CN101514320B

CN101514320B - 核酸扩增用器件

Info

Publication number: CN101514320B
Application number: CN2008101814482A
Authority: CN
Inventors: 梶山智晴; 白井正敬; 神原秀记
Original assignee: Hitachi Ltd
Current assignee: Hitachi Ltd
Priority date: 2008-02-21
Filing date: 2008-11-13
Publication date: 2012-09-26
Anticipated expiration: 2028-11-13
Also published as: US9278355B2; JP5283924B2; JP2009195160A; US20090215162A1; CN101514320A

Abstract

本发明提供一种核酸扩增用器件。所述核酸扩增用器件能够在试样的独立化扩增过程的前后，维持靶分子的存在比例，得到能应用于基因表达解析的高精度的解析结果。本发明的核酸扩增用器件具有平面状地配置多个微小反应池的结构，所述反应池具有1组微珠保持空间和试剂反应空间，所述微珠保持空间能够仅保持1个解析用微珠，所述试剂反应空间不保持微珠但具有能够进行试剂反应的充分的容积。

Description

核酸扩增用器件

技术领域

本发明涉及基因解析技术。更详细地讲，涉及核酸扩增用器件，所述核酸扩增用器件在独立地在微珠等固相表面对作为测定对象的mRNA等靶分子进行扩增时，使这些靶分子的利用率提高，消除靶分子的混合或过度扩增。

背景技术

在基因序列解析技术中，对于作为测定对象的mRNA或DNA片段等靶分子，在保存其序列信息的状态下对其进行扩增是重要的技术。作为其一例，有利用焦磷酸测序(Pyrosequencing)的序列解析系统(非专利文献1)。该系统中，为了使作为测定对象的靶分子在1个微珠表面上仅为1种，需要实现靶分子的独立扩增。

另一方面，还有利用通过油中的水溶液胶束进行的分离作为实现独立扩增的要素技术的方法(非专利文献2)。该方法中，通过2相(水相、油相)的搅拌，形成水溶液胶束，在该胶束内保持微珠、靶分子和核酸扩增所需要的一组试剂等，通过扩增仪在微珠表面扩增核酸。因此，理想的情况是在1个胶束内放入微珠和靶分子各1个。但是，对于全部胶束，实现这样的条件是不可能的，通常存在如下情况，即，有微珠但不含靶分子的胶束、反之有靶分子但没有微珠的胶束、进而放入有多个微珠和靶分子的胶束、微珠和靶分子都没有放入的胶束等(非专利文献2)。在1个胶束内放入有多个靶分子的情况下，扩增时发生它们的混合存在，使序列解析成为不可能。另外，尽管胶束中存在靶分子，但在没有放入微珠的情况下，靶分子不能在微珠表面扩增，导致靶分子的损失。进而，在胶束内放入有多个微珠的情况下，由于来自相同靶分子的扩增在多个微珠表面发生，因此产生过度解析的问题。

进而，还报告有在载玻片等平板表面上生成部分的聚集区域(集落)的扩增方法(非专利文献3)。该方法是，使用在平板上固定有扩增用引物的物质，以确保某种距离的浓度分布使靶分子与平板上的引物进行互补链结合，之后，利用周边的引物，反复进行引物延伸和桥状的互补链结合，从而形成扩增物质的集落。该方法的问题是，由于对平面上的引物的互补链结合的效率低，因此需要过量的靶分子，并且如果多个靶分子接近进行互补链结合时，则扩增物的集落结合，发生混合。

非专利文献1：NATURE，Vol.437，pp.376-380(2005)

非专利文献2：PNAS，Vol.100，No.15，p8817-8822(2003)

非专利文献3：Cell，Vol.129，p823-837(2007)

发明内容

发明要解决的问题

如上所述，现有技术中，就靶分子的扩增来说，存在如下问题：(1)由于水滴(胶束)内没有微珠，因此不能对该胶束内的靶分子进行解析；(2)胶束内存在多个微珠，生成多个固定来自靶分子的扩增产物的微珠，形成过度解析。因此，在称为扩增工序的解析前处理的前后，不能维持靶分子的存在比例，即使统计性地解析得到的序列信息的频度，也不能得知所用的靶分子的比例，难以应用于基因表达解析。

另外，各胶束的大小即容量依赖于胶束生成时的搅拌，因此其大小的变动很大。故此，扩增反应时的试剂量变动，结果，得到的微珠上的扩增物的量也有很大变动。因而，例如，在利用上述焦磷酸测序的解析中，每个微珠的信号量大幅变动，因此存在检测系统的动态范围(dynamic range)不足，存在发生由检测限以下或超出检测灵敏度引起的无法检测的事故这样的问题。

本发明的课题是解决这些现有技术的问题，提供高效率高精度的核酸扩增用器件。

解决问题的手段

本发明人等，为了解决上述问题，想出了能够使直径数十微米以下的微小微珠一个一个地反应、大规模的平行扩增用器件。

也就是说，本发明涉及核酸扩增用器件，作为一个例子，其为平面状配置多个反应池的核酸扩增用器件，所述反应池具有1组能够保持1个第1微珠的第1空间和与所述第1空间相对的第2空间，该核酸扩增用器件的特征在于，按照使所述第1微珠不位于从所述平面状的面看时的所述第1空间和所述第2空间不重叠的区域的方式来配置所述第1空间和所述第2空间。

某实施方式中，微珠保持空间(能够保持1个第1微珠的第1空间)和试剂反应空间(相对的第2空间)直接上下连接。这时，相对于1微珠的直径r，各空间的高度和直径满足以下条件，从而按照使1个微小反应池保持1个微珠的方式来构成反应池(微小反应池)：

1)微珠保持空间的高度大于1/2r且小于3/2r；

2)微珠保持空间的高度和试剂保持空间的高度之和为2r以下；

3)微珠保持空间的直径大于r且小于2r。

微珠保持空间和试剂反应空间也可以用细管连接，所述细管具有比微珠的直径小的直径。

本发明还提供一种核酸扩增用器件，其具有这样的结构：平面状配置多个微小反应池，所述微小反应池具有1组能够仅保持1个解析用微珠的微珠保持空间1、不保持微珠的试剂反应空间和能够仅保持1个与所述解析用微珠不同种类的微珠的微珠保持空间2。该器件，例如可以使预先固定有试样核酸的微珠保持于微珠保持空间2。

某个实施方式中，试剂反应空间位于微珠保持空间1和微珠保持空间2之间。此时，对于微珠的直径r，各空间的高度和直径满足以下条件，从而按照使1个微小反应池保持1个微珠的方式来构成：

1)微珠保持空间1和2的高度大于1/2r且小于3/2r；

2)微珠保持空间1或2的高度和试剂保持空间的高度之和为2r以下；

3)微珠保持空间1和2的直径大于r且小于2r。

另外的实施方式中，微珠保持空间1和微珠保持空间2用细管连接，所述细管具有比微珠的直径小的直径。

本发明的器件中，所述微小反应池能够通过组装而流通池(flowcell)化，另外，通过设置覆盖其开口面的部件(上板)，各微小反应池的独立化成为可能。该覆盖开口面的部件(上板)最好具有含密封材料等弹性材料的层。

另外，微小反应池的与流通池接触的空间的壁面不一定必须是垂直的，通过按照朝流通池侧打开来使其倾斜，可以使多余的微珠容易流出。

发明的效果

根据本发明，在大规模平行型核酸序列技术中，能够减少不实施解析的靶分子，提高应用于基因表达解析时的解析精度。另外，能够减少大规模平行解析时不能解析的试样，使解析效率提高。

附图说明

图1是器件的部分截面图。

图2是器件的整体图。

图3是微小反应池的扩大图。

图4是将器件流通池化的组装图。

图5是说明微珠被保持于微珠保持空间的构造的图。

图6是说明微珠保持及流出的图。

图7是说明试剂反应空间的直径大、微珠保持空间的第1微珠和第2微珠不接触时，微珠保持及流出的图。

图8是说明试剂反应空间的壁面倾斜时，微珠保持及流出的图。

图9是表示微小反应池的独立化的图。

图10是表示上板具有2层结构的构成的图。

图11是微小反应池被独立化的器件的整体图。

图12是说明使用2种微珠的器件的微珠保持及流出的图。

图13是说明第2种微珠比第1种微珠大时，微珠保持及流出的图。

图14是将2种微珠1个1个地独立化的微小反应池的图。

图15是说明第2种微珠比第1种微珠小时，微珠保持及流出的图。

图16是说明2个空间用细管连接的结构的微小反应池的图。

图17是表示器件的流通池化的图。

图18是表示微小反应池的独立化的图。

图19是表示第1种微珠保持空间和第2种微珠保持空间用细管连接的构成的图。

图20是说明第1种微珠保持空间和第2种微珠保持空间用细管连接的构成中，微珠保持及流出的图。

图21是说明1个微珠被微小反应池捕捉的情况的图。

符号说明

101......微小反应池；301......微珠保持空间；302......试剂反应空间；310......微珠保持空间高度；311......试剂反应空间高度；320......微珠保持空间直径；321......试剂反应空间直径；401......平行扩增器件；402......上板；403......隔离(spacer)材料；404......成为流通池的空间；405......流入口；406......排出口；501，502......微珠；503......空间；601，701......触点；702......角度；901......上板；902......试剂反应空间；1001......主体；1002......密封材料；1202......微珠；1201......微小反应池；1203......微珠保持空间；1204......上板；1205......密封材料；1303......上板；1301，1302......微珠；1401......上板；1402......密封材料；1601，1604，1607......直径；1602，1605，1608......高度；1603......第1空间；1606......第2空间；1609......细管；1701......下板；1702......上板；1703，1704......微珠；1801......下板；1902，1901......微珠；2001......试剂反应空间；2002......琼脂糖凝胶(Sepharose)扩增用微珠；2003......氧化锆微珠；2101......微珠；2102，2104......捕捉空间(2012和2103之间，2104和2105之间......试剂反应空间)。

具体实施方式

通过本发明的实施例详细地说明本发明，但本发明不限于这些实施例。

实施例1

器件的基本构成

实施例1表示本发明的器件的基本构成。图1是本发明的对作为靶分子的核酸进行平行扩增的器件的部分截面图。图2表示器件的整体图。图2的虚线部分A-A’的截面图是图1。这里，表示的是在长方形的平板表面具有多个微小反应池101的结构，但本发明的器件不限于此。

图3是微小反应池的截面。本实施例中，微小反应池具有圆柱状的微珠保持空间301和圆柱状的试剂反应空间302。各自的高度和直径设定为310、311和320、321。这里，池的形状，只要能够获得后述的本发明的效果，就不限于圆柱状。

高度310和直径320按照以下条件来设计。所用的微珠的直径设定为r的话，首先，是高度(310)满足(1/2r)<高度(310)<(3/2r)的条件。高度(310)和高度(311)之和为2r以下。另外，关于直径，微珠保持空间的直径320需要满足r<直径(320)<2r。通过该条件，能够在反应池保持1个微珠。

器件的流通池化

图4表示器件的流通池化。如图4所示，器件具有重叠有平行扩增器件401、上板402和隔离材料403的结构，在隔离材料403的中央部分具有成为流通池的空间404。空间404投影于器件上的407。器件上的微小反应池组用410表示。上板402具有流入口405和排出口406，从流入口405流入含有微珠的溶液，从而使微珠保持于流通池内的微小反应池。

图5表示微珠被保持于微珠保持空间的构造。图5中，图示有微珠501和微珠502。空间503被含有微珠的溶液充满，左为流入口侧，右为排出口侧，溶液左右地反复流动，一部分微珠如图所示地落入微小反应池内。微珠501进入微小反应池的微珠保持空间，在左右的溶液流动中，由于不容易流出，因此被保持在微珠保持空间。另一方面，微珠502通过试剂的流动，再次流出到流路部分。

图6是表示微珠的保持及流出的图。微珠501和502接触的状态下，微珠502在触点601与池的壁面接触。微珠的切线与壁面的延长上的微珠接触的面所成的角用602表示，其不为0时，随着试剂的流动，微珠流出。因此，如图6所示，在微珠保持空间有1个微珠的状态下，如果第2微珠502与池接触的角度相比于池壁面与微珠切线一致的条件为正数的话，第2微珠502被排出，因此对于1个微小反应池，成为仅保持1个微珠的条件。

图7表示试剂反应空间的直径321大，微珠保持空间的第1微珠与第2微珠不接触的例子。此时也同样地，如果成为对于触点701，角度702为正数的条件，则对于1个微小反应池，可以期待仅保持1个微珠。为了使角度702为正数，高度311需要是高度(311)<(1/2r)。

图8表示试剂反应空间的壁面为倾斜的例子。如图所示，使试剂反应空间的壁面相对于流动为不垂直，向外侧倾斜，则第2微珠变得更容易排出。

如上所述，本发明的器件按照1个微小反应池保持1个微珠的方式来构成(1个微珠/1个微小反应池)。通过左右振动试剂数次，能够容易地使几乎所有反应池保持有微珠。

试剂反应空间的独立化和核酸扩增

如果达到1个微珠/1个微小反应池的条件，则剩余的微珠全部通过流通池排出。然后，流通池内，流入靶分子和核酸扩增所需要的引物、酶等试剂，充满微小反应池。此时，每1个池的试剂的容量是微小反应池的容量减去1微珠的体积得到的。因此，靶分子的浓度稀释至1个池只装入1分子的程度。这里，稀释大的话，则不含靶分子的比例变高，但本发明中，由于在扩增结束后检测扩增的有无，因此没有问题。反而，降低2分子同时装入反应池的可能性是很重要的。

图9表示微小反应池(试剂反应空间)的独立化。如图9所示，注入试剂后，通过拆除流通池，将上板901设置在池上，使得各微小反应池和池内的试剂反应空间902可以被独立化。其结果是，在具有1个微珠的各个微小反应池中，能够独立实施核酸扩增。

图10是上板具有2层结构的例子。如图所示，上板具有主体1001和硅橡胶等有弹性的薄密封材料1002的2层结构，从而能够实现更确实的试剂反应空间的独立化。

图11表示将试剂反应空间独立化的器件的整体图。如图11所示，通过被1片上板(本图中，是主体1101和密封材料1102的2层结构)覆盖，使得全部微小反应池在空间上成为独立。图11的结构的情况下，如果器件的厚度为2mm以下，则使用以往的载玻片用扩增仪，就可以容易地实施核酸扩增。核酸扩增后，回收全部微珠，检测核酸扩增的有无。核酸扩增的有无可以通过现有报道(PNAS，Vol.100，No.15，p8817-8822(2003))所记载的方法等来检测。

实施例2

这里，作为本实施例，使用直径50μm的微珠作为固相，说明研究DNA扩增的结果。首先，所利用的微小反应池的尺寸，在图3中，直径320是80μm，直径321是500μm，高度310和高度311分别是40μm和20μm。微小反应池，是利用以聚碳酸酯作为材料的纳米压印(Nanoimprint)形成来制作的。微小反应池，在制作时显示疏水性，但通过表面处理能够实现亲水化。例如，熟知的方法有用含有PEG等两亲性聚合物的水溶液洗涤表面，或者照射几分钟程度的紫外线灯等方法(Anal.Chem.2001，73，4196-4201)。我们通过照射水银灯(40mW/cm²)10分钟，在抑制着色的同时实现亲水化。所利用的微珠是以氧化锆为材料的微珠。氧化锆微珠，比重大至5～6，可以通过自重容易地沉降在池中，因此容易制作1个微珠的状态。微珠表面具有由表面以C12连接链(linker)连接的20碱基的低聚物。其与扩增对象DNA分子的扩增用引物的单侧是相同序列，作为扩增用引物发挥作用。这里，扩增对象是mRNA时，可以利用在微珠表面结合有由表面以C12连接链连接(polyT)的低聚物的物质。这时，也能够应用特开2007-319028记载的技术。

本实施例中，用上板覆盖时的微小反应池的总容量为约4128pL。1个微珠的体积为约65pL，因此具有1个微珠的微小反应池的反应溶液总量成为约4063pL。如果将扩增对象试样DNA调整为最终浓度约0.4fmol/L以下，则可以实现1微小反应池内1分子。

基因的扩增如下。作为装入微小反应池的反应液，除了试样DNA以外，还使用了表1组成的PCR反应溶液。F引物是与微珠表面固定的序列相同的引物。扩增的温度循环为94℃15秒钟，56℃30秒钟，70℃30秒钟，重复40个循环。结果，在微珠表面可以得到连接于F引物的单链化DNA扩增物。

表1 PCR扩增试剂条件

Tris-HCl(pH8.8)	67mM
		NH₄SO₄	16.6mM
MgCl₂	6.7mM
		巯基乙醇	10mM
dNTPs	1mM
		F引物	0.05μM
R引物	25μM
		Taq聚合酶	15unit

实施例3

本发明中，微小反应池表述为圆柱状和圆锥状。就利用球形的微珠来说，认为，圆柱状和圆锥状的形状，与微珠的水平方向的中心截面形状相似，试剂反应空间从中心360度各向同性扩展，因此适于扩增物向微珠的固定。

但是，根据本发明的目的，形状不限于圆柱状和圆锥状。进一步来讲，从制造上的适宜性来看，有时其他形状是合适的。例如，如前所述，作为器件，利用有机树脂的纳米压印形成时，其制造中所使用的压模制作的简便性，在实际中是重要的。压模，例如容易利用多在通常的半导体制造工艺中所利用的掩模和光曝光带来的形成。但是，这时，作为描画为掩模的形状，含有曲线这是增加工艺的一个原因。因此，我们发现，制作近似于圆形的6角形的池，达到同样的功能。

图21是微小反应池捕捉1个微珠时的说明图。(1)是圆柱状，(2)是6角形状的例子。捕捉微珠2101时，圆柱状时捕捉空间以2102显示，试剂反应空间成为2102和2103所夹的区域。如果微小反应池由6角柱构成，则捕捉空间以2104显示，试剂反应空间成为2104和2105所夹的区域。这时，确认具有与圆柱状的池同样的功能。

实施例4

实施例4中，显示了将具有2种不同微珠保持空间的微小反应池1对1独立化而具备的器件。

图12是，在保持第1种微珠1202的微小反应池1201上，设置具有第2种微珠保持空间1203的上板1204和密封材料1205的状态。将该器件与实施例1的图4的器件401同样地，进行流通池化，流入含有第2种微珠的试剂。

图13表示在由上板1303流通池化的器件中，第2种微珠1301和1302的流入和保持。图13中，特别表示了第2种微珠比第1种微珠1202大的例子。这时，与实施例1同样地，第2种微珠中，微珠1301保持于微珠保持空间1203，但微珠1302不被保持而再次流出。结果，微小反应池中，第1种微珠1202和第2种微珠1301各被保持1个。

图14表示通过用上板覆盖而独立化的微小反应池。如图14所示，上述操作后，通过设置上板1401和密封材料1402，能够实现微小反应池的独立化。通过该构成，能够将扩增前的试样固定于一方的微珠表面，将扩增物固定于另一方的微珠表面。

图15是第2种微珠比第1种微珠小的例子。这样的情况下，通过与上述相同的操作，可以实现微小反应池的独立化。

实施例5

实施例5中，显示了具有用细管连接微珠保持空间和试剂反应空间的结构的器件。

图16表示用细管连接2个空间的结构。这里，用直径1607、高度1608的细管1609连接直径1601、高度1602的第1空间1603和直径1604、高度1605的第2空间1606。该器件中，第1空间作为微珠保持空间，第2空间作为试剂反应空间。

图17表示本器件的流通池化。如图17所示，在通过下板1701关闭第2空间的状态下，与图4同样地，使用上板1702进行流通池化，导入含有微珠的水溶液，则微珠1703被保持。微珠1704，与前述的例子同样地，再次流出，因此达到微小反应池保持1个微珠的状态。

图18表示微小反应池(试剂反应空间)的独立化。如图18所示，拆除流通池，用板材关闭第1空间，使上下反转，则如图18，可以达到具有用下板1801关闭的微珠保持空间的器件。在该状态下，如果卸下板1701，与图4同样地进行流通池化，则能够将试剂导入试剂反应空间。另外，如图18，如果再次设置板1701，则可以达到微小反应池(试剂反应空间)的独立化。

实施例6

实施例6表示具有用细管连接第1种微珠保持空间和第2种微珠保持空间的结构的器件。

图19表示用细管连接第1种微珠保持空间和第2种微珠保持空间的将诶过后。与实施例同样地，通过使第2种微珠1901和1902流入、使微珠1902流出流通池化的器件，微小反应池中可以保持第1种微珠和第2种微珠1901各1个。

图20表示试剂反应空间的独立化。如图20所示，注入试剂后，通过拆除流通池，在池上设置上板，可以实现含有2种微珠各1个的微小反应池的独立化。这时，试剂反应空间是以2001表示的圆柱状的空间，兼为2个微珠保持空间的连接部。

本例的适宜的应用方法如下。在微珠表面扩增DNA时，以及使用微珠表面存在的扩增物实施各种检测、测定、序列确定等时，需要的微珠的性能不同的情况很多。例如，在微珠表面扩增DNA时，要求作为扩增反应试剂的成分的引物和酶难以吸附于微珠表面，因此经常利用以琼脂糖凝胶(sepharose)或琼脂糖(agarose)等亲水性聚合物作为原料的微珠。另一方面，就使用存在于微珠表面的扩增物，实施各种检测、测定和序列确定等的情况来说，该利用在流通池内实施时，就流通来说，为了不发生微珠的流出，微珠比重大的物质容易利用。因此，利用氧化硅微珠、氧化锆微珠、各种塑料微珠、金属微珠等。本实施例为，事先，在前述实施例中说明的那样的工序中，在琼脂糖凝胶扩增用微珠2002的表面扩增扩增物，作为测定用微珠2003，利用比重大的氧化锆微珠。试剂反应空间填满可以以微珠2002表面的DNA为模板实施PCR扩增的试剂。在该条件下，装载于扩增仪，通过在微小反应池内实施PCR扩增，在测定用微珠2003表面扩增了解析对象的DNA扩增物。

工业上的可应用性

本发明能够应用于生命科学、医疗、食品等需要基因解析技术的一切领域。

Claims

1.核酸扩增用器件，其为平面状地配置多个反应池的核酸扩增用器件，所述反应池具有1组能够保持1个第1微珠的第1空间和与所述第1空间相对的第2空间，该核酸扩增用器件的特征在于，按照使所述第1微珠不位于从所述平面状的面看时的所述第1空间和所述第2空间不重叠的区域的方式来配置所述第1空间和所述第2空间，对于所述第1微珠的直径r，满足下述1)～3)的条件：

1)所述第1空间的高度大于1/2r且小于3/2r；

2)所述第1空间的高度和试剂保持空间的高度之和为2r以下；

3)所述第1空间的直径大于r且小于2r。

2.根据权利要求1记载的核酸扩增用器件，其中，所述第1空间和所述第2空间用细管连接，所述细管具有比所述第1微珠的直径小的直径。

3.根据权利要求1或2记载的核酸扩增用器件，其中，所述反应池被流通池化，所述流通池具有上板，所述上板具有含微珠的溶液的流入口和排出口且设置在反应池上部。

4.根据权利要求3记载的核酸扩增用器件，其中，所述反应池的与流通池接触的空间的壁面以朝着流通池侧打开的方式倾斜。

5.根据权利要求1记载的核酸扩增用器件，其中，具有根据需要设置在所述反应池的开口面上的、能够将各所述反应池独立化的上板。

6.根据权利要求5记载的核酸扩增用器件，其中，所述上板具有含弹性材料的层。