CN101910415A

CN101910415A - 微流体装置及其使用方法

Info

Publication number: CN101910415A
Application number: CN2008801242049A
Authority: CN
Inventors: 卡尔·拉尔斯·根吉斯·汉森; 卡罗琳娜·特罗皮尼
Original assignee: University of British Columbia
Current assignee: University of British Columbia
Priority date: 2007-11-07
Filing date: 2008-11-07
Publication date: 2010-12-08
Anticipated expiration: 2028-11-07
Also published as: WO2009059430A1; CN101910415B; JP2011504094A; CA2705213C; US9211537B2; CA2705213A1; JP5404638B2; US20110053151A1; EP2212437A1; EP2212437A4

Abstract

微流体装置，其包含与在弹性体基底中形成的流动通道流体连通的多个反应室、防止从多个反应室蒸发的蒸汽屏障以及用于分隔所述多个反应室中每一个的连续相流体。

Description

微流体装置及其使用方法

本申请要求2007年11月7日提交的美国临时申请60/996,236的优先权，其通过引用整体并入本文。

技术领域

本发明涉及微流体装置。

背景技术

目前的微流体装置(“芯片”)和系统允许对小体积(一般为几微升)进行半自动化和自动化操作。样品处理和测定的小型化提供了速度和灵敏度的同时提高，以及规模的经济性——运行测定和获得期望信息所需的试剂、样品和空间更少，并且减少对单个样品和试剂的操作减少了误差的机会。已改造或计划将微流体装置和系统用于多种化学和生化分析，包括蛋白质晶体学、无细胞蛋白质合成、气相色谱、细胞分离、电泳、聚合酶链式反应(PCR)等等。

PCR和其它基于核酸的方法的出现以及人基因组测序的完成产生了多种基于核酸的诊断和检测，这不断地需要更精确和灵敏的分析工具。对基因表达、多态性、突变(可遗传的或其他的)等的认识已经被转化成卫生保健的改善，这继而要求更精确和灵敏的分析工具。更早地检测和诊断遗传疾病、癌症和感染提供了直接的有益影响——可更有效地治疗疾病的早期阶段，并且成功的程度经常更高，因此大大改善了受试者的结局和生活质量。

定量实时PCR(RT-PCR)是目前用于检测相对稀有的多态性的“金标准”，但是其要求在可靠地检测差异之前样品中存在20％或更高的差异。因为PCR是指数性技术，所以其内在地具有高灵敏度，原则上允许检测单个分子。但是，任何非特异性扩增或污染均可导致假阳性，由此使其很难可靠地检测稀有序列。在靶序列与可能以更高水平存在的其它种类非常相似时特别是这样，因此可能限制测定在检测稀有分子种类时的灵敏度，稀有癌细胞群体中单核苷酸多态性的存在可能由于具有几乎相同序列的高背景正常分子而不可见。另外，实时监测指数反应具有高动态范围，但是区分能力有限，两个序列相对丰度的差异低于约20％可能就难以检测。在许多应用中，可能需要高得多的灵敏度。例如，从循环血中检测胎儿非整倍性会需要准确检测约1-6％的等位基因差异(Lo等人，1998.Am JHuman Genetics)。

数字化PCR首先由Vogelstein和Kinzler在1999年报道(Proc.NatlAcad.Sci USA 96：9236-9241)。数字化PCR技术提供对单个分子的扩增，但是使用常规96孔和384孔板对微升体积反应器进行宏观实现可能必须克服非特异性扩增、污染、高试剂成本以及反应数不大的问题。因此，通过数字化PCR进行定量分析要求以低假阳性率可靠地扩增单个分子，这通常要求对微升体积反应器进行仔细优化。另外，数字化PCR分析的准确性依赖于反应的数目。对1％差异的可靠检测将需要成千上万至数百万个反应。这无法使用现有方法来实现。

正在出现的微流体技术通过小体积区室提供了高灵敏度、可放大性和规模经济性，由此允许充分实现数字化PCR的能力。

减小测定的规模不仅仅带来规模上的经济性——可使用更少的样品和对一个样品运行更多的检测是最明显的益处，而且还可实现在使用“常规”的体积和样品大小时不实际或者不可能的生物学测定。在一些情况下，可以简单地缩小常规测定的规模，例如使用1微升体积代替100微升；而在另一些情况下，可能需要在建立测定的方式、所分析的数据或者其它方面进行重大的修改。Zhang等，2006(Biotechnology Advances 24：243-284)综述了用于DNA扩增的PCR微流体装置以及多种可用于微流体应用的方法、材料和技术。

将溶液区室化为很多小体积反应可用于许多领域中。包含阀和流体通道的微流体装置允许以规则的空间排列形成平面(二维)乳液。这种规则排列具有可以随时间追踪每个液滴或者对其成像的优点。这在要求随时间监测读数的测定(例如实时聚合酶链式反应)中特别重要。此外，这些方法允许精确定义的阵列，其中每个液滴具有基本相同的体积。

利用通过阀进行区室化的微流体数字化PCR已用于环境细菌的多基因分析(Warren等人，2006.PNAS 103：17807-17812)，以及用于造血细胞的转录因子谱测定(Ottesen等，2006.Science 314：1464-1467)。用于这些实验的微流体装置提供了约9000个独立10nL反应的区室化阵列。

现有微流体装置中可实现的PCR反应的密度和最小体积可具有实际的局限性。随着阵列密度的增加，个体反应室的体积减少，阀可能占据过多的空间，使其变得不可行。可以可靠制造的微流体阀的最大密度(根据间距约200微米的50×50的室阵列，通常为约2500cm²)提供了可制造的独立阀限定的反应室数目的上限(Thorsen等人，2002.Science298：580-584)以及2)可在透气性弹性体装置中实施而在热循环过程中没有过量试剂蒸发的PCR反应的最小体积(约1nL)。在数字化PCR中密度和规模特别重要，这是因为准确的测量需要将单个样品区室化成数千至数百万个独立反应，使得其在装置面积和试剂消耗方面非常昂贵。因此，显著增加测定密度并减少测定体积的新方法是实现此技术全部潜力的中心问题。

尽管已知多种材料可用于微流体应用，但是硅酮橡胶材料(例如聚二甲硅氧烷或PDMS)由于其操作便利性和适于微流体装置的整体结构而是优选的，PDMS显示高透气性，使得可以填充盲端结构。另外，PDMS对水蒸汽具有高透过性。因此，在PDMS构建的微流体装置中进行的一些过程(特别是要求高温的，例如PCR)可能由于快速蒸发而使小的水反应体积变干，反应可能失败。

克服这一局限性的努力使用了外部水化方法。尽管这一尝试在一定程度上减少了蒸发率，但是即使使用这种水化，能够成功使用的样品体积大小仍然受到蒸发的限制。这限制了该系统整合能够实现高密度阵列的极小体积的样品大小(例如皮升或更小的量级上，从而实现大样品数)从而改善该装置效用的能力。

US 7,118,910公开了用于实施PCR测定的微流体装置，还公开了在微流体装置中使用流体-流体防护通道来减少流体从装置中蒸发。

US 6,555,389公开了通过毛细管通道从流体储器补充蒸发所致的流体损失，从而补偿微流体装置中蒸发的方法。

发明内容

本发明涉及微流体装置。本发明还涉及这样的微流体装置，其包含与弹性体基底中形成的流动通道流体连通的多个反应室、防止从所述多个反应室蒸发的蒸汽屏障以及分隔所述多个反应室中每一个的连续相流体。还提供了使用所述微流体装置对靶核酸进行数字化定量的方法。

本发明提供了下述微流体装置，所述装置使反应室密度提高了三个数量级，实现了高达约10000000个反应室/平方英寸(约1.5×10⁶个/cm²)的密度，而同时将每个测定的体积减少相当的量。所述装置提供了pL体积乳液阵列的测定区室化，而不需要阀来分隔各个反应室。

根据本发明的一个方面，提供了微流体装置，其包含与弹性体基底中形成的流动通道流体连通的多个反应室、防止从所述多个反应室蒸发的蒸汽屏障以及分隔所述多个反应室中每一个的连续相流体。

根据本发明的一个方面，提供了微流体装置，其包含与弹性体基底中形成的流动通道流体连通的多个反应室，以及共面施加到多个反应室并且通过弹性体层与反应室隔开的蒸汽屏障。

根据本发明的另一方面，所述微流体装置还包含沿流动通道设置的多个阀，所述多个阀中的每一个包含一个或多个与所述流动通道相交的控制通道。

根据本发明的另一个方面，所述阀位于所述流动通道的第一和第二端。

根据本发明的另一个方面，所述反应室为皮升或飞升体积。

根据本发明的另一个方面，所述反应室为盲端反应室。

根据本发明的另一个方面，所述反应室含有一种或多种预先放置的试剂。

根据本发明的另一个方面，所述反应室以5000个室/cm²或更高的密度存在。

根据本发明的另一个方面，提供了对包含与含有第一流体之流动通道流体连通的多个反应室的微流体装置中的流体进行区室化的方法；用第二流体冲洗所述流动通道并置换所述流动通道的第一流体但不置换反应室中的第一流体，所述第二流体不与所述第一流体混溶；其中每个所述多个反应室中的所述第一流体通过所述流动通道中的第二流体与每个其它反应室中的第一流体分隔开。

根据本发明的另一个方面，提供了对靶核酸进行数字化定量的方法，所述方法包括用包含靶核酸的第一流体填充与微流体阵列的流动通道流体连通的多个反应室；用第二流体冲洗所述流动通道并置换所述流动通道的第一流体但不置换反应室中的第一流体，所述第二流体不与所述第一流体混溶；其中每个所述多个反应室中的所述第一流体通过所述流动通道中的第二流体与每个其它反应室中的第一流体分隔开；以及孵育所述微流体阵列。

根据本发明的另一个方面，所述反应室为皮升或飞升体积。

根据本发明的另一个方面，所述第一流体是水溶液。

根据本发明的另一个方面，所述第二流体是非水流体。

根据本发明的另一个方面，所述第一流体包含PCR反应混合物。

根据本发明的另一个方面，所述第一流体包含样品。

根据本发明的另一个方面，所述反应室是盲端反应室。

根据本发明的另一个方面，所述反应室含有一种或多种预先放置试剂。根据本发明的另一个方面，所述靶核酸在第一流体中为合适的浓度，从而在多个反应室中平均而言为每个反应室提供少于约一个靶核酸。

根据本发明的另一个方面，所述靶核酸在第一流体中为合适的浓度，从而在多个反应室中平均而言为每个反应室提供少于约0.5个靶核酸。

根据本发明的另一个实施方案，所述孵育步骤包括热循环。

根据本发明的另一个方面，提供了微流体装置，其包含与弹性体基底中形成的流动通道相连的多个反应室，以及防止两个或更多个反应室之间流体连通的流体屏障。

根据本发明的另一个方面，所述装置还包含共面施加于多个反应室并通过弹性体层与所述反应室隔开的蒸汽屏障。

本发明内容不一定描述了本发明的全部特征。参考下述本发明具体实施方式，本领域技术人员将明了本发明的其它方面、特征和优点。

附图说明

从参考附图的下列说明中，本发明的这些和其它特征将进一步显现，其中：

图1显示了微流体装置制造方法的示意图。

图2显示根据本发明一个实施方案的微流体阵列示意图，(a)特征为1″×1″(2.54cm×2.54cm)面积中1000000个反应室的微流体阵列，(b)插图A显示加样区，(c)插图B显示微制造的反应室和进料通道，(d)反应室几何构造的三维显示。在该实施例中，所述室的底面每边长10微米，高40微米，总体积4皮升(pL)。(e)如(a)所示的微流体阵列，没有阀通道，(f)插图D。(g)如A中所示的微流体阵列，没有阀通道但包含水化通道。

图3显示分隔反应室中流体的示意图。在(A)中，通道和反应室中充有第一流体(F₁-点)。在(B)中，引导第二流体(F₂-方格)流入所述通道，所述第二流体置换所述通道中的第一流体，但是第一流体仍保留在所述反应室中(由第二流体的流动所“断开”)。在(C)中，通道中的第一流体被置换，仅保留在反应室中以及反应室进入通道的一部分中。流体流动的方向由箭头显示。

图4显示精确度和特异性随体积缩放的统计曲线，(A)作为室个数的函数，使用数字化PCR在差异1％的两个等位基因测量值的分离的数值计算。由随机二项式噪声(取样噪声)所确定的预计标准差(σ)对差异进行归一化。针对与50％的反应室中阳性扩增相对应的模板浓度进行计算。在约1000000个室下实现5σ的分离。(B)为检测以百万分之一比率存在的稀有种类，作为室体积函数的特异性和非特异性扩增的效率比的数值计算。

图5显示对以每室10个拷贝加载的基因组DNA(阳性对照)和无模板对照(阴性对照)样品进行GAPDH扩增的荧光图像。窄线显示一组与同一流动通道连接的反应室。粗线显示蒸汽屏障的边界。在装置的底部可见由于样品失水导致的扩增失败的边缘效应。阳性对照反应室(区域A、D和E)中的PCR反应包含靶DNA和用于扩增所需试剂，而区域B和C中的阴性对照反应室缺少靶DNA。亮区显示靶DNA的成功PCR扩增。

图6显示本发明微流体装置中的PCR反应的扩增曲线。

图7显示使用本发明平面乳液阵列的染色体21(C21)相对于染色体9(C9)增加3％的检测结果。将6％的三体型21DNA掺入基因组DNA样品中，最终导致C21相对于C9增加3％(实心菱形)。来自染色体正常个体的纯化基因组DNA具有1∶1的C21∶C9比值(实心正方形)。

图8显示检测JAK2中野生型与V617突变体不同比值的测定结果。将不同量的突变质粒加入恒定量的野生型中(0.5的填充系数)。(A)显示获得的比值(深色条)和理论比值(浅色条)。(B)显示与A中相同的比值，但是是0.1％与对照样品的比值。

发明详述

本发明涉及微流体装置，其包含与弹性体基底中形成的流动通道流体连通的多个反应室、防止从多个反应室蒸发的蒸汽屏障以及分隔多个反应室中每一个的连续相流体。还提供了使用所述微流体装置对靶核酸进行数字化定量的方法。

“流动通道”一般指可流过流体的通路。

“反应室”、“反应孔”或“孔”是发生化学或酶促反应的有界区域。其可以由壁以及一个或多个阀限定边界。或者，反应室可以由壁和流体屏障限定边界。反应室的“壁”包括限定该室边界的所有流体、固体或半固体表面。反应室与一个或多个流动通道相连接；所述连接包括开口，其允许通过一个或多个流动通道填充和/或排空所述反应室。根据本发明一些实施方案的微流体装置中的多个反应室可以排布成规则的阵列，这种排布可称为微流体阵列。

“分隔的反应室”是不与另一个反应室或流动通道流体连通的反应室。可以例如通过阀或者通过流体屏障来防止流体连通。例如，所述流体屏障可以是由不与反应室中材料(通常为另一种流体)混溶的流体形成。

“盲端反应室”是具有单个进入端口或开口的反应室，其允许流体进入，但缺少独立的出口。

“死端(dead end)填充”是在压力下用流体填充死端或盲端反应室的方法。当流体开始注入通道结构时，其会沿着阻力最小的通道流动并留下一些未填充或者部分填充的区域。可研究微流体制造中所用的一些弹性体材料的透气性，以允许对死端通道进行填充。通过闭合所有出口阀并在压力下注入流体(高达约300psi或约200kPa)，加压流体填充通道并压缩装置的室或通道中的任何气体(空气)。加压气体会通过所述弹性体扩散出去，留下被所述流体填充的末端或盲端反应室。

“试剂”广义地表示反应中所用的除分析物(例如所分析的细胞、代谢物或核酸)之外的任何物质。用于核酸扩增反应的试剂实例包括但不限于缓冲剂、表面活性剂、金属离子、DNA或RNA聚合酶、逆转录酶、激酶或磷酸酶、引物、模板或靶核酸、核苷酸、标记、染料、核酸酶等。用于酶反应的试剂包括如底物、辅因子、缓冲剂、金属离子、抑制剂和活化剂。用于基于细胞之反应的试剂包括但不限于上述用于酶反应及核酸检测的试剂，以及细胞、细胞特异性染料或与细胞受体结合的配体(例如激动剂和拮抗剂)。表面活性剂例如吐温-20可包含在反应混合物中，以减少试剂在弹性体表面上的吸附。

引物是短(通常10-30个核苷酸)核酸或寡核苷酸，其与靶核酸退火并由核酸聚合酶延伸。引物可以与靶核酸完全互补(引物与靶核酸所有核苷酸之间100％匹配)，或者可以基本上互补(小于100％)，使得引物在靶核酸的位置选择性杂交。

探针是与靶核酸特异性杂交的核酸序列。所述杂交是可检测的，例如通过仅在形成双链构造时改变荧光特性的荧光标记或染料(例如DNA染料)或者通过荧光(例如分子信标)。探针可以是任何适当长度，以提供与靶核酸序列的充分互补性并在反应条件下退火。用于杂交中的探针可包括双链DNA、单链DNA和RNA寡核苷酸、锁核酸(LNA)探针和肽核酸。用于鉴定单核苷酸多态性或其它涉及少量核苷酸突变的杂交方法描述于美国专利6,270,961；6,025,136；和6,872,530。用于本发明的合适杂交探针包括寡核苷酸、多核苷酸、LNA和PNA，其长度为约6至约400个核苷酸、约20至约200个核苷酸、或者约30至约100个核苷酸。

寡核苷酸是不同长度的核酸，可用作检测和/或扩增特定核酸的探针、引物。合成寡核苷酸的多种方法是本领域已知的，例如参见Bonora GM.etal.Nucleic Acid Res.(1990)18(11)：3155-9；Lashkari DA.等PNAS(1995)92(17)：7912-5；McGall G.等PNAS(1996)93(24)：13555-60；Albert TJ.等Nucleic Acid Res.(2003)31(7)：e35；Gao X.等Biopolymers(2004)73(5)：579-96；和Moorcroft MJ.等Nucleic Acid Res.(2005)33(8)：e75).Gait，1-22页；Atkinson等，35-81页；Sproat等，83-115页；和Wu等，135-151页，Oligonucleotide Synthesis：A Practical Approach，M.J.Gait编辑，1984，IRL Press，Oxford；或者Molecular Cloning：a LaboratoryManual第三版.Sambrook和Russell.CSHL Press，Cold Spring Harbour，New York。

一些核酸或寡核苷酸可含有提供改变或改进的酶稳定性或者寡核苷酸中构象限制的单体。例如，双环核苷可对寡核苷酸提供构象限制，并可提供与未修饰寡核苷酸相比不同的杂交或稳定性谱。LNA核苷是双环核苷的一个实例，其具有2′-4′环键，如US 6,268,490、US 6,794,499、US 7,034,133所述(均通过引用并入本文)。合成和聚合包含LNA之核酸聚合物的方法描述于例如WO 99/14226、WO 00/56746、WO 00/56748、WO01/25248、WO 0148190、WO 02/28875、WO 03/006475、WO03/09547、WO 2004/083430、US 6,268,490、US 6,794,499、美国专利No.7,034,133。

“一锅法(one-pot)”过程或反应是在单个反应室中进行并且没有多个独立的试剂添加和反应步骤的过程。在一锅法反应中，反应所必需的试剂基本上同时混合在单一反应介质中。例如，一锅法PCR反应可以将用于扩增反应和检测的试剂合并在单个反应室中，扩增和检测在同一反应室中进行。可以将包含用于扩增和检测特异性靶核酸的所有试剂(包括靶核酸、引物、探针、聚合酶、核苷酸、缓冲液、盐等)的反应混合物合并，将此单混合物注入本发明的微流体装置。用所述反应混合物充满全部反应室，分隔所述室并进行热循环。特异性扩增产物的检测可以在热循环进行的同时进行，或在之后进行，或以上两者均有。作为一锅法的变型，可在所述装置的合成过程中或之后将试剂置于本发明微流体装置的反应室阵列或亚阵列中。将包含其余所有扩增所需试剂的反应混合物注入本发明的微流体装置，最后在反应室中将引物和探针与反应混合物混合。同样，特异性扩增产物的检测可以在热循环进行的同时进行，或在之后进行，或以上两者均有。

“流体连通”：如果存在连接两者之间且不留下流体的连续通路，则微流体装置的两个或更多个元件(例如流动通道、注入口、出口、通路、反应室、入口或其它由边界限定的空间)是流体连通的。流体连通可以由屏障、阀、泵或其它控制装置来调节，以允许可控地中断流体连通并分隔所述微流体装置的一个或多个元件。在其内具有第一相的第一流体的两个或更多个元件之间的流体连通还可由第二相的不混溶流体来介导。当所述不混溶流体引入所述元件之一时，其排出第一流体。例如，在乳液中，该乳液中的连续相中断或阻止分散相微滴的流体连通。

在本发明的一些实施方案中，不混溶流体可以是屏障或阀(“流体屏障”或“流体阀”)，其介导或阻止本发明微流体装置反应室中液滴之间的流体连通。

不受理论的限制，本文提供的方法利用了第一流体、一个或多个通道壁或反应室壁以及与第一流体不混溶的第二流体之间的表面张力，以建立微尺度液滴的规则阵列，其位置和大小由微流体通道的结构精确限定。

乳液在将两种不混溶流体相组合时形成，一种流体(分散相)以液滴或胶体的形式悬于另一种流体中(连续相)。所述连续相形成液滴之间的屏障，如果乳液是稳定的(防止液滴聚结)，则每个液滴可以是独立的反应容器。使用表面活性剂是稳定乳液的一种方式。另一种方式是利用分散相、一个或多个通道或反应室壁与连续相之间的表面张力，与腔室化微流体装置相组合(其允许实现微尺度液滴的规则阵列，其位置和大小由微流体装置的结构精确限定)，从而不允许其互相接触。

根据本发明一些实施方案的微流体装置的结构包含微流体通道的线性阵列，所述微流体通道通过进入通道与一系列纳升(nL)、皮升(pL)或飞升(fL)体积的室相连。将第一流体(例如包含PCR扩增所需全部组分的测定混合物)首先在压力下引入流动通道，使其对所有反应室进行死端填充。环境空气被压入透气性弹性体装置体内并离开反应室。以有限稀释加载的模板分子根据泊松统计随机分布于室阵列中。一旦室被填充，则通过流动通道注入第二流体以代替第一流体。不受理论的限制，相界面前进经过每个室，在通道收缩处产生表面张力驱动的不稳定性，导致水溶液的液滴分离，其位置和体积由室的几何形状精确限定。由于表面张力，这些水性液滴仍被限制于室的大横截面上，实现了热循环过程中每个液滴的精确定位。

多层软式光刻技术(Multilayer soft lithography，MSL)是软弹性体加工中公知的制造技术，其允许灵活且可靠地制造具有成千上万个微观反应室、阀、泵、流体逻辑元件及其它组件的微流体装置。Xia &Whitesides，1998(Angewandte Chemie-International Edition 37：551-575；通过引用并入本文)记载并综述了用于软式光刻技术(包括MSL)的过程、材料和技术。

简言之，多层软式光刻法(MSL)的一般思想是彼此重叠堆积厚度不同的弹性体(例如PDMS)层。在独立的片层上形成化学计量比分别低于或高于10∶1的PDMS薄层和厚层。事先在所述片层上制成的抗光蚀图案将限定所述装置的微流体通道。然后，将厚层从所述片层上剥离，并置于薄片层上。烘烤后，各个层的过量组分将粘合形成由两层通道组成的PDMS“芯片”。操作弹性体以及将它们应用于微流体应用的方法是本领域已知的，参见例如美国专利No.6,929,030；Scherer等Science 2000，290，1536-1539；Unger等Science 2000，288，113-116；McDonald等Acc.Chem.Res.2002，35，491-499；Thorsen，T.等，.Science 2002，298，580-584；Liu，J.等Anal.Chem.2003，75，4718-4723；Rolland等2004 JACS126：2322-2323，PCT公开WO 02/43615和WO 01/01025。

多种软聚合物(一般称为弹性体)可用于微流体装置和系统中。弹性体一般具有大范围热稳定性、高润滑性、斥水性和生理惰性的特征。弹性体的其它期望特征可以根据应用而不同。针对预期目的选择适当的弹性体或弹性体组合在本领域技术人员能力之内。弹性体的例子包括硅氧烷、聚二甲硅氧烷(PDMS)、可光固化全氟聚醚(PFPE)、氟硅酮、聚异戊二烯、聚丁二烯、聚氯丁烯、聚异丁烯、聚氨酯、聚(苯乙烯-丁二烯-苯乙烯)、乙烯基硅烷交联的硅氧烷，等等。弹性体可以是光学上透明的或者不透明的，或者具有不同程度的透明度。在本发明的一些实施方案中，使用生物相容性弹性体可能是理想的。PDMS是最先开发且较为广泛地使用于软式光刻应用的弹性体之一。尽管在本发明的多个实施方案中描述的弹性体为PDMS，但其仅为示例性目的，替代性弹性体的选择在本领域技术人员的知识范围之内。适用于微流体应用的多种弹性体以及其多种性质和应用实例描述于美国专利No.6,929,030。

设计在硅片层或其它合适支持物上的抗光蚀剂图案提供了用于铸造层的模具。一般地，抗光蚀剂可分为正性或负性。正性抗光蚀剂能够实现极高的分辨率。它们在碱性溶液例如KOH中溶解度很高；但是，感光性溶解抑制剂例如重氮萘醌(diazonaphthaquinone，DQ)通常用于阻断这种作用。与紫外线(UV)的光反应破坏DQ，允许抗光蚀剂溶于显影液中。处理此类型抗光蚀剂的思想是除去所有暴露于UV光的部分。正性抗光蚀剂的实例有SPR220-7(Shipley Company LLC)。

负性抗光蚀剂一般包含非感光底物、感光性交联剂以及涂覆溶剂。在暴露于UV光后，交联剂被活化，导致形成坚硬的环氧树脂。用显影液洗去抗光蚀剂剩余未曝光的部分。SU8(MicroChem)是负性抗光蚀剂的一个例子，其在两种MSL模具中均可使用。另外，作为环氧树脂的SU8非常坚硬，可抵抗随后的光刻过程。使用特定抗光蚀剂的详细方法和技术可从多个制造商获得，本文不再赘述。特定抗光蚀剂的例子仅用于说明目的，不认为对本发明有限制作用。

在制备过程中可将其它组件并入所述微流体装置中，在MSL过程中可整合微米级别的阀、泵、通道、流体多路器、灌注腔室等。制备和整合这些组件的方法描述于例如美国专利No.7,144,616、7,113,910、7,040,338、6,929,030、6,899,137、6,408,878、6,793,753、6,540,895；US专利申请2004/0224380、2004/0112442；PCT申请WO 2006/060748。

在皮升体积范围中进行测定时，蒸发是需要克服的障碍。在制造微流体装置的过程中，可将蒸汽屏障引入所述装置中将放置或传送流体并且不希望流体损失的反应室和通道的附近。蒸汽屏障可包含任何适当的材料。适当的材料优选是光学上透明的、不透过水蒸气、不与基底反应的，所述基底包括所述微流体装置和用于测定混合物的流体或者用于排出流动通道中测定混合物的不混溶的油或流体，并且能够承受用于制备微流体阵列和使用它们的测定中的温度范围。另外，使用可与所用弹性体结合的材料是理想的。良好的结合可以是弹性体的一种特性，或者可通过施加一个或多个粘合层来实现或者通过材料表面改性实现(例如，通过暴露于氧等离子体)。合适材料的实例有醋酸酯、聚乙烯或基于聚乙烯的片、聚二甲苯聚合物(Parylene^TM N，C，D)，其它包括玻璃、硅、石英、云母。也可使用其它聚合物材料，这些聚合物材料可以以预制膜的形式沉积或者通过其他聚合物加工技术沉积，例如沉积将凝固成膜的液体(实例包括树脂制剂、聚合物溶液、前体混合物等)，或者通过汽相沉积聚合物(例如Parylene)或者通过蒸发，其中材料在表面上浓缩，或者通过喷涂气溶胶，等等。

在制造微流体装置的过程中，将蒸汽屏障与阵列的至少一侧共面地施加或放置。弹性体层将所述蒸汽屏障与阵列反应室的一个壁隔开，所述弹性体的厚度足以吸收被死端填充所压入弹性体的气体。此厚度可以为例如约10至约500μm，或者约50至约250μm，或者约75至约225μm，或者约100至约200μm，或者约125至约175μm。不受理论的限制，此几何形状提供了基本为二维的水蒸气梯度的建立，使得仅仅通过阵列的侧面发生输送(蒸发)。

在一个优选实施例中，所述阵列两个平面的侧面都有蒸汽屏障。在本发明的一些实施方案中，微流体阵列位于硅基底(所述阵列的底部)与所述阵列上方的醋酸酯或聚乙烯片之间，对于利用如所述设置的两个蒸汽屏障的装置，所述屏障可分开任何适当的距离，其根据反应室的高度和任何位于反应室阵列之上或之下的流动通道、阀等额外层的存在情况而不同。

制造过程的简单示意图显示于图1。(A)使用标准软式光刻技术将模构造(feature)120铸造于晶片121上。(B)将液体PDMS置于晶片顶上并部分硬化，使得其厚度略高于所述构造的高度。(C)将蒸汽屏障123施加于PDMS层122顶上，并覆盖PDMS第二层124。(D)在脱气和烘烤之后，将所述装置从模上剥离，在固化的PDMS上留下负印。

参照图2a-d，根据本发明一个实施方案的装置示意图一般性地显示于100。图2b显示图2a的A插图；图2c显示图2d的B插图；图2d显示反应室114的三维图，为图2c的插图C。该示例性装置包括与用于加载反应室114的一系列级联流动通道105、107、109流体连通的13条一级流动通道103。每个一级流动通道提供了亚阵列，可以载入包含反应混合物、样品等的流体，并且可以独立于流动通道，从而使得能够在同一装置上加载和处理多于一种的样品或者对相同样品进行多于一种的反应。

阀流动通道102a、102b与主流动通道103相交，其位于反应室阵列的侧面。来自注入口104的流体流动由阀108调节；阀108由阀流动通道102a、b中的流体压力打开或关闭。沿着阀流动通道102a的所有阀可以由注入口106a同时操作；沿着阀流动通道102b的所有阀可以由注入口106b同时操作。反应室114通过反应室进入通道112与反应室流动通道110流体连通。在图2c和2d中所示的实施方案中，反应室114是盲端室，其具有单个填充口而没有独立的出口。图2d中举例说明的反应室114高度大于宽度，其在反应室底部具有进入流动通道。反应室的其它构造是可能的。例如，例如图2d中所示的反应室可具有小“着地”面积(宽×长)，而高度大于宽度或长度。此类“垂直”构造可提供更大的样品体积并使得所述室的面密度尽可能大。更大的反应体积可允许在反应室中包含更大量的荧光团(或其它检测标签或信号产生试剂)，由此产生更强的检测信号。

参照图2e和2f，130一般性地显示了缺少阀通道102a、b、阀108和阀流动通道106a、b的本发明一个替代性实施方案的示意图。图2f显示图2e的插图D，图2f的插图B如图2c中所示。用于加载反应室114的流动通道103、105、107、109如上所述。

独立于阀流动通道和主流体通道进行填充和操作的水化通道可包含在阵列的外围，以对接近阵列边缘的反应室进行水化。参照图2g，本发明一个替代性实施方案的示意图一般地显示于140。此实施方案包含如图2a-d和e-f所示的注入口104和流动通道，还包含水化通道142和端口144。水化通道142在主流动通道103上方或下方的层中形成，通过足够厚的弹性体与流动通道和反应室(包括主流动通道103)分隔开，从而使得水化通道中的流体流动和加压显著限定主流动通道103或流动通道105、107或109中的流体流动(未显示)。术语“显著限定”(或类似术语)用于表示与水化通道不包含流体或者在处于压力之下时流入、流向或流经流动通道或反应位置的流体流动相比，流入、流向或流经流动通道或反应室的流体流动减少不超过40％、通常不低于30％，优选低于20％或者更优选低于10％。水化通道142可以具有与流动通道103、105、107或109大致相同的内径。

本领域技术人员了解，本文公开的多种特征可以合并到本发明的一些实施方案中。例如，微流体装置可包含如图2a和b所示的阀流动通道，以及水化通道。还考虑了水化通道的其它构造；例如可沿微流体装置的边缘放置一系列分离的水化通道。

根据本发明一些实施方案的装置可以制造成包含多个独立的注入口，其每个与独立的部分或亚阵列相接，高密度阵列允许在单个装置上使用空间多重法进行多样品分析。例如，约1000000个反应的阵列可分为40个独立的部分，每个部分由约25000个反应室构成。与每个独立亚阵列相接的独立注入口使得能够实施多样品分析。

可将预加载策略应用于阵列上限定区域内的空间多重性独立测定。简言之，可使用一个或多个阀分隔阵列上的部分，在其中可死端载入溶液中不同的试剂组(例如不同的引物和/或探针组)。随后，可用空气冲刷流动通道以除去过量的试剂，将所述装置在约80℃下孵育以从反应混合物中蒸发水，在阵列中限定的部分中留下干燥引物和探针。使用这些预加载装置，可将包含溶液中靶核酸的样品引入阵列的所有反应室，并分析多种靶核酸(例如对于具有40个独立部分的阵列，可分析高达40种不同的靶核酸)。

在图2a-d中举例的装置中，阀流动通道提供了位于装置边缘的阀。如图2e-g中所示，也可使用微流体装置的阀实施方案。在这些实施方案中，可通过微流体装置外部的阀控制流入、流出和流经流动通道或水化通道的流体。

为了将反应混合物(第一流体)载入反应室，用通过注入口104注入的第一流体(F1，图3)对反应室(114)进行死端填充。这样，所有反应室通过反应室进入通道与流动通道流体连通。随后，将第二流体(F2)注入到注入口，随着其通过流动通道流动，F₂排出F₁。

第一流体可以是水溶液，例如用于测定中的反应混合物。例如，对于聚合酶链式反应(PCR)测定，第一流体可包含PCR必需的所有试剂——模板核酸、核苷酸、引物、合适的核酸聚合酶、缓冲剂、盐。根据所述测定的预定用途，第一流体还可包含染料、标记、探针或用于检测PCR测定产物的其它试剂。第二流体与第一流体不混溶，并且也与构成微流体装置的材料相容。第二流体可以是与制造装置的PDMS弹性体相容的油，例如氟化油。“相容”表示第二流体不以有害方式与装置相互作用或反应，例如，弹性体在暴露于该流体时不吸收流体或膨胀，并且所述装置的物理性质不变(弹性或刚性基本不变)。可用于包含PDMS的微流体装置的第二流体的实例包括：全氟己烷(Fluorinert^TM)、氟化硅氧烷油类、氟化油类(例如FC40，FC43，FC70，FC-72，FC-77，FC-84，FC-87等，可得自3M或其它供应者)以及高分子量油类例如石蜡油。

反应室的具体尺寸和密度以及本发明微流体装置的其它特征仅受限于多层软式光刻(MSL)法本身的限制。目前的MSL方法通常能够制造小至1μm的构造。例如，本发明的微流体装置可包含数量为约50000至约108或其间任何量、或者约100000至约5x10⁶或其间任何量、或者约200000至约2×10⁶或其间任何量、或者约250000至约10⁶或其间任何量的反应室阵列，其取决于装置的总尺寸。

反应室的密度可以通过单位面积上的数量来表示。例如，一些装置可具有以下反应室密度：每平方厘米约1000至约2×10⁶或其间任何量，每平方厘米约5000至约10⁶或其间任何量，约10000至约500000或其间任何量。例如，反应室的密度可以为每平方厘米约1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10000、15000、20000、25000、30000、35000、40000、45000、50000、100,000、150,000、200,000、250,000、300,000、350000、400,000、450,000、500,000、550,000、600,000、650,000、700,000、750,000、800,000、850,000、900,000、950,000、1,000,000、1,050,000、1,100,000、1,150,000、1,200,000、1,250,000、1,300,000、1,350,000、1,400,000、1,450,000、1,500,000、1,550,000、1,600,000、1,650,000、1,700,000、1,750,000、1,800,000、1,850,000、1,900,000、1,950,000、2,000,000。

可置于微流体装置中的反应室的密度也可不同。例如，具有约10微米间距的5μm³反应室代表每平方厘米10⁶个反应室的总密度(每个室约125fL)。所述室的间距会随着装置的预定用途而不同；较大的间隔可能是需要较大体积的反应所必需的(例如，如果将整个细胞置于反应室或者如果靶分子不能使用便利方法充分浓缩)。对于一些微流体装置，间距可能必须根据经验确定，对最佳间距的确定在本领域技术人员能力范围内。例如，间距可以为约1至约1000μm或其间任何量，约2至约80μm或其间任何量，5至约60μm或其间任何量，约10至约40μm或其间任何量，约20至约50μm或其间任何量。例如，间距可以是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100μm。

小体积液滴中单个颗粒的区室化使该颗粒、细胞或分子的有效浓度能够很高。区室化的一个方法是利用乳液，其中水性液滴在至少一侧被第二液相例如油所分离。根据本发明一些实施方案的包含具有限定的微腔室(反应室)的流体通道的微流体装置允许形成具有规则空间排列的平面(2维乳液)，不需要阀来限定反应室，因此消除了它们可能对反应室阵列中间距和反应室密度产生的限制。在与扩增方法联用时，这种浓度增强允许对单分子进行计数，即数字化定量。不受理论的限制，通过此类区室化对生物物质浓度的提高提供了提高检测和测定灵敏度的手段。所述颗粒的浓度可表示为相对于每个阵列孔的平均数。例如，在每个孔平均含有1个颗粒的反应室阵列中，一些反应室可含有0个，一些可含有1个，而一些可含有两个或更多个颗粒。又例如，在每个孔平均含有0.1个颗粒的反应室阵列中，大多数反应室预计含有0个颗粒，约10％的预计含有1个颗粒，极少数可含有2个或更多个颗粒。根据本发明的一些实施方案，所述颗粒可以如下每个反应室的平均浓度提供：约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0或其间任何量。

颗粒可以是可流过微尺度系统的任何离散物质。示例性颗粒包括珠、核酸、靶核酸、蛋白质、生物细胞、分子等。例如，可以使用聚合物珠(例如聚苯乙烯、聚丙烯、乳胶、尼龙等)、二氧化硅或硅珠、粘土或粘土珠、瓷珠、玻璃珠、磁珠、金属珠、无机化合物珠和有机化合物珠。许多种颗粒是市售的，例如，通常用于色谱的那些(参见，例如1999 Sigma″Biochemicals and Reagents for Life Sciences Research″Catalog fromSigma (Saint Louis，Mo.)，例如1921-2007页；1999 Suppleco″Chromatography Products″Catalogue等)，以及常用于亲和纯化的那些(例如来自Dynal的Dynabeads.TM，以及许多衍生的珠，例如多种衍生的Dynabeads.TM.(例如多种磁性Dynabeads.TM.，其通常包含偶联试剂)，例如由Promega，Baxter Immunotherapy Group以及许多其它来源提供的)。

例如，含有单个DNA分子的1微升体积溶液的区室化具有10⁶L^-1的浓度。将此溶液区室化成各为1皮升体积的1000000个液滴得到999999个浓度为0的液滴以及1个有效浓度为10¹²L^-1的液滴，增强了1000000倍。在另一个实例中，本发明的微流体装置可用于将反应室中的细胞区室化(例如约100pL的体积)。单细胞的分离使得细胞对其环境施加大的影响，并分泌充分浓缩足以用于检测的分子。

皮升(pL)体积液滴具有大的表面积体积比，热循环过程中的试剂蒸发可破坏单分子的可靠扩增，这一现象在由已知具有非常高透气性的PDMS制成的装置中特别严重。这种蒸发在平面乳液阵列中可能是明显的，在所述阵列中垂直于平面的方向上具有显著的梯度。为了控制这种蒸发，可将蒸汽屏障嵌入所述装置中并位于阵列的侧面。这样，除去了垂直于阵列平面的梯度蒸发损失，使得可以在pL体积反应中成功扩增靶核酸。“皮升体积”通常描述小体积，其为约1至约1000pL或其间任何量、约1至约500pL或其间任何量、约1至约200pL或其间任何量、约1至约100pL或其间任何量、或约1至约50pL或其间任何量。例如，本发明微流体装置形成的反应混合物的体积或者本发明方法所用的反应混合物的体积可以是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950或1000pL。

根据本发明的多个实施方案，亚皮升反应体积也可以是实用并且可用的。如所讨论的，常规平版印刷制造技术可实现小至1微米的构造，因此能够限定具有飞升至皮升级体积的室。例如，微流体装置中1μm³的室将具有约1飞升(fL)的体积；约5μm³的室将具有约125fL的体积。亚皮升体积一般描述约1至约1000fL或其间任何量、10至约500fL或其间任何量、或100至约500fL或其间任何量的小体积。例如，本发明微流体装置形成的反应混合物体积或者本发明方法中使用的反应混合物体积可以是约1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950或者1000fL。

或者，反应室可通过其立方微米体积或类似维度而不是由液滴体积来描述。确定单位之间的必要转换在本领域技术人员的能力范围之内，例如从立方微米至皮升，等。

除了限制或防止反应室中的反应混合物蒸发之外，还控制反应条件。

如果在控温反应中利用所述装置(例如在一个或多个温度下孵育一段时间，作为单次孵育或一系列循环温度，例如PCR或其它扩增或延伸反应中所用的热循环)，则可以将弹性体装置固定在支持物上，例如玻璃载玻片或硅片。所述装置可置于温度和/或环境受控孵箱中，或者对于热循环反应，所述装置可置于任何数量的热循环板上。用于热循环的装置是已知的，并且是可获得的。一般来说，包含反应室阵列的微流体装置可置于热循环板，以实现反应的热循环。多种此类热循环板可获得自商业来源，例如BioRad、Thermo、Eppendorf、Techne、Applied biosystems等等。或者，所述装置的基底可含有主动加热元件和温度传感元件，以提供必要的热循环条件。例如硅基底中加热器和温度传感器的制造是本领域已知的。

对于PCR来说，热循环需要对温度和反应物在特定温度下孵育的时间这两者进行精确控制。模板或靶核酸变性、退火和延伸的温度范围根据所进行的具体扩增反应、所用引物的互补性、靶核酸的组成以及所选的具体聚合酶而不同。其它扩增方法可能不需多轮热循环，但是仍可能受益于反应条件的温度和时间调节。例如，多种等温核酸扩增策略例如滚环扩增是已知的，并且包括在本发明中。

监测所述装置和反应室之温度特征的能力也是有用的。可将传感器引入所述微流体装置中，例如热电偶或热敏电阻或热电传感器。可通过使用红外照相机或使用热变色材料监测温度。这些及其它用于监测微流体装置中温度特征的方法描述于美国专利No.7,118,910。

根据本发明一些实施方案的微流体装置和方法的应用多且各有不同。本文所述的微流体装置和方法的用途或应用以及包括用途或应用的方法不限于任何特定申请或其用途。在本发明的一些实施方案中，考虑下列用途和应用。

样品、测定和测定条件

存在众多可应用本发明一些实施方案的微流体装置的测定和用途。这些用途的综述以及方法和方案的参考文献和公开在PCT公开WO00/50172中提供。本文举例的所选测定用于说明性目的，而不认为具有限制性。

单细胞测定。基于微流体的单细胞分析可用于多种目的，例如细胞分选、核酸纯化和扩增、膜片钳、钙流量测定以及全细胞电泳。另外，在微流体装置中对一个或少量单细胞进行捕获和成像可用于监测细胞对不同浓度的一种或数种化学刺激的反应。

微流体装置或包含此类装置的系统可提供用于以允许随后进行刺激和分析的形式分选和捕获细胞亚群的细胞操作能力。此类系统可允许从群体中选择单个细胞、将该细胞捕获至可寻址室阵列中的任何位置、应用一种或多种反应条件以及对每个反应室成像。此功能可提供对多个单细胞进行化学遗传学研究的工具。基于细胞的微流体测定的实施例描述于例如PCT公布WO 98/00231和WO 98/45481。基于细胞的微流体测定可用于筛选细胞配体(例如受体配体、药物、辅因子等)的结合和/或内化。

本发明一些实施方案的微流体阵列中的颗粒可存在固体或半固体表面，用于连接多种连接化学物质中的任意种，从而允许将目的生物及化学组分并入阵列的颗粒成员中。多种天然和合成的有机及无机聚合物可用作固体表面材料。示例性聚合物包括聚乙烯、聚丙烯、聚(4-甲基丁烯)、聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸酯、聚对苯二甲酸乙二酯、人造丝、尼龙、聚丁酸乙烯酯、聚二氟乙烯(PVDF)、硅氧烷、聚甲醛、纤维素、醋酸纤维素、硝酸纤维素等。很多种连接化学物质可用于将分子连接到多种固体或半固体颗粒支持元件上。本领域技术人员了解并且可根据预定应用容易地选择合适的化学物质。

蛋白质结构研究。根据本发明一些实施方案的微流体装置可用于结构生物学应用，例如蛋白质晶体学。可用于此类应用的方法和技术描述于例如Hansen & Quake，2003.Current Opinion in Structural Biology113：538-544；Hansen et al，2006.J Am Chem Soc.128：3142-3143；美国专利no.7,217,321。

根据本发明一些实施方案的微流体装置可适用于包括筛选其它生物学组分的用途，所述组分包括细胞、抗体、抗体配体、蛋白质、肽等。也已知此类细胞、抗体和抗体配体的存在与否与希望或不希望的特征相关联。可将样品的有限稀释物施加到微流体装置并使其流入反应室，并如所述以流体屏障将室分隔开。应用之前，可将样品与标记物合并，例如标记抗体(例如具有荧光标签)或类似标记物。分隔后，可通过筛选标记物的存在情况来研究各个室是否存在生物学组分。筛选测定、免疫测定、蛋白质鉴定测定等的实例记载于例如美国专利No.6,632,655。

测序、多态性的鉴定。根据本发明一些实施方案的微流体装置可用于核酸测序，特别是产生测序文库。给待测序DNA(靶核酸)提供聚合酶和引物以及其它必需试剂，然后每次暴露于一种类型的DNA碱基(A、C、T或G)以快速测定碱基掺入。下文描述了多种用于确定核苷酸序列的方法。在本发明的一些实施方案中，本发明的微流体装置可用于对核酸测序。本发明的装置任选地包含实施生物学或化学测定的试剂(其可以是阵列的一部分或者流入与阵列相接触，例如在试剂列中)。用于测序的反应混合物可包含一些或所有核苷酸、聚合酶、dNTP、ddNTP、dNTP类似物、荧光dNTP、或荧光dNTP、无机磷酸盐、ATP、热稳定聚合酶、核酸内切酶、核酸外切酶、磷酸酶、嵌入式染料、标记探针、还原剂、Mg⁺⁺、分子拥挤剂(例如PEG)、缓冲液、盐、DTT、BSA、去污剂或表面活性剂、抑制或提高电渗流动的化学物质(例如聚丙烯酰胺)等。

下文描述了分析靶核酸的其它方法。

靶核酸是包含一个或多个目的序列的核酸。可检测样品或反应混合物中靶核酸的存在情况，根据试验设计，也可对其进行定量。靶核酸可获得自生物样品(“样品”)。

“多态性”是群体中存在两种或更多种形式的靶核酸。多态性位点可以在核酸序列中已知的位置，或者可使用本文所述方法确定存在于靶核酸中。或者，多态性可以描述为序列变异或序列变体；如果在DNA中，为“DNA序列变异”；如果在RNA中，则为“RNA序列变异”。单核苷酸多态性(或SNP)是由单个碱基变化组成的多态性。

组织样品可通过例如刮取、针吸活组织检查或针刺(核芯)活组织检查、用以对组织取样的切取活组织检查、或者切除活组织检查来获得，可能需要整个去除目的组织。或者，使用本领域已知的方法，可使用含有遗传物质的其它身体样品，例如毛发、血、血浆、血清、痰、尿、大便、精液、羊水、绒毛膜绒毛或其它胎儿或胚胎组织。

DNA和RNA可通过本领域已知的任何方法分别或共同分离自生物样品。方法的选择可取决于待测定的核酸(DNA或RNA)、用于测定的方法等。从生物样品中分离DNA和RNA的方法是本领域已知的，例如Sambrook J.等″Molecular Cloning″，Cold Spring Harbor LaboratoryPress(1989)以及Ausubel，FM等″Current Protocols in MolecularBiology″，John Wiley & Sons，Inc.(1994)，Botwell，DDL.Anal.Biochem.(1987)162：463-465)；美国专利5,130,423；美国专利5,945,515；美国专利5,989,431；美国专利5,128,247。在一些情况下，例如单细胞的分析，可不需要在分析前纯化DNA或RNA。

可通过本领域已知多种方法中的任意方法扩增样品中靶核酸的特定序列，所述方法例如降落PCR(touchdown PCR)、逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)、聚合酶链式反应(PCR)、反向PCR、转录介导扩增(TMA)、巢式PCR、连接酶链式反应(LCR)、基于核酸序列的扩增(NASBA)等。参见，例如Compton J.1991.Nature.350：91-92；Malek等，1994.MethodsMol Biol 28：253-60；Innis等(eds.)PCR Protocols：A Guide to Methodsand Applications，60-66页，San Diego，CA，Academic Press，Inc.，1990；Roux K.，1994.Biotechniques 16：812-4；HeckerK和Roux，L.，1996；Biotechniques 20：478-85；Ochman等，1988.Genetics 120：621-3；美国专利No.5,299,491。这些参数、方法和试剂的选择以及针对具体反应条件对其进行优化的方法在本领域技术人员的能力范围之内。

本发明微流体装置的高密度反应室阵列还允许在单个装置上分析多个靶核酸或者多个样品或其两者。例如，约1000000个反应的阵列可分为40个独立的部分，每个部分由约25000个数字化PCR室构成。包含与独立亚阵列相接的独立注入口使得能够实施多样品分析。在另一个实例中，可将预加载策略用于阵列所限定范围内的空间多重性独立测定。微阀可用于分隔阵列的部分，不同的引物和探针组可按照所述死端加载到所述部分中。随后，可用空气冲刷流动通道，以除去过量的测定混合物，孵育预加载的装置(例如在约70-80℃下)以使得预加载测定混合物中的试剂脱水，在预定部分中留下干燥的引物和探针。在此脱水步骤之后，如上所述将包含一种或多种靶核酸及其它PCR必需的试剂(但不包含已经预加载的引物和探针)注入到微流体装置的一种或多种亚阵列中，使脱水的试剂再水化。随后，冲刷流动通道，以分隔反应室，使反应进行热循环。在扩增反应期间或之后可监测扩增产物。

在另一个实例中，可在单个反应中检测和定量两种或更多种扩增产物。这可以通过将用光谱不同的荧光团标记的多种序列特异性荧光探针掺入反应混合物中来实现。这种形式的多重性增加了可在单个样品中测定的靶核酸数，通过允许以参照核酸对结果进行归一化而在一种或多种靶核酸的定量分析中具有重要作用。

检测靶核酸或者其扩增产物也是有用的。多种策略可用于本文所述的微流体装置和方法中；对合适系统的选择取决于反应的具体情况、检测系统和试剂与反应条件产物的兼容性、反应数的规模(例如反应室的数目、密度)以及是在测定过程中还是在终点监测靶核酸或其扩增产物。待检测的信号类型可包括选自下列的类型：荧光团、生色团、化学发光、比色反应、放射性、来自酶促反应的底物等。

用于检测信号的示例性方法包括激光共聚焦显微术、共振能转移(resonance energy transfer，RET)、荧光共振能转移(fluorescentresonance energy transfer，FRET)、生物发光共振能转移(bioluminescent resonance energy transfer，BRET)、闪烁检测、荧光相关光谱术、光散射、光吸收(UV或可见光)、反射率等。

可通过例如双链核酸特异性染料的摄入或者通过所扩增核酸部分与探针的杂交来确定靶核酸或其扩增产物的存在情况。

只在结合双链核酸时发荧光的DNA染色染料可用于检测扩增产物。这些染料的实例包括SYBR Green I、II，SYBR Gold，YO(噁唑黄)、TO(噻唑橙)、PicoGreen(PG)(可得自Molecular Probes，Invitrogen)、溴化乙锭、碘化丙锭、Hoechst 33258，Hoechst 33342，DAPI等。关于DNA染色染料的其它讨论可见于例如Glazer等，1997.Curr Opin Biotechnol8：94-102；以及Glazer，AN和Rye，HS.1992.Nature 359：859-61，Higuchi等，BioTechnology 10：413-417。

“分子信标”是单链寡核苷酸，其除非与靶核酸杂交，否则会以发夹构型存在。所述寡核苷酸的第一端连接有荧光染料，第二端连接有猝灭分子。在发夹构型中，荧光被临近的猝灭分子猝灭，观察不到荧光。一旦寡核苷酸“信标”与靶核酸杂交，所述荧光染料与猝灭分子充分分离，可检测到荧光。通过监测染料的发光变化，可以间接监测扩增产物。足以指导本领域技术人员的其它细节可见于例如PCT公布WO 95/13399，Tyagi S等人1998.Nat Biotechnol 1：49-53；Tyagi S和Kramer FR.1996 NatBiotechnol 3：303-8；以及Marras SA等，1999.Genet Anal 5-6：151-6。

荧光共振能转移(FRET)是供体荧光团和受体荧光团对之间的距离依赖性相互作用，对其进行选择以使得供体发射光谱覆盖受体的激发光谱。当荧光团足够接近时，第一确定波长对供体荧光团的激发从供体转移到受体，可检测到第二确定波长的荧光。对于核酸杂交的检测，用供体/受体对的一个成员标记特异性探针，用所述供体/受体对的另一个成员标记核苷酸。在游离于溶液中时(例如在核酸聚合反应或者杂交发生之前)，所述供体/受体对距离足够远以防止能量转移。随着聚合反应的进行，带标记的核苷酸将被掺入分子中，与带标记的引物充分接近，使得可发生能量转移，检测到荧光。可用于检测靶核酸中多态性的方法实例描述于例如美国专利No.6,500,650，美国专利No.5,945,283美国专利公开2004/0005613和WO 97/22719。

可使用实时定量PCR通过测定扩增期间和/或之后形成的扩增产物的量来确定样品中靶核酸序列的量。市售TaqMan^TM测定(AppliedBiosystems)基于Taq聚合酶的5′核酸酶活性，其取代并切割与靶DNA结合的寡核苷酸探针，产生荧光信号。必须有两种在多态性位点上有差异的探针，其中一种探针与“正常”序列互补，另一种与目的突变互补。这些探针具有连接到5′端的不同荧光染料以及连接到3′端的猝灭剂，在探针完整时，猝灭剂通过荧光共振能转移(FRET)与荧光相互作用以使探针的荧光猝灭。在PCR退火步骤过程中，杂交探针与靶DNA杂交。在延伸步骤中，Taq聚合酶的5′核酸酶活性切割5′荧光染料，导致报告染料的荧光增加。错配探针被取代而不发生断裂。通过测定两种不同染料的信号强度来确定样品中突变的存在。参见美国专利No.5,210,015、5,487,972。

侵入性切割方法利用了称为Invader^TM探针的寡核苷酸以及与具有单核苷酸重叠的与靶DNA退火的序列特异性探针。当所述序列特异性探针与多态性碱基互补时，侵入寡核苷酸的3′端重叠形成被Flap核酸内切酶识别并切割的结构，释放等位基因特异性探针的5′臂。足以指导本领域技术人员的其它细节由例如下列所提供，Neri B.等2000.Advances inNucleic Acid and Protein Analysis 3826：117-125，美国专利No.6,964,848。

也可使用包括使用Scorpion探针系统的测定。这些探针和系统描述于例如Nucleic Acids Research 200028：3752-3761和PCT公开WO99/66071。

引物延伸反应(即微测序，核苷酸特异性延伸或者简单PCR扩增)也可用于序列鉴别反应，以鉴定靶核酸中的多态性。例如，在微测序反应中，引物与其靶核酸(通常为DNA)中在紧邻SNP的上游退火，延伸与多态性位点互补的单个核苷酸。在所述核苷酸不互补时，不发生延伸。

寡核苷酸连接测定(Oligonucleotide ligation assay，OLA)需要每个SNP的两种序列特异性探针和一种共用连接探针。所述共用连接探针在序列特异性探针邻近处杂交，在合适的序列特异性探针完全匹配时，所述连接酶将序列特异性探针与共用探针连接。在没有完全匹配时，连接酶不能将序列特异性与共用探针相连接。可例如通过酶免疫测定来检测所述探针的退火(Villahermosa ML.J Hum Virol(2001)4(5)：238-48；RomppanenEL.Scand J Clin Lab Invest(2001)61(2)：123-9；Iannone MA.等Cytometry(2000)39(2)：131-40)。

连接-滚环扩增(Ligation-Rolling Circle Amplification，L-RCA)也已成功用于对单核苷酸多态性进行基因分型，如Qi X.等Nucleic Acids Res(2001)29(22)：E 116所述。

Sanger测序(Sanger等，1977 PNAS 74：5463-5467)利用DNA聚合酶合成多种长度的序列依赖性片段。所述片段的长度由双脱氧核苷酸碱基特异性终止子的随机掺入决定。然后，可在凝胶中分离这些片段、显影并确定序列。已经完成了许多改进以精制上述方法以及使测序方法自动化。类似地，RNA测序方法也是已知的，参见例如Zimmern D.和KaesbergP.Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1978)75(9)：4257-4261)以及Mills DR.和Kramer FR.(Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1979)76(5)：2232-2235)。用于RNA测序的直接化学方法也是已知的(Peattie DA.Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1979)76(4)：1760-1764)。其它方法包括Donis-Keller等(1977，Nucl.Acids Res.4：2527-2538)，Simoncsits A.等(Nature(1977)269(5631)：833-836)，Axelrod VD.等(Nucl.Acids Res.(1978)5(10)：3549-3563)，以及Kramer FR.和Mills DR.(Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1978)75(11)：5334-5338)的方法。

也可通过用激光激活被切割核苷酸的天然荧光来读取核酸序列，同时单核苷酸包含在荧光增强基质中(美国专利5,674,743)。在微测序反应中，DNA聚合酶将与邻近SNP的靶DNA退火的引物延伸与多态性位点互补的一个核苷酸。该方法基于DNA聚合酶核苷酸掺入的高准确度。分析引物延伸产物有不同的技术。例如，根据为检测产物所选择的方法，在微测序反应中使用带标记或未标记的核苷酸，与dNTP组合的ddNTP或者仅使用ddNTP。

模板引导法。在一个实施例中，模板引导的染料终止子掺入和荧光极化检测(template-directed dye-incorporation with fluorescentpolarization，TDI-FP)方法描述于Freeman BD等(J Mol Diagnostics(2002)4(4)：209-215)，用以大规模筛选；5′核酸酶测定可用于对单核苷酸多态性进行基因分型(Aydin A.等Biotechniques(2001)(4)：920-2，924，926-8.)；如WO 0181631所述聚合酶校正法可用于确定SNP的身份；通过酶扩增电子传导对单碱基对DNA突变的检测描述于Patolsky F等NatBiotech.(2001)19(3)：253-257。

序列特异性PCR法也已成功用于单核苷酸多态性的基因分型(Hawkins JR.等Hum Mutat(2002)19(5)：543-553)。或者，单链构象多态性(Single-Stranded Conformational Polymorphism，SSCP)测定或切割酶片段长度多态性(Cleavase Fragment Length Polymorphism，CFLP)测定可用于检测如本发明所述的多态性。

微流体装置的应用

所述包含皮升或飞升反应室阵列的微流体装置可用于生物测定和诊断。例如，使用成千上万至数百万个反应的核酸数字化定量提供了以下独特能力：(1)以高统计学能力区分非常小的等位基因失衡，(2)在单个分子上在长基因组距离中对靶序列进行共定位，以及(3)在高度同源性遗传背景下检测稀有事件。

数字化PCR测定的动态范围可描述为浓度相对于预计阳性反应数随着模浓度线性增加的浓度范围。不受理论的限制，分子在整个阵列上的分布是随机的，使得观察到线性响应，直至每个室的平均占据达到1，导致饱和。因此，数字化阵列的动态范围随着室的总数相应地变化。皮升体积区室化提供了可用于在高序列同源性大背景下检测稀有序列的浓度的有效增强。为了说明这一点，考虑进行在野生型背景下1个拷贝/1百万的相对浓度下(1千万野生型背景下10个拷贝的SNP)检测10个拷贝单核苷酸多态性(SNP)的情况。在此条件下，即便是微小量的野生型序列非特异性扩增也可能导致假阳性，使得任何PCR方法难以或者不可能进行检测。但是，将该样品分配到1000000个室，得到平均每个反应室10个拷贝的野生型序列。这些反应室中的大多数将不含有靶序列，而刚好10个反应室(大概率)会含有SNP的单拷贝。在此条件下，背景可以降低1百万倍，对SNP的检测可由仅能区分十个分子中一个的测定来实现。图4显示检测1百万个高序列同源性分子背景下单个分子所需的特异性和非特异性反应所需相对效率的体积依赖性。例如，使用30个循环的PCR反应以及所需信噪比10(通过特异性与非特异性扩增的比值来定义)，1μL反应器中所需相对反应效率为约6×。比较而言，如果该样品被分成100000个体积为10pL的反应器，则所需的反应效力比将为1.4。

通过将反应体积减少到数皮升并将样品中的核酸分散到平均每个反应少于一个，提供了高有效浓度。这还具有减少非特异性扩增和竞争反应的优点，否则其会提高背景。

数字化PCR提供了使用光学多重PCR测定基因重排频率的能力，所述基因重排导致在同一DNA分子上存在两个靶序列。因为将分子装载到多个分隔区中，所以它们本身随机且独立地分布。如果样品含有带两个靶序列的稀有分子亚群，则反应室内扩增的共定位会高于偶然的预计，表明存在该物质。此分析的统计学能力提高了室的总数，使得对于非常大的阵列来说，可以检测具有两个靶序列的少量物质，而与其确切的定位无关。这种能力应使得能够检测多种稀有基因重排，包括基因融合、转座、选择性剪接以及倒位。例如，此方法可用于使用单个双色多重测定来检测充分表征的BCR/ABL融合致癌基因的变体。22q11上的BCR与9q34上的ABL的融合是公知的染色体畸变，其在95％的慢性粒细胞性白血病(CML)病例、约25％的成年人急性淋巴母细胞性白血病(ALL)病例中以及约2-5％的儿童ALL病例中存在(Burmeister等人，2000.Leukemia14：1850)。RT-qPCR对共有融合转录本的检测通常用作诊断和预后的金标准。但是，由于过长的扩增子需要桥连内部外显子，大量可能的断裂点给设计检测所有转录本的引物带来了困难，排除了使用单一引物组。在大多数的融合中，外显子E1(BCR)和A11(ABL)位于融合位点的侧翼。可使用多重测定来检测掺有含BCR/ABL融合物之细胞(例如慢性髓性白血病原代细胞或者具有类似融合物的细胞系)的克隆cDNA的连续稀释物的基因组DNA样品中共定位的频率，以确定引起统计学上显著的共定位富集的融合物最小级分，在所述测定中使用FRET探针并使用两个引物组独立地检测外显子E1和A11以两种不同的颜色报告(FAM和Cal Orange)。

本领域技术人员会了解，序列内多态性位置的数字编号是相对于特定序列的。另外，根据序列编号的方法以及所选的序列，相同的位置可分配不同的数字编号。此外，序列变异例(如插入或缺失)可改变突变位点处及其周围的特定核苷酸的相对位置并因此改变数字编号。

表1：序列

SEQIDNO：	序列	描述
			1	CCGGTGCCACCTGTGGTCCACCTGACCCTCCGCCAGGCCGGCGACGACTTCTCCCGCCGCTACCGCCGCGACTTCGCCGAGATGTCCAGCCAGCTGC	应答曲线模板(BCL2)
2	GCCACCTGTGGTCCACCT	应答曲线引物
			3	TGGACATCTCGGCGAAGTCG	应答曲线引物
4	FAM-CGACGACTTCTCCCGCCGCT-BHQ	FAM-BHQ标记探针
			5	CACATTTGGAGGGCACAAAAGTGAGAAGCCGGCTCTGCCTCGGAAGAGGGCAGGGGAGAACAGGTCTGACCAGGTGACCCGAGGCACAGTAACGCCTCCCCCCAGGCTGGTGAAAAAGAATGAGGAAGCTGCTGATGAGGTCTTCAAAGACATCATGGAGTCCAGCCCGGGCTCCAGCCCGCCCAACCTGACTCCAAAACCCCTCCGGC	人ABL11模板
6	ATTTGGAGGGCACAAAAGTG	ABL11引物
			7	GGGGGAGGCGTTACTGTG	ABL11引物
8	ACAGGTCTGACCAGGTGACC	CalOrange标记探针
			9	ATCGAGCAGGAGCTGGAG	AIRE引物
10	TGCCGGTCATAGCTCTTCTT	AIRE引物
			11	GCTCCAGG	AIRE LNA探针1
12	ATTTGGAGGGCACAAAAGTG	ABL引物
			13	AGGGGTTTTGGAGTCAGGTT	ABL引物
14	ACAGGTCTGACCAGGTGACC	CalOrange用于ABL的标记探针
			15	<无>

16	<无>
			17	AAGCTTTCTCACAAGCATTTGGTTT	正向JAK引物

18	AGAAAGGCATTAGAAAGCCTGTAGTT	反向JAK引物
			19	TCTCCACAGACACATAC	野生型JAK探针(VIC标记)
20	TCCACAGAAACATAC	用于多态性的JAK探针(FAM标记)
			21	TCCTCAGAACGTTGATGGCAG	Jak2fwd
22	ATTGCTTTCCTTTTTCACAAGAT	Jak2rev

实验方法

芯片制造：使用标准多层软式光刻技术制造微流体聚二甲硅氧烷(PDMS)装置。通过利用20000dpi透明度掩模(CAD/Art Services)使用标准光刻技术产生抗光蚀剂的图案。产生色度掩模，以产生MegaPixel模(University of Alberta Nanofab)。使用软式光刻技术制备负模，将SU8-2025用于控制层，产生25微米厚的通道，而使用SU8-100来产生立方体反应室。10微米高的通道与反应室相连，由SU8-5制造。旋转SPR-220以实现10微米的厚度，用于产生流动线部分，其与阀相交(Unger M.A.等，2000.Science 288：113)。

简言之，将弹性体层(5∶1 GE RTV)旋涂至模上(250rpm×1分钟)，部分硬化。将蒸汽屏障(IPA清洁的透明度)置于反应室区域上，用7毫米弹性体层(5∶1 GE RTV)覆盖，脱气，在80℃下烘烤90分钟以使弹性体硬化，冷却1小时。将硬化的反应室层从模上剥离，将其与弹性体控制层(20∶1 GE RTV，之前旋涂于支持物基质上，500rpm×30秒+1875rpm×90秒，然后在80℃下烘烤45分钟)对齐。将两个层在80℃下烘烤1小时使其结合，冷却并从载体基质上剥离。在装置上打孔，将装置装于基底层上(20∶1 GE RTV，按照所述旋涂)。将最终的装配物在80℃下烘烤过夜，以使弹性体硬化。

所述装置由以硅片粘合的两层PDMS构成，其具有抬高的几何形状。通过首先以820RPM旋转PDMS层(5∶1 RTV A∶B)得到流动层。然后，将用于水蒸气控制的聚乙烯透明载玻片置于相关构造之上，将约40g的PDMS倾倒在整个硅片上，随后将其烘烤1小时。对于控制层，用PDMS(10∶1 RTV A∶B)涂覆硅片，以1800rpm旋转，随后烘烤45分钟。然后，将控制层和流动层对齐并共同烘烤。

芯片操作：首先将待分析样品与反应所需的所有试剂(引物、探针、dNTP、聚合酶、MgCl₂)混合，然后将其注入具有大规模平版印刷所限定室阵列特征的微流体通道结构。首先用PCR反应混合物加压填充PCR反应室。然后，用油对主流动通道加压。

所述室的几何形状确保了高表面张力，需要施加高压(约10PSI)以使得流体进入。所述几何形状辅助了其后的区室化，因为在所述室充满水流体之后，流动线的加压导致仅有连接通道中的溶液被油排出，而室本身中则不发生排出。

PCR测定和分析：除非另作说明，负责使用本发明微流体装置实施的所有PCR反应以ABI TAQ FAST master混合物按照制造商的说明进行，FAM的探针浓度为500nM，Cal Orange为250nM。向反应混合物中添加表面活性剂(0.1％吐温-20)。每种引物的浓度为750nM。热循环方案包括20秒热启动，95度1秒和60度30秒的40个循环。使用BioMark^TM系统(Fluidigm)进行热循环和成像。获得终点测量，并使用Matlab分析图像。模板(靶DNA)包含根据SEQ ID NO：1的人BCL2基因的一部分，由IDT(Integrated DNA Technologies)对其进行合成并进行PAGE纯化。此模板之前已通过实时PCR证明了100％的PCR效率。所用引物为GCCACCTGTGGTCCACCT(SEQ ID NO：2)和TGGACATCTCGGCGAAGTCG(SEQ ID NO：3)以及探针FAM-CGACGACTTCTCCCGCCGCT-BHQ(SEQ ID NO：4)，均由IDT合成。

为了监测装置间的变异，以不同颜色的测定使用对照，如下所述。由IDT合成来自人ABL11基因的模板(SEQ ID NO：5)并进行PAGE纯化。由IDT合成下列引物：ATTTGGAGGGCACAAAAGTG(SEQ ID NO：6)和GGGGGAGGCGTTACTGTG(SEQ ID NO：7)。由Biosearch Technologies合成下列CalOrange探针：ACAGGTCTGACCAGGTGACC(SEQ ID NO：8)。

21三体差异：用来自Roche Diagnostics的下列引物和探针靶向第21号染色体上AIRE基因区域：ATCGAGCAGGAGCTGGAG(SEQ ID NO：9)，TGCCGGTCATAGCTCTTCTT(SEQ ID NO：10)和LNA探针1(GCTCCAGG)(SEQ ID NO：11)。

用下列引物和探针靶向第9号染色体上的ABL基因：ATTTGGAGGGCACAAAAGTG(SEQ ID NO：12)，AGGGGTTTTGGAGTCAGGTT(SEQ ID NO：13)(由IDT合成)和来自Biosearch Technologies的CalOrange-ACAGGTCTGACCAGGTGACC-BHQ1(SEQ ID NO：14)。向基因组DNA中掺入6％的获得自Child and Family Research Institute，Vancouver，BC的纯三体21 DNA。将用于数字化PCR反应的最终DNA样品设置为获得约20％的填充因数。本应用使用具有90000个室的装置。

JAK2测定：

从来自杂合患者的扩增子产生Jak2野生型和突变体质粒。简言之，使用下列引物扩增453bp靶标：

Jak2fwd TCCTCAGAACGTTGATGGCAG(SEQ ID NO：21)，和

Jak2rev ATTGCTTTCCTTTTTCACAAGAT(SEQ ID NO：22)。扩增条件为50℃退火温度，3.5mM MgCl₂浓度，由100ng的基因组DNA起始。将PCR产物在7％聚丙烯酰胺凝胶上电泳，以验证正确大小的片段。使用TOPO TA亚克隆试剂盒(Invitrogen)按照制造商的说明进行亚克隆。简言之，将1微升的PCR产物与1微升缓冲液和1微升线性化活化载体以及3微升dH₂O合并，在室温下孵育5分钟，然后置于冰上。将4微升的克隆反应物与一等分试样的试剂盒所提供的感受态细胞混合，在冰上孵育5分钟。将50微升的转染反应物置于LB氨苄西林平板上，在37℃下培养过夜。将10个单菌落挑至LB amp培养基，过夜培养，然后分离DNA。

使用Qiagen Midi质粒纯化试剂盒分离质粒DNA。在基于Taqman的等位基因辨别测定(Applied Biosystems)中逐个检测来自10个单菌落的DNA。进一步分离出Jak2野生型(质粒A)和Jak2突变体(质粒B)各一个进行后续研究。

所述质粒用作恒定野生型背景(wt或WT)和量逐渐增加的突变体(mt或MT)的模板(1∶1的wt∶mt至1∶1000)。反应中使用750nM终浓度的引物和探针，其具有以下序列：

正向引物AAGCTTTCTCACAAGCATTTGGTTT(SEQ ID NO：17)

反向引物AGAAAGGCATTAGAAAGCCTGTAGTT(SEQ ID NO：18)

探针(MGB)

WT TCTCCACAGACACATAC (VIC)(SEQ ID NO：19)

MT TCCACAGAAACATAC(FAM) (SEQ ID NO：20)

野生型浓度为约0.5个质粒/室。本应用使用具有90000个室和五个入口管线的装置。应用40个循环的PCR，使用Matlab程序对阳性室的数目进行计数。

实施例1：

大规模微流体乳液阵列中靶核酸的扩增

使用包含选定的蒸汽屏障覆盖的装置来证明PCR实验中蒸发的作用。将室密度为1个室/1600μm²的具有图2d所示室几何形状的微流体装置设计成具有5个分离的室阵列，从而在同一芯片上测试不同的样品。将PCR溶液引入所述装置中，并按照图3中所示进行区室化。使用GAPDH的标准TaqMan测定和TaqMan(Applied Biosystems)来监测反应的进展，模板DNA浓度为约10个拷贝/反应室。使反应进行40个循环，在图5中显示终点图。

图5的显微照片显示一个实验的结果。由蒸汽屏障覆盖的含有阳性对照的反应室(阳性对照区A和D)成功扩增了靶核酸，而位于蒸汽屏障覆盖区域之外的阳性对照反应室(阳性对照区E的部分)未成功扩增。

通过将蒸汽屏障并入微流体装置中，我们证明了在高达90000个体积约30皮升的反应室阵列中进行可靠的单分子扩增。

实施例2

靶DNA的单拷贝扩增

通过将初始DNA(靶核酸)稀释使得每个反应室仅含有一个DNA分子或没有，可以定量鉴定样品中所存在DNA的初始量。因为每个具有光信号的室显示在PCR扩增之前存在靶核酸，所有只有含有靶核酸拷贝的反应室会提供检测荧光信号以供检测。

如所述，通过将流体线与含稀释DNA的PCR溶液的加压储器相连而对微流体芯片进行加载。在填充了所有室之后，在主流动线中压入Fluorinert^TM油，从而排出除室以外所有地方的流体，所述芯片准备好进行热循环。随着PCR反应的进行，在每个循环时拍摄芯片的图像。因此，可以见到DNA产物随每个循环增加(通过荧光信号)。这示于图6。所述反应室的每侧为30微米。随着循环数的增加，来自阴性对照反应室的信号保持在背景水平，而来自阳性对照的信号呈指数增加。

我们已经证明，通过在具有百万个反应室的芯片上进行数字化PCR，由于大大增加了动态范围而可以非常精确地对DNA分子进行计数。特别地，此类分析对于与已知对照相比对稀有基因表达产物进行计数来说是至关重要的。由于可以使用几种不同的探针，可以定量鉴定几种基因的表达谱。

实施例3：

小等位基因失衡的区分：非侵入性检测胎儿21三体

使用数字化PCR计数，利用本文所述的微流体阵列检测染色体数的少量失衡。为了确定样品中C21增加1.5％，对于5σ的确定性约需要9000000个PCR反应：

n_C21-n_C15＝mε＝kσ＝k√n_C21 ε＝1.5％

n_C21＝N_室p(1+ε) n_C21＝m(2+ε)

M是基因组等同物的数目(1组基因组＝每个染色体各两个)。采样噪声σ是21号染色体数的平方根。如所讨论的，如果使用常规PCR技术，这个反应数非常大，实际上是不可能的。使用包含10⁶个反应室的微流体阵列将该数目的反应压缩到有可能实现的规模。

使用对已知分别以单拷贝存在于21号和9号染色体上的AIRE基因和ABL基因的数字化检测来确定21号(C21)和9号(C9)染色体的拷贝数。在相对于正常基因组样品中获得的计数进行归一化后，对90000个数字化室的掺有6％的21三体DNA的样品的测定显示预计的3％AIRE基因的富集(图7)。这些测定代表了目前为止所报道的任何PCR技术的最高区分能力，可以直接的方式将其扩展至检测1％以下的差异。令人感兴趣的是，对正常基因组DNA中AIRE和ABL的测定显示与阳性反应室绝对数目相一致的差异。

实施例4

在高同源性背景下检测稀有序列：JAK2测定

作为其原理的证实，分析了含有Jak2基因中SNP突变(V617F)的质粒样品。V617F突变对于几种脊髓增生性疾病(例如真性红细胞增多、特发性血小板增多、特发性骨髓纤维化)以及几种白血病具有特异性。使用SNP区域特异性的探针以及共用引物检测含有野生型Jak2基因或V617F变体的质粒。FAM中的探针用于检测SNP，而VIC中的探针用于检测V617F突变体。检测在恒定野生型背景下含有不同量突变体的样品，所述测定能够检出低至1∶1000的突变体与野生型的比值，与此相比，文献报道的最低值为5∶100(Bosdquet等人，2006.Hum Pathol 37：1458)。这些结果在图8A、B中显示。

皮升体积区室化使可用于在高序列同源性大背景下检测稀有序列的浓度得到有效增强。在1个拷贝/1千相对浓度的野生型背景下(1000个野生型背景中1个拷贝的SNP)检测数个拷贝单核苷酸多态性(SNP)的检测不易于用非数字化技术进行检测。在这种情况下，即便极少量的野生型序列非特异性扩增也会导致假阳性，使得任何PCR方法进行的检测极度地困难或者不可能完成。但是，将该样品分配到100000个室，导致每个反应室平均为100个拷贝的野生型序列。这些反应室中的大多数不含有靶核酸，而100个反应室(大概率)含有包含SNP的单拷贝靶核酸。在这种情况下，背景可以降低4个数量级，对SNP的检测可由仅能够区分十个分子中一个的测定来实现。

实施例5

微流体阵列用于产生测序文库的应用

可使用自动化测序仪或系统产生测序文库，所述测序仪或系统依赖于通过延伸进行测序或通过连接进行测序。这些测序技术中的关键步骤是在测序之前定位扩增单个分子。在此步骤中，可将待测序DNA模板的单个分子与其邻近分子分隔开，使用聚合酶链式反应或滚环扩增对其进行扩增。例如，根据本发明的微流体装置可装载微米级的珠，其浓度选择成得到每个室中有数个珠。包含约10000000个反应室的装置可以约0.1至约0.5的浓度装载含有靶核酸的PCR反应混合物中的珠混悬液。提供平均约5个珠/室的足量的珠。基于泊松统计，这种装载会得到含有样品的约1000000个室，它们中约95％含有单个模板，它们几乎全部含有至少一个珠(平均为5个)。扩增后，将珠从所述室中除去。从室除去珠的方法实例包括清洗步骤或者将微流体装置从支持物(例如玻璃)上剥离的步骤。可回收所述珠用以测序。这会得到约5000000个珠的文库，其中约95％连接有单一序列，代表约1000000个分子的总样品大小。这些文库的大小还可通过制造具有更多室的装置或者通过使用多个装置而进一步提高。

所有引用均通过参考并入本文。

已通过举例方式描述了一个或多个目前优选的实施方案。对本领域技术人员来说很明显的是，可在不脱离权利要求所定义的本发明范围的情况下，进行多种改变和修改。

权利要求书(按照条约第19条的修改)

1.微流体装置，其包含：

共面排列的多个盲端反应室，所述盲端反应室与在弹性体基底中形成的流动通道以无阀微流体方式流体连通；和

蒸汽屏障，其施加在与所述多个反应室平行的面上，并由弹性体层与所述反应室分隔开。

2.根据权利要求1的装置，其还包含沿流动通道设置的多个阀，所述多个阀中的每一个包含一个或多个与流动通道相交的控制通道。

3.根据权利要求1的装置，其中所述阀设置在所述流动通道的第一端和第二端。

4.根据权利要求1的装置，其中所述反应室的体积小于一纳升。

5.根据权利要求1的装置，其中所述反应室的体积为约10pL至约100pL。

6.根据权利要求1的装置，其中所述反应室含有一种或多种预先放置的试剂。

7.根据权利要求1的装置，其中所述共面排列的盲端反应室具有小于约200μm的间距。

8.根据权利要求1的装置，其中所述弹性体层的厚度为约10μm至约1000μm。

9.根据权利要求1的装置，其中所述反应室以5000或更多个室/cm²的密度存在。

10.对微流体装置中的液体进行区室化的方法，其包括：

将第一液体加压充入流动通道和多个盲端反应室中，所述盲端反应室共面排列，并与流动通道流体连通；并通过对气体通透但对液体不通透的反应室壁排出所述盲端反应室中的空气；

用第二液体冲洗所述流动通道并排出所述流动通道中的第一液体而不排出反应室中的第一液体，所述第二液体与所述第一液体不混溶；

其中多个反应室中每一个中的所述第一液体通过所述流动通道中的第二液体与每个其它反应室中的第一液体分隔开。

11.根据权利要求10的方法，其中所述样品还包含用于PCR的一种或多种试剂。

12.根据权利要求10的方法，其中所述反应室的体积小于一纳升。

13.根据权利要求10的方法，其中所述反应室的体积为约10pL至约100pL。

14.根据权利要求10的方法，其中所述第一液体是水溶液。

15.根据权利要求10的方法，其中所述第二液体是非水液体。

16.根据权利要求10的方法，其中所述第一液体包含PCR反应混合物。

17.根据权利要求10的方法，其中所述第一液体包含样品。

18.根据权利要求10的方法，其中所述反应室含有一种或多种预先放置的试剂。

19.根据权利要求10的方法，其中所述微流体装置还包含蒸汽屏障，其位于与所述多个反应室平行的面上，并由弹性体层与所述反应室分隔开。

20.对靶核酸进行数字化定量的方法，所述方法包括：

将包含靶核酸的第一液体加压充入流动通道和多个盲端反应室中，所述多个盲端反应室共面阵列并与微流体阵列的流动通道流体连通，并通过对气体通透但对液体不通透的反应室壁排出盲端反应室中的空气；用第二液体冲洗所述流动通道并排出所述流动通道中的第一液体而不排出反应室中的第一液体，所述第二液体与所述第一液体不混溶；

其中多个反应室中每一个中的所述第一液体通过所述流动通道中的第二液体与每个其它反应室中的第一液体分隔开；以及

孵育所述微流体阵列。

21.根据权利要求19的方法，其中所述反应室的体积小于一纳升。

22.根据权利要求20的方法，其中所述反应室的体积为约10pL至约100pL。

23.根据权利要求20的方法，其中所述第一液体是水溶液。

24.根据权利要求20的方法，其中所述第二液体是非水液体。

25.根据权利要求20的方法，其中所述第一液体包含PCR反应混合物。

26.根据权利要求20的方法，其中所述第一液体包含样品。

27.根据权利要求20的方法，其中所述反应室含有一种或多种预先放置的试剂。

28.根据权利要求20的方法，其中所述靶核酸在第一液体中的浓度适于在所述多个反应室中平均为每个反应室提供少于约三个靶核酸。

29.根据权利要求20的方法，其中所述靶核酸在第一液体中的浓度适于在所述多个反应室中平均为每个反应室提供少于约一个靶核酸。

30.根据权利要求20的方法，其中所述靶核酸在第一液体中的浓度适于在所述多个反应室中平均为每个反应室提供少于约0.5个靶核酸。

31.根据权利要求20的方法，其中所述靶核酸在第一液体中的浓度适于在所述多个反应室中平均为每个反应室提供少于约0.1个靶核酸。

32.根据权利要求20的方法，其中所述孵育步骤包括热循环。

33.根据权利要求20的方法，其中所述第一液体包含至少两种靶核酸。

34.根据权利要求32的方法，其中所述至少两种靶核酸中的每一种在第一液体中的浓度适于在所述多个反应室中平均为每个反应室提供少于约3个靶核酸。

35.根据权利要求32的方法，其中所述孵育步骤包括光学多重测定。

36.微流体装置，其包含：

与弹性体基底中形成的流动通道连通的多个共面排列的盲端反应室；以及

所述多个盲端反应室中的每一个由壁以及防止两个或更多个反应室之间流体连通的流体屏障限定边界。

37.根据权利要求34的装置，其还包含施加在与所述多个反应室平行的面上并通过弹性体层与所述反应室分隔开的蒸汽屏障。

Claims

1.微流体装置，其包含：

与在弹性体基底中形成的流动通道流体连通的多个反应室；和

共面施加至所述多个反应室并由弹性体层与所述反应室分隔开的蒸汽屏障。

2.根据权利要求1的装置，其还包含沿流动通道设置的多个阀，所述多个阀中的每一个包含与流动通道相交的一个或多个控制通道。

4.根据权利要求1的装置，其中所述反应室为皮升或飞升体积。

5.根据权利要求1的装置，其中所述反应室是盲端反应室。

6.根据权利要求5的装置，其中所述反应室含有一种或多种预先放置的试剂。

7.根据权利要求1的装置，其中所述反应室以5000或更多个室/cm2的密度存在。

8.对微流体装置中的流体进行区室化的方法，其包括：

向与流动通道流体连通的多个反应室中充入第一流体；

用第二流体冲洗所述流动通道，并排出所述流动通道中的第一流体而不排出反应室中的第一流体，所述第二流体与所述第一流体不混溶；

其中所述多个反应室中每一个中的所述第一流体通过所述流动通道中的第二流体与每个其它反应室中的第一流体分隔开。

9.根据权利要求8的方法，其中所述样品还包含一种或多种用于PCR的试剂。

10.根据权利要求8的方法，其中所述反应室为皮升或飞升体积。

11.根据权利要求8的方法，其中所述第一流体是水溶液。

12.根据权利要求8的方法，其中所述第二流体是非水流体。

13.根据权利要求8的方法，其中所述第一流体包含PCR反应混合物。

14.根据权利要求8的方法，其中所述第一流体包含样品。

15.根据权利要求8的方法，其中所述反应室是盲端反应室。

16.根据权利要求8的方法，其中所述反应室含有一种或多种预先放置的试剂。

17.对靶核酸进行数字化定量的方法，所述方法包括：

向与微流体阵列的流动通道流体连通的多个反应室中充入包含靶核酸的第一流体；

其中多个反应室中每一个中的所述第一流体通过所述流动通道中的第二流体与每个其它反应室中的第一流体分隔开；以及

孵育所述微流体阵列。

18.根据权利要求17的方法，其中所述反应室为皮升或飞升体积。

19.根据权利要求17的方法，其中所述第一流体是水溶液。

20.根据权利要求17的方法，其中所述第二流体是非水流体。

21.根据权利要求17的方法，其中所述第一流体包含PCR反应混合物。

22.根据权利要求17的方法，其中所述第一流体包含样品。

23.根据权利要求17的方法，其中所述反应室是盲端反应室。

24.根据权利要求17的方法，其中所述反应室含有一种或多种预先放置的试剂。

25.根据权利要求17的方法，其中所述靶核酸在第一流体中的浓度适于在所述多个反应室中平均为每个反应室提供少于约一个靶核酸。

26.根据权利要求17的方法，其中所述靶核酸在第一流体中的浓度适于在所述多个反应室中平均为每个反应室提供少于约0.5个靶核酸。

27.根据权利要求17的方法，其中所述孵育步骤包括热循环。

28.微流体装置，其包含

与在弹性体基底中形成的流动通道连通的多个反应室；以及

防止两个或更多个反应室之间流体连通的流体屏障。

29.根据权利要求28的装置，其还包含共面施加于所述多个反应室并通过弹性体层与所述反应室分隔开的蒸汽屏障。