CN118086053A - 一种自灌流培养板及使用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及细胞和/或类器官培养技术领域，公开了一种自灌流培养板及使用方法，包括多组培养单元，培养单元包括依次连通的培养基储藏室、培养室和通气孔；通气孔和培养室之间设置有灌流停止阀；灌流停止阀包括上部的连通部和均与其下端连通的进液通道和出液通道；所述培养基储藏室和通气孔均为漏斗状结构；培养基储藏室下端通过第一微流道连通培养室下端；培养室与第一微流道连接的对侧通过第二微流道连接进液通道；出液通道通过第三微流道连通与外界连通的通气孔；本发明不依赖外接设备提供液体驱动力，仅由培养板自身通过液体蒸发作用作为驱动力，即可进行动态灌流培养。
Description
技术领域
本发明涉及细胞和/或类器官培养技术领域，具体涉及一种自灌流培养板及使用方法。
背景技术
传统的细胞培养板主要由板体和板盖两部分组成，其板上设置有培养孔，在培养孔内加入培养基和/或基质胶后，即可对细胞和/或类器官进行培养。但传统的细胞培养板只能实现静态的细胞和/或类器官培养，其培养基为静止状态浸泡细胞和/或类器官。动态灌流式培养是指把细胞和/或类器官以及培养基一起加入培养容器后，在细胞和/或类器官增长和产物形成过程中，不断地将部分培养基取出，同时又连续不断地灌注新的培养基的动态培养方式，其优势是在进行3D细胞培养和（或）类器官培养时，能够更好的与3D立体结构内部进行物质交换，保证3D立体结构中心不会出现细胞和/或类器官因为缺乏营养物质出现坏死凋亡的情况。但常规的灌流式培养需要如蠕动泵、注射泵、管路等来为液体流动提供驱动力，培养体系较为复杂，不利于在常规细胞培养箱中搭建。
现有的培养板，如公开号为CN113773959A公开了一种类器官培养芯片和培养方法，所述类器官培养芯片包括：细胞培养板；类器官培养装置，设于所述细胞培养板内；所述类器官培养装置与所述细胞培养板之间形成培养基储液池；所述类器官培养装置包括：类器官培养装置本体、设于所述类器官培养装置本体内的类器官培养腔室和设于所述类器官培养装置本体两侧侧壁上的侧孔，所述类器官培养腔室与所述两侧侧壁上的侧孔相连通形成灌流通道，所述类器官培养腔室包括设于顶部的加样孔和设于底部的微孔，所述加样孔与微孔均与所述细胞培养板底部相连通。这种培养芯片基于现有的细胞培养板，通过设计插件模块化的芯片实现类器官的动态管理培养，但该方案中，其动态灌流培养仍然需要一台摇摆式摇床提供液体驱动力。
如公开号为CN107723236A公开了动态灌流培养系统，该动态灌流培养系统形成培养液的闭环的循环回路。该动态灌流培养系统包括：储液部，其用于存储在循环回路中循环流动的培养液；动力源，其提供驱动力以使得储液部内的培养液在循环回路中进行循环流动；以及灌流槽，来自储液部的培养液在动力源的作用下流入灌流槽内，各灌流槽的内部的收纳腔的尺寸能够根据灌流培养组织的尺寸而变化。储液部、动力源和至少一个灌流槽通过管路串联连通。提供了一种新型的三维动态灌流培养系统，该动态灌流培养系统通过自身的培养液的闭环的循环回路在实现体外生物制造类组织结构体的长期体外培养维持的状态下结构简单且能够被小型化。但是这种培养系统，液体驱动需要有专门的动力源，并需要管路串联连通，虽然整套动态灌流培养系统相对来说结构简单，较为小型化，但对于培养空间宝贵的细胞培养箱来说，整套系统仍然占用了大量空间，且难以进行彻底的灭菌处理，易导致细胞培养箱内出现污染。
发明内容
本发明针对现有技术存在的问题提供一种自灌流培养板及使用方法。
本发明采用的技术方案是：一种自灌流培养板，包括多组培养单元，培养单元包括依次连通的培养基储藏室、培养室和通气孔；通气孔和培养室之间设置有灌流停止阀；
灌流停止阀包括上部的连通部和均与其下端连通的进液通道和出液通道；
所述培养基储藏室和通气孔均为漏斗状结构；培养基储藏室下端通过第一微流道连通培养室下端；培养室与第一微流道连接的对侧通过第二微流道连接进液通道；出液通道通过第三微流道连通与外界连通的通气孔。
进一步的，所述培养基储藏室包括上部的储液部和下部的出液口，储液部直径大于出液口直径；通气孔包括上部的蒸发室和下部的进液口，蒸发室直径大于进液口直径；连通部的下端面与储液部和蒸发室的下端面位于同一水平面。
进一步的，所述培养室内套设有嵌套培养层；嵌套培养层下端面所在水平面高于培养室下端面所在水平面；嵌套培养层下部与第一微流道和第二微流道位置对应位置均设置有灌流孔。
进一步的，所述嵌套培养层上端面设置有限位槽，培养室上部对应位置设置有与限位槽相配合的限位桩。
进一步的，所述培养单元设置于培养孔内；培养孔设置于培养板架上，还设置有对应的培养板盖。
进一步的，所述第一微流道靠近培养基储藏室一端的直径小于靠近培养室一端的直径。
进一步的，培养板盖上对应通气孔位置设置有开孔，开孔表面覆有0.22 μm的微孔滤膜。
进一步的，所述灌流停止阀上部设置有硅胶塞。
一种自灌流培养板的使用方法，包括以下步骤：
步骤1：在培养室内接种细胞悬液或含有类器官的微滴；
步骤2：细胞贴壁或微滴固化后，从培养基储藏室加入培养基；
步骤3：培养基持续沿第一微流道、培养室、第二微流道、灌流停止阀、第三微流道流向通气孔；
步骤4：待培养基储藏室、培养室、通气孔液面高度相等，并加满后，放入培养箱进行培养。
本发明的有益效果是：
（1）本发明不依赖外接设备提供液体驱动力，仅由培养板自身通过液体蒸发作用作为驱动力，即可进行动态灌流培养；
（2）本发明可以将培养单元整合入常规的96、48、24、12、6孔细胞培养板中，也可以将培养单元整合入可拆卸培养孔内；将可拆卸培养孔设置于培养板架上，形成如常见酶标板的可拆卸培养板；从而发展出多种产品，更好的满足于不同用户需求。
（3）本发明中培养单元里的培养室的大小和孔位置严格保持与常规细胞培养板相对应，以保证该自灌流培养板在成像或检测时能够适配主流成像及检测设备。提高了该培养板的易用性和通用性；
（4）本发明中培养基储藏室、通气孔形状不一定为圆形，也可根据需要改为方形、长椭圆形等其他形状设计，从而调整培养基储藏室的储液体积或调整通气孔内液体的蒸发表面积，延伸出系列产品。用户可以根据自身需求选择在不换液的情况下维持更长时间的自灌流培养或不同灌流速度的自灌流培养板。
附图说明
图1为本发明培养单元结构示意图。
图2为本发明培养单元俯视图。
图3为本发明中常规细胞培养板的结构示意图。
图4为本发明中可拆卸酶标板的结构示意图。
图5为本发明中第二培养板架结构示意图。
图6为本发明中第一培养板架结构示意图。
图7为本发明培养单元中的液体流向示意图。
图8为本发明中嵌套培养层和硅胶塞的结构示意图，a为嵌套培养层正视图，b为嵌套培养层俯视图，c为硅胶塞正视图。
图9为本发明中灌流停止阀工作示意图。
图中：1-培养基储藏室，2-培养室，3-灌流停止阀，4-通气孔，5-嵌套培养层，6-硅胶塞，7-限位桩，8-第一微流道，9-第二微流道，10-第三微流道，11-灌流孔，12-限位槽，13-培养孔，14-微孔滤膜，15-第二培养板架，16-第一培养板架，17-培养板盖，18-开孔。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步说明。
如图1～2所示，一种自灌流培养板，包括多组培养单元，培养单元包括依次连通的培养基储藏室1、培养室2和通气孔4；通气孔4和培养室2之间设置有灌流停止阀3；上述腔室保持上述顺序即可，腔室布局不限于按照直线方式排列，可以根据需要自由调整腔室位置和布局。
灌流停止阀3包括上部的连通部和均与其下端连通的进液通道和出液通道；连通部和进液通道和出液通道，从上往下看呈“工”字形的隔板构成。这种结构能够尽可能的减小空腔体积，减少培养基消耗，同时保证液体流通。连通部高度与培养基储藏室1、通气孔4的漏斗状结构高度相等。当内液面位置随着蒸发降到与隔板高度相同时，停止蒸发，此时可以保证培养室2、培养基储藏室1内仍然保持有与隔板高度相等的液面，从而保证培养的细胞和/或类器官不会由于液体过度蒸发导致培养基干涸，起到一个自动安全阀的作用，如图9所示。
所述培养基储藏室1和通气孔4均为漏斗状结构；培养基储藏室1下端通过第一微流道8连通培养室2下端；培养室2与第一微流道8连接的对侧通过第二微流道9连接进液通道；出液通道通过第三微流道10连通与外界连通的通气孔4。
培养基储藏室1包括上部的储液部和下部的出液口，储液部直径大于出液口直径；通气孔4包括上部的蒸发室和下部的进液口，蒸发室直径大于进液口直径；连通部的下端面与储液部和蒸发室的下端面位于同一水平面。培养基储藏室1和通气孔4均为漏斗状结构，上部体积较大，下部为一条垂直通道。该设计能够缩小腔室体积，节约培养基用量，又能保证腔室内培养基完全流入通道内，不会出现液体残留。
培养室2内套设有嵌套培养层5；嵌套培养层5下端面所在水平面高于培养室2下端面所在水平面；嵌套培养层5下部与第一微流道8和第二微流道9位置均设置有灌流孔11。设置嵌套培养层5形成双层培养结构，用于不同种类器官和/或细胞共培养。培养室2底部可以为球形底，也可为正常平底。
如图8所示，嵌套培养层5上端面设置有限位槽12，培养室2上部对应位置设置有与限位槽12相配合的限位桩7。可以保证嵌套培养层5底部的灌流孔能够始终正对着第一微流道和第二微流道。
灌流停止阀3上部设置有硅胶塞6。限位槽12与限位桩7对应咬合，可以保证嵌套培养层5在嵌入培养室2内时保持固定的方向，使灌流孔11正对着第一微流道8和第二微流道9。
培养单元设置于培养孔13内；培养孔13设置于培养板架上，还设置有对应的培养板盖17。培养孔13可以是可拆卸形式形成可拆卸培养板，也可以将培养单元直接整合到常规的细胞培养板中形成不可拆卸的培养板。培养板盖17上有对应通气孔4的开孔18，开孔18上表面覆有0.22 μm的微孔滤膜。该微孔滤膜既能保证气体流通，以实现液体蒸发，又能隔离外接污染物，如细菌、真菌等对培养物的污染。如图6所示，图中表示的是在实际使用过程中同一阵列的通气孔4上的开孔18表面可以覆同一张膜。
第一微流道8靠近培养基储藏室1一端的直径小于靠近培养室2一端的直径。第一微流道8的变径结构，使得培养基能够同时通过馆流控和培养室2底部，流向灌流停止阀3，以保证在使用嵌套培养层5时，双层培养的细胞或类器官都能实现动态灌流式培养。通气孔4上表面开孔位置覆有0.22 μm的微孔滤膜14。
本发明的使用效果如图3～图5所示，可以作为常规细胞培养板也可以作为可拆卸酶标板使用。整个培养板可采用但不限于PP塑料、PS塑料等材料进行生产，既能按照常规细胞培养板的样式（一体成型）进行加工，如图3所示。也能按照常规酶标板的样式变成培养板架+可拆卸培养孔的模式如图4和图5所示，用户可根据实际需求自行装入相应数量的可拆卸培养孔以避免多余培养孔浪费。
一种自灌流培养板的使用方法，包括以下步骤：
步骤1：在培养室2内接种细胞悬液或含有类器官的微滴；可以根据需要选用或不选用嵌套培养层。若选用嵌套培养层也按照此步骤接种细胞悬液或类器官的Metrigel微滴。
步骤2：细胞贴壁或微滴固化后，如果选用嵌套培养层，将嵌套培养层5嵌入培养室2；从培养基储藏室1加入培养基；
步骤3：如图7所示，培养基持续沿第一微流道8、培养室2（若选择嵌套培养层5此处还包括嵌套培养层）、第二微流道9、灌流停止阀3、第三微流道10流向通气孔4；
步骤4：待培养基储藏室1、培养室2、通气孔4液面高度相等，并加满后，盖上培养板盖17放入培养箱进行培养。
在连通器原理的作用下，培养基会持续流向通气孔4，四个室内液面高度保持相等，直至液体加满，盖上培养板盖17。放入培养箱当中。由于培养箱内为37 ℃恒温环境，通气孔4内液体随温度开始逐渐蒸发，蒸发速率可达到100 uL/天，整块培养板可在不更换培养基的前提下保持动态灌流式培养3-5天。
本方案提供一种能够不依赖外接设备提供液体驱动力，仅由培养板自身通过液体蒸发作用做为驱动力，即可进行动态灌流培养的培养板，流速可以通过调整蒸发面积来进行调节。该培养板内每个自灌流单元设置有培养基储藏室1、培养室2、灌流停止阀3、与外界环境相通的通气孔4等四个主要腔室，四个腔室依次连通并形成连通器结构。通过细胞培养箱中的37 ℃恒温条件对通气孔内培养基的蒸发作用，通气孔4内液体量减少，在连通器原理作用下即可为培养板内流体运动提供驱动力，使培养基储藏室1的液体缓慢持续单向流向通气孔4，进而实现对培养室2内培养的细胞或类器官进行营养物质的更新和补充。其中，在培养室2和通气孔4之间的灌流停止阀3能够在通气孔4内液面位置随着蒸发降到与隔板高度相同时，停止蒸发，此时可以保证培养室2、培养基储藏室1内仍然保持有与隔板高度相等的液面，从而保证培养的细胞（类器官）不会由于液体过度蒸发导致培养基干涸，起到一个自动安全阀的作用。该自灌流单元的设计使该培养板完全摆脱了对任何液体驱动力设备的依赖，凭借液体自蒸发作用和连通器原理，即可为培养板内部培养基流动提供驱动力，模拟了体内环境中连续自然流动的血液循环过程，并实现对培养室内培养基的更新和补充。该自灌流单元中各腔室的孔径可与常见96孔板、48孔板、24孔板、12孔板、6孔板的培养孔孔径大小相对应，从而衍生出5种不同通量、培养室大小不同、灌流流速不同的自灌流培养板。其中，96孔板孔径大小的自灌流单元最多能够集成单块板24通量；48孔板孔径大小的自灌流单元最多能够集成单块板12通量；24孔板孔径大小的自灌流单元最多能够集成单块板6通量；12孔板孔径大小的自灌流单元最多能够集成单块板3通量；6孔板孔径大小的自灌流单元最多能够集成单块板1通量。此外，该自灌流单元在包含培养基储藏室1、培养室2、灌流停止阀3、与外界环境相通的通气孔4等基本结构的前提下，可将培养室2数量根据需要调整为1-3个。整个培养板的设计布局与现有常规细胞培养板的孔径大小、培养孔排列布局等完全一致，能够适配各种常规生物实验中的成像及检测仪器，如荧光倒置显微镜、酶标仪等。该培养板的设计充分考虑到行业内用户的使用习惯，大大降低了用户使用该培养板的学习成本。并且该培养板与现有主流仪器设备具有较强的兼容性，无需专为该培养板开发专门的成像或检测设备及相关附件，有利于动态灌流式培养方案在细胞和/或类器官培养中的广泛使用。
本发明可以将培养单元整合入常规的96、48、24、12、6孔细胞培养板中，也可以将培养单元整合入可拆卸培养孔内；将可拆卸培养孔设置于培养板架上，形成如常见酶标板的可拆卸培养板；从而发展出多种产品，更好的满足于不同用户需求。培养单元里的培养室的大小和孔位置严格保持与常规细胞培养板相对应，以保证该自灌流培养板在成像或检测时能够适配主流成像及检测设备。提高了该培养板的易用性和通用性。培养基储藏室、通气孔形状不一定为圆形，也可根据需要改为方形、长椭圆形等其他形状设计，从而调整培养基储藏室的储液体积或调整通气孔内液体的蒸发表面积，延伸出系列产品。用户可以根据自身需求选择在不换液的情况下维持更长时间的自灌流培养或不同灌流速度的自灌流培养板。
Claims (9)
1.一种自灌流培养板，其特征在于，包括多组培养单元，培养单元包括依次连通的培养基储藏室（1）、培养室（2）和通气孔（4）；通气孔（4）和培养室（2）之间设置有灌流停止阀（3）；
灌流停止阀（3）包括上部的连通部和均与其下端连通的进液通道和出液通道；
所述培养基储藏室（1）和通气孔（4）均为漏斗状结构；培养基储藏室（1）下端通过第一微流道（8）连通培养室（2）下端；培养室（2）与第一微流道（8）连接的对侧通过第二微流道（9）连接进液通道；出液通道通过第三微流道（10）连通与外界连通的通气孔（4）。
2.根据权利要求1所述的一种自灌流培养板，其特征在于，所述培养基储藏室（1）包括上部的储液部和下部的出液口，储液部直径大于出液口直径；通气孔（4）包括上部的蒸发室和下部的进液口，蒸发室直径大于进液口直径；连通部的下端面与储液部和蒸发室的下端面位于同一水平面。
3.根据权利要求1所述的一种自灌流培养板，其特征在于，所述培养室（2）内套设有嵌套培养层（5）；嵌套培养层（5）下端面所在水平面高于培养室（2）下端面所在水平面；嵌套培养层（5）下部与第一微流道（8）和第二微流道（9）对应位置均设置有灌流孔（11）。
4.根据权利要求3所述的一种自灌流培养板，其特征在于，所述嵌套培养层（5）上端面设置有限位槽（12），培养室（2）上部对应位置设置有与限位槽（12）相配合的限位桩（7）。
5.根据权利要求1所述的一种自灌流培养板，其特征在于，所述培养单元设置于培养孔（13）内；培养孔（13）设置于培养板架上，还设置有对应的培养板盖（17）。
6.根据权利要求4所述的一种自灌流培养板，其特征在于，所述第一微流道（8）靠近培养基储藏室（1）一端的直径小于靠近培养室（2）一端的直径。
7.根据权利要求5所述的一种自灌流培养板，其特征在于，所述培养板盖（17）上对应通气孔位置设置有开孔（18），开孔表面覆有0.22 μm的微孔滤膜（14）。
8.根据权利要求1所述的一种自灌流培养板，其特征在于，所述灌流停止阀（3）上部设置有硅胶塞（6）。
9.如权利要求1～8任一所述自灌流培养板的使用方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1：在培养室（2）内接种细胞悬液或含有类器官的微滴；
步骤2：细胞贴壁或微滴固化后，从培养基储藏室（1）加入培养基；
步骤3：培养基持续沿第一微流道（8）、培养室（2）、第二微流道（9）、灌流停止阀（3）、第三微流道（10）流向通气孔（4）；
步骤4：待培养基储藏室（1）、培养室（2）、通气孔（4）液面高度相等，并加满后，放入培养箱进行培养。
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