CN113588963B - 一种高通量单细胞蛋白组分析及其与转录组联合分析方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种高通量单细胞蛋白组分析及其与转录组联合分析方法，包括使用微流控芯片分别捕获条形码抗体标记细胞和编码微球，向芯片中通入气体，使细胞和编码微球分别被包绕于单液滴中，各自形成独立的反应单元；对所述细胞和编码微球进行配对，裂细胞，使细胞表面的条形码抗体及细胞内的mRNA被编码微球捕获；对配对后的编码微球依次进行逆转录反应、外切酶处理反应，然后向所述芯片通入气体，收集所述编码微球；对收集的微球进行扩增、分离100‑300bp和/或300bp以上核酸片段、测序。本发明方法可以同时实现高效、快速、高通量、低成本的单细胞蛋白组与转录组联合分析平台。

Description

一种高通量单细胞蛋白组分析及其与转录组联合分析方法
技术领域
本发明涉及微流控芯片领域，具体涉及一种高通量单细胞蛋白组分析及其与转录组联合分析方法。
背景技术
细胞是构成生物体形态结构和生理功能的基本单元。由于细胞增殖、分化和代谢等过程受到细胞内在生命活动以及周围微环境的影响，不同细胞之间存在异质性，即使是遗传信息完全相同的两个细胞，细胞内物质组成和含量也会有很大差异，从而导致其在细胞大小、化学组成、生物活性、生理响应对象以及响应时间等方面存在异质性。随着扩增技术，测序技术与成像技术的极大发展，单细胞基因组，转录组分析发展迅速。相对而言，单细胞蛋白组学分析受限于可检测的单细胞通量，蛋白靶标数量，有限的灵敏度，发展相对缓慢。
目前，单细胞蛋白组分析主要依赖于基于蛋白质印迹法、流式细胞术和质谱流式法和质谱分析技术。其中，单细胞蛋白质印迹法利用微流控微孔芯片进行单细胞的捕获与裂解，通过对所释放的蛋白进行电泳分离和免疫荧光分析获取蛋白表达信息(NatureMethods2014,11,749)，可检测蛋白靶标数量有限，灵敏度较低；流式细胞术和质谱流式术分别利用荧光标记及金属标记抗体以对单细胞蛋白质进行检测，但受到荧光光谱的重叠和相邻通道的干扰等影响，仍存在可检测的蛋白质数量有限的弊端(Science 2011,332,687)；单细胞蛋白质质谱检测采用同位素标签对特异性标记多肽的氨基基团进行串联质谱分析，目前已实现了对单个细胞超过1000种蛋白的检测，然而质谱操作一次只能完成一个单细胞的分析，其对单细胞的操作通量受限。因此，目前缺少一种单细胞蛋白组分析方法，可以同时实现高通量单细胞操控，高通量和高灵敏的蛋白靶标检测。
另外，目前大多数单细胞组学分析相关工作都局限于单组学研究。单个细胞的行为受到多种分子的共同调控，单维度的分析无法解释多层面的问题，无法全面地获取单细胞信息。只有在单细胞分辨率上组合多层信息，才能更仔细地观察细胞之间的可变性，更清楚地识别特定细胞及其功能，同时对多组学之间的互动关系进行研究。在单细胞多组学研究中，单细胞蛋白组与转录组的联合分析具有重要意义。蛋白质作为表型的直接输出者，直观反映了细胞当下的生理状态与细胞功能，mRNA作为基因的表达产物，在特定时间和空间的限定下传递着基因信息。对二者进行同时分析，有助于理解基因表达与功能表现之间的相关关系，同时还能利用这两种信息更精准地判断细胞来源。目前，单细胞蛋白组和转录组联合分析主要有三种方法。第一种方法利用免疫化学法及单分子荧光原位杂交(smFISH)技术同时对少数单细胞的蛋白质及mRNA进行荧光成像。这种方法虽然保留了蛋白质及mRNA的原始空间位置，但是受到荧光光谱重叠的限制，靶标检测数量有限，同时灵敏度较低(Biotechniques,2015,59,209)。第二种方法借助邻位连接蛋白质分析技术(PLA)或邻位延伸分析蛋白质技术(PEA)，将蛋白质信息转化为核酸信息，同时通过逆转录方法将mRNA信息转化为cDNA信息。研究人员将单细胞裂解液通入微流控液滴生成装置，借助液滴数字化PCR技术，对上述反应的DNA产物进行绝对定量，从而获得蛋白质及mRNA的定量信息(GenomeBiol.,2016,17,188)(Mol.Cell,2016,61,914)。这种方法仍然受到靶标数量的限制，且一次只能完成一个细胞的测定，通量低。第三种方法，利用DNA条形码-抗体标记细胞后与编码微球共包裹于液滴中，细胞裂解所释放的DNA条形码-抗体和mRNA被编码微球捕获，随后对液滴中的所有产物进行放大与测序，实现单细胞蛋白组和转录组的联合分析(Nat.Methods,2017,14,865)(Nat.Biotechnol.,2017,35,936)。这种方法在将mRNA的分析扩展至全转录组的同时将抗体与DNA条形码相关联，使得利用测序方法检测蛋白质成为可能，大大增加了靶标检测数量；另一方面，结合微流控液滴及编码微球技术使每个细胞带上独立标签，实现了低成本、高通量单细胞多维分析。然而，上述方法中仍存在以下问题，严重阻碍其实际高效运用：首先，所使用的DNA条形码-抗体制备方法复杂，需要利用化学偶联小分子，通过化学共价键作用偶联DNA和抗体。在使用化学偶联小分子时，一般需要先将化学偶联小分子与抗体进行连接，用超滤离心等纯化方法除去多余化学小分子后，再将修饰的抗体与DNA混合。采用化学偶联小分子作媒介的偶联方法效率低，时间长，损失大。其次，现有技术中所采用的液滴微流控方式，在形成液滴之后无法进行液滴内外物质的交换，在液滴生成以前就需移除游离条形码抗体。因此他们在条形码抗体与细胞孵育后，即在离心管中通过循环的“离心-去上清”步骤进行清洗。这种方式存在步骤繁琐，游离条形码抗体去除不干净等问题。
再次，上述技术在形成单细胞-单微球包裹液滴的过程中，为了使得每个液滴有且仅包含单细胞/单微球，需要对原有悬液进行有限稀释，当其服从泊松分布时，可以最大限度保证液滴中含有有且仅有一个的单细胞/单微球，而此时，存在大量空细胞/空微球液滴。换言之，大量细胞由于没有与单微球匹配，失去了被标记的机会，从而造成了信息丢失，无法应用到痕量细胞的研究中。最后，现有技术通常使用油相对连续液相包绕的但细胞/微粒进行隔断从而防止相邻反应单元间的信号干扰。由于存在油水不相容的天然属性，油相的使用往往会导致油水液滴生成不稳定、难以进行后续细胞融合、裂解、芯片通道内油相残留、堵塞，使得芯片难于再次利用、油水液滴包裹及破乳效果差、成本高、回收效率低等一系列问题，致使难以在芯片上同时实现高通量及多反应的集成。
因此，亟待发展一种高捕获、高通量、高效率的单细胞蛋白组和转录组联合分析平台，利用微流控技术、高效蛋白标记技术、编码技术及测序技术，从基因表达与功能表现两方面揭示细胞的异质性，并应用于基础研究和临床样品研究。
发明内容
针对现有技术中存在的上述问题，本项目拟通过发展高效的单细胞单微球捕获配对及操控平台，快速通用的蛋白标记方法，结合编码微球及高通量测序技术，实现高效、快速、高通量、低成本的单细胞蛋白组分析，及其和转录组的联合分析。
为实现上述目的，本发明公开了一种利用配对微流控芯片进行高通量单细胞蛋白组分析及其和转录组联合分析方法，所述方法包括步骤：
1)使用微流控芯片分别捕获于悬浮液中分散的条形码抗体标记细胞，以及编码微球，实现单个细胞和编码微球的分别捕获其中所述条形码抗体包括抗体、链霉亲和素和条形码DNA；
2)向所述微流控芯片中通入气体，以使所述细胞和编码微球分别被包绕于单液滴中，每个液滴分别包含单个所述细胞或单个所述编码微球，所述液滴间以气体分隔，各自形成独立的反应单元，以及实施测序分析；
其中，所述微流控芯片具有如下结构：
所述微流控芯片包括捕获层与控制层，所述捕获层包括两套并行且呈轴对称设置的微粒捕获流道，所述捕获层还设有供流体通过的开口；每套微粒捕获流道包括至少两个首尾相连的串联单微粒捕获单元，以捕获单个微粒；两套微粒捕获流道中的各单微粒捕获单元，通过连接通道配对相连；所述控制层位于所述捕获层上方或下方，且与捕获层不连通，所述控制层通过向所述连接通道施加或释放压力，控制所述两套微粒捕获流道的连通。
本发明的一些实施方案中，还包括以下步骤：
3)对由气体分隔的液体形式的所述条形码抗体标记细胞和编码微球进行配对，裂解所述细胞，使所述细胞表面的条形码抗体及细胞内的mRNA被编码微球捕获；
4)对配对后的微球依次进行外切酶处理反应、逆转录反应，然后向所述芯片通入气体，回收所述编码微球。
本发明的一些实施方案中，进一步包括对所收集的编码微球进行扩增、分离核酸片段、测序，所述的核酸片段选自于长度为100-300bp和大于300bp之一种或几种。
本发明所述微粒，是本领域熟知的，需要进行捕获、分析、反应的颗粒。本领域熟知的微粒包括但不限于细胞、细胞团簇、微生物、微生物团簇、噬菌体、外泌体、胶束和人造微球，其人造微球包括但不限于聚乙二醇、聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酸、聚甲基丙烯酸酯、聚乙烯醇、聚乙烯、聚苯乙烯、聚酯(如：PLGA和PLA)、二氧化硅和石墨烯等微球，所述人造微球表面修饰有实现预期检测目的的物质，如：但不限于核酸适体、核酸、蛋白质和多肽等生物大分子。一些实施方案中，所述人造微球是修饰有用于RNA捕获的核酸序列的微球，另一些实施方案中，所述人造微球是修饰有用于基因捕获的核酸序列的微球，另一些实施方案中，所述人造微球是修饰有核酸适体或抗体等分子的微球，另一些实施方案中，所述人造微球是修饰有上述两种或者几种分子的微球。
本发明所使用的微流控芯片中，可依据具体分离需要选择单微粒捕获单元的个数。在一些实施方案中，每套微粒捕获流道由400～1000个首尾相连的单微粒捕获单元串联而成。
本发明的一些实施方案中，所述单微粒捕获单元包括流道、用于捕获单个微粒时的储液腔室、捕获通道；优选地，相邻单微粒捕获单元经所述流道的两端首尾相连。
本发明的一些实施方案中，所述单微粒捕获单元储液腔室和捕获通道均位于所述流道两端口之间；一个单微粒捕获单元内，所述流道长度大于所述流道两端间的直线距离。
本发明的一些实施方案中，所述储液腔室设有三个开口，第一开口连接所述流道一端的流道壁；第一开口截面直径大于等于待捕获的单微粒，第二开口接合所述捕获通道的一侧开口，所述第二开口截面直径等于所述捕获通道直径，所述捕获通道的另一侧开口接合所述流道另一端的流道壁；第三开口与所述连接通道接合，通往并行对称的另一微粒捕获流道中单微粒捕获单元的储液腔室，所述第三开口的截面直径小于待捕获的单微粒。
本发明的一些实施方案中，所述单微粒捕获单元中流道的形状包括但不限于U型管，弧形管、门字型管、弯管、折角弯管等。
本发明中，所述两套微粒捕获流道尺寸(例如长度、横截面形状、直径、边长等)可以是相同的，也可以是不同的。实际使用中，根据待捕获微粒大小，确定捕获流道尺寸。
本发明的一些实施方案中，所述控制层包括阻隔通道；所述阻隔通道位于所述连接通道下方或上方，与连接通道相交但互不相通，例如可由隔膜分隔。所述阻隔通道设有供流体通过的开口。通过向开口中注入流体，改变通道尺寸，向捕获层连接通道施加或释放压力，控制所述两套微粒捕获流道内流体的沟通。
本发明的一些实施方案中，所述微流控芯片还包括用于改变所述单微粒捕获单元中储液腔室体积，以促进两套配对储液腔室内物质交换的两套呈轴对称设置的驱动泵单元，包括相连通的驱动泵控制网络通道，及驱动泵形变腔室，所述驱动泵控制网络通道还设有驱动泵入口；所述驱动泵形变腔室分别位于所述储液腔室上方或下方；所述驱动泵单元与所述捕获层不连通，优选所述驱动泵形变腔室与所述储液腔室经隔膜分隔。
本发明的一些实施方案中，所述微流控芯片供流体通入及流出的开口可分别为多相连通结构。通过调节阀门，可实现不同流体(例如包含细胞、微球等的液体，或气体)的独立通入和回收。例如，所述开口可连接多相连通阀，进一步连接细胞入口、微球入口、缓冲液入口、空气入口；或细胞出口及微球出口等；控制多相连通阀，可快速实现不同流体入口或出口转换。
本发明的一些实施方案中，步骤1)中，所述条形码抗体标记细胞通过将待检测细胞与条形码抗体孵育后制备获得，优选制备方法包括将抗体、链霉亲和素、条形码DNA混合后孵育，例如旋转孵育20min；其中所述抗体与条形码DNA的摩尔比为1:1～1:3，所述抗体与条形码DNA的总和与链霉亲和素的摩尔比为4:1～1:1。
一些实施方案中，所述抗体和条形码DNA是经生物素所化的。一些实施方案中，孵育后离心，去除上清液，重复数次以清洗细胞，去除未与细胞结合的游离条形码抗体。
本发明的一些实施方案中，用于分散条形码抗体标记细胞和编码微球的悬浮液可以是相同的，也可以是不同的。适于条形码抗体标记细胞分散的悬浮液包括但不限于磷酸缓冲液、含有牛血清白蛋白的磷酸缓冲液、含有表面活性剂的磷酸缓冲液；适于编码微球的悬浮液包括但不限于海藻酸钠溶液、含有表面活性剂的海藻酸钠溶液、蔗聚糖(Ficoll)溶液等。
本发明所述流体，指可流动的液体或气体等，所述液体例如包括但不限于细胞处理液、悬浮液、缓冲液、培养液、纯溶剂例如水；所述气体例如包括但不限于空气、氮气、氩气、氧气、氦气、二氧化碳等。所述气体可以为不参与反应的惰性气体，也可以为参与反应的反应气体。本发明的一些实施方案中，所述气体包括空气、氮气、氩气、氦气、氧气、二氧化碳中的一种或多种。
本发明的一些实施方案中，所述步骤1)中，所述编码微球和细胞捕获包括以下步骤：
a.增加控制层压力，阻断所述捕获层的连接通道，避免两套微粒捕获流道间的物质连通；优选地，通过向控制层注入流体增加压力，例如注入水、溶液或气体；
b.分别于捕获层的两套微粒捕获通道捕获已于悬浮液中分散的条形码抗体标记细胞和编码微球，所述条形码抗体标记细胞和编码微球的捕获可以是同时进行的，也可是分步进行的；其中，
所述编码微球的捕获步骤为：
保持控制层压力。将编码微球悬浮液注入一套微粒捕获流道。根据差异流阻流体力学原理，当所述储液腔室为空时，由于流道路径较长，相比于储液腔室阻力较大，编码微球更倾向于进入储液腔室。由于捕获通道截面直径小于编码微球，所述编码微球被分别捕获于该套微粒捕获流道的各储液腔室。当储液腔室被编码微球占据之后，基于空间限制，后续编码微球只能从流道通过，进入下一个未被占据的储液腔室。从而实现高通量编码微球捕获。
所述条形码抗体标记细胞的捕获步骤为：
保持控制层压力。将条形码抗体标记细胞悬浮液注入另一套微粒捕获流道。根据差异流阻流体力学原理，当储液腔室为空时，由于型流道路径较长，相比于储液腔室阻力较大，细胞更倾向于进入储液腔室。由于捕获通道截面直径小于细胞，因此细胞可被捕获于该套微粒捕获流道的各储液腔室。当储液腔室被细胞占据之后，基于空间限制，后续细胞只能从流道通过，进入下一个未被占据的储液腔室，从而实现高通量单细胞捕获。
本发明的一些实施方案中，步骤2)中，以细胞、微球同向或反向流动，分别向两套微粒捕获流道通入气体。当气体相进入微粒捕获流道时，由于储液腔室毛细阻力较大，因此气体不进入储液腔室，而进入单微粒捕获单元的流道，将单微粒捕获单元流道中的液体排出，此时微球储液腔室内溶液被保留，形成气包溶液的液滴。液滴中包含有单个细胞或单个编码微球，相邻细胞或微球之间由空气隔开，形成独立的反应单元。
本发明的一些实施方案中，步骤2)中所述独立的反应单元的形成进一步包括，使用气体，例如通过气体的推力及浮力作用，将所述捕获流道内的残余微粒(包括细胞及微球)，从所述芯片的开口排出。
本发明的一些实施方案中，步骤3)中所述细胞和编码微球的配对通过以下方式实现：
a.在步骤2)向所述微流控芯片中通入气体之前，先向捕获编码微球的微粒捕获流道中注入细胞裂解液(优选的，细胞裂解液具有粘度，以防止微球沉降，提高粘度的手段如：加入海藻酸钠)，以替换所述单微粒捕获单元流道及储液腔室内的液体；
b.在步骤2)之后，减小控制层压力，使两套微粒捕获流道的储液腔室连通，捕获有编码微球储液腔室中的裂解液通过连接通道进入捕获细胞的储液腔室，实现所述细胞和编码微球的配对，所述细胞被捕获有微球储液腔室中的裂解液裂解，所述细胞表面结合的条形码抗体及细胞内的mRNA通过所述连接通道进入到捕获有编码微球的储液腔室，进而被编码微球捕获。
本发明的一些实施方案中，在进行步骤3)后，对所述芯片做如下处理：
a.使捕获编码微球的储液腔室中的液体进入捕获细胞的储液腔室，而后增大控制层压力，关闭连接通道；
本步骤中尽可能使得微球储液腔中不包含任何溶液，以避免部分残留未捕获的游离mRNA被其它的微球捕获，造成交叉污染。
b.分别向两套微粒捕获流道中通入清洗液，以替换所述微粒捕获流道内的液体。
本发明的一些实施方案中，步骤4)进一步包括以下步骤：
a.向微粒捕获流道中通入外切酶试剂，以替换流道内清洗液，进行外切酶处理反应；
b.向微粒捕获流道中通入清洗液，以替换所述微粒捕获流道内的外切酶试剂；
c.向微粒捕获流道中通入逆转录试剂，以替换所述微粒捕获流道内的外切酶试剂，进行逆转录处理反应；
d.向微粒捕获流道中通入回收液，以替换所述微粒捕获流道内的逆转录试剂。
e.利用流体扰动作用，将两套单微粒捕获单元的流道及储液腔室、细胞储液腔室中的所有微球由出口排出并收集，例如收集于离心管中。
在微流控芯片包括上述驱动泵单元的实施方案中，本发明的上述分析方法还可包括以下步骤的一步或多步：
步骤1)中，步骤a后减小驱动泵单元压力至不施压状态；例如，分别向两套驱动泵单元注入液体，以排净驱动泵单元内部空气，然后减小驱动泵压力至自然状态；步骤b将所述细胞或编码细胞捕获后，增加与对应微粒捕获流道匹配的驱动泵单元压力，使捕获的细胞或编码微球进一步困于储液腔室；
一些实施方案中，进行步骤3)后，多次改变两套驱动泵单元压力，使连通的储液腔室中的液体混合；
一些实施方案中，步骤4)的步骤a)中，通过增大与捕获编码微球储液腔室匹配的驱动泵单元压力，促进所述储液腔室内的液体向另一套储液腔室流动。
本发明的一些实施方案中，所述步骤5)的实施方法包括以下步骤中的一步或多步：
a.配制PCR反应溶液，对微球上编码的条形码及cDNA信息进行扩增；
b.例如利用磁珠分离技术，收集100-300bp核酸片段，此片段含有蛋白质组信息。将此部分片段进行建库处理与上机测序，对测序结果进行分析，获得高通量单细胞蛋白组信息；或
例如利用磁珠分离技术，同时收集100-300bp核酸片段(此片段含有蛋白质组信息)及大于300bp核酸片段(此片段含有转录组信息)。将两部分片段分别进行建库处理与上机测序，对测序结果进行分析，获得高通量单细胞蛋白组和转录组的联合信息。
本发明的微流控芯片，可采用本领域常规方法制作。优选的实施方式中，芯片模板的制作采用传统的软光刻技术。在其表面浇筑高分子材料聚二甲基硅氧烷(PDMS)并固化后复制微通道结构并打孔封装。
一些实施方案中，细胞通道、微球通道和连接通道的高度分别为25μm，46μm和10μm，细胞通道的宽度为40μm，微球通道的宽度为60μm，控制层高度为10μm。
一些实施方案中，编码微球由疏松多孔的固相载体及其表面的众多寡核苷酸序列组成。该类序列由四个部分构成，包括通用引物、细胞编码、分子编码、捕获序列多聚胸腺嘧啶d(T)。其中，通用引物为一段固定的DNA序列(25bp)，用来进行后续的DNA扩增；细胞编码(12bp)序列用于标记细胞，其在同一个微球上是相同的，而不同微球含有不同的细胞编码；分子编码(8bp)为一段随机序列，同一个微球上拥有不同的分子编码，用于校正DNA扩增偏差，更精确地对单细胞转录组及蛋白组进行定量；捕获序列由一段胸腺嘧啶d(T)序列组成(30bp)，通过碱基互补配对原理，捕获带有多聚腺苷酸d(A)序列的mRNA分子及DNA条形码-抗体分子/核酸适体标签。
本发明的一些实施方案中，条形码DNA自5’端向3’端，DNA序列包括：
第一保守序列，具体为：CCTTGGCACCCGAGAATTCCA；
第一可变序列，长度为6个碱基，碱基选自A、T、C或G；
第二可变序列，长度为1个碱基，碱基选自T、C或G；
第二保守序列，长度为32个碱基A。
一些实施方案中，一种条形码DNA其序列可表示如下：
CCTTGGCACCCGAGAATTCCANNNNNNBAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA，其中，N代表A、T、C、G四个碱基中任意一个碱基，B代表T、C、G三个碱基任意一个碱基。
本发明有益效果：
1.本发明高效蛋白标记方法，发展快速通用抗体-DNA偶联方法，不需要复杂的化学修饰、超滤纯化等步骤，“一步法”即可完成条形码抗体的制备，减少了由于多步化学修饰及超滤纯化带来的原料损失；另外，反应速率快，整个反应只需要20min即可完成，大大提高反应效率，而其他化学修饰相关方法至少需要小时至过夜；故而本发明方法解决了现有方法在制备条形码抗体过程中偶联效率低、偶联时间长、步骤繁琐等问题，进而实现了芯片检测整体流程的效率提升。
2.本发明芯片在捕获完细胞后，由于使用气相代替油相分隔单细胞/单微粒，故而仍能进物质交换，可在芯片内部进行洗涤步骤。因此，条形码抗体与细胞进行孵育后，不需要采用已有的离心管中繁琐的“离心-去上清”步骤，即可直接通入芯片。在捕获完细胞后的清洗步骤中，游离的条形码抗体就可被去除。这种洗涤方式清洗液可使清洗液与单分散的细胞表面完全接触，因此游离条形码抗体的去除能力更好。
3.本发明基于差异流阻流体力学的细胞与编码微球配对芯片，结合编码微球技术与高通量测序新技术，无需进行有限稀释(或泊松分布)，可以最大程度保证单细胞与单微球的配对率，适合于稀有细胞分析，故而可实现高通量单细胞蛋白组或其与转录组的联合分析，解决了单细胞测序中细胞利用率低的瓶颈。
4.本发明高通量单细胞转录组和蛋白质联合分析方法，利用编码微球及测序技术同时获得大量单细胞的多组学信息。
5.本发明方法中，在细胞或微球捕获后，将气体通入微流控芯片，可以稳定地形成由气相分隔的含单个细胞或微球的液体，解决了微流控芯片使用油相实现细胞分隔时，油水界面难以破乳，不能形成有效的油包水液滴的问题。
6.本发明方法所使用气体廉价易得，无批次差异，体系稳定，因此解决了“油相”中含有表面活性剂的油相昂贵，且批次间差异大导致结果不稳定的问题。
7.本发明方法可以方便的实现微流控芯片通道内溶液试剂的去除，避免了传统“油相”方式微乳液滴在微流控芯片通道中的残留，并可以对独立液滴进行新试剂替换，使依次添加多种试剂成为可能，大大扩展了能于微流控芯片上进行的、依赖于单微粒的试验种类，提高了实验、检测及分析效率。
7.传统“油相”方法中需使用破乳剂对“油包水”形式的捕获微粒进行破乳，该方法往往效果差、成本高；本发明方法可以有效实现“背景扣除”及捕获微粒的无损回收，解决了传统“油封”方法中因油相包覆微粒导致的污染，以及萃取回收微球方式导致的微球高损失率。
8.在可进行捕获微粒配对的微流控芯片中，本发明方法可以实现稳定的液滴混合和试剂替换，解决了传统“油封”方法中油膜将配对液滴隔离，配对液滴融合困难导致的有效配对液滴比例低，以及微粒(例如细胞)无法裂解等问题。
附图说明
图1本发明优选微流控芯片的整体结构俯视图，其中1、2是细胞/微球入口，3是缓冲液入口，4、5是细胞/微球空气入口，6、7是细胞/微球出口，8是隔离阀口，9、10是细胞/微球驱动泵口。
图2细胞/微球配对捕获单元俯视图，其中11、12是细胞/微球储液腔，13、14是U型流道，15、16是细胞/微球捕获通道，17是连接通道，18、19是细胞/微球驱动泵，20是隔离阀。
图3高通量单细胞mRNA分析编码微球结构示意图，该序列由四个部分构成，包括通用引物、细胞编码、分子编码、捕获序列多聚胸腺嘧啶d(T)。其中，通用引物为一段固定的DNA序列(25bp)，用来进行后续的DNA扩增；细胞编码(12bp)序列用于标记细胞，其在同一个微球上是相同的，而不同微球含有不同的细胞编码；分子编码(8bp)为一段随机序列，同一个微球上拥有不同的分子编码，用于校正DNA扩增偏差，更精确地对单细胞转录组及蛋白组进行定量；捕获序列由一段胸腺嘧啶d(T)序列组成(30bp)，通过碱基互补配对原理，捕获带有多聚腺苷酸d(A)序列的mRNA分子及DNA条形码-抗体分子/核酸适体标签。
图4高通量单细胞蛋白组分析流程图。
图5高通量单细胞蛋白组和转录组联合分析流程图。
图6实施例2所制备条形码抗体的核酸片段分析图。
图7A使用本发明方法捕获细胞及微球后的捕获率及配对率。
图7B使用本发明方法捕获细胞及微球后的液滴生成图。
图8使用本发明方法实现细胞、微球配对，对建库后的产物进行片段化分析所得结果。
图9使用对比实施例所述方法捕获细胞及微球后的液滴生成图。
具体实施方式
实施例1
基于本发明的微流控芯片使用方法，实现高通量配对捕获单微粒，所使用芯片如图1-2所示，该芯片由标准软光刻技术加工，包括捕获层、控制层及载片。捕获层包括两套并行且呈轴对称设置的微粒捕获流道。捕获层的一套微粒捕获流道设有供流体通过的细胞入口(1)、缓冲液入口(3)、细胞气体入口(4)、细胞出口(6)，另一套微粒捕获流道设有微球入口(2)、微球气体入口(5)及微球出口(7)。其中细胞入口(1)、缓冲液入口(3)、微球入口(2)经所述微粒捕获流道的一侧开口接入所述芯片，细胞气体入口(4)、微球气体入口(5)、细胞出口(6)及微球出口(7)经所述微粒捕获流道的另一侧开口接入所述芯片。
微粒捕获流道由合计800～2,000个首尾相连的单微粒捕获单元串联而成。两套微粒捕获流道中的各单微粒捕获单元，通过连接通道(17)配对相连。
所述控制层位于所述捕获层下方，彼此不连通，包括数条连同的阻隔通道(20)，与连接通道(17)相交但互不相通。所述阻隔通道(20)设有供流体通过的入口(8)。
一套单微粒捕获单元包括流道(13)、用于捕获单个细胞的储液腔室(11)、捕获通道(15)；相邻单微粒捕获单元经所述流道(13)的两端首尾相连。与之对称的另一套单微粒捕获单元包括流道(14)、用于捕获单个编码微球的储液腔室(12)、捕获通道(16)；相邻单微粒捕获单元经所述流道(14)的两端首尾相连。
所述微流控芯片还包括两套呈轴对称设置的驱动泵单元，包括相连通的驱动泵控制网络通道(21)，及驱动泵形变腔室(18、19)，所述驱动泵控制网络通道还设有细胞驱动泵入口(9)和微球驱动泵入口(10)；所述驱动泵形变腔室(18、19)分别位于所述储液腔室(11、12)上方，与所述储液腔室经隔膜分隔；所述驱动泵单元与所述捕获层不连通。
其中，两套单微粒捕获单元中，储液腔室(11、12)和捕获通道(15、16)均分别位于所述流道(13、14)两端口之间；所述流道(13、14)呈U型，长度分别大于流道两端间的直线距离。
储液腔室(11、12)分别设有三个开口，第一开口连接所述流道一端的流道壁；第一开口截面直径大于等于待捕获的单微粒，第二开口接合所述捕获通道的一侧开口，所述第二开口截面直径等于所述捕获通道(15、16)直径，所述捕获通道(15、16)的另一侧开口接合所述流道另一端的流道壁；第三开口与所述连接通道(17)接合，通往并行对称的另一微粒捕获流道中单微粒捕获单元的储液腔室，所述第三开口的截面直径小于待捕获的单微粒。
实施例2
以下实施例中所用试剂均为本领域可常规购买的。
示例性的试剂来源为：抗-EpCAM抗体[VU-1D9](生物素)购自Abcam公司，货号ab79079；抗-ErbB2 分子(生物素)购自Abcam公司，货号ab31890；抗-EGFR抗体[EGFR1](生物素)购自Abcam公司，货号ab24293；生物素抗-小鼠CD326(Ep-CAM)抗体购自Biolegend公司，货号118203；人IgG对照购自Genescript公司，货号A01006；人结肠癌细胞SW480、小鼠胚胎干细胞mES、人乳腺癌细胞MCF7、人乳腺癌细胞SK-BR-3、人乳腺癌细胞MDA-MB-231，均来自于中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库；0.5％F68为Pluronic F-68非离子表面活性剂，购自赛默飞，货号：#24040032。
使用本发明方法得到的高通量单细胞mRNA分析编码微球结构示意图如图3所示；使用本发明方法进行的高通量单细胞蛋白组分析，及其与转录组联合分析的流程图如图4-5所示。
a.制备条形码抗体。将生物素化的抗体、链霉亲和素、生物素化的条形码DNA以1：1：3的物质的量比混合，旋转孵育20min，得到条形码抗体。不同抗体对应不同的DNA条形码。自5’端向3’端，DNA序列包括：
第一保守序列，具体为：CCTTGGCACCCGAGAATTCCA；
第一可变序列，长度为6个碱基，碱基选自A、T、C或G；
第二可变序列，长度为1个碱基，碱基选自T、C或G；
第二保守序列，长度为32个碱基A。
一种条形码DNA实施方式，其序列可表示如下：
CCTTGGCACCCGAGAATTCCANNNNNNBAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA，其中，N代表A、T、C、G四个碱基中任意一个碱基，B代表T、C、G三个碱基任意一个碱基。
另一种具体的条形码DNA，其序列示例为：
CCTTGGCACCCGAGAATTCCAATCACGBAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA；
另一种具体的条形码DNA，其序列示例为：
CCTTGGCACCCGAGAATTCCACGATGTBAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA；
另一种具体的条形码DNA，其序列示例为：
CCTTGGCACCCGAGAATTCCATTAGGCBAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA；
另一种具体的条形码DNA，其序列示例为：
CCTTGGCACCCGAGAATTCCAACAGTGBAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA；
另一种具体的条形码DNA，其序列示例为：
CCTTGGCACCCGAGAATTCCATGACCABAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA。
对所得条形码抗体进行变性处理，并于核酸原料、制备的条形码抗体分别进行核酸片段分析，结果如图6所示。所使用核酸长度为60bp，结果显示，条形码抗体组由于核酸与抗体处于连接状态，因此在60bp左右处无游离峰；核酸组、变性后的条形码抗体组在60bp左右处拥有游离峰存在，说明此时核酸不与抗体连接，以游离形式存在。因此，将所有原料(抗体、DNA及链霉亲和素)经“一步法”混合在一起孵育，即可完成条形码抗体的制备。
b.将待测细胞与分别与步骤a中制备的不同条形码抗体孵育20min，直接取任一制备的条形码抗体标记的细胞进行后续反应。
c.在阻隔通道入口(8)注满溶液，增加隔离阀压力，阻断位于其正上方的捕获层中的连接通道中(17)的液体流通，保持隔离阀压力不变。在细胞驱动泵口(9)及微球驱动泵口(10)中注满溶液，排尽两驱动泵通道内部空气后，减小驱动泵压力至自然状态。
d.保持隔离阀压力不变。将1000个编码微球分散于微球悬浮液中(0.25％海藻酸钠+0.2％聚乙二醇辛基苯基醚)，从微球入口(2)处注入。根据差异流阻流体力学原理，微球被依次捕获于微球储液腔室(12)；
所述编码微球，其自5’端向3’端依次为第三保守序列AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTAC，细胞编码，分子编码序列、第三可变序列和第二保守序列；细胞编码序列，其长度为12个碱基，各个碱基随机选自A/T/G/C；分子编码序列，其长度为8个碱基，各个碱基随机选自A/T/G/C；第三可变序列长度为1，随机选自A/G/C，第三保守序列为30个碱基T。
e.保持隔离阀压力不变。在微球入口(2)注入1×PBS，清洗通道内残余的海藻酸钠及聚乙二醇辛基苯基醚溶液。向微球驱动泵口(10)注入溶液，并使溶液充满驱动泵控制网络通道和驱动泵变形腔室(19)，使其处于加压状态，将微球困于微球储液腔室(12)内，保持微球驱动泵压力不变。
f.保持隔离阀压力不变，保持微球驱动泵压力不变。将步骤b制备的条形码抗体标记的细胞分散于细胞悬浮液中(1×PBS，0.5％F68)，从细胞入口(1)处注入，细胞被依次捕获于细胞储液腔室(11)。
g.保持隔离阀压力不变，保持微球驱动泵压力不变。在细胞入口(1)注入1×PBS，清洗通道内残余的细胞。注入溶液，并使细胞驱动泵口(9)注入溶液，并使溶液充满驱动泵控制网络通道和驱动泵变形腔室(18)，使其处于加压状态，将细胞困于细胞储液腔内(11)，保持细胞驱动泵压力不变。
h.保持隔离阀压力不变，保持微球驱动泵压力不变，保持细胞驱动泵压力不变。在微球入口(2)注入细胞裂解液(160mM Tris pH 7.5(Sigma)，0.16％Sarkosyl(Sigma,#L7414)，16mM EDTA，0.5U/μL RNase Inhibitor(TransGen Biotech)，0.12％F68)，替换U型流道(14)及微球储存腔中(12)内的液体。在细胞空气入口(4)，微球空气入口(5)注入空气，利用空气的推力及浮力作用将细胞出口(6)，微球出口(7)中的残余细胞、微球排出。通过显微镜观察计数，测得单细胞、单微球的占有率及细胞/微球的配对率均在90％以上；并获取液体生成图，可以清楚地看到气相方法生成的液滴稳定、饱满(例如图7A-B所示)。
i.保持隔离阀压力不变，保持微球驱动泵压力不变，保持细胞驱动泵压力不变。拔去微球入口(2)注射管，拔去细胞入口(1)注射管，用实心针堵住微球出口(7)，细胞出口(6)，在细胞空气入口(4)，微球空气入口(5)注入空气。两相空气反向进入通道，当空气相进入捕获单元时，由于微球储液腔室(12)、细胞储液腔室(11)毛细阻力较大，因此空气相不进入微球储液腔(12)、细胞储液腔(11)以及捕获通道(15、16)，而进入U型流道(13、14)，将U型流道(13、14)中的液体排出，此时细胞储液腔室(11)的细胞悬浮液，微球储液腔室(12)中的细胞裂解液被保留，分别形成空气包绕液体的液滴，每个液滴中含有单个细胞或微球，相邻细胞及微球之间由空气隔开，形成独立的反应单元。
j.减小阻隔通道(20)压力，使连接通道(17)连通，细胞储液腔室(11)与微球储液腔室(12)的液体可进行沟通。分别不断改变驱动泵形变腔室(18)和细胞驱动泵(19)压力，使两储存腔室中的液体充分混合，微球储液腔室室(12)中的裂解液进入到细胞储液腔室(11)中裂解细胞，细胞表面结合条形码抗体及细胞内的mRNA可进入到微球储液腔室(12)中被编码微球捕获。
k.增大微球驱动泵形变腔室(18)压力，将微球储液腔室(12)中的液体推入细胞储液腔室(11)，增大阻隔通道(20)压力，关闭连接通道(17)。在细胞入口(1)和微球入口(2)处通入清洗液(1×PBS)，将U型流道(13、14)及储液腔室(11、12)中的液体替换为清洗液。
l.从细胞入口(1)和微球入口(2)处通入外切酶试剂，将U型流道(13、14)及储液腔室(11、12)中的清洗液替换为外切酶试剂。拔掉所有注射管，将芯片用封口膜缠绕3圈，防止内部液体挥发，并放入37℃烘箱内45min，进行外切酶处理反应。
外切酶反应溶液配方
m.在细胞入口(1)和微球入口(2)处通入逆转录试剂，将U型流道(13、14)及储液腔室(11、12)中的清洗液替换为逆转录试剂。拔掉所有注射管，使芯片开口封闭，并将芯片用封口膜缠绕3圈，防止内部液体挥发，放入42℃烘箱内2个小时进行逆转录反应。
逆转录反应溶液配方
n.将芯片从烘箱取出，在细胞入口(1)和微球入口(2)处通入清洗液(1×PBS)，将U型流道(13)(14)及储液腔室(11)(12)外切酶试剂替换为回收试剂(1×PBS)。利用流体及空气扰动作用，将U型流道(14)及微球储液腔室(12)中的微球由微球出口(7)排出并收集于离心管中。
o.配制PCR反应溶液，在离心管中对微球上编码的cDNA及DNA信息进行扩增。PCR反应试剂及反应条件如下。
PCR反应溶液配方
PCR反应条件
/>
p.利用磁珠分离技术收集100-300bp核酸片段(此片段含有蛋白质组信息)及大于300bp核酸片段(此片段含有转录组信息)。磁珠分离采用本领域常规方法进行，例如，可通过商业购买试剂盒(南京诺唯赞生物科技有限公司，N412-01)，依据说明书，进行磁珠分离操作。
q.将蛋白质组片段进行建库处理。建库处理试剂及反应如下：
蛋白质组片段建库反应溶液配方
蛋白质组片段建库反应条件
P5测序引物及P7测序引物序列为(其中N为索引序列)：
r.利用诺唯赞TD503建库试剂盒对转录组片段cDNA进行建库。建库处理采用本领域常规方法进行，例如，可通过商业购买试剂盒(南京诺唯赞生物科技有限公司，TD503)，依据说明书，进行建库处理操作。
P5测序引物及P7测序引物序列为(其中N为索引序列)：
s.将蛋白建库后产物与cDNA建库后产物以1：9混合，高通量测序用本领域常规方法进行，可依托相关测序公司进行。测序方法采用双端150bp(PE150)。根据索引序列进行数据拆分，数据拆分为本领域常规方法，获得独立的蛋白质样本数据及转录组样本数据。
t.对蛋白质样本数据进行分析。
针对蛋白质样本数据，参照Nat.Methods,2017,14,865分析方法。首先，对测序数据进行质控处理。质控处理使用本领域常规方法：使用FastQC、Fastp、MultiQC、Cutadapt、TrimGalore、Trimmomatic、seqtk等软件对测序原始数据进行数据质量分析，剔除低质量数据信息，并去除多聚腺苷酸d(A)序列和接头序列等。对于低质量的编码序列，将编码序列和与之对应的生物样本序列成对去除。
接着，使用Dropseq-tools、UMI-tools、zUMIs、scPipe、Cell Ranger等软件对筛选后的R1文件数据进行信息提取(细胞编码、分子编码)。对R2文件数据前六个碱基进行提取，前六个碱基为表面蛋白信息序列，从表面蛋白信息序列推算出蛋白信息。如下表所示。
然后，将R1文件与R2文件对应，根据蛋白信息及分子编码个数统计每个细胞编码下不同蛋白的表达个数，根据本领域常规方法建立蛋白表达矩阵。
u.对转录组样本数据进行分析。
针对转录组样本数据，参照Nat.Methods,2017,14,865分析方法。首先，对测序数据进行质控处理。质控处理使用本领域常规方法：使用FastQC、Fastp、MultiQC、Cutadapt、TrimGalore、Trimmomatic、seqtk等软件对测序原始数据进行数据质量分析，剔除低质量数据信息，并去除多聚腺苷酸d(A)序列和接头序列等。对于低质量的编码序列，将编码序列和与之对应的生物样本序列成对去除。
接着，使用STAR、Kallisto、Rapmap、Subread、hisat2等序列比对软件将R2文件的cDNA序列比对到参考基因组hg19及mm10，使用Dropseq-tools、UMI-tools、zUMIs、scPipe、Cell Ranger等软件对筛选后的R1文件数据进行信息提取(细胞编码、分子编码)。然后，将R1文件与R2文件对应，根据比对到的基因情况及分子编码个数统计每个细胞编码下不同基因的表达个数，根据本领域常规方法建立转录本表达矩阵。
v.根据细胞编码序列将蛋白质信息与mRNA信息相关联，参照Nat.Methods,2017,14,865分析方法。结合单细胞mRNA及蛋白两种分子表达水平，利用降维算法、聚类算法与分类算法等进行单细胞群体分析，并对不同群体细胞的转录本与蛋白表达进行包括差异表达、信号通路富集、基因共表达等进一步的深入下游分析。
对建库后的产物进行片段化分析，可以获得两种平均长度分别为188及645的片段峰。其中，188片段峰为条形码抗体中DNA的扩增建库后片段，645片段峰为细胞cDNA扩增建库后片段，说明本体系可以成功获得单细胞蛋白质信息和转录组信息(参见图8)。
对比实施例
采用与实施例2中a-h步骤相同方法进行实验，仅将其中通入空气的步骤替换为通入氟油(FC40)，所得芯片视图如图9所示。可见，油相方法生成的液滴易扰动，无规则，部分液滴生成失败。
序列表
<110> 厦门大学
<120> 一种高通量单细胞蛋白组分析及其与转录组联合分析方法
<160> 15
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ccttggcacc cgagaattcc a 21
<210> 2
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ccttggcacc cgagaattcc aatcacgbaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 60
<210> 3
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ccttggcacc cgagaattcc acgatgtbaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 60
<210> 4
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ccttggcacc cgagaattcc attaggcbaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 60
<210> 5
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ccttggcacc cgagaattcc aacagtgbaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 60
<210> 6
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ccttggcacc cgagaattcc atgaccabaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 60
<210> 7
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
aagcagtggt atcaacgcag agtac 25
<210> 8
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
aatgatacgg cgaccaccga gatctacacg cctgtccgcg gaagcagtgg tatcaacgca 60
gagtac 66
<210> 9
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
caagcagaag acggcatacg agatnnnnnn gtgactggag ttccttggca cccgagaatt 60
cca 63
<210> 10
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
caagcagaag acggcatacg agatnnnnnn nngtctcgtg ggctcgg 47
<210> 11
<211> 6
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
atcacg 6
<210> 12
<211> 6
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
cgatgt 6
<210> 13
<211> 6
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
ttaggc 6
<210> 14
<211> 6
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
acagtg 6
<210> 15
<211> 6
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
tgacca 6

Claims (9)

1.一种高通量单细胞蛋白组分析及其与转录组联合分析方法，其特征在于，包括如下步骤：
第一，提供一种微流控芯片，
所述微流控芯片捕获层、控制层及载片，所述捕获层包括两套并行且呈轴对称设置的微粒捕获流道；
所述捕获层的一套微粒捕获流道设有供流体通过的细胞入口（1）、缓冲液入口（3）、细胞气体入口（4）、细胞出口（6），另一套微粒捕获流道设有微球入口（2）、微球气体入口（5）及微球出口（7），其中细胞入口（1）、缓冲液入口（3）、微球入口（2）经所述微粒捕获流道的一侧开口接入所述芯片，细胞气体入口（4）、微球气体入口（5）、细胞出口（6）及微球出口（7）经所述微粒捕获流道的另一侧开口接入所述芯片；
所述微粒捕获流道由首尾相连的多个单微粒捕获单元串联而成，所述两套微粒捕获流道中的各单微粒捕获单元，通过连接通道（17）配对相连；
所述控制层位于所述捕获层下方，彼此不连通，包括数条连同的阻隔通道（20），与连接通道（17）相交但互不相通，所述阻隔通道（20）设有供流体通过的阻隔通道入口（8）；
所述一套单微粒捕获单元包括第一流道（13）、用于捕获单个细胞的细胞储液腔室（11）、细胞捕获通道（15），本套单微粒捕获单元中相邻单微粒捕获单元经所述第一流道（13）的两端首尾相连；
所述另一套单微粒捕获单元包括第二流道（14）、用于捕获单个编码微球的微球储液腔室（12）、微球捕获通道（16），本套单微粒捕获单元中相邻单微粒捕获单元经所述第二流道（14）的两端首尾相连；
其中，所述两套单微粒捕获单元中，所述细胞储液腔室（11）、细胞捕获通道（15）和微球储液腔室（12）、微球捕获通道（16）分别位于所述第一流道（13）和第二流道（14）两端口之间；所述第一流道（13）和第二流道（14）分别呈U型，长度分别大于流道两端间的直线距离；
细胞储液腔室（11）和微球储液腔室（12）分别设有三个开口，第一开口连接所述流道一端的流道壁；第一开口截面直径大于等于待捕获的单微粒，第二开口接合所述捕获通道的一侧开口，所述第二开口截面直径等于所述细胞捕获通道（15）或微球捕获通道（16）的直径，所述细胞捕获通道（15）、微球捕获通道（16）的另一侧开口分别接合所述流道另一端的流道壁；第三开口与所述连接通道（17）接合，通往并行对称的另一微粒捕获流道中单微粒捕获单元的储液腔室，所述第三开口的截面直径小于待捕获的单微粒；
第二，基于所述微流控芯片的分析方法包括如下步骤：
a.将抗体和条形码DNA混合孵育，制备得到条形码抗体；
b.将待测细胞与步骤a中制备得到的所述条形码抗体混合孵育，制备得到条形码抗体标记细胞；
c.向所述微流控芯片的阻隔通道入口（8）注满流体，阻断所述连接通道（17）中的流体流通；
d.将编码微球分散于微球悬浮液中，从微球入口（2）处注入所述芯片，所述编码微球被依次捕获于微球储液腔室（12）；
e.向微球入口（2）注入清洗液，清洗流道内残余的微球悬浮液；
f.将步骤b制备得到的所述条形码抗体标记细胞分散于细胞悬浮液中，并从细胞入口（1）处注入所述芯片，所述细胞被依次捕获于细胞储液腔室（11）；
g.向所述细胞入口（1）注入清洗液，清洗流道内残余的细胞；
h.向所述微球入口（2）注入细胞裂解液，替换呈U型的第二流道（14）及微球储液腔室（12）内的液体；向细胞气体入口（4）、微球气体入口（5）注入气体，使残余细胞和/或微球从细胞出口（6）和微球出口（7）排出；
i.封闭细胞入口（1）、微球入口（2）、细胞出口（6）和微球出口（7），向细胞气体入口（4），微球气体入口（5）注入气体；两相气体反向进入呈U型的流道，使呈U型的流道中的液体排出；所述细胞储液腔室（11）中的细胞悬浮液，微球储液腔室（12）中的细胞裂解液被保留，分别形成气体包绕液体的液滴，每个液滴中含有单个细胞或微球，相邻细胞或相邻微球之间由空气隔开，形成独立的反应单元；
j.减小阻隔通道（20）压力，使连接通道（17）连通，细胞储液腔室（11）与微球储液腔室（12）的液体可进行沟通；使两储存腔室中的液体充分混合，微球储液腔室（12）中的裂解液进入到细胞储液腔室（11）中裂解细胞，所述细胞表面结合的条形码抗体及细胞内的mRNA进入到微球储液腔室（12）中，被所述编码微球捕获；
k.将微球储液腔室（12）中的液体推入细胞储液腔室（11）；增大阻隔通道（20）压力，关闭连接通道（17）；在细胞入口（1）和微球入口（2）处通入清洗液，将呈U型的流道及储液腔室中的液体替换为清洗液；
l.配制外切酶试剂，从细胞入口（1）和微球入口（2）处通入所述外切酶试剂，将呈U型的流道及储液腔室中的液体替换为外切酶试剂；封闭所述芯片，对其进行外切酶处理反应；
m.配制逆转录试剂，在细胞入口（1）和微球入口（2）处通入所述逆转录试剂，将呈U型的流道及储液腔室中的液体替换为逆转录试剂；封闭所述芯片对其进行逆转录反应；
n.从细胞入口（1）和微球入口（2）处通入清洗液，将呈U型的流道及储液腔室中的液体替换为回收试剂，使呈U型的第二流道（14）及微球储液腔室（12）中的微球由微球出口（7）排出并收集；
o.配制PCR反应溶液，对收集的微球上编码的cDNA及DNA信息进行扩增；
p.分别分离收集包含蛋白质组信息和转录组信息的核酸片段；
q.将包含蛋白质组信息的片段进行建库处理；
r.对包含转录组片段的cDNA进行建库；
s.将步骤q蛋白建库后产物与步骤r cDNA建库后产物混合，进行高通量测序，获得独立的蛋白质样本数据及转录组样本数据；
t.对步骤s得到的蛋白质样本数据进行分析，建立蛋白表达矩阵；
u.对步骤s得到的转录组样本数据进行分析，建立转录本表达矩阵；
v.根据所述细胞的编码序列将所述蛋白质组信息与mRNA信息相关联，进行下游分析。
2.根据权利要求1所述的分析方法，其中，
步骤a中，将生物素化的抗体、链霉亲和素和生物素化的条形码DNA混合孵育，制备得到所述条形码抗体，其中所述抗体与条形码DNA的摩尔比为1:1~1:3，所述抗体与条形码DNA的总和与链霉亲和素的摩尔比为4:1~1:1。
3.根据权利要求1所述的分析方法，其中，
所述微流控芯片还进一步包括两套呈轴对称设置的驱动泵单元，包括相连通的驱动泵控制网络通道（21），及细胞驱动泵形变腔室（18）和微球驱动泵形变腔室（19）；
所述驱动泵控制网络通道（21）还设有细胞驱动泵入口（9）和微球驱动泵入口（10）；所述细胞驱动泵形变腔室（18）和微球驱动泵形变腔室（19）分别位于所述细胞储液腔室（11）和微球储液腔室（12）上方；
所述驱动泵单元与所述捕获层不连通；
基于所述微流控芯片的分析方法进一步包括：
在步骤c后的步骤c’：在细胞驱动泵入口（9）及微球驱动泵入口（10）中注满溶液，排尽两驱动泵通道内部空气后，减小驱动泵压力至自然状态；
在步骤e后的e’步骤：向微球驱动泵入口（10）注入溶液，并使溶液充满驱动泵控制网络通道和微球驱动泵形变腔室（19），使其处于加压状态，将微球困于微球储液腔室（12）内；
在步骤g后的g’步骤：向细胞驱动泵入口（9）注入溶液，并使溶液充满驱动泵控制网络通道和细胞驱动泵形变腔室（18），使其处于加压状态，将细胞困于细胞储液腔室（11）内；
步骤j中，通过分别不断改变细胞驱动泵形变腔室（18）和微球驱动泵形变腔室（19）的压力，使细胞储液腔室和微球储液腔室中的液体充分混合；
步骤k中，通过增大微球驱动泵形变腔室（19）压力，将微球储液腔室（12）中的液体推入细胞储液腔室（11）。
4.根据权利要求1或2所述的分析方法，其中，
所述气体包括空气、氮气、氩气、氦气、氧气、二氧化碳中的一种或多种。
5.根据权利要求1或2所述的分析方法，其中，
所述条形码DNA的序列，自5’端向3’端，包括：
第一保守序列，具体为：CCTTGGCACCCGAGAATTCCA；
第一可变序列，长度为6个碱基，碱基选自A、T、C或G；
第二可变序列，长度为1个碱基，碱基选自T、C或G；
第二保守序列，长度为32个碱基A。
6.根据权利要求1或2所述的分析方法，其中，
所述条形码DNA的序列为SEQ ID No. 2、SEQ ID No. 3、SEQ ID No. 4、SEQ ID No. 5或SEQ ID No. 6所示的序列。
7.根据权利要求1或2所述的分析方法，其中，
所述编码微球由多孔固相载体及修饰于其表面的寡核苷酸序列组成；所述寡核苷酸序列由通用引物、细胞编码、分子编码、捕获序列组成；其中，所述通用引物为固定的DNA序列，用于进行后续DNA扩增；细胞编码序列用于标记细胞，同一个微球上的细胞编码相同，不同微球细胞编码不同；分子编码为随机序列，同一个微球上拥有不同的分子编码，用于校正DNA扩增偏差；捕获序列由胸腺嘧啶序列组成，通过碱基互补配对原理，捕获带有多聚腺苷酸序列的mRNA分子及DNA条形码-抗体分子/核酸适体标签。
8.根据权利要求1或2所述的分析方法，其中，
所述编码微球，自5’端向3’端依次为SEQ ID No. 7所示的第三保守序列、细胞序列、分子编码序列、第三可变序列和第二保守序列；所述细胞编码序列为随机选自A、T、G或C的12个碱基；所述分子编码序列为随机选自A、T、G或C的8个碱基；第三可变序列为随机选自A、G或C的1碱基；第三保守序列为30个碱基T。
9.根据权利要求1或2所述的分析方法，其中，
步骤p中的所述核酸片段选自于长度为100-300bp和大于300bp之一种或几种。
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