
根据本发明的一些实施方案，提供了所述的器官芯片或所述的器官芯片培养平台在建立骨重建系统中的应用，与所述骨重建相关的细胞包括成骨细胞、骨细胞、前体成骨细胞、巨噬细胞、骨髓间充质干细胞、内皮祖细胞、骨祖细胞和单核细胞等。
在一些具体的实施方案中，将所述成骨细胞、骨细胞、前体成骨细胞、巨噬细胞、骨髓间充质干细胞中、内皮祖细胞、骨祖细胞和单核细胞的任意两种细胞分别接种至所述器官芯片的上通道和下通道中。在一些示例性的实施方案中，所述骨髓间充质干细胞具有分化为成骨细胞的潜能，所述内皮祖细胞具有分化为成骨细胞的潜能，所述骨祖细胞具有分化为成骨细胞或破骨细胞的潜能，所述单核细胞具有分化为破骨细胞的潜能。在一些优选的实施方案中，将所述成骨细胞、骨细胞、前体骨细胞、具有分化为成骨细胞潜能的骨髓间充质干细胞、具有分化为成骨细胞潜能的内皮祖细胞和具有分化为成骨细胞潜能的骨祖细胞中的任一种接种至上通道或下通道中，将巨噬细胞、前体破骨细胞、具有分化为成骨细胞潜能的骨髓间充质干细胞、具有分化为破骨细胞潜能的骨祖细胞和具有分化为破骨细胞潜能的单核细胞中的任一种接种至另一通道中。
在一些示例性的实施方案中，所述前体成骨细胞为MC3T3-E1细胞，所述巨噬细胞为Raw264.7细胞。
进一步地，将所述述成骨细胞、骨细胞、前体成骨细胞、巨噬细胞、具有分化为成骨细胞潜能的骨髓间充质干细胞、具有分化为成骨细胞潜能的内皮祖细胞、具有分化为成骨细胞潜能的骨祖细胞、具有分化为破骨细胞潜能的骨祖细胞和具有分化为破骨细胞潜能的单核细胞按照2～8×106cells/ml的密度接种至所述器官芯片的上通道和下通道中，优选为5×106cells/ml的密度。
在一些可选的实施方案中，将培养液按照35～45μl/min的速度灌注入上通道和下通道中，优选为40μl/min，在此持续灌注的速度下所产生的剪切应力为0.8～3Pa，更能满足模拟人体生理条件的骨细胞培养条件。
为了保证细胞培养的无菌环境，器官芯片需进行灭菌处理后放置于超净台中，并在超净台中连接所述器官芯片平台中的各个元件，以确保细胞培养过程中不受杂菌的污染。
实施例
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1：器官芯片的制备
采用模塑法制备器官芯片，运用comsol软件对模拟骨细胞生长环境的通道形状和尺寸以及流速设置进行模拟运算，确定器官芯片的形状及尺寸。如图2～图4所示，器官芯片6包含上基板13和下基板15，在上基板13、下基板15的相对面上分别设置上通道17、下通道22。上通道17由上交流段16-1、从上交流段两端引出的第一上延伸段18和第二上延伸段19组成；下通道22由下交流段16-2、从下交流段两端引出的第一下延伸段23和第二下延伸段24组成。所述第一上延伸段18和第二上延伸段19分别与上交流段16-1成45°夹角；所述第一下延伸段23和第二下延伸段24分别与下交流段16-2成45°夹角。上交流段16-1、下交流段16-2共线相贴，上交流段16-1和下交流段16-2的贴合面上设有分隔膜14，上交流段16-1和下交流段16-2贴合形成器官芯片的交流段16。第一上延伸段18与第一下延伸段23组成V形组合通道，位于交流段16的一端；第二上延伸段19与第二下延伸段24组成交流段16另一端的V形组合通道。
在第一上延伸段18的末端设置第一贯通孔9、第二上延伸段19的末端设置第二贯通孔10分别作为液体注入孔和流出孔，且使得所述上通道17的两端通过第一贯通孔9和第二贯通孔10与上基板13远离分隔膜14的一侧表面连通；在上基板上还设置有第三贯通孔11、第四贯通孔12，第三贯通孔11和第四贯通孔12均贯通上基板13。在第一下延伸段23的末端设置第一下通孔、第二下延伸段24的末端设置第二下通孔分别作为液体注入孔和流出孔，且所述第一下通孔和第二下通孔与所述下基板15远离分隔膜14的一侧表面不连通。第一贯通孔9和第二贯通孔10与第一下通孔和第二下通孔之间不重叠。如前所述，第三贯通孔11和第四贯通孔12均贯通上基板，所述第三贯通孔11和第四贯通孔12分别与第一下通孔和第二下通孔相对应且连通形成通道。
上基板、下基板的尺寸分别为：
上基板：35mm×15mm×3mm，下基板：35mm×15mm×1mm。
上交流段：长20mm，宽1mm，深1mm；第一贯通孔、第二贯通孔、第三贯通孔和第四贯通孔：R＝0.75mm，深3mm；下交流段：长：20mm，宽1mm，深0.5mm；第一下通孔和第二下通孔：R＝0.75mm，深0.5mm。
第一上延伸段、第二上延伸段、第一下延伸段、第二下延伸段：长5mm，宽1mm，深1mm。
分隔膜选用PET多孔膜，具体选用孔径为0.4um、厚度为23um、孔隙率为4×106且为全透明的状态。
采用上基板、PET多孔膜、下基板自上而下的自组装方式，采用等离子体处理的方式对芯片组件进行化学改性从而使其能够常温键合，等离子体处理流程为：首先用异丙醇浸泡芯片和PET膜并在超声波清洗机中清洗2min，接着倒入去离子水振荡芯片，以彻底去除芯片上的灰尘；用镊子取出芯片和PET膜并置于数显红外烘烤灯下烘干芯片，将PDMS芯片和PET膜放在锡箔纸上，芯片有通道的一侧朝上，然后将锡箔纸置于等离子体清洗机的腔室中，旋紧开关；设置等离子体机的参数，包括：Power；Oxygen Rate；Time和VaccumSetpoint:<＝0.1torr；参数设置好后，点击等离子体机触控屏上的Vaccum按钮，机器抽真空完成后再点Start按钮，机器等离子体清洗结束按Vent按钮，机器放气结束后拿出芯片；最后将组合的芯片置于真空干燥箱中，80℃下加热30min，取出后保存在干燥防潮柜中备用。
实施例2：器官芯片培养平台的构建
如图1和图2所示，器官芯片平台包含共由进液装置1、高通量蠕动泵3、框架装置4、器官芯片6、废液装置5五部分组成。器官芯片6位于可折叠的框架装置4上，用以支撑和固定器官芯片6。将进液装置1、高通量蠕动泵3、器官芯片6、废液装置5依次利用导管2连接。
如图2所示，导管2与上基板上的各通孔之间通过枪头7连通，以防止导管变向滑开，并在导管两端分别设置卡钳8以固定导管，所述导管为BPT导管(Biocompatibleperistatic pump tubing，医用级蠕动泵硅胶管)的内径为0.25mm；所述枪头为200μl枪头。
应用例1
利用实施例2制备得到的器官芯片培养平台进行骨重建，并以2D细胞培养、Transwell细胞培养及传统细胞培养方法进行的骨重建作为对照。选用小鼠前体成骨细胞MC3T3-E1细胞系和小鼠单核巨噬细胞Raw264.7细胞系作为基础细胞。
1、器官芯片的细胞培养：
(1)芯片的灭菌处理
采用了物理法和化学法相结合的方式，首先将芯片放入75％乙醇中浸泡过夜，之后再将芯片通风处理8小时确保乙醇挥发干净，再使用紫外照射2小时灭菌，最后将芯片存放在培养皿内并放于超净台中备用。
(2)器官芯片培养平台的构建
按照实施例2的方式，在超净台中将各个装置进行连接，构建得到如实施例2所述的器官芯片培养平台。
(3)细胞的培养
将MC3T3-E1细胞和Raw264.7细胞分别置于含有10％胎牛血清和1％双抗的α-MEM培养基中、在37℃、5％CO2的细胞培养箱中培养至细胞密度为2～8×106个细胞(cells)/ml。
在器官芯片培养平台中引入Matrigel使细胞的生长状态更接近人体的环境。在使用Matrigel的初期尝试了不同的浓度，将MC3T3-E1细胞通过第一贯通孔以密度为5×106cells/ml接种至铺有不同浓度(10mg/ml、20mg/ml、40mg/ml)的固化Matrigel基质胶的芯片的上通道中，将Raw264.7细胞通过第三贯通孔接种至铺有对应浓度(10mg/ml、20mg/ml、40mg/ml)的固化Matrigel基质胶的下通道中，将芯片置于CO2培养箱中在5％CO2、37℃条件下进行细胞培养，期间通过进液装置和高通量蠕动泵以40μl/min的速度分别向上通道和下通道中灌注培养液(含有10％胎牛血清和1％双抗的α-MEM培养基)，培养24小时后用显微镜观察MC3T3-E1细胞在通道内的状态。
如图10所示，从左到右Matrigel的浓度分别为10mg/ml、20mg/ml、40mg/ml，从图10中的B和图10中的C看出细胞的生长出现部分团聚状，且通道中许多细胞消失了，猜测是由于基质胶的浓度过低在芯片中无法起到较好的促进细胞粘附的作用，因此造成部分贴壁不牢固的细胞随着流体的作用而流出通道(图10中箭头标出部分)。而图10中的A相比图10中的B和图10中的C细胞在通道内基本呈均匀的分散状态，因此选择稀释浓度为10mg/ml的Matrigel基质胶用于后续实验。
在筛选到合适的Matrigel基质胶浓度后，在器官芯片中铺设10mg/ml的Matrigel基质胶，按照上述步骤和条件利用器官芯片培养细胞，培养期间通过进液装置和高通量蠕动泵以40μl/min的速度分别向上通道和下通道中灌注培养液(含有10％胎牛血清和1％双抗的α-MEM培养基，以及2.4mmol/L的Sr2+)，共培养24h。
2、2D细胞培养
利用传统细胞培养皿培养细胞，具体为：将成骨细胞MC3T3-E1细胞和Raw264.7细胞分别在含有10％胎牛血清和1％双抗的α-MEM培养基中、在37℃、5％CO2的细胞培养箱中培养至细胞密度为2～8×106cells/ml；将成骨细胞MC3T3-E1细胞和Raw264.7细胞分别以密度为5×106cells/ml接种至培养基(含有10％胎牛血清和1％双抗的α-MEM培养基，以及2.4mmol/L的Sr2+)的培养皿中，置于CO2培养箱中在5％ CO2、37℃条件下进行细胞培养，共培养24h。
3、Transwell细胞培养
将MC3T3-E1细胞和Raw264.7细胞分别置于含有10％胎牛血清和1％双抗的α-MEM培养基中、在37℃、5％CO2的细胞培养箱中培养至细胞密度为2～8×106cells/ml，制备细胞悬液，将MC3T3-E1细胞以5×106cells/ml接种至Transwell上室中，将Raw264.7细胞以5×106cells/ml接种至Transwell下室(上室和下室中的培养基为含有10％胎牛血清和1％双抗的α-MEM培养基，以及2.4mmol/L的Sr2+)，置于CO2培养箱中在5％ CO2、37℃条件下进行细胞培养24h。
4、在传统细胞培养皿中无Sr2+干预条件下培养细胞
将MC3T3-E1细胞和Raw264.7细胞分别置于含有10％胎牛血清和1％双抗的α-MEM培养基中、在37℃、5％CO2的细胞培养箱中培养培养至细胞密度为2～8×106cells/ml，制备细胞悬液，将MC3T3-E1细胞以5×106cells/ml接种至培养皿中，用无Sr2+干预的条件培养基(含有10％胎牛血清和1％双抗的α-MEM培养基)培养，置于CO2培养箱中在5％CO2、37℃条件下进行细胞培养24h。
培养结束后通过显微镜分别观察通过器官芯片培养得到的MC3T3-E1细胞和通过传统细胞培养皿培养得到的MC3T3-E1细胞的粘附形态、统计细胞周长并测定细胞活力，结果如图5所示：细胞在两种不同培养模型上生长24小时的形态如图5中的A所示，从图中可以看出，在高倍率显微镜观察下，和传统细胞培养皿(无流体)相比，在器官芯片(有流体)中培养的MC3T3-E1细胞出现更多的丝状伪足；图5中的B和图5中的C中通过ImageJ软件对细胞粘附面积和周长进行分析，结果表明与传统细胞培养皿(无流体)相比，器官芯片(有流体)中培养的细胞具有更小的粘附面积和更大的粘附周长，这表明器官芯片微通道中的细胞表现出更细长的纺锤体形状，证明在器官芯片中，成骨细胞可以对流体剪切应力刺激做出响应。
通过免疫荧光染色观察培养结束后的细胞的排列，结果如图6所示：图6中的A显示7天的免疫荧光染色的结果可以看出器官芯片(含10μl/ml Matrigel基质胶，OOC)组中的成骨细胞和Transwell组相比，形成了更多的多孔网络状结构，并且在网络状结构中观察到了BMPR2蛋白的表达(Merge OOC组中的绿色荧光)，这一类似成熟成骨组织的网络状结构的形成意味着和静态结构相比，器官芯片的3D动态微环境条件下成骨细胞的分化受到了促进。图6中的B和图6中的C显示，和Transwell组相比，OOC组的细胞排列取向在流体影响下呈现出一定的朝向性，细胞骨架更多呈现出180°的取向的同时更少呈现出90°的取向(180°代表微流控系统中流体流动的方向)。因此可以证明在器官芯片模型中流体剪切应力影响了细胞的肌动蛋白骨架排列进而激活BMP通路影响骨形成，这和文献中报道的流体影响细胞肌动蛋白细胞骨架的方式与SMAD相互作用从而激活BMP/SMAD通路这一结论相一致。
ALP活性可以作为成熟成骨细胞表型的依据，而成骨细胞表型的成熟是能够生成3D成骨细胞组织的前提，因此，通过ALP实验分析不同培养模型对MC3T3-E1细胞成骨分化的影响，结果如图7所示：实验结果显示芯片系统(OOC)中MC3T3-E1细胞相较于2D细胞培养和Transwell体系表现出更强的ALP活性，相比Transwell模型，器官芯片中MC3T3-E1细胞的ALP活性值提高了12.1％，MC3T3-E1细胞在器官芯片的3D动态微环境中存在更显著的成骨分化行为，有更多的细胞分化成为成熟成骨细胞，更有生成3D成骨细胞组织的潜力。
通过实时荧光定量PCR对用不同培养方式3天和7天得到的细胞中的成骨相关基因进行测定，成骨相关基因包括ALP、OSX、COL1A1、SMAD1、BMPR2、OPN。结果如图8所示，培养7天时，在器官芯片(OOC)中培养得到的细胞中成骨相关基因BMPR2和OPN的表达量相比Transwell组均显著上调(图8中的B)。
通过茜素红染色实验研究器官芯片的3D动态微环境对成骨细胞矿化的影响，结果如图9所示，图9中的B显示的器官芯片组的矿化结节程度最显著，主要表现为可以明显观察到矿化结节聚集而且总量较高；而图9中的A显示的Transwell组相比总量差距不大。图9中的C中的定量统计和显微镜观察的矿化结节结果基本一致，器官芯片组的矿化活性值达到Transwell组的1.83倍。
综合以上结果表明，器官芯片组中的MC3T3-E1细胞表现出了最多的矿化结节，即3D动态微环境下MC3T3-E1细胞形成成熟矿化成骨细胞组织的能力优于2D静态微环境和3D静态微环境。
需要说明的是，尽管以具体实例介绍了本发明的技术方案，但本领域技术人员能够理解，本发明应不限于此。
以上已经描述了本发明的各实施例，上述说明是示例性的，并非穷尽性的，并且也不限于所披露的各实施例。在不偏离所说明的各实施例的范围和精神的情况下，对于本技术领域的普通技术人员来说许多修改和变更都是显而易见的。本文中所用术语的选择，旨在最好地解释各实施例的原理、实际应用或对市场中的技术改进，或者使本技术领域的其它普通技术人员能理解本文披露的各实施例。
Claims (10)
1.一种器官芯片，其包含上基板和下基板，上基板、下基板的相对面上分别设置上通道、下通道；
所述上通道包括上交流段、从上交流段两端引出的上延伸段；
所述下通道包括下交流段、从下交流段两端引出的下延伸段；
上交流段、下交流段共线相贴，上交流段和下交流段的贴合面上设有分隔膜；上延伸段、下延伸段以交流段为基准，轴对称设置；
所述上延伸段的末端分别设置有第一贯通孔和第二贯通孔，使得所述上通道的两端通过第一贯通孔和第二贯通孔与上基板远离分隔膜的一侧表面连通；
所述下延伸段的末端分别设置有第一下通孔和第二下通孔，且所述第一下通孔和第二下通孔与所述下基板远离分隔膜的一侧表面不连通；
所述上基板设置有第三贯通孔和第四贯通孔，第三贯通孔和第四贯通孔均贯通上基板，所述第三贯通孔和第四贯通孔分别与第一下通孔和第二下通孔相对应。
2.根据权利要求1所述的器官芯片，其特征在于，所述上延伸段、下延伸段在同一基板上的投影呈现为：顶角落在交流段端部的V形。
3.根据权利要求1或2所述的器官芯片，其特征在于，所述第一贯通孔和第二贯通孔与第一下通孔和第二下通孔之间均不对应。
4.根据权利要求1～3任一项所述的器官芯片，其特征在于，所述上交流段和下交流段分别占上通道和下通道的至少50％；优选为60％、70％、80％或90％。
5.根据权利要求1～4任一项所述的器官芯片，其特征在于，所述上基板和下基板的基底材质为聚二甲基硅氧烷；
可选地，所述分隔膜为多孔膜，优选为PET多孔膜；
可选地，所述上通道和下通道内含有Matrigel基质胶；优选地，Matrigel基质胶的浓度为10μl/ml。
6.一种器官芯片培养平台，其特征在于，所述器官芯片培养平台包含进液装置、高通量蠕动泵、框架装置、权利要求3～5任一项所述的器官芯片和废液装置。
7.根据权利要求6所述的器官芯片培养平台，其特征在于，所述进液装置、高通量蠕动泵、框架装置、权利要求3～5任一项所述的器官芯片和废液装置通过导管依次连接；
可选地，导管经所述蠕动泵后，与所述器官芯片的第一贯通孔和第三贯通孔连接，进而分别与上通道和下通道连接；
可选地，所述废液装置通过导管与所述器官芯片的第二贯通孔和第四贯通孔连接，进而分别与上通道和下通道连接。
8.一种利用器官芯片培养细胞的方法，其特征在于，使用权利要求6或7所述的器官芯片培养平台对细胞进行培养；
可选地，所述方法包括以下步骤：
接种细胞的步骤：将细胞按照2～8×106个细胞/ml的密度分别接种至所述器官芯片的上通道和下通道中，优选为5×106个细胞/ml，
细胞培养的步骤：将培养液按照1～60μl/min的速度分别灌注入上通道和下通道中，优选为30～50μl/min，更优选为40μl/min；
可选地，所述培养液中含有金属离子，优选地，所述金属离子包括钙离子、镁离子、锌离子、正三价铁离子、铜离子和锶离子中的至少一种；优选为锶离子。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述细胞选自成骨细胞、骨细胞、前体成骨细胞、巨噬细胞、骨髓间充质干细胞、内皮祖细胞、骨祖细胞和单核细胞中的至少一种；
可选地，将所述成骨细胞、骨细胞、前体成骨细胞、巨噬细胞、骨髓间充质干细胞、内皮祖细胞、骨祖细胞和单核细胞中的任意两种细胞分别接种至上述器官芯片的上通道和下通道中。
10.如权利要求1～5任一项所述的器官芯片，或如权利要求6或7所述的器官芯片培养平台在建立骨重建系统中的应用；
可选地，与所述骨重建相关的细胞包括成骨细胞、骨细胞、前体成骨细胞、巨噬细胞、间充质干细胞、内皮祖细胞、骨祖细胞和单核细胞中的至少一种。
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