CN117229918A - 一种无泵驱动液体灌注装置及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物技术领域，公开了一种无泵驱动液体灌注装置及方法，包括从上到下依次叠置为整体结构的顶层、第一中间层、第二中间层、第三中间层、第四中间层、第五中间层、第六中间层和底层；设置培养基储藏室、细胞培养室、一个与外界环境相通的液体蒸发室，用第一培养基通道将三个腔室连通起来并构成连通器；本发明使器官芯片内的细胞培养完全摆脱了对液体驱动力设备的依赖，凭借液体自蒸发作用和连通器原理，即可为芯片内部培养基流动提供驱动力，对培养室内的细胞进行培养基的更新和补充。
Description
技术领域
本发明涉及生物医学技术领域，具体涉及一种无泵驱动液体灌注装置及方法。
背景技术
细胞培养是生物研究的一个重要工具，一个多世纪以来，二维2D细胞培养物一直被用作体外模型，以研究细胞对来自生物物理和生物化学线索的刺激的反应。越来越多的证据表明，在某些情况下，2D系统可能导致细胞生物活性明显偏离体内反应。例如，癌症细胞的一些重要特征在2D培养中无法正确建模。与2D情况相比，三维（Three-Dimensional，3D）细胞培养允许生物细胞在所有三维环境中生长或与周围环境互动。事实证明，在三维模型中生长的细胞更具有生理相关性，并在一些生物机制的研究中显示出改进，在许多情况下，3D培养平台已被证明更有能力在体内诱导所研究的特定过程的类细胞命运。相关研究的结果表明，将细胞周围细胞外基质（ECM）的维度从2D增加到3D可以显著影响细胞增殖、分化、机械反应和细胞存活。总的来说，随着技术的发展，3D平台将可能成为越来越有吸引力的2D细胞培养替代方案。
传统的3D培养方式包括球体培养（Spheroid culture）、生物聚合物支架、预制3D打印支架、水凝胶、多层细胞薄片堆叠（Cell sheets）等，但这些3D培养方式均为静态3D培养，需要定期人为更换培养基以保持细胞的营养物质供应。器官芯片是利用微流控芯片技术在体外构建包含有多种细胞、功能组织界面、生物流体和机械力刺激等复杂因素的微缩人体器官模型。与传统3D培养方式不同，器官芯片中可以通过流道和腔室的设计，精确控制培养环境中的流体运动速度和流向，配合液流驱动力使芯片内的培养基产生流动，从而模拟体内血流、间质流等。为3D培养的细胞持续的更新和补充培养基，实现细胞的3D动态灌流培养。近年来，由于器官芯片可部分模拟体内器官微环境和功能，被广泛地应用于疾病模型构建、药物筛选和毒性测试等研究中。
常规的器官芯片动态灌流培养其芯片本身只设计培养室、液体流道、进液口和出液口，不包含培养基储藏室，培养基置于外部的储液管中。需要蠕动泵提供液体流动动力，将培养基泵入芯片当中，实现对芯片内培养基的更新补充。整套灌流装置需要将储液管，蠕动泵，硅胶管，器官芯片等组件依次连接成一个封闭的循环管路。这样的装置在连接过程中易出现接头匹配度不好导致的管路漏液、易导致培养箱污染，流速控制不当易产生气泡等问题，整个灌流体系的稳定性很差。且尽管蠕动泵通常支持4～8通道同时灌流，但依照此方式搭建的灌流系统每增加一组灌流管路，其复杂程度成倍提升，管路间错综复杂易产生管路缠绕、打结，绞管等问题。
目前有研究提出在实验中通过对芯片内通道结构进行特殊设计，芯片包括两个培养基储藏室和细胞培养室，培养室介于两个培养基储藏室中间，三者通过通道连接并构成连通器，通过摇床的摇摆运动使芯片内的液体随之摇晃，两个仓室的液面产生高低差，在连通器原理作用下，两个仓室的培养基相互流动，实现培养基的补充和更新，从而实现简单的器官芯片无泵动态灌流培养。但是这种方法仍需要一台摇床来为芯片提供液流动力，没有完全摆脱对设备的依赖；摇床还会占据培养箱内宝贵的培养空间。
发明内容
本发明针对现有技术存在的问题提供一种无泵驱动液体灌注装置及方法。
本发明采用的技术方案是：一种无泵驱动液体灌注装置，包括从上到下依次叠置为整体结构的顶层、第一中间层、第二中间层、第三中间层、第四中间层、第五中间层、第六中间层和底层；
顶层上设置有用于向细胞培养室注液的细胞培养室进液口、用于向第一培养基储藏室注液的培养基储藏室进液口和与外界连通的液体蒸发室出口，液体蒸发室出口顶上覆有0.22 μm微孔滤膜；
第一中间层上设置有第一培养基储藏室和液体蒸发室；
第二中间层上设置有与第一培养基储藏室对应的第二培养基储藏室和连通缓冲仓、液体蒸发室的第一培养基通道；
第三中间层上设置有与第一培养基储藏室对应的第三培养基储藏室和缓冲仓；
第五中间层上设置有连通第三培养基储藏室和缓冲仓的第二培养基通道；
第一培养基储藏室、第二培养基储藏室和第三培养基储藏室均连通，并与第二培养基通道连通；缓冲仓与第二培养基通道连通；缓冲仓通过第一培养基通道与液体蒸发室连通；
第六中间层上设置有细胞培养室，细胞培养室上表面覆有微孔PET膜；细胞培养室通过微孔PET膜与第二培养基通道进行物质交换。
进一步的，所述第四中间层上设置有培养基储藏室出液口和缓冲仓进液口；第三培养基储藏室通过的培养基储藏室出液口和第二培养基通道连通；缓冲仓通过设置在第四中间层上的缓冲仓进液口和第二培养基通道连通。
进一步的，所述第一培养基通道主体为多条细长的长条形通道，进液端和出液端均呈圆弧形；一端连通缓冲仓，另一端连通液体蒸发室。
进一步的，所述第二培养基通道主体为多条细长的长条形通道，进液端和出液端均呈圆弧形；一端连通培养基储藏室出液口，另一端连通缓冲仓进液口。
进一步的，所述细胞培养室进液口依次穿过第一中间层、第二中间层、第三中间层、第四中间层、第五中间层连通细胞培养室。
进一步的，所述细胞培养室进液口设置有两个，分别连通细胞培养室的进液通道和出液通道。
进一步的，所述第一培养基储藏室、第二培养基储藏室和第三培养基储藏室结构相同，均为圆角矩形或圆形；培养基储藏室进液口设置有两个，若第一培养基储藏室为圆角矩形，则培养基储藏室进液口设置在第一培养基储藏室对角线的两端；若第一培养基储藏室为圆形，则培养基储藏室进液口设置在第一培养基储藏室直径的两端。
进一步的，所述液体蒸发室出口的面积为0.32 cm2～4.5 cm2。
进一步的，所述顶层、第一中间层、第二中间层、第三中间层、第四中间层、第五中间层、第六中间层和底层采用透明材质，材料为以下材料的一种聚二甲基硅氧烷、聚苯乙烯塑料、聚碳酸酯塑料、聚甲基丙烯酸甲酯。
一种无泵驱动液体灌注装置液体灌注的方法，包括以下步骤：
通过细胞培养室进液口向细胞培养室注入待培养的细胞悬液；
通过培养基储藏室进液口向第一培养基储藏室、第二培养基储藏室和第三培养基储藏室内注满培养基；
将装置置于细胞培养箱中，随着液体蒸发室内的液体蒸发，第一培养基储藏室、第二培养基储藏室和第三培养基储藏室的液体通过第二培养基通道流向缓冲仓；缓冲仓内液体通过第一培养基通道流向液体蒸发室；装置内的液体单向流动，实现培养基流动和细胞培养室内营养物质交换。
本发明的有益效果是：
（1）本发明使装置内的细胞培养完全摆脱了对液体驱动力设备的依赖，凭借液体自蒸发作用和连通器原理，即可为装置内部培养基流动提供驱动力，对培养室内的细胞进行培养基的更新和补充；
（2）本发明通过不同大小的蒸发表面积即可实现对液体流量的控制，完全摆脱了装置对设备的依赖，装置自身即可实现动态3D灌流培养。
（3）本发明中通过在液体蒸发室顶层设置0.22 μm隔绝了外界环境对芯片内培养基的污染，保证了芯片内细胞培养的无菌环境。
（4）为了避免了液体蒸发室的培养基蒸发后，培养基中的一些无机盐类组分浓度过高，直接通过培养基通道向细胞培养室扩散，从而影响细胞培养，本发明中通过在液体蒸发室和培养基储藏室之间设置一个缓冲仓，使液体蒸发室内液体不直接与细胞培养室上方的培养基流道连通。
附图说明
图1为本发明结构示意图。
图中：1-顶层，101-培养基储藏室进液口，102-细胞培养室进液口，103-液体蒸发室出口，2-第一中间层，201-第一培养基储藏室，202-第一进液通孔，203-液体蒸发室，3-第二中间层，301-第二培养基储藏室，302-第二进液通孔，303-第一培养基通道，4-第三中间层，401-第三培养基储藏室，402-第三进液通孔，403-缓冲仓，5-第四中间层，501-培养基储藏室出液口，502-第四进液通孔，503-缓冲仓进液口，6-第五中间层，601-第二培养基通道，602-第五进液通孔，7-第六中间层，701-细胞培养室，8-底层，9-微孔滤膜，10-微孔PET膜。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步说明。
如图1所示，一种无泵驱动液体灌流装置，包括从上到下依次叠置为整体结构的顶层1、第一中间层2、第二中间层3、第三中间层4、第四中间层5、第五中间层6、第六中间层7和底层8；本发明中的各层是为了表述方便和制作方便而设置，在实际应用中其组合为整体结构，可以通过注塑等方法直接制备为整体结构。
顶层1上设置有用于向细胞培养室701注液的细胞培养室进液口102、用于向第一培养基储藏室201注液的培养基储藏室进液口101和与外界连通的液体蒸发室出口103，液体蒸发室出口103顶上覆有0.22 μm微孔滤膜9。
第一中间层2上设置有第一培养基储藏室201和液体蒸发室203；
第二中间层3上设置有与第一培养基储藏室201对应的第二培养基储藏室301和连通缓冲仓403、液体蒸发室203的第一培养基通道303；
第三中间层4上设置有与第一培养基储藏室201对应的第三培养基储藏室401和缓冲仓403；
第五中间层6上设置有连通第三培养基储藏室401和缓冲仓403的第二培养基通道601；
第一培养基储藏室201、第二培养基储藏室301和第三培养基储藏室401均连通，并与第二培养基通道601连通；缓冲仓403与第二培养基通道601连通；缓冲仓403通过第一培养基通道303与液体蒸发室203连通；
第六中间层7上设置有细胞培养室701，细胞培养室701上表面覆有微孔PET膜10；细胞培养室701通过微孔PET膜10与第二培养基通道601进行物质交换。
第四中间层5上设置有培养基储藏室出液口501和缓冲仓进液口503；第三培养基储藏室401通过的培养基储藏室出液口501和第二培养基通道601连通；缓冲仓403通过设置在第四中间层5上的缓冲仓进液口503和第二培养基通道601连通。
第一培养基储藏室201、第二培养基储藏室301和第三培养基储藏室401相连通使用时构成一个大的培养基储藏室。培养基储藏室可根据培养时间长短需求，设置大小底面积和厚度，以实现不同的体积容量，储藏室底面形状没有特殊要求，可以设计为圆角矩形或圆形，圆角结构有利于液体随张力充分充满储藏室空间，不易产生死腔。第一培养基储藏室201、第二培养基储藏室301和第三培养基储藏室401结构相同，均为圆角矩形或圆形；培养基储藏室进液口101设置有两个，若第一培养基储藏室201为圆角矩形，则培养基储藏室进液口101设置在第一培养基储藏室201对角线的两端；若第一培养基储藏室201为圆形，则培养基储藏室进液口101设置在第一培养基储藏室201直径的两端。
细胞培养室701优先设计为圆形，有利于注入的液体充满培养室，避免产生死腔。
液体蒸发室203优先设计为圆形，可根据培养所需的液体灌流流速调节圆形直径，从而调整蒸发表面积，以调节液体蒸发速度和蒸发量，进而调节第二培养基通道601内液体流速。微孔滤膜9孔径为0.22 μm，该滤膜通常用于过滤除菌，用于隔绝外界微生物进入芯片对类器官培养造成污染，微孔滤膜面积能够覆盖液体蒸发室的表面。
第一培养基通道303主体为多条细长的长条形通道，进液端和出液端均呈圆弧形；一端连通缓冲仓403，另一端连通液体蒸发室203。第二培养基通道601主体为多条细长的长条形通道，进液端和出液端均呈圆弧形；一端连通培养基储藏室出液口501，另一端连通缓冲仓进液口503。
细胞培养室进液口102依次穿过第一中间层2上的第一进液通孔202、第二中间层3上的第二进液通孔302、第三中间层4上的第三进液通孔402、第四中间层5上的第四进液通孔502、第五中间层6上的第五进液通孔602连通细胞培养室701。细胞培养室进液口102设置有两个，分别连通细胞培养室701的进液通道和出液通道。细胞培养室701优选设置为圆形结构，进液通道和出液通道设置在圆形直径的两端点处向外延伸形成，进液通道的进液端为圆弧状结构，出液通道的出液端为圆弧状结构。这种结构有利于液体随张力充满整个通道，避免产生气泡或死腔，培养基通道宽度根据细胞培养室表面积进行调整。
微孔PET膜10根据需要选择0.4 μm、3 μm、5 μm、8 μm等不同孔径，用于细胞培养、药物测试等不同功能，膜面积能够完全覆盖细胞培养室701表面积。
液体蒸发室出口103的面积为0.32 cm2～4.5 cm2。顶层1、第一中间层2、第二中间层3、第三中间层4、第四中间层5、第五中间层6、第六中间层7和底层8通过真空等离子键合的方法组合为整体结构。顶层1、第一中间层2、第二中间层3、第三中间层4、第四中间层5、第五中间层6、第六中间层7和底层8采用透明材质制造。透明材质包括但不限于聚丙乙烯塑料（PS）、聚碳酸酯塑料（PC）、聚丙烯酸甲酯（PMMA），也可以用柔性的聚二甲硅氧烷（PDMS）材质制作。
根据测试结果液体蒸发室出口103当面积大小为4.5 cm2时，液体蒸发速度为14～17.5 μL/h，当面积大小为2 cm2时，液体蒸发速度为6～10 μL/h，当面积大小为1 cm2时，液体蒸发速度为5～8.5 μL/h，当面积大小为0.32 cm2时，液体蒸发速度为2.5～4.2 μL/h，具体蒸发速度根据不同型号培养箱内部气流循环结构不同存在差异。培养基通道宽度可根据细胞培养室大小进行调整，深度可根据所需液体灌流流速进行调整。培养基通道液体灌流流速根据实际培养基通道宽度、深度、液体蒸发速度即可进行计算。
无泵驱动液体灌流的方法，包括以下步骤：
通过细胞培养室进液口102向细胞培养室701注入待培养的细胞悬液；
通过培养基储藏室进液口101向第一培养基储藏室201、第二培养基储藏室301和第三培养基储藏室401形成的培养基储藏室内注满培养基；
将装置置于细胞培养箱中，随着液体蒸发室203内的液体蒸发，培养基储藏室的液体通过第二培养基通道601流向缓冲仓403；缓冲仓403内液体通过第一培养基通道303流向液体蒸发室203；整个装置内的液体以相对恒定的速度保持单向流动，实现装置内培养基流动和细胞培养室701内营养物质交换。
本发明在装置中设置培养基储藏室、细胞培养室、一个通过液体蒸发室出口与外界环境相通的液体蒸发室，用第二培养基通道601将三个腔室连通起来并构成连通器。通过细胞培养箱中的37 ℃恒温条件对蒸发室内培养基的蒸发作用，蒸发室内液体量减少，在连通器原理作用下即可为装置内流体运动提供驱动力，使细胞培养室的液体流向蒸发室，进而培养基储藏室内的液体也会流向细胞培养室，从而实现装置内的培养基流动和细胞培养室内培养基的更新和补充。使器官装置完全摆脱了对任何液体驱动力设备的依赖，凭借液体自蒸发作用和连通器原理，即可为装置内部培养基流动提供驱动力，从而对培养室内的细胞进行培养基的更新和补充。为了避免了液体蒸发室的培养基蒸发后，培养基中的一些无机盐类组分浓度过高，直接通过培养基通道向细胞培养室扩散，从而影响细胞培养，本发明中通过在液体蒸发室和培养基储藏室之间设置一个缓冲仓，使液体蒸发室内液体不直接与细胞培养室上方的培养基流道连通。通过不同大小的液体蒸发室表面积即可实现对液体流量的控制，装置自身即可实现动态3D灌流培养。并且可作为一个模块整合到任意器官芯片中，具有良好的普适性。
Claims (10)
1.一种无泵驱动液体灌注装置，其特征在于，包括从上到下依次叠置为整体结构的顶层（1）、第一中间层（2）、第二中间层（3）、第三中间层（4）、第四中间层（5）、第五中间层（6）、第六中间层（7）和底层（8）；
顶层（1）上设置有用于向细胞培养室（701）注液的细胞培养室进液口（102）、用于向第一培养基储藏室（201）注液的培养基储藏室进液口（101）和与外界连通的液体蒸发室出口（103），液体蒸发室出口（103）顶上覆有0.22 μm微孔滤膜（9）；
第一中间层（2）上设置有第一培养基储藏室（201）和液体蒸发室（203）；
第二中间层（3）上设置有与第一培养基储藏室（201）对应的第二培养基储藏室（301）和连通缓冲仓（403）、液体蒸发室（203）的第一培养基通道（303）；
第三中间层（4）上设置有与第一培养基储藏室（201）对应的第三培养基储藏室（401）和缓冲仓（403）；
第五中间层（6）上设置有连通第三培养基储藏室（401）和缓冲仓（403）的第二培养基通道（601）；
第一培养基储藏室（201）、第二培养基储藏室（301）和第三培养基储藏室（401）均连通，并与第二培养基通道（601）连通；缓冲仓（403）与第二培养基通道（601）连通；缓冲仓（403）通过第一培养基通道（303）与液体蒸发室（203）连通；
第六中间层（7）上设置有细胞培养室（701），细胞培养室（701）上表面覆有微孔PET膜（10）；细胞培养室（701）通过微孔PET膜（10）与第二培养基通道（601）进行物质交换。
2.根据权利要求1所述的一种无泵驱动液体灌注装置，其特征在于，所述第四中间层（5）上设置有培养基储藏室出液口（501）和缓冲仓进液口（503）；第三培养基储藏室（401）通过的培养基储藏室出液口（501）和第二培养基通道（601）连通；缓冲仓（403）通过设置在第四中间层（5）上的缓冲仓进液口（503）和第二培养基通道（601）连通。
3.根据权利要求1所述的一种无泵驱动液体灌注装置，其特征在于，所述第一培养基通道（303）主体为多条细长的长条形通道，进液端和出液端均呈圆弧形；一端连通缓冲仓（403），另一端连通液体蒸发室（203）。
4.根据权利要求2所述的一种无泵驱动液体灌注装置，其特征在于，所述第二培养基通道（601）主体为多条细长的长条形通道，进液端和出液端均呈圆弧形；一端连通培养基储藏室出液口（501），另一端连通缓冲仓进液口（503）。
5.根据权利要求1所述的一种无泵驱动液体灌注装置，其特征在于，所述细胞培养室进液口（102）依次穿过第一中间层（2）、第二中间层（3）、第三中间层（4）、第四中间层（5）、第五中间层（6）连通细胞培养室（701）。
6.根据权利要求5所述的一种无泵驱动液体灌注装置，其特征在于，所述细胞培养室进液口（102）设置有两个，分别连通细胞培养室（701）的进液通道和出液通道。
7.根据权利要求1所述的一种无泵驱动液体灌注装置，其特征在于，所述第一培养基储藏室（201）、第二培养基储藏室（301）和第三培养基储藏室（401）结构相同，均为圆角矩形或圆形；培养基储藏室进液口（101）设置有两个，若第一培养基储藏室（201）为圆角矩形，则培养基储藏室进液口（101）设置在第一培养基储藏室（201）对角线的两端；若第一培养基储藏室（201）为圆形，则培养基储藏室进液口（101）设置在第一培养基储藏室（201）直径的两端。
8.根据权利要求5所述的一种无泵驱动液体灌注装置，其特征在于，所述液体蒸发室出口（103）的面积为0.32 cm2～4.5 cm2。
9.根据权利要求1所述的一种无泵驱动液体灌注装置，其特征在于，所述顶层（1）、第一中间层（2）、第二中间层（3）、第三中间层（4）、第四中间层（5）、第五中间层（6）、第六中间层（7）和底层（8）采用透明材质，材料为以下材料的一种：聚二甲基硅氧烷、聚苯乙烯塑料、聚碳酸酯塑料、聚甲基丙烯酸甲酯。
10.如权利要求1～9任一所述无泵驱动液体灌注装置液体灌注的方法，其特征在于，包括以下步骤：
通过细胞培养室进液口（102）向细胞培养室（701）注入待培养的细胞悬液；
通过培养基储藏室进液口（101）向第一培养基储藏室（201）、第二培养基储藏室（301）和第三培养基储藏室（401）内注满培养基；
将装置置于细胞培养箱中，随着液体蒸发室（203）内的液体蒸发，第一培养基储藏室（201）、第二培养基储藏室（301）和第三培养基储藏室（401）的液体通过第二培养基通道（601）流向缓冲仓（403）；缓冲仓（403）内液体通过第一培养基通道（303）流向液体蒸发室（203）；装置内的液体单向流动，实现培养基流动和细胞培养室（701）内营养物质交换。
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