MXPA02001437A - Aparatos microfluidicos para la manipulacion controlada de volumenes pequenos. - Google Patents

Aparatos microfluidicos para la manipulacion controlada de volumenes pequenos.

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MXPA02001437A
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Abstract

Se presenta un metodo para conducir un amplio rango de analisis o manipulaciones bioquimicas en una serie de volumenes de reaccion de nano a subnanolitros y un aparato para llevar a cabo los mismos. El metodo y aparato estan implementados en un microchip fluidico para proporcionar un alto rendimiento en serie. El aparato y metodo de la presente invencion, tambien conducen por si mismos a multiples analisis y manipulacion paralela para proporcionar un mayor rendimiento para la generacion de informacion bioquimica. En particular, el aparato descrito es un aparato de canal microfabricado que puede manipular volumenes de reaccion bioquimica en nanolitros o subnanolitros en una forma controlada, para producir resultados en rangos de 1 a 10 Hz por canal. Los volumenes de reaccion individuales son manipulados en un modo en serie analogo a un registrador de cambio digital. El metodo y aparato de conformidad con la presente invencion, tienen aplicacion a problemas tales como clasificacion de objetivos moleculares o celulares utilizando granulos solos procedentes de bibliotecas de combinacion de sintesis-division, clasificacion de celulas solas para la expresion de ARN o proteina, clasificacion de diagnostico genetico en el nivel de una sola celula, o en la realizacion de estudios de transduccion de senal de una sola celula.

Description

APARATOS MICROFLUIDICOS PARA LA MANIPULACIÓN CONTROLADA DE VOLÚMENES PEQUEÑOS Campo del Invento La presente invención se refiere a un aparato fluidico microfabricado, y en particular, a un aparato que es configurado para formar y transportar una serie de segmentos de volumen diminuto de un material, y para almacenar, recuperar y analizar el mismo y a un método para formar, transportar, almacenar y recuperar una serie de segmentos de volumen diminuto.
Antecedentes del Invento Durante los últimos años se ha mostrado un número de aparatos fluidicos microfabricados elementales.
Aunque muchos de estos aparatos fluidicos son muy simples, son muy poderosos en dirigir muchas aplicaciones reales y también pueden revolucionar la forma en que se llevan a cabo las separaciones bioquímicas. La mayoría de las demostraciones, han involucrado la transferencia de técnicas de medición química conocidas, tales como electroforesis y cromatografía liquida, en plataformas microfabricadas .
Tales demostraciones sugieren que los aparatos de separación microfabricados serán muy útiles para mejorar el tiempo y costo asociado con la información de recolección de tales experimentos. Sin embargo, los aparatos conocidos no han explotado los nuevos métodos experimentales para lo que tales aparatos microfabricados son potencialmente hábiles. Se considera que a través de las mejoras en el control microfluidico, surgirán nuevos paradigmas experimentales bioquímicos más poderosos. El área de fluidicos microfabricados que ha recibido la mayor atención, es la de los procesos de operación electrocinética . Se han demostrado manipulaciones de fluido electrocinéticas para mezclar y hacer reaccionar reactivos, inyección o suministro de muestras, y separaciones químicas. Las técnicas de separación operadas en forma eléctrica tales como electroforesis capilar (CE) , electrocromatografia de canal abierto (OCEC) y cromatografía capilar electrocinética micelar (MEKC) han sido demostradas por medio de un número de grupos de investigación. Tanto los fragmentos de dsADN y productos de secuenciación han sido diseñados utilizando electroforesis de gel capilar de microchip acoplada con detección de fluorescencia inducida por láser. Se han estudiado separaciones electroforéticas menos convencionales en formaciones posteriores utilizando CD y campos eléctricos impulsados. Además, se han demostrado inmunoensayos competitivos a base de fluorescencia utilizando separación electroforética de microchip de enlaces y antigenos marcados libres. Estos aparatos miniaturas han mostrado un desempeño ya sea equivalente o mejor que los aparatos de laboratorio convencionales en todos los casos investigados, y parecen ofrecer una rara combinación de "mejor más-rápido menos-costoso" en forma simultánea. Los aparatos de separación de microchip exhiben ventajas de velocidad de uno a varios órdenes de magnitud con respecto a los métodos convencionales. La eficacia de las separaciones electroforéticas bajo condiciones limitadas por difusión, es proporcional a la caida de voltaje experimentada por la muestra. Estas condiciones de limitación de difusión pueden ser logradas en distancias de separación cortas en microchips, debido a la extensión axial angosta de los tapones de inyección que se generan. El tiempo del análisis disminuye en forma cuadrática en distancias con potencial aplicado constante, lo cual produce una ventaja fundamental para las separaciones electroforéticas a base de microchip. Otras ventajas significativas de las separaciones químicas a base de microchips son los volúmenes pequeños que pueden ser analizados, la capacidad de integrar en forma monolítica el procesamiento y análisis de muestras, y el bajo costo de réplica que hace posible un análisis altamente paralelo. Todos estos factores son consistentes con el análisis de alto rendimiento y las reducciones en costo y tiempo para generar información bioquímica. Los esfuerzos anteriores que demuestran integración del procesamiento de la muestra, incluyen la derivación de separación posterior y separación previa de aminoácidos acoplados a separaciones electroforéticas. Las digestiones de restricción de ADN en chips y las amplificaciones PCR han sido acopladas con un diseño de fragmento electroforético en microchips monolíticos integrados. Se llevaron a cabo lisis celular, PCR múltiple y análisis CE en células de E . col i que contienen plasma en un solo aparato. También se han demostrado ensayos PCR/CE paralelos de múltiples muestras en chips que contienen múltiples depósitos de reacción. Además, se han llevado a cabo experimentos de inmunoensayo competitivo en un aparato de microchip que incluyen elementos fluidicos para la mezcla de la muestra con reactivos, incubación y separaciones electroforéticas. Otros elementos fluidicos microfabricados que han sido acoplados a las separaciones de conducción eléctrica incluyen ionización de electrorocio para análisis mediante espectrometría de masa, y concentración de muestra utilizando elementos de membrana porosa y extracción de fase sólida. También se han mostrado aparatos que emplean transporte electrocinético únicamente para llevar a cabo reacciones químicas y bioquímicas. Los ejemplos incluyen aparatos para cinéticas de reacción enzimática, ensayos de enzimas, síntesis orgánica y manipulaciones celulares. Estas cuatro últimas aplicaciones podrían eventualmente ser de importancia significativa para la biología experimental, aunque no han sido lo suficientemente desarrolladas hasta este momento . También se ha mostrado que un número de aparatos fluidicos microfabricados utilizan fuerzas hidráulicas para el transporte de fluidos. Aunque el uso de fuerzas hidráulicas se puede aplicar a un rango más amplio de materiales fluidicos que los fenómenos electrocinéticos, es menos conveniente implementarlos en general. Las conexiones externas a microchips para la conducción hidráulica de flujo, son más engorrosas que aplicar un potencial eléctrico. Además, las fuerzas de conducción en forma electrocinética siguen del flujo de corriente eléctrica, y por lo tanto, permiten un mayor control en el transporte dentro de un múltiple de microcanal contra la aplicación de presión o vacio hasta un término de un múltiplo. Las fuerzas electrocinéticas también tienen la capacidad de generar presiones mucho más efectivas de lo que es práctico con las hidráulicas. Las capacidades de los aparatos conducidos en forma hidráulica demostradas, parecen ser arrastradas de los aparatos de conducción en forma electrocinética. Sin embargo, se han reportado un número de capacidades importantes. Los aparatos microfluidicos para realizar el PCR, han recibido un interés considerable. Los aparatos anteriores incluyeron únicamente cámaras maquinadas en silicón para actuar como recipientes de muestras, mientras que los últimos aparatos han utilizado la estructura de silicón para el calentamiento de resistencia, o han utilizado filtros integrados para el aislamiento de células de glóbulos blancos. Más recientemente, se reportó un aparato interesante para el PCR de flujo continuo, que utiliza un solo microcanal que serpentea a través de zonas de temperatura para lograr un ciclo térmico. Los filtros para el procesamiento de materiales celulares han sido micromaquinados en substratos de silicón. También se han micromaquinado aparatos de cito etría de flujo en substratos de silicón y vidrio y han sido conducidos en forma hidráulica. La capacidad para manipular reactivos y productos de reacción "en chip" sugiere la eventual capacidad para llevar a cabo virtualmente cualquier tipo de procedimiento de banco "quimico-húmedo" en un aparato microfabricado . El cambio de paradigma de mover el laboratorio a un microchip, incluye las ventajas de reducir los volúmenes de reactivo, automatizar o la manipulación de material sin partes en movimiento, costos de capital reducidos, procesamiento paralelo mayor y una velocidad de procesamiento más alta. El volumen de fluidos que son manipulados o abastecidos en las estructuras microfluidicas mencionadas anteriormente, está en la escala de nanolitros o más pequeñas, versus, décimas de microlitros en la escala de laboratorio, correspondiente a una reducción de tres órdenes de magnitud o más. Los rangos de flujo en los aparatos que han sido estudiados, son del orden de lml/año de operación continua. Implementando procesos múltiples en un solo aparato (integración vertical), estas pequeñas cantidades de fluido pueden ser manipuladas de proceso en proceso en forma eficiente y automática, bajo el control de computadoras. Un operador podria únicamente tener que cargar la muestra que será analizada. Obviamente, esta integración en serie de los pasos de análisis múltiple puede ser combinada con la expansión paralela de la capacidad de procesamiento replicando estructuras microfabricadas, por ejemplo, canales de separación paralela, en el mismo aparato. Aunque el denominado "Lab-en-un-Chip" parece mantener varias promesas, y se considera que se cumplirán muchas de ellas, existen desarrollos adicionales necesarios para lograr un nivel de impacto que sea paralelo a la escala de miniaturización realizada en el campo de las microelectrónicas . Existen al menos 4 puntos significativos a los que se deben dirigir para proporcionar aparatos "Lab-en-un-Chip" al siguiente nivel de sofisticación, o potencia de procesamiento, en la siguiente década. Dichos puntos son: control microfluidico avanzado, la interfase "mundo-para-un-Chip", detección y estrategias de manufacturación viables. Actualmente, la manipulación electrocinética de fluidos en estructura de microcanal representa el estado del arte en el manejo controlado de volumen pequeño con alta precisión. La estrategia ha sido controlar el potencial eléctrico dependiente del tiempo en cada una de las terminales del canal para mover materiales a lo largo de una trayectoria deseada. Aunque esta estrategia ha sido muy efectiva para la distribución y mezclado en diseños simples, está limitada en su capacidad de aplicación y desempeño conforme los diseños se vuelven más complejos. Se considera que serán necesarias nuevas estrategias que permitan el control de potenciales eléctricos en múltiples puntos en el diseño de microcanal, para estas estructuras más complejas. El transporte electrocinético también tiene limitaciones en los tipos de soluciones y materiales que pueden ser manipulados. La interfase mundo-para-ship, es el término que se ha asignado al problema de proporcionar múltiples muestras o reactivos en microchips, para lograr un análisis de alto rendimiento. No obstante que una muestra determinada puede ser analizada en tiempos tan breves como un milisegundo, actualmente no se pueden presentar múltiples muestras a aparatos de microchips en un rango. Ha existido muy poco esfuerzo dirigido hacia este problema, aunque representa un obstáculo importante para lograr la experimentación con un rendimiento ultra alto.
Sumario del Invento De acuerdo con un primer aspecto de la presente invención, se proporciona un método para formar y transportar una serie de segmentos de volumen diminuto (nanolitro o subnanolitros ) de un material en un microchip fluidico, en donde cada uno de los segmentos de volumen están separados por material de segmentación. El método incluye los pasos de proporcionar un primer canal que tiene un extremo de entrada conectado a una fuente de fluido de transporte y un extremo de salida conectado a un recipiente de fluido, y proporcionar un segundo canal que tiene un extremo de entrada conectado a una fuente de fluido de segmentación y un extremo de salida interconectado con el primer canal. Un volumen diminuto del fluido de segmentación, es extraído en el primer canal y transportado en el primer canal hacia el recipiente de fluido. Los pasos de extraer y transportar el volumen diminuto de fluido de segmentación en el primer canal, son repetidos para formar una serie de volúmenes de fluido de transporte y/o volúmenes de análisis entre los volúmenes de fluido de segmentación. Se pueden inyectar o insertar en los volúmenes de fluido de transporte reactivos, células o granulos de reacción para proporcionar una serie de volúmenes de ensayo o análisis. Los volúmenes de ensayo o análisis son transportados en un modo en serie, para proporcionar el registro en serie de los mismos para almacenamiento y recuperación para análisis posterior y otra manipulación en el microchip. De acuerdo con otro aspecto de la presente invención, se proporciona un aparato para formar y transportar una serie de segmentos de volumen diminuto de un material. El aparato es un microchip fluidico que tiene un primero y segundo microcanales formados en un substrato. El primer microcanal tiene un extremo de entrada conectado a una fuente de fluido de transporte y un extremo de salida conectado a un recipiente de fluido. El segundo microcanal tiene un extremo de entrada conectado a una fuente de fluido de segmentación y un extremo de salida interconectado con el primer microcanal. Una pluralidad de electrodos están dispuestos en el primer microcanal entre los extremos de salida del primer microcanal y el segundo microcanal. Una segunda pluralidad de electrodos, están dispuestos en el primer microcanal entre el extremo de entrada del primer microcanal y el segundo microcanal o El aparato incluye además medios para (i) insertar un volumen de fluido de segmentación a partir del segundo microcanal en el primer microcanal, desplazando de este modo el fluido de transporte contenido en el primer microcanal, (ii) detener el transporte del volumen de fluido de segmentación en el primer microcanal, y posteriormente (iii) transportar el transporte intercalado y los volúmenes de segmentación en el primer microcanal hacia el recipiente de fluido. Las modalidades adicionales del aparato de acuerdo con la presente invención, incluyen canales, fuentes de reactivos, diluyentes de reactivos, células y/o partículas de reacción adicionales, para insertar tales materiales en los volúmenes de transporte formados mediante pares secuenciales de los volúmenes de fluido de segmentación. Los medios para transportar los reactivos, células y/o granulos de reacción, también están incluidos en tales modalidades. En un ajuste preferido, el primer microcanal incluye uno o más circuitos para proporcionar un almacenamiento en serie de los volúmenes de reacción para la recuperación y análisis o manipulación posterior.
Breve Descripción de los Dibujos El sumario anterior, asi como la descripción detallada que se encuentra a continuación serán mejor comprendidas cuando sean leídas junto con los dibujos anexos, en los cuales: Las figuras ÍA, IB y 1C son diagramas esquemáticos parciales de un microchip que muestra la secuencia de pasos para insertar un volumen de fluido de segmentación en un microcanal que contiene un fluido de transporte de acuerdo con un aspecto de la presente invención; La figura 2, es un diagrama en esquema parcial de un microchip que muestra la carga de un reactivo en volúmenes de transporte entre pares de alternación de volúmenes de fluido de segmentación en un microcanal de acuerdo con otro aspecto de la presente invención; La figura 3, es un diagrama en esquema parcial de un microchip que muestra la carga de partículas entre pares de alternación de volúmenes de fluido de segmentación en un microcanal de acuerdo con otro aspecto de la presente invención; La figura 4, es un diagrama en esquema parcial de un microchip que muestra la secuencia para insertar un fluido de segmentación, una enzima, y un substrato en un microcanal en un modo en serie de acuerdo con un aspecto adicional de la presente invención; La figura 5, es un diagrama en esquema parcial de un microchip que muestra la secuencia para insertar un fluido de segmentación, una partícula de reacción y un fluido de reactivo en un microcanal en un modo en serie de acuerdo con un aspecto aún adicional de la presente invención; La figura 6, es un diagrama en esquema parcial de un microchip que muestra un ajuste para preparar una serie de ensayos de enzima-granulos; La figura 7, es un diagrama en esquema de un microchip que muestra un ajuste para almacenar y recuperar una serie de células, granulos de reacción o volúmenes de reactivos; y La figura 8, es un esquema de un sistema para investigar e identificar nuevos fármacos que incorpora un microchip, tal como el que se muestra en la figura 7.
Descripción Detallada del Invento Haciendo referencia ahora a los dibujos, en donde los números de referencia y similares se refieren a los mismos componentes o características o similares, y en particular a las figuras ÍA, IB y 1C, se muestra un microcanal principal 10. El microcanal principal 10 es substancialmente lineal y tiene una entrada 12 que está conectada a una fuente de fluido de transporte (no mostrado) y a una salida 14 que está conectada a un depósito de desperdicio (no mostrado) . Un canal de ramificación 16 tiene una entrada 18 y una salida 20 que interceptan con el microcanal principal 10 para conducir un fluido de segmentación o aislamiento 22 en el canal principal 10. Los electrodos el, e2, e3 y e4 están colocados en lugares separados a lo largo del microcanal principal 10 entre la salida 20 y la salida 14. Los electrodos e5, e6 y e7 están colocados en lugares separados a lo largo del lado del microcanal principal entre la salida 20 en la entrada 12. Todos los electrodos están en contacto con los fluidos contenidos dentro de los microcanales . Ya sea el fluido de transporte, el fluido de segmentación o ambos, se pueden transportar a través de microcanales cuando son expuestos a un campo eléctrico axial. Esta función será referida como fluido electrocinético e incluye fenómenos tales como electroforesis, electroósmosis y transporte electrohidrodinámico . Con el ajuste mostrado en las figuras ÍA, IB y 1C, el fluido de segmentación 22 puede ser insertado en el microcanal principal 10 como una serie de volúmenes diminutos independientes. Los pasos para llevar a cabo la inserción de los volúmenes diminutos del fluido de segmentación 22, son esencialmente como se indica a continuación. El microcanal principal 10 se llena con el fluido de transporte. Se aplica una fuente de potencial eléctrico 24a entre los electrodos el y e2 y se aplica una segunda fuente de potencial eléctrico 24b entre los electrodos e5 y eß. Las magnitudes y polaridades de los potenciales eléctricos son seleccionadas para inducir el flujo electrocinético del fluido de transporte en el microcanal principal 10 en las direcciones indicadas por las flechas de la figura ÍA. Tal flujo de fluido de transporte origina que el fluido de segmentación 22 sea extraído en el microcanal principal 10, tal como se muestra en la figura IB. Suponiendo que el fluido de segmentación tiene una conductividad menor a la del fluido de transporte, cuando el fluido de segmentación 22 está en contacto con la membrana de puenteo e5, la corriente entre los electrodos e5 y e6 cae, y termina el flujo de fluido en dicha dirección. Sin embargo, el fluido de segmentación 22 continúa fluyendo hacia la salida 14 en virtud del potencial eléctrico a través de los electrodos el y e2. Cuando se ha extraído el volumen deseado de fluido de segmentación en el microcanal principal 10, el volumen de fluido de segmentación es abastecido en el microcanal principal 10 aplicando una fuente de potencial eléctrico 24c entre los electrodos eß y e7. La magnitud y polaridad de potencial eléctrico entre los electrodos eß y e7, son seleccionadas para inducir un flujo electroosmótico del fluido de transporte en el microcanal principal 10 en las direcciones indicadas por las flechas en la figura 1C. Cuando el volumen de fluido de segmentación está en contacto con la membrana de puenteo el, la corriente entre los electrodos el y e2 cae, y termina el flujo de fluido en dicha dirección. Posteriormente se aplica un potencial eléctrico entre los electrodos e2 y e3 para continuar transportando el fluido de transporte y el volumen de fluido de segmentación. De manera similar, cuando el volumen de fluido de segmentación está en contacto con la membrana de puenteo e2, la corriente entre los electrodos e2 y e3 cae, y termina el flujo de fluido en dicha dirección. Posteriormente se aplica un potencial eléctrico entre los electrodos e3 y e4 para continuar adicionalmente con el transporte del fluido de transporte, y el volumen de fluido de segmentación, a lo largo del microcanal principal 10. La construcción física y operación de un ajuste de bombeo lineal del tipo utilizado en la presente invención, se describe con mayor detalle en nuestra Solicitud de Patente también pendiente Serie No. 09/244,914 cuya especificación completa se encuentra incorporada a la presente invención como referencia. Como una alternativa para los mecanismos de transporte electrocinético, el movimiento del fluido de transporte y la inyección del fluido de segmentación, y cualesquiera otros materiales utilizados en un aparato o método de acuerdo con la presente invención, se puede lograr mediante la aplicación de presión o vacio al canal o canales adecuados. También se contempla que las combinaciones de mecanismo de transporte electrocinético, de presión y/o de vacio, pueden ser utilizadas, si se desea, para implementar un aparato o método determinado de acuerdo con la presente invención. Una vez que un volumen de segmentación ha recorrido una distancia suficiente en el microcanal principal 10, el proceso se repite para insertar otro volumen de segmentación. Si el rango de bombeo del fluido de segmentación en el microcanal principal 10 no es lo suficientemente alto, entonces se pueden colocar electrodos similares en el canal de ramificación 16. El fluido de segmentación es preferentemente un liquido que es no mezclable en el fluido de transporte y el fluido (s) de reacción. Asimismo, el fluido de segmentación debe ser biocompatible con los reactivos biológicos que se utilizan. El fluido de segmentación es preferentemente no conductivo para el control de operación del proceso de reacción/transporte. Por ejemplo, un fluido no conductivo proporciona una forma conveniente para arrastrar el lugar de reacción y bombear volúmenes en la serie de volúmenes diminutos transportados en el microcanal. Además, el fluido de segmentación debe tener un coeficiente minimo de distribución química para los diversos reactivos que se utilizan. La parafina y aceites minerales son adecuados debido a que han sido utilizados para aislar células en pequeños volúmenes de soluciones extracelulares sin efectos perjudiciales. Los perfluorocarbonos también pueden ser adecuados, debido a que son ampliamente utilizados cuando se requiere biocompatibilidad. Los aceites de silicón son otra clase de materiales adecuados para el fluido de segmentación. Los gases tales como propano, pueden ser adecuados para utilizarse como el fluido de segmentación, aunque podrían ser disueltos en el fluido de transporte o reacción o escaparse a través de una placa de cubierta permeable al gas, reduciendo de este modo su efectividad para aislar segmentos de fluido.
A continuación se encuentran descripciones de modos preferidos para implementar varias manipulaciones de cantidades diminutas de materiales en un modo en serie en un microchip fluidico. Aunque no se muestran o describen en relación con las modalidades diversas, las diversas configuraciones pueden incluir modos de contacto eléctrico, tal como se describe con referencia a la figura 1, para proporcionar los potenciales eléctricos necesarios para efectuar el transporte de los materiales fluidicos en los canales de varios aparatos microfabricados . De manera alternativa, tal como se describió anteriormente, también se pueden utilizar medios de presión o vacio. Una característica significativa del método de acuerdo con la presente invención, es la capacidad de insertar una serie de volúmenes de fluido de reacción diminutos en la serie de segmentos de volumen diminuto en el microcanal principal. Haciendo referencia ahora a la figura 2, se muestra un modo para la carga controlada de reactivos en una serie de volúmenes de reacción en el microcanal principal 10. Una pluralidad de volúmenes de fluido de segmentación 26a, 26b, 26d y 26e son insertados, tal como se describió anteriormente, en el microcanal principal 10 en intervalos separados. Un canal de reactivo 28 tiene una entrada 30 y una salida 32 que intercepta con el microcanal principal 10 para conducir un reactivo químico o bioquímico 34 en el microcanal principal 10. Un canal de desperdicio 38 se interconecta con el microcanal principal 10 en un lugar substancialmente opuesto a la salida 32. Un canal de dilución 40 se interconecta con el canal de reactivo 28 para que se pueda mezclar un agente de dilución en el fluido de reacción 34. Los pasos para llevar a cabo la inserción de volúmenes diminutos del fluido de reacción 34, son esencialmente tal como se indica a continuación. Los volúmenes del fluido de transporte y del fluido de segmentación 26a, 26b, 26c, 26d y 26e son bombeados a través del microcanal principal 10. Cuando un par en secuencia de los volúmenes de fluido de segmentación 26b y 26c están adyacentes a la salida 32, se detiene el bombeo y el fluido de reacción 34 es bombeado en el volumen entre los volúmenes de fluido de segmentación 26b y 26c. El fluido de transporte contenido entre los volúmenes de fluido de segmentación 26b y 26c, es preferentemente conducido en el canal de desperdicio 38. De manera alternativa, el fluido de transporte puede ser agregado o reemplazado. El volumen de fluido de reacción 36a, posteriormente es transportado en forma electrocinética a lo largo del microcanal principal 10. Aunque el proceso de acuerdo con este aspecto de la presente invención, ha sido descrito con un modo de operación estático, se reconocerá que la transferencia dinámica del fluido de reacción en los volúmenes de reacción, proporcionará un rendimiento más alto. Tal operación dinámica podria ser implementada mediante el transporte controlado del fluido de transporte y el fluido de reacción, de modo que el fluido de reacción sea inyectado en sincronía con la llegada del volumen de reacción en la salida 32. Preferentemente, los volúmenes de fluido de reacción 36a y 36b están contenidos entre los pares en secuencia alternativos de los volúmenes de fluido de segmentación. De este modo, tal como se muestra en la figura 2, el volumen de fluido de reacción 36a está contenido entre los volúmenes del fluido de segmentación 26b y 26c. Por lo anterior, el volumen de fluido de reacción 36b está contenido entre los volúmenes de fluido de segmentación 26d y 26e. Tal secuenciación alterna permite el bombeo de los volúmenes de fluido de reacción a través del microcanal principal sin exponer el fluido de reacción a un campo eléctrico axial, o el transporte se efectúa en casos en donde el fluido de reacción no soporta el flujo electrocinético. En otras palabras, los potenciales eléctricos se aplican únicamente a los segmentos que contienen el fluido de transporte. La concentración del fluido de reacción se ajusta mezclando un diluyente en el reactivo antes de que sea inyectado en el volumen entre los volúmenes de segmentación. De esta forma, se puede generar una serie de volúmenes de reactivos, teniendo cada uno una concentración diferente. Otra característica significativa del método de acuerdo con la presente invención, es la capacidad de insertar una serie de partículas de reacción, tales como granulos o células, en la serie de segmentos de volumen diminuto en el microcanal principal. Haciendo referencia ahora a la figura 3, se muestra un modo para clasificar y cargar una pluralidad de partículas de reacción 44 en una serie de volúmenes de reacción en el microcanal principal 10. Se extrae una pluralidad de volúmenes de fluido de segmentación 26a, 26b, 2ßc, 26d y 26e en el microcanal principal 10 en intervalos separados, tal como se describió anteriormente. Un recipiente de partículas 42 contiene una pluralidad de partículas de reacción 44 en un fluido de suspensión. El canal de clasificación de partículas 46, está conectado a la salida del recipiente 42 para recibir las partículas 44. Un par de canales de enfoque 48a y 48b están interconectados con el canal de clasificación de partículas 44. Los canales de enfoque 48a y 48b proporcionan un fluido de enfoque para estrechar el descenso del flujo de partículas 44 a una corriente con el ancho de una sola partícula. El enfoque electrocinético de este tipo, se describe en nuestra Solicitud de Patente también pendiente Serie No. 09/098,178, y en nuestra Patente Norteamericana presentada No. 5,858,187, cuyas especificaciones completas se encuentran incorporadas a la presente invención como referencia. Un canal de partículas de reacción 50 intercepta el canal de clasificación de partículas 46 en un lugar de corriente descendente de los canales de enfoque 48a y 48b. En la intersección del canal de partículas de reacción 50 y el canal de clasificación de partículas 46, las partículas de reacción deseadas 44' son separadas de las partículas no deseadas 44". Se aplica un potencial o presión a la entrada 50a del canal 50 para dirigir las partículas 44' en y a lo largo del canal 50 hacia el microcanal principal 10. El canal de partículas de reacción 50 tiene una salida 56 que se interconecta con el microcanal 10 para conducir las partículas de reacción en el microcanal principal 10. Las partículas no deseadas 44", son conducidas aparte a lo largo del canal de desperdicio de partícula 52 que se extiende a partir del canal de clasificación de partículas 46. Los pasos para llevar a cabo la inserción de las partículas de reacción 44' en la corriente de transporte, son esencialmente tal como se indica a continuación. Los volúmenes del fluido de transporte y el fluido de segmentación 26a, 26b, 26c, 26d y 26e son bombeados en forma electrocinética a través del microcanal principal 10. Cuando un par en secuencia de los volúmenes de fluido de segmentación 26b y 26c están adyacentes a la salida 56, el fluido de suspención de partículas con una sola partícula es bombeada en forma electrocinética en el volumen entre los volúmenes de fluido de segmentación 26b y 26c, y el fluido de transporte contenido en el mismo es conducido en el canal de desperdicio 38. En este modo, la sección transversal y el canal de desperdicio, o al menos su entrada, está diseñada para evitar que las partículas pasen a través del mismo. La partícula de reacción y su volumen de fluido de suspensión posteriormente es transportada en forma electrocinética a lo largo del microcanal principal 10 para un canal de detección/análisis 39. Preferentemente, las partículas de reacción están contenidas entre los pares en secuencia alternos de los volúmenes de fluido de segmentación. De este modo, tal como se muestra en la figura 3, una primera partícula está contenida entre los volúmenes de fluido de segmentación 26b y 26c. Por lo anterior, una segunda partícula está contenida entre los volúmenes de fluido de segmentación 26d y 26e. Tal secuenciación alterna permite el bombeo de los volúmenes de fluido de reacción a través del microcanal principal sin exponer la partícula de reacción a un campo eléctrico axial. Hasta este punto, los potenciales eléctricos son aplicados únicamente para los segmentos que contienen el fluido de transporte. La capacidad para manipular en forma precisa el flujo de fluido y el mezclado de reactivos con un microchip fluidico, conduce en si al estudio de la actividad e inhibición enzimática del mismo. Un microchip de ensayo de enzimas tiene importantes implicaciones para el descubrimiento de fármacos y diagnósticos médicos. Haciendo referencia a la figura 4, se muestra un modo para proporcionar ensayos de enzimas de alto rendimiento. Una pluralidad de volúmenes de fluido de segmentación 26a, 26b, 26c y 26d son insertados en el microcanal principal 10 en intervalos separados, tal como se describió anteriormente en la presente especificación. Un canal de enzimas 428 tiene una entrada 430 y una salida que intercepta con el microcanal principal 10 para conducir un material de enzimas fluidico 434 en el microcanal principal 10. Un canal de desperdicio 38 se interconecta con el microcanal principal 10 en un lugar substancialmente opuesto a la salida del canal de enzimas 428. Un canal diluyente 440 se interconecta con el canal de enzimas 428 de modo que se pueda mezclar un agente de dilución en el material de enzimas 434. Un canal de substrato 68 tiene una entrada y una salida que interceptan con la corriente descendente del microcanal principal 10 de la salida del canal de enzimas para conducir un material de substrato fluidico 70 en el microcanal principal 10. Un canal de dilución 72 se interconecta con el canal de substrato 68, de modo que se pueda mezclar un agente de dilución en el material de substrato 70. Los pasos para lograr la inserción de volúmenes diminutos del material de enzimas 434 en el microcanal principal, son esencialmente los mismos que los descritos para la inyección de fluidos de reactivo con referencia a la figura 2. Los volúmenes de fluido de transporte y fluido de segmentación 26a, 26b, 26c y 26d son bombeados a través del microcanal principal 10. Cuando un segmento de volumen de enzimas 434a contenido entre un par en secuencia de los volúmenes de fluido de segmentación 26b y 26c está adyacente a la salida del canal de substrato 68, se detiene el bombeo y el material de substrato fluidico 70 es bombeado en el segmento de volumen de enzimas 434a. El material de enzimas y el substrato son mezclados en el volumen de reacción. El volumen de fluido combinado posteriormente es transportado a lo largo del microcanal principal 10 hacia un canal de detección/análisis 39. Las concentraciones de los materiales de enzimas y substratos, pueden ser variadas, variando la cantidad de diluyente mezclada en cada uno, produciendo de este modo una multitud de diferentes ensayos de enzimas que pueden ser transportados a lo largo del microcanal 10 en un modo en serie. También se pueden proporcionar medios para agregar un inhibidor al volumen de reacción. En una modalidad de un proceso, se implementa un registrador de cambio de granulo para el suministro de los inhibidores. En tal modo, la enzima, substrato e inhibidor se harán reaccionar, y el lugar del granulo que conduce a la inhibición positiva es registrado para análisis futuros. Un modo alternativo es reunir una biblioteca de granulos en un recipiente de los cuales, los granulos son abastecidos en forma aleatoria. Los granulos individuales son transportados en un lugar en donde se proporciona un compuesto al volumen de reacción que contiene un objetivo de ensayo. El granulo es indexado en un modo de registrador de cambio, tal como el conocido y descrito con referencia a la figura 4, aunque únicamente durante un tiempo suficiente para proporcionar un resultado de ensayo. Si el resultado es negativo, el granulo es transferido en un recipiente de almacenamiento general, aunque si se observa inhibición, el granulo es almacenado en el registrador de cambio ya sea para la identificación inmediata o posterior del compuesto, por ejemplo, mediante espectrometría de masa por electrorocio . La actividad enzimática del volumen de reacción es analizada con instrumentación adecuada en el canal de análisis 39 el cual está ubicado en una corriente descendente de distancia adecuada del microcanal 10. La distancia real depende del tiempo de incubación requerido por la enzima, substrato e inhibidor y de la velocidad lineal promedio del volumen de reacción del ensayo . En un ejemplo de un ensayo enzimático que utilizan mezclado electrocinético y transporte de reactivos en un microchip fluidico de acuerdo con esta modalidad de la presente invención, se mezcla un substrato fluorogénico (resorufina-ß-D- galactopiranosida) con la enzima ß-galactosidasa. Las cinéticas de la reacción se obtienen monitoreando la fluorescencia del producto de hidrólisis, resorufina. Se derivan las constantes Michaelis-Menten para la reacción de hidrólisis en la presencia y ausencia de inhibidores. Un segundo ejemplo de un ensayo enzimático que se puede implementar en el método de acuerdo con la presente invención, es un ensayo para determinar la actividad de acetilcolinesterasa (AchE) . Este es un ensayo de dos etapas mediante el cual AchE hidroliza acetiltiocolina para tiocolina, el cual a su vez, se hace reaccionar con coumarinilfenilmaleimida (CPM) para producir un tioéter, CPM-tiocolina altamente fluorescente. La fluorescencia del último producto es monitoreada para determinar la actividad enzimática. La presencia de un inhibidor puede reducir la señal de fluorescencia relativa a la ausencia de tal inhibidor.
En la figura 5, se muestra un modo para una clasificación de alto rendimiento para ensayos celulares incluyendo viabilidad celular. Se inserta una pluralidad de volúmenes de fluido de segmentación 26a-26g en el microcanal principal 10 en intervalos separados del canal de ramificación 10, tal como se describió anteriormente. Un canal de células 50 intercepta el microcanal principal 10 para conducir las células 44' en el microcanal principal 10 en un lugar de corriente descendente del canal de ramificación 16. Las células son suspendidas en un amortiguador biocompatible . Un canal de desperdicio 38 se interconecta con un microcanal principal 10 en un lugar substancialmente opuesto a la salida del canal de células 50. La sección transversal del canal de desperdicio 38, es dimensionada para ser más pequeña que la dimensión de sección transversal mayor minima de las células 44' . Un canal de reactivo 28 intercepta el microcanal principal 10 en un lugar de corriente descendente del canal de células 50. Un segundo canal de desperdicio 38' se interconecta con el microcanal principal 10 en un lugar substancialmente opuesto a la salida del canal de reactivo 28. Los volúmenes de fluido de transporte y de fluido de segmentación 26a-26g son bombeados a través del microcanal principal 10. Cuando un par en secuencia de los volúmenes de fluido de segmentación 26b y 26c está adyacente a la salida del canal de células 50, se bombea el fluido de suspensión celular en el volumen de reacción entre los volúmenes de fluido de segmentación 26b y 26c para que una sola célula se inserte en el volumen de reacción. De manera alternativa, podria cargarse un ensamble de células en un volumen de reacción. De manera concurrente, el fluido de transporte contenido en el mismo es conducido en el canal de desperdicio 38. Las células y volumen de fluido de suspensión en el volumen de reacción posteriormente son transportados a lo largo del microcanal principal 10 hacia la salida del canal de reactivo 28. El reactivo 34 es bombeado en el volumen de reacción que contiene la célula, desplazando el fluido de suspensión celular. El fluido de suspensión celular es conducido aparte através del canal de desperdicio 38' . La célula y el reactivo en el volumen de reacción, posteriormente son transportados al canal de detección/análisis 39. Este proceso se repite para cada célula. Preferentemente, las células 44' están contenidas en los volúmenes de reacción entre los pares en secuencia alternos de los volúmenes de fluido de segmentación, tal como se describió anteriormente. Los ensayos celulares son examinados como una función de tiempo, condiciones de bombeo y composición media. El consumo extremadamente bajo de materiales de reactivo en chips microfluidicos , proporcionan una ventaja significativa para los materiales de reactivo e inhibidores de clasificación costosos y sus materiales de substrato. Las bibliotecas de péptidos para tales experimentos, pueden ser sintetizadas como de costumbre en granulos de 10 a 100 mieras de diámetro o mayores con enlazadores liberables ortogonales. La figura 6 muestra un modo básico para implementar un procedimiento de clasificación de granulos en un microchip fluidico de acuerdo con la presente invención. Un par de microcanales 10 y 610 están colocados en una relación paralela separada. Un recipiente de amortiguador 80 está conectado al microcanal 610 a través de un canal de amortiguación 82. Un recipiente de desperdicio 84 está conectado al microcanal 10 a través de un canal de desperdicio 86. Un canal de transferencia 88 interconecta el microcanal 610 al microcanal 10 en un lugar substancialmente en alineación con el canal de amortiguación 82 y el canal de desperdicio 86.
Se forma una serie de volúmenes de reacción entre los volúmenes del fluido de segmentación 26a-26d en el microcanal 10 y se forma una serie de volúmenes de reacción correspondientes entre los volúmenes de fluido de segmentación 626a-626d en el microcanal 610. Los volúmenes de reacción en cada microcanal son transportados a lo largo de microcanales respectivos, de modo que los volúmenes de reacción b?_?, bi y b1+? en el microcanal 610 se mantienen en sincronía con los volúmenes de reacción Cj_?, Cj y Cj+i en el microcanal 10. Los granulos 44a, 44b y 44c se insertan en los volúmenes de reacción bi_?, bi y bi+i, respectivamente en una forma similar a la descrita anteriormente con referencia a la figura 3. Los volúmenes de enzimas 36a, 36b y 36c son insertados en los volúmenes de reacción Cj_?, Cj y c-,+?, respectivamente, en un modo similar al descrito anteriormente con referencia a la figura 2. Cuando cada granulo llega al canal de transferencia 88, su compuesto es liberado del granulo y transferido al volumen de reacción correspondiente. El granulo y su volumen de reacción asociado posteriormente son cambiados en el registro para una estación de corriente descendente en donde se agrega un substrato fluorogénico al volumen de reacción (Cj_ i, Cj y Cj+i) para el ensayo de fluorescencia. Un granulo correspondiente a un volumen de reacción que exhibe inhibición, puede ser eliminado y transferido a una estación en donde se efectúa una segunda liberación del compuesto mediante un método de disociación ortogonal. Dicho compuesto puede ser analizado mediante espectrometría de masa de ionización por electrorocio para determinar su estructura química. La utilización de cualesquiera de los procedimientos implementados por microchips fluidicos descritos anteriormente, produce una serie extendida de ensayos, células, granulos, etc., independientes transportados en un microcanal. Los volúmenes de reacción involucrados, son preferentemente volúmenes de nanolitros o subnanolitros , proporcionando de este modo numerosos compuestos, ensayos, células, granulos, etc., diferentes. También se contempla que se pueden utilizar volúmenes más grandes. Ya que el volumen de reacción es independiente, su posición puede ser identificada y arrastrada conforme se mueve a través del microcanal, en forma análoga a una serie de bits electrónicos que se mueven a través de un registrador de cambio digital. En la figura 7 se muestra un arreglo para archivar y recuperar numerosos volúmenes de reacción que contienen reactivos, células, granulos de bibliotecas de combinación, etc. Un microcanal 10 está conectado a una fuente de fluido de transporte a través de un canal de fluido de transporte 60. Tal como se describió anteriormente, se proporciona un fluido de segmentación para el microcanal 10 a través de un canal de ramificación 16. Se insertan reactivos, células o granulos en los volúmenes de reacción en el microcanal 10 a través del canal de reactivo 28. Un canal de desperdicio 38 está interconectado con el microcanal 10 para conducir aparte el fluido de transporte del volumen de reacción. El microcanal 10 se extiende en una dirección para formar una pluralidad de circuitos 64a, 64b y 64c y termina en un recipiente 62a. El microcanal 10 se extiende en una dirección opuesta para formar una segunda pluralidad de circuitos 66a, 66b y 66c y termina en un recipiente 62b. En un primer modo de operación, los volúmenes de reacción formados entre los volúmenes del fluido de segmentación, avanzan transportándolos en un modo escalonado en la dirección mostrada por las flechas sólidas y a través de los circuitos 64a, 64b y 64c para el archivo. En un segundo modo de operación, los volúmenes de reacción son recuperados transportándolos en un modo escalonado en la dirección mostrada en las flechas punteadas. La longitud combinada de los circuitos 66a, 66b y 66c es similar a la longitud de la longitud combinada a los circuitos 64a, 64b y 64c, de modo que toda la serie de los volúmenes de reacción archivada en los circuitos 64a, 64b y 64c puede ser recuperada para un análisis posterior . Aunque no se muestra en la figura 7, la distribución de electrodos necesaria para implementar el aparato de archivo/recuperación del método 1, podria ser de tal modo que se haga posible el transporte de los volúmenes de reacción en dos direcciones. Preferentemente, los electrodos o contactos podrían entrar a partir de cada uno de los cuatro lados de los circuitos. La geometría de los electrodos, es seleccionada para proporcionar el contacto adecuado con los circuitos de microcanal en una periodicidad de espacio adecuada. Con tal distribución, los materiales pueden ser cargados en serie en el registrador para ser analizados inmediatamente o en un momento posterior. Los materiales pueden ser entregados a estaciones de reactivos o ensayo conforme los volúmenes de reacción son cambiados hacia adelante y hacia atrás entre los circuitos del microcanal.
El número de volúmenes de reacción que se puede mantener en el banco de almacenamiento definido por los circuitos 64a, 64b y 64c, puede ser estimado utilizando la ecuación 1 que se encuentra a continuación.
(Ecuación 1) Ls es la longitud de un lado del circuito exterior, LR la longitud del volumen de reacción, t es la longitud del segmento de aislamiento, Lc es el espacio centro a centro entre los canales adyacentes en los circuitos, y n es el número de circuitos. Por ejemplo, si Ls es de lOOmm, LR+LI = lmm, Lc es 0. lmm y n = 100, entonces se pueden almacenar aproximadamente 19010 volúmenes de reacción (N) en los circuitos de almacenamiento del registrador de cambio. Tal aparato podria utilizar únicamente aproximadamente el 10% del área de un substrato de microchip de lOOmm x lOOmm cuadrados. Aunque el modo preferido descrito en la presente invención incluye uno o más circuitos para formar el canal de almacenamiento, los expertos en la materia apreciarán fácilmente que se pueden utilizar otras configuraciones. Por ejemplo, un arreglo de serpentina podria ser igualmente efectivo.
Tales aparatos de almacenamiento/recuperación del registrador de cambio son muy convenientes para manejar bibliotecas de granulos de combinación, tal como se describe con referencia a las figuras 5 y 6. Los granulos de una síntesis-división podrían ser cargados en forma colectiva en un recipiente y abastecidos, utilizando las capacidades de clasificación de granulos en chip, en el registrador de almacenamiento. Los compuestos pueden ser liberados de los granulos en forma parcialmente fotolitica según sea necesario o liberados previamente en los contenidos del volumen de reacción. La biblioteca de granulos puede ser certificada incorporando una estación de ionización por electrorocio en el microchip para la identificación de espectrometría de masa de los compuestos de reacción. Los granulos también pueden ser llevados a un lugar en donde el compuesto es entregado a un volumen de reacción por separado para realizar un ensayo biológico, tal como se describe con referencia a la figura 6. Haciendo referencia ahora a la figura 8, se muestra un sistema 800 para lograr la identificación de nuevos fármacos. Un módulo de síntesis 810 para la síntesis de una serie de compuestos de fármacos potencialmente útiles, está conectado a un microcanal principal 812 a través de una pluralidad de canales de inserción. Cada uno de los compuestos sintetizados es insertado en un volumen de transporte y son transportados a lo largo del microcanal 812 en la forma descrita anteriormente. Un módulo de certificación 814 está proporcionado para el análisis y certificación de la estructura molecular de los compuestos sintetizados. El módulo de certificación está conectado al microcanal 812 a través de una segunda pluralidad de canales para obtener muestras de los compuestos sintetizados. También se proporciona un módulo de ensayo 818 para llevar a cabo ensayos de clasificación en las series de compuestos sintetizados contra objetivos moleculares o celulares. El módulo de clasificación 818 está conectado al microcanal 812 mediante una tercera pluralidad de canales para obtener muestras de los compuestos de fármacos sintetizados. Las moléculas o células objetivos son almacenadas en un modo en serie en los módulos de almacenamiento objetivo 820, 821. Un segundo microcanal 822 está colocado entre los módulos de almacenamiento objetivo para transportar los objetivos al módulo de clasificación 818. Las series de compuestos de fármacos son transportadas a lo largo del microcanal 812 a los módulos de almacenamiento 816, 817 para la recuperación posterior. Esta característica permite que los compuestos del fármaco sean analizados y/o clasificados en un momento substancialmente posterior al momento de la síntesis. Los resultados de las clasificaciones llevadas a cabo por el módulo de clasificación 818, son proporcionados a un módulo de decisión 824 el cual puede evaluar la efectividad de los compuestos sintetizados y proporcionar retroalimentación al módulo de síntesis 819 para sintetizar compuestos nuevos y diferentes con base en los resultados anteriores. De esta forma, una multitud de compuestos de fármacos nuevos pueden ser rápida y automáticamente sintetizados, certificados y clasificados en un solo microchip. En virtud de las descripciones anteriores y los dibujos que la acompañan, los expertos en la materia apreciarán que el método y aparato de acuerdo con la presente invención, tienen la capacidad de dirigirse a un amplio rango de problemas de análisis bioquímicos que se benefician de las manipulaciones automáticas a escala de nanolitros o subnanolitros con una alta capacidad de rendimiento en serie. El aparato y método descritos en la presente invención, también conducen por si mismos a una expansión paralela múltiple la cual proporcionará un rendimiento mayor para la generación de información química y bioquímica. Los aparatos de microcanal descritos, pueden manipular volúmenes de reacción bioquímica en una forma controlada para proporcionar resultados rápidos, por ejemplo, rangos de al menos aproximadamente de 1 a 10 Hz por canal, y se espera conseguir rangos de hasta 100 Hz ó 1000 Hz. Los volúmenes de reacción utilizados tienen la capacidad de contener especies moleculares o de particulado sin pérdidas de difusión. Los volúmenes de reacción individual son manipulados en un modo en serie análogo a un registrador de cambio digital. El aparato incluye microcanales de circuito para proporcionar almacenamiento en serie de los volúmenes de reacción para la recuperación posterior. El método y aparato de acuerdo con la presente invención, tienen aplicación para problemas tales como clasificación de objetivos moleculares o celulares, utilizando granulos solos procedentes de bibliotecas de combinación de síntesis-división, clasificación de células solas para expresión de ARN o proteina, clasificación de diagnóstico genético en el nivel de una sola célula, o la realización de estudios de transducción de señal de una sola célula.
Los términos y expresiones que se han empleado en la descripción anterior, se utilizan como términos de descripción y no de limitación. No hay intención en el uso de tales términos y expresiones, de excluir cualesquiera equivalentes de las características mostradas y descritas o partes de las mismas. Sin embargo, se reconocerá que son posibles varias modificaciones tales como dimensión de canal, ubicación y ajuste, dentro del alcance de la presente invención tal como se reclama a continuación.

Claims (1)

  1. NOVEDAD DE LA INVENCIÓN Habiendo descrito la presente invención se considera como novedad y por lo tanto se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes: REIVINDICACIONES 1. Un método para formar y transportar una serie de segmentos de un material de volumen diminuto en un microcanal que comprende los pasos de: a. proporcionar un primer canal que tiene un extremo de entrada conectado a una fuente de fluido de transporte y un extremo de salida conectado a un recipiente de fluido; b. proporcionar un segundo canal que tiene un extremo de entrada conectado a una fuente de fluido de segmentación y un extremo de salida interconectado con el primer canal; c. extraer un volumen de fluido de segmentación en el primer canal; d. transportar el volumen de fluido de segmentación en el primer canal hacia el recipiente de fluido; y posteriormente e. repetir los pasos c y d para formar una serie de volúmenes independientes de fluido de segmentación. 2. Un método de conformidad con la reivindicación 1, en donde el paso de extracción del volumen del fluido de segmentación en el primer canal comprende los pasos de: a. proporcionar un primero, segundo y tercer contacto eléctrico en el primer canal en un lugar entre los extremos de salida del primer canal y el segundo canal; b. proporcionar un cuarto, quinto y sexto contacto eléctrico en el primer canal en un lugar entre el extremo de entrada del primer canal y el extremo de salida del segundo canal; y c. aplicar un primer potencial eléctrico a través del primero y segundo contactos eléctricos, y un segundo potencial eléctrico a través del cuarto y quinto contactos eléctricos, teniendo el primero y segundo potenciales eléctricos magnitudes y polaridades que son efectivas para inducir el flujo del fluido de transporte en el primer canal, para extraer el fluido de segmentación en el primer canal. 3. Un método de conformidad con la reivindicación 2, en donde el método comprende los pasos de: a. reducir la magnitud del segundo potencial eléctrico a través del cuarto y quinto contactos eléctricos; y b. mantener la magnitud y polaridad del primer potencial eléctrico a través del primero y segundo contactos eléctricos hasta que sea extraído el volumen deseado de fluido de segmentación en el primer canal. 4. Un método de conformidad con la reivindicación 3, en donde el paso de transportar el volumen de fluido segmentación en el primer canal, comprende los pasos de: a. aplicar un tercer potencial eléctrico a través del quinto y sexto contactos eléctricos mientras se mantiene el primer potencial eléctrico a través del primero y segundo contactos eléctricos, hasta que el volumen de fluido de segmentación alcanza el primer contacto eléctrico; y posteriormente b. aplicar un cuarto potencial eléctrico a través del segundo y tercero contactos eléctricos, por lo que el volumen del fluido de segmentación es transportado hacia el segundo contacto eléctrico. 5. Un método de conformidad con la reivindicación 1, que comprende el paso de inyectar un volumen de un reactivo en el primer canal entre un par en secuencia de los volúmenes del fluido de segmentación. 6. Un método de conformidad con la reivindicación 5, en donde el paso de inyectar el reactivo comprende los pasos de: a. proporcionar un cuarto canal que tiene un extremo de entrada conectado a una fuente de reactivos y un extremo de salida interconectado con el primer canal; b. proporcionar un quinto canal que tiene un extremo de entrada interconectado con el primer canal; y c. aplicar un potencial eléctrico entre el cuarto canal y el quinto canal para originar que el volumen de reactivo fluya en el primer canal y el fluido de transporte fluya en el quinto canal. 7. Un método de conformidad con la reivindicación 5, que comprende el paso de diluir la concentración del reactivo antes de que sea inyectado en el primer canal . 8. Un método de conformidad con la reivindicación 5, que comprende el paso de repetir la inyección del reactivo en el primer canal, de modo que una pluralidad de volúmenes de reactivo sea inyectada entre pares en secuencias no adyacentes de volúmenes del fluido de segmentación. 9. Un método de conformidad con la reivindicación 8, que comprende el paso de transportar la pluralidad de volúmenes de reactivo inyectados a lo largo del primer canal hacia el recipiente de fluido. 10. Un método de conformidad con la reivindicación 9, que comprende el paso de almacenar en forma secuencial la pluralidad de volúmenes de reactivo inyectados, de modo que un volumen seleccionado de los volúmenes de reactivo puede ser recuperado para análisis. 11. Un método de conformidad con la reivindicación 10, que comprende el paso de recuperar el volumen de reactivo seleccionado del almacenamiento . 12 Un método de conformidad con la reivindicación 1, que comprende el paso de insertar una partícula de reacción en el primer canal entre un par en secuencia de volúmenes del fluido de segmentación . 13. Un método de conformidad con la reivindicación 12, que comprende el paso de repetir la inserción de la partícula de reacción en el primer canal, de modo que se inserten una pluralidad de partículas de reacción entre pares de volúmenes en secuencia no adyacentes del fluido de segmentación. 14. Un método de conformidad con la reivindicación 12, que comprende el paso de transportar la pluralidad de partículas de reacción a lo largo del primer canal hacia el recipiente del fluido . 15 Un método de conformidad con la reivindicación 14, que comprende el paso de almacenar en forma secuencial la pluralidad de partículas de reacción insertadas, de modo que una partícula seleccionada de las partículas de reacción pueda ser recuperada para análisis. 16. Un método de conformidad con la reivindicación 10, que comprende el paso de recuperar la partícula de reacción seleccionada del almacenamiento. 17. Un aparato para formar y transportar una serie de segmentos de un material de volumen diminuto, en donde el aparato comprende: un substrato que tiene un primero y segundo microcanales formados en el mismo, teniendo el primer microcanal un extremo de entrada conectado a una fuente de fluido de transporte y un extremo de salida conectado a un recipiente de fluido, teniendo el segundo microcanal un extremo de entrada conectado a una fuente del fluido de segmentación y un extremo de salida interconectado con el primer microcanal; un primero, segundo y tercer contactos eléctricos dispuestos en el primer microcanal en un lugar intermedio entre el extremo de salida del primer microcanal y el segundo microcanal; un cuarto, quinto y sexto contactos eléctricos dispuestos en el primer microcanal en una posición intermedia entre el extremo de entrada del primer microcanal y el segundo microcanal; y medios para aplicar en forma secuencial potenciales eléctricos a través de los pares adyacentes de contactos eléctricos para (i) extraer un volumen de fluido de segmentación en el primer microcanal, (ii) detener la extracción del volumen de fluido de segmentación en el primer microcanal, y posteriormente (iii) transportar los volúmenes del fluido de segmentación en el primer microcanal hacia el recipiente de fluido. 18. Un aparato de conformidad con la reivindicación 17, en donde el aparato comprende: un cuarto canal que tiene un extremo de entrada conectado a una fuente de reactivos y un extremo de salida interconectado con el primer canal; un quinto canal que tiene un extremo de entrada interconectado con el primer canal; y medios para inyectar un volumen de reactivo entre un par de volúmenes secuenciales del fluido de segmentación en el primer canal, de modo que el fluido de transporte dispuesto entre el par de volúmenes secuenciales del fluido de segmentación, es originado para fluir en el quinto canal. 19. El aparato de conformidad con la reivindicación 18, que comprende medios que aplican un potencial eléctrico entre el cuarto canal y el quinto canal para inyectar el volumen de reactivo. 20. El aparato de conformidad con la reivindicación 18, que comprende medios para diluir el reactivo cuando es inyectado en el primer canal. 21. El aparato de conformidad con la reivindicación 19, que comprende medios para variar la dilución del reactivo para proporcionar una serie de volúmenes de reactivo diluido que tienen diferentes concentraciones, y medios para inyectar cada uno de los volúmenes en pares de alternación de los volúmenes del fluido de segmentación en el primer canal. 22. El aparato de conformidad con la reivindicación 18, que comprende: contactos eléctricos adicionales localizados a lo largo del primer canal entre el cuarto canal y el recipiente de fluido; y medios para aplicar potenciales eléctricos entre pares respectivos de contactos eléctricos adicionales para transportar el volumen de reacción a lo largo del primer canal hacia el recipiente de fluido. 23. El aparato de conformidad con la reivindicación 18, en donde el primer canal comprende un circuito para mantener una pluralidad de volúmenes de reactivo diluidos dispuestos entre los pares de alternación de los volúmenes de fluido de segmentación . 24. El aparato de conformidad con la reivindicación 17, que comprende: un cuarto canal que tiene un extremo de entrada conectado a una fuente de partículas de reacción suspendidas en un medio de fluido, y un extremo de salida interconectado con el primer canal; un quinto canal que tiene un extremo de entrada interconectado con el primer canal; y medios para inyectar una partícula de reacción suspendida en el medio de fluido entre un par de volúmenes secuenciales del fluido de segmentación en el primer canal, de modo que el fluido de transporte dispuesto entre el par de volúmenes secuenciales del fluido de segmentación, es originado para fluir en el quinto canal . 25. El aparato de conformidad con la reivindicación 20, que comprende medios para aplicar un potencial eléctrico entre el cuarto canal y el quinto canal para originar un volumen del medio de fluido que contiene la partícula de reacción para fluir dentro del primer canal y el fluido de transporte para fluir dentro del quinto canal. 26. El aparato de conformidad con la reivindicación 20, que comprende medios para clasificar las partículas de reacción de acuerdo con una cualidad o característica de las partículas de reacción, y medios para inyectar las partículas de reacción individuales entre un par de volúmenes secuenciales del fluido de segmentación en el primer canal . 27. El aparato de conformidad con la reivindicación 22, que comprende medios para controlar la inyección de cada una de las partículas de reacción, de modo que las partículas de reacción son insertadas entre los pares de alternación de los volúmenes del fluido de segmentación en el primer canal . 28. El aparato de conformidad con la reivindicación 23, que comprende: contactos eléctricos adicionales localizados a lo largo del primer canal entre el cuarto canal y el recipiente de fluido; y medios para aplicar potenciales eléctricos entre pares respectivos de los contactos eléctricos adicionales para transportar el volumen de fluido de segmentación a largo del primer canal hacia el recipiente de fluido. 29. El aparato de conformidad con la reivindicación 18, en donde el primer canal comprende un circuito para mantener una pluralidad de partículas de reacción dispuestas entre los pares de alternación de los volúmenes del fluido de segmentación. RESUMEN Se presenta un método para conducir un amplio rango de análisis o manipulaciones bioquímicas en una serie de volúmenes de reacción de nano a subnanolitros y un aparato para llevar a cabo los mismos. El método y aparato están implementados en un microchip fluidico para proporcionar un alto rendimiento en serie. El aparato y método de la presente invención, también conducen por si mismos a múltiples análisis y manipulación paralela para proporcionar un mayor rendimiento para la generación de información bioquímica. En particular, el aparato descrito es un aparato de canal microfabricado que puede manipular volúmenes de reacción bioquímica en nanolitros o subnanolitros en una forma controlada, para producir resultados en rangos de 1 a 10 Hz por canal. Los volúmenes de reacción individuales son manipulados en un modo en serie análogo a un registrador de cambio digital. El método y aparato de conformidad con la presente invención, tienen aplicación a problemas tales como clasificación de objetivos moleculares o celulares utilizando granulos solos procedentes de bibliotecas de combinación de sintesis-división, clasificación de células solas para la expresión de ARN o proteina, clasificación de diagnóstico genético en el nivel de una sola célula, o en la realización de estudios de transducción de señal de una sola célula.
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