DE60111218T2

DE60111218T2 - Verbesserter invasionsassay

Info

Publication number: DE60111218T2
Application number: DE60111218T
Authority: DE
Inventors: J. Kenneth LIVAK; Y. Michael LUCERO; A. Muhammad SHARAF
Original assignee: Applera Corp
Current assignee: Applied Biosystems Inc
Priority date: 2000-03-27
Filing date: 2001-03-26
Publication date: 2006-03-23
Anticipated expiration: 2021-03-27
Also published as: CA2403890A1; EP1290219A2; US20030099941A1; JP2003528627A; WO2001073127A3; EP1290219B1; ATE296899T1; AU4777401A; US6964848B2; WO2001073127A2; DE60111218D1

Description

1. GEBIET DER ERFINDUNG
Die Erfindung betrifft verbesserte Verfahren zum Nachweisen und Charakterisieren von Nukleinsäuresequenzen und Variationen in Nukleinsäuresequenzen.
2. HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Seit der Entwicklung der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) führte der Bedarf an schnellen, verlässlichen und kostenwirksamen Tests für den Nachweis von spezifischen Nukleinsäuresequenzen zu der Entwicklung einer Vielzahl von neuen Testtechniken. Eine von diesen, die als der INVADER^TM (eine Marke von Third Wave Technologies, Madison, Wisconsin) -Test, Invasionsspaltungstest oder Invasionstest bezeichnet wird, benötigt nicht die Verwendung von PCR. Invasionstests sind hochgradig empfindlich und können verwendet werden, um beispielsweise Einzelbasenunterschiede von spezifischen Nukleotidzielen zu bestimmen. Vergleiche z.B. Lyamichev, V. et al., Nature Biotech. 17: 292–296 (1999), und Ryan, D. et al., Molecular Diag. 4(2): 135–144 (1999).
Invasionstests basieren auf der Fähigkeit von manchen Enzymen (z.B. Endonukleasen), Nukleotid-"Klappbereiche (flaps)", wie diejenigen, die in 1A gezeigt sind, zu spalten, die gebildet werden, wenn ein Oligonukleotid, das komplementär zu einem Teil einer DNA-Matrize ist, mit einem anderen Oligonukleotid, das komplementär zu einem anderen Teil der Matrize ist, überlappt. Spezifische Enzyme, wie FEN 1, spalten Klappbereiche, die gebildet werden, wenn das 3'-Ende eines stromaufwärts liegenden Oligonukleotids, das komplementär zu einem Teil einer DNA-Matrize ist, mit dem 5'-Ende eines stromabwärts liegenden Oligonukleotids, das komplementär zu einem anderen Teil der DNA-Matrize ist, überlappt. Wie in 1B gezeigt, stellt eine Spaltung durch ein solches Enzym eines stromabwärts liegenden Oligonukleotids (identifiziert als Sonde in 1B) ein Fragment bereit, das der Überlappung zwischen den zwei Oligonukleotiden, die komplementär zu der Matrize sind, entspricht. Vergleiche Lyamichev, V. et al., Nature Biotech. 17: 292–296 (1999).
Viele Endonukleasen sind thermostabil und können nahe an den Schmelztemperaturen der Sonden-Oligonukleotide, die sie spalten, verwendet werden. Vergleiche Kaiser, M. W. et al., J. Biol. Chem. 274(30): 21387–21394 (1999), und die Patente und veröffentlichten Patentanmeldungen, auf die hierin Bezug genommen wird. Die meisten Invasionstests ziehen aus dieser Eigenschaft dadurch einen Vorteil, dass sie einen molaren Überschuss eines Sonden-Oligonukleotids verwenden, das bei oder nahe seiner Schmelztemperatur schnell mit der Matrizen-DNA assoziieren wird und sich schnell von dieser entfernen wird. Dies ermöglicht einer neuen nicht gespaltenen Sonde, eine gespaltene Sonde zu ersetzen, so dass, wenn das Experiment abgeschlossen ist, die Menge an gespaltenen fluoreszierenden Fragmenten signifikant größer ist als die Menge an Matrizen-DNA. Vergleiche Lyamichev, V. et al., Nature Biotech. 17: 292–296 (1999).
Die WO-A-01/32922 beschreibt Verfahren zum Nachweisen oder Messen einer Zielnukleinsäuresequenz, wobei eine Spaltstruktur durch Inkubieren einer Probe, die die Zielnukleinsäuresequenz, einen stromaufwärts liegenden Oligonukleotidprimer und eine Oligonukleotidprimersonde, die stromabwärts von dem stromaufwärts liegenden Primer lokalisiert ist, umfasst, mit einer Nukleinsäurepolymerase gebildet wird, die Spaltstruktur mit einer FEN-Nuklease gespalten wird, um ein Nukleinsäurefragment freizusetzen, und die Freisetzung des Fragments als ein Nachweis des Vorhandenseins der Zielsequenz in der Probe nachgewiesen und/oder gemessen wird.
2 stellt eine Darstellung eines Invasionstests bereit, der z.B. in der US-PS 5,994,069 beschrieben ist. In diesem Test dringt das Fragment, das von einem Sonden-Oligonukleotid gespalten wird, in eine zweite Struktur (die hierin als "Reportervorläufer" bezeichnet wird) ein, die einen fluoreszierenden Reporter R und einen Quencher Q enthält. Eine Assoziierung des Sondenfragments mit der zweiten Struktur bildet einen Klappbereich aus, der durch ein Enzym in dem Gemisch abgespalten wird. Diese Abspaltung bricht die Verbindung zwischen dem Reporter R und dem Quencher Q und stellt ein fluoreszierendes Reporterfragment bereit.
Theoretischerweise kann eine Spaltung des in 2 gezeigten Reportervorläufers lediglich dann auftreten, nachdem ein sekundäres Invader-Oligonukleotidfragment durch die primäre Invasionsreaktion gebildet wurde. In manchen Fällen bindet jedoch das primäre Invader-Oligonukleotid, das lediglich an die Matrizen-DNA binden soll, auch zu einem gewissen Grad an die sekundäre Struktur, was eine Spaltung dieser Struktur bewirkt. Diese Spaltung erzeugt ein Hintergrundsignal, das berücksichtigt werden muss, wenn das Ergebnis des Tests bestimmt wird. Folglich wurden Invasionstests, wie sie durch 2 dargestellt sind, mit einer Kontrolle durchgeführt, d.h. ein Test, in dem Matrize oder Ziel-DNA nicht vorhanden ist. Das Fluoreszenzsignal, das bei Abschluss dieses Kontrolltests gemessen wird, ist das Signal aufgrund der unerwünschten Spaltung der sekundären Struktur durch das primäre Invader-Oligonukleotid. Dieses Kontrollsignal wird von demjenigen abgezogen, das bei dem Abschluss des Test-Assays (d.h. dem Assay mit der Matrizen-DNA) gemessen wird, um eine Abschätzung des Signals aufgrund lediglich einer Überlappung zwischen dem Invader-Oligonukleotid und Sonden-Oligonukleotiden in der primären Invasionsreaktion bereitzustellen. Theoretisch zeigt ein positives Nettosignal an, dass das Invader-Oligonukleotid und das Sonden-Oligonukleotid komplementär zu unterschiedlichen Teilen der DNA-Matrize sind und überlappen.
Der Invasionstest ist ein leistungsstarkes analytisches Werkzeug, das verwendet werden kann, um bestehende Tests wie PCR zu ergänzen oder sogar zu ersetzen. Es ist jedoch erwünscht, dessen Geschwindigkeit und Genauigkeit zu erhöhen. Es ist auch erwünscht, die Menge an Sondenmaterial, die verwendet werden muss, um ein geeignetes (z.B. verlässliches) Ergebnis bereitzustellen, zu reduzieren. Diese und andere Bedürfnisse werden durch die hierin beschriebene Erfindung erfüllt.
3. ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die Erfindung betrifft einen verbesserten Invasionstest, der eine Analyse von Invasionstestdaten umfasst. Die Erfindung basiert teilweise auf einer Feststellung, dass Signale aufgrund der Spaltung einer Sonde, die an ein Matrizenpolynukleotid (z.B. DNA oder RNA) angelagert ist, ein Verhalten über die Zeit zeigen kann, das unterschiedlich von dem Verhalten über die Zeit von Signalen ist, die durch Hintergrundreaktionen (z.B. Reaktionen, die nicht von dem Vorhandensein von Zielpolynukleotid abhängen) erzeugt werden. Zum Beispiel kann das positive Signal, das durch viele Invasionstests erzeugt wird (d.h. das Signal, das eine Spaltung eines Sonden-Oligonukleotids, das an ein Zielpolynukleotid angelagert ist, anzeigt) an ein Polynom angepasst werden, das eine höhere Ordnung aufweist als das Polynom, das zum Charakterisieren von Hintergrundsignal benötigt wird.
Es ist folglich möglich, die Ergebnisse eines Invasionstests in Echtzeit oder bei Abschluss des Tests dadurch zu bestimmen, dass bestimmt wird, ob das Verhalten des Signals, das er erzeugte, über die Zeit unterschiedlich von demjenigen eines typischen, abgeschätzten, theoretischen oder tatsächlich gemessenen Hintergrundsignals ist.
3.1. KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1A stellt eine schematische Darstellung der Konfigurationen bereit, die von Oligonukleotiden mit einer Überlappung, die komplementär zu einem DNA-Ziel ist, angenommen werden. Das 3'-Ende des stromaufwärts liegenden Oligonukleotids (A) oder das 5'-Ende des stromabwärts liegenden Oligonukleotids (C) kann jeweils durch das andere verdrängt werden, wobei beide Konformere sich über eine intermediäre Form (B) austauschen. Endonukleasen, wie FEN1, spalten lediglich den Klappbereich, der durch die Verdrängung des stromabwärts liegenden Segments (C) gebildet wird. Vergleiche Lyarnichev, V. et al., Nature Biotech. 17: 292–296 (1999).
1B stellt ein Beispiel einer Zielregion und der Spaltstrukturen, die sich aus der Überlappung von 0, 1, 3, 5 und 8 Nukleotiden ergeben, und die Struktur einer Sonde und von fünf Invader-Oligonukleotiden bereit. Die unterstrichenen Nukleotide an dem 3'-Ende der Invader-Oligonukleotide zeigen das Ausmaß der Überlappung mit dem Sonden-Oligonukleotid. Die markierten Pfeile über der Sonde zeigen die Spaltstellen, die durch jedes Invader-Oligonukleotid induziert werden. Der Stern zeigt eine fluoreszierende Markierung an. Vergleiche Lyamichev, V. et al., Nature Biotech. 17: 292–296 (1999).
2 stellt eine schematische Darstellung eines Typs an Invasionstest bereit, der hierin als ein "Kaskadeninvasionstest" bezeichnet wird.
3 zeigt einen positiven Test und vier negative Tests.
4 zeigt idealisierte invasive Spalttest-Reaktionskurven.
5 zeigt die Wirkung einer Domänentransformation auf eine Familie von Reaktionsfunktionen, die mit zugesetztem willkürlichen Rauschen simuliert wurden.
6 zeigt die Koeffizienten zweiter Ordnung, die aus Anpassungen der in 3 gezeigten Daten erhalten wurden.
7 zeigt die Transformation von experimentellen Reaktionen, die aus den in 3 gezeigten Daten gewonnen wurden.
8 zeigt transformierte Signale (oberes Feld) und die Reste, die erhalten werden, wenn ein lineares Modell an Signale aus den Wells 5 und 19 in dem Datensatz von Tabelle 1 angepasst wird.
3.2. DEFINITIONEN
"Nukleobase" betrifft einen substituierten oder nicht substituierten stickstoffhaltigen heteroaromatischen Stammring eines Typs, der herkömmlicherweise in Polynukleotiden zu finden ist. Typischerweise, aber nicht notwendigerweise, ist die Nukleobase zur Bildung von Watson-Crick- und/oder Hoogsteen-Wasserstoffbindungen mit einer geeignet komplementären Nukleobase fähig. Beispielhafte Nukleobasen beinhalten in nicht begrenzender Weise Purine wie 2-Aminopurin, 2,6-Diaminopurin, Adenin (A), Ethenoadenin, N⁶-Δ²-Isopentenyladenin (6iA), N⁶-Δ²-Isopentenyl-2-methylthioadenin (2ms6iA), N⁶-Methyladenin, Guanin (G), Isoguanin, N²-Dimethylguanin (dmG), 7-Methylguanin (7mG), 2-Thiopyrimidin, 6-Thioguanin (6sG), Hypoxanthin und O⁶-Methylguanin, 7-Deazapurine wie 7-Deazaadenin (7-Deaza-A) und 7-Deazaguanin (7-Deaza-G), Pyrimidine wie Cytosin (C), 5-Propinylcytosin, Isocytosin, Thymin (T), 4-Thiothymin (4sT), 5,6-Dihydrothymin, O⁴-Methylthymin, Uracil (U), 4-Thiouracil (4sU) und 5,6-Dihydrouracil (Dihydrouracil, D), Indole wie Nitroindol und 4-Methylindol, Pyrrole wie Nitropyrrol, Nebularin, Base (Y), etc. Zusätzliche beispielhafte Nukleobasen können in Fasman, 1989, Practical Handbook of Biochemistry and Molecular Biology, Seiten 385–394, CRC Press, Boca Raton, Florida, und den dort zitierten Referenzen gefunden werden. Bevorzugte Nukleobasen sind Purine, 7-Deazapurine und Pyrimidine. Besonders bevorzugte Nukleobasen sind die normalen hierin definierten Nukleobasen und deren herkömmliche Analoga, z.B. 2ms6iA, 6iA, 7-Deaza-A, D, 2dmG, 7-Deaza-G, 7mG, Hypoxanthin, 4sT, 4sU und Y.
"Normale Nukleobase" betrifft eine Nukleobase, die natürlich auftritt und kodiert, d.h. Adenin, Cytosin, Guanin, Thymin oder Uracil.
"Nukleosid" betrifft eine Verbindung, die aus einer Nukleobase besteht, die kovalent, typischerweise über ein heteroaromatisches Ringstickstoffatom, an das C1'-Kohlenstoffatom eines Pentosezuckers gebunden ist. Typische Pentosezucker be inhalten in nicht begrenzender Weise diejenigen Pentosen, bei denen ein oder mehrere der Kohlenstoffatome jeweils unabhängig voneinander mit einer oder mehreren der gleichen oder verschiedenen -R-, -OR-, -NRR- oder Halogengruppen substituiert sind, wobei jede Gruppe R unabhängig ein Wasserstoffatom, eine (C₁-C₆)-Alkyl- oder (C₅-C₁₄)-Arylgruppe ist. Der Pentosezucker kann gesättigt oder ungesättigt sein. Beispielhafte Pentosezucker beinhalten in nicht begrenzender Weise Ribose, 2'-Desoxyribose, 2'-(C₁-C₆)-Alkoxyribose, 2'-(C₅-C₁₄)-Aryloxyribose, 2',3'-Didesoxyribose, 2',3'-Didehydroribose, 2'-Desoxy-3'-halogenribose, 2'-Desoxy-3'-fluorribose, 2'-Desoxy-3'-chlorribose, 2'-Desoxy-3'-aminoribose, 2'-Desoxy-3'-(C₁-C₆)-alkylribose, 2'-Desoxy-3'-(C₁-C₆)-alkoxyribose, 2'-Desoxy-3'-(C₅-C₁₄)-aryloxyribose, 2',3'-Didesoxy-3'-halogenribose und 2',3'-Didesoxy-3'-fluorribose.
Wenn die Nukleobase ein Purin oder ein 7-Deazapurin ist, ist der Pentosezucker an die N9- oder C8-Position der Nukleobase gebunden. Wenn die Nukleobase ein Pyrimidin ist, ist der Pentosezucker an die N1-Position der Nukleobase gebunden (vergleiche z.B. Kornberg und Baker, 1992, DNA Replication, 2. Ausgabe, Freeman, San Francisco), ausgenommen Pseudouridine, bei denen der Pentosezucker an die C5-Position der Uracilnukleobase gebunden ist. Bevorzugte Nukleoside sind diejenigen, bei denen die Nukleobase ein Purin, ein 7-Deazapurin, ein Pyrimidin, eine normale Nukleobase oder ein herkömmliches Analogon einer normalen Nukleobase ist und der Pentosezucker ein jeglicher der vorstehend aufgeführten beispielhaften Pentosezucker ist.
"Normales Nukleosid" betrifft eine Verbindung, die aus einer normalen Nukleobase besteht, die über die N1-Position (C, T oder U) oder N9-Position (A oder G) der Nukleobase an das C1'-Kohlenstoffatom einer Ribose oder 2'-Desoxyribose kovalent gebunden ist.
"Nukleosid-Analogon" betrifft ein Nukleosid, in dem der Pentosezucker mit einem Pentosezucker-Analogon ersetzt ist. Beispielhafte Pentosezucker-Analoga beinhalten in nicht begrenzender Weise substituierte oder nicht substituierte Furanosen mit mehr oder weniger als 5 Ringatomen, z.B. Erythrosen und Hexosen, und substituierte oder nicht substituierte acyclische Zucker mit 3 bis 6 Kohlenstoffatomen. Ein oder mehrere der Kohlenstoffatome können unabhängig voneinander mit einer oder mehreren der gleichen oder verschiedenen -R-, -OR-, -NRR- oder Halogengruppen substituiert sein, wobei jede Gruppe R unabhängig ein Wasserstoffatom, eine (C₁-C₆)-Alkyl- oder (C₅-C₁₄)-Arylgruppe ist.
"Nukleotid" betrifft ein Nukleosid, bei dem eines oder mehrere, typischerweise eines der Pentosekohlenstoffatome mit einem Phosphatester der Formel:
substituiert ist, worin a eine ganze Zahl von 0 bis 4 ist. Vorzugsweise weist a den Wert 2 auf und der Phosphatester ist an das 3'- oder 5'-Kohlenstoffatom der Pentose gebunden. Besonders bevorzugte Nukleotide sind diejenigen, bei denen die Nukleobase ein Purin, ein 7-Deazapurin, ein Pyrimidin, eine normale Nukleobase oder ein herkömmliches Analogon davon ist.
"Normales Nukleotid" betrifft ein normales Nukleosid, bei dem das 3'- oder 5'-Kohlenstoffatom der Ribose oder 2'-Desoxyribose mit einem Phosphatester der Formel:
substituiert ist, worin a eine ganze Zahl von 0 bis 2 ist. Bevorzugte normale Nukleotide sind diejenigen, bei denen a den Wert 2 aufweist und der Phosphatester an das 5'-Kohlenstoffatom der Ribose (NTP) oder 2'-Desoxyribose (dNTP) gebunden ist.
"Nukleotid-Analogon" betrifft ein Nukleotid, bei dem der Pentosezucker und/oder einer oder mehrere der Phosphatester mit seinem entsprechenden Analogon ersetzt ist. Beispielhafte Pentosezucker-Analoga sind diejenigen, die vorstehend im Zusammenhang mit Nukleosid-Analoga beschrieben wurden. Beispielhafte Phosphatester-Analoga beinhalten in nicht begrenzender Weise Alkylphosphonate, Methylphosphonate, Phosphoramidate, Phosphotriester, Phosphorothioate, Phosphorodithioate, Phosphoroselenoate, Phosphorodiselenoate, Phosphoroanilothioate, Phosphoroanilidate, Phosphoroamidate, Boronophosphate, etc., einschließlich jeglicher zugehöriger Gegenionen, falls vorhanden.
Auch eingeschlossen in die Definition von "Nukleotid-Analogon" sind Nukleobasen-Monomere, die in Polynukleotid-Analoga polymerisiert werden können, bei denen das DNA/RNA-Phosphatester- und/oder Zuckerphosphatester-Rückgrat mit einem unterschiedlichen Bindungstyp ersetzt ist.
"Nukleosid/tid" betrifft ein Nukleosid und/oder ein Nukleotid und/oder ein Gemisch davon.
"Polynukleotid" betrifft eine lineare polymerische Kette von Nukleosid-Monomer-Einheiten, die kovalent miteinander durch Phosphatesterinternukleosid-Bindungen verbunden sind. Wenn nicht anders angegeben, beinhaltet "Polynukleotid", wie hierin verwendet, Polymere einer jeglichen Länge, einschließlich Oligonukleotiden, Polynukleotiden und Polynukleotiden, wie diese Begriffe herkömmlicherweise verwendet werden. In dem Fall, dass Polynukleotide mit spezifischen Größenbereichen vorgesehen sind, ist die Anzahl von Monomer-Einheiten spezifisch beschrieben. Folglich können Polynukleotide erfindungsgemäß eine Größe von wenigen Monomer-Einheiten (z.B. 4 bis 40) bis einigen Hundert Monomer-Einheiten bis mehreren Tausend Monomer-Einheiten oder noch mehr Monomer-Einheiten aufweisen. Wann immer ein Polynukleotid durch eine Sequenz von Buchstaben, z.B. "ATGCCTG", dargestellt ist, wird verstanden werden, dass die Sequenz in der 5'→3'-Richtung angegeben ist. 2'-Desoxyribopolynukleotiden wird der Buchstabe "d" vorangestellt, z.B. "d(ATGCCTG)".
Polynukleotide können aus einer einzigen Art an Zuckergruppe, wie in dem Fall von RNA und DNA, oder Gemischen von verschiedenen Zuckergruppen, wie in dem Fall von RNA/DNA-Chimären, bestehen.
4. GENAUE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die Erfindung betrifft einen verbesserten Invasionstest, der mehrere Vorteile im Vergleich zu früheren Tests bereitstellt. Diese Vorteile beinhalten in nicht begrenzender Weise weniger Sonde, die zum Bereitstellen eines verlässlichen Ergebnisses erforderlich ist, weniger Zeit, die zum Bereitstellen eines verlässlichen Ergebnisses benötigt wird, die Fähigkeit Testergebnisse in Echtzeit zu bestimmen oder abzuschätzen (d.h. während Daten gesammelt werden), und die Fähigkeit, verlässliche Ergebnisse ohne Durchführung von Kontrolltests zu erhalten. Erfindungsgemäß umfasst ist ferner ein neues Verfahren zum Analysieren von Daten, die von frühe ren Invasionstests bereitgestellt werden. Bei jedem der erfindungsgemäßen Verfahren erfolgt eine Datensammlung und/oder -analyse vorzugsweise durch einen Computer.
Die Erfindung basiert auf der Feststellung eines zeitabhängigen Verhaltens von bestimmten Invasionstests, die hierin als "Kaskadentests" oder "Kaskadeninvasionstests" bezeichnet werden. In erfindungsgemäßen Kaskadentests, wie denjenigen, die in 2 dargestellt sind, kann ein Invader-Oligonukleotid an das interessierende Ziel- oder Matrizen-Polynukleotid (z.B. DNA oder RNA) hybridisieren. Invader-Oligonukleotide können ein jegliches Oligonukleotid sein, wobei mindestens ein Teil davon an den Teil der Matrize, der interessiert, hybridisieren kann. Erfindungsgemäße Sonden können mit einem Bereich der Matrize hybridisieren, der zu dem Bereich, an den das Invader-Oligonukleotid hybridisieren oder in sonstiger Weise assoziieren kann, benachbart ist und mit diesem überlappt. Invader-Oligonukleotide können Bereiche enthalten, die nicht mit der Matrize hybridisieren und dennoch die Spaltung von Sonden-Oligonukleotiden beeinflussen. Vergleiche z.B. 5 von Harrington, J. J. und Lieber, M. R., J. Biol. Chem. 270(9): 4503–4508, 4506 (1995) und den begleitenden Text.
Beispiele für Invader-Oligonukleotide, die erfindungsgemäß geeignet sind, beinhalten in nicht begrenzender Weise diejenigen, die als das "zweite Oligonukleotid", "zweite Oligo" oder "Invader" in der US-PS 5,994,069 identifiziert sind. Vergleiche z.B. die US-PS 5,994,069 in Spalte 37, Zeilen 41–48. Vergleiche auch die US-PSen 5,843,669, 5,846,717, 5,874,283, 5,888,780, 5,985,557 und 6,001,567 und die internationalen Patentanmeldungen WO 97/27214, WO 98/23774 und WO 98/42873. Beispiele für Sonden beinhalten in nicht begrenzender Weise diejenigen, die als das "erste Oligonukleotid", "erste Oligo" oder die "Sonde" in der US-PS 5,994,069 identifiziert sind. Vergleiche z.B. die US-PS 5,994,069 in Spalte 37, Zeilen 37–41. Vergleiche auch die US-PSen 5,843,669, 5,846,717, 5,874,283, 5,888,780, 5,985,557 und 6,001,567 und die internationalen Patentanmeldungen WO 97/27214, WO 98/23774 und WO 98/42873.
Die Wechselwirkung zwischen dem Invader-Oligonukleotid, Sonden-Oligonukleotid und Matrizen- oder Zielpolynukleotid in den erfindungsgemäßen Tests ist z.B. in der US-PS 5,994,069 , der internationalen Patentanmeldung WO 98/42873 und in Harrington, J. J. und Lieber, M. R., J. Biol. Chem. 270(9): 4503–4508 (1995) beschrieben. Vergleiche auch die US-PS 5,994,069 in Spalte 37, Zeile 30 bis Spalte 41, Zeile 41 und 5 von Harrington, J. J. und Lieber, M. R., J. Biol. Chem. 270(9): 4503–4508, 4506 (1995), und den begleitenden Text.
In einem typischen erfindungsgemäßen Test, wird, wenn sich sowohl das Invader-Oligonukleotid als auch das Sonden-Oligonukleotid an das Zielsubstrat anlagern und um mindestens ein Nukleotid überlappen, eine Spaltstruktur gebildet, die einen Klappbereich der Sonde umfasst. Dieser Klappbereich kann z.B. durch eine Endonuklease abgespalten werden. Beispiele für Endonukleasen beinhalten in nicht begrenzender Weise diejenigen, die in den US-PSen 5,843,669, 5,846,717, 5,874,283, 5,888,780, 5,985,557, 5,994,069 und 6,001,567 beschrieben sind. Besonders bevorzugte Endonukleasen sind z.B. von der internationalen Patentanmeldung WO 98/23774 beschrieben. Wenn abgespalten, kann sich der Klappbereich sodann an eine weitere Struktur anlagern, was deren Spaltung und die Erzeugung eines noch weiteren Moleküls bewirkt. Falls gewünscht, kann dieses Verfahren eine Kette von Reaktionen fortsetzen, die letztendlich ein Signal, das durch den Beobachter nachgewiesen wird, bereitstellen werden. Typischerweise induziert jedoch der abgespaltene Probenklappbereich, der in der primären Reaktion gebildet wird, die Spaltung von dem, was hierin als ein Reportervorläufer bezeichnet wird. Typischerweise umfasst der Reportervorläufer Reporter- und Quenchergruppen, wie in 2 gezeigt. Beispiele für Reportervorläufer sind die Haarnadelstrukturen, die z.B. von der US-PS 5,994,069 beschrieben werden. Vergleiche z.B. die US-PS 5,994,069 in Spalte 72, Zeilen 11–67. Vergleiche auch die US-PSen 5,843,669, 5,846,717, 5,874,283, 5,888,780, 5,985,557 und 6,001,567 und die internationalen Patentanmeldungen WO 97/27214, WO 98/23774 und WO 98/42873. Eine Spaltung des Reportervorläufers stellt einen Reporter bereit, der durch herkömmliche Mittel, wie in nicht begrenzender Weise Fluoreszenz, nachgewiesen werden kann.
Es wurde nun festgestellt, dass das durch eine Kaskade (d.h. mindestens zwei) von Spaltungsreaktionen erzeugte Signal typischerweise ein unterschiedliches Verhalten über die Zeit zeigt, als ein Signal, das durch unterschiedliche Reaktionen oder Reihen von Reaktionen erzeugt wird. Reaktionen, die ein Signal bereitstellen, aber für das interessierende Spaltungsverfahren nicht Indikativ sind (z.B. die primäre Reaktion, die in 2 gezeigt ist), werden hierin als Hintergrundreaktionen bezeichnet. In typischen erfindungsgemäßen Kaskadeninvasionstests ist das Hintergrundsignal in seiner Art linear und kann an eine Gleichung der Formel: S(t) = p1 + p2t (1)angepasst werden, worin t die Zeit ist, p₁ das Signal beim Zeitpunkt t = 0 ist und p₂ die Geschwindigkeit der Signalzunahme ist. Im Gegensatz dazu zeigt das Signal, das als ein Ergebnis der primären Reaktion erzeugt wird, ein quadratisches Verhalten und wird am besten an eine Gleichung der Formel: S(t) = P1 + P2t + p3t2 (2)angepasst, worin p₃ größer als Null ist. Dieser Unterschied hinsichtlich des Verhaltens ist z.B. in der 3 gezeigt.
Ohne theoretisch gebunden zu sein, wird angenommen, dass das unterschiedliche zeitabhängige Verhalten der Hintergrund- und Zielsignale auf die Spaltung von vielen Sonden zurückzuführen ist, die nahe oder an ihrem Schmelzpunkt mit einem einzigen Ziel oder einer einzigen Matrize, an das/die ein einziges primäres Invader-Oligonukleotid auch assoziiert ist, assoziieren können. Die Spaltung einer jeglichen dieser Sonden induziert die Spaltung eines Reporter-Quencher-Komplexes. Folglich kann die Überlappung eines einzigen primären Invader-Oligonukleotids mit vielen Sonden auf einer Matrize eine große Anzahl von Reporterfragmenten über die Zeit erzeugen. Im Gegensatz dazu wird angenommen, dass die Assoziierung eines einzigen primären Invader-Oligonukleotids mit einem Reporter-Quencher-Komplex lediglich ein Reporterfragment erzeugt.
Was auch immer die tatsächliche Ursache des Unterschieds hinsichtlich ihrer zeitabhängigen Signale ist, ist es nun möglich, zwischen positiven Testsignalen und Hintergrundrauschen durch einfaches Beobachten des Signals, das durch einen Invasionstest bereitgestellt wird, als eine Funktion der Zeit zu differenzieren. Für viele Kaskadentests kann dies einfach dadurch erreicht werden, dass die Daten an Gleichung 2 angepasst werden und bestimmt wird, ob p₃ größer als Null ist. Praktischerweise weist dieser Ansatz jedoch einige Begrenzungen auf.
Theoretischerweise wird erwartet, dass eine lineare Wachstumskurve einen Wert von Null für den t²-Koeffizienten (p₃) erzeugt, wenn sie unter Verwendung der Gleichung 2 modelliert wird. Praktisch macht jedoch ein experimentelles Rauschen es wahrscheinlich, einen Nichtnullwert zu ergeben. Es ist daher bevorzugt, dass die Testbedingungen (z.B. die verwendeten Reagenzien, die Konzentration der Reaktanten, die spezifischen verwendeten Invader-Oligonukleotide und Sonden-Oligonukleotide und die Temperatur) angepasst werden, um Hintergrundrauschen zu minimieren. Jedoch besteht ein weiteres Problem beim Untersuchen der Signifikanz des t²-Koeffizienten darin, dass der Wert von p₃ hochgradig durch Faktoren beeinflusst wird, wie in nicht begrenzender Weise Reaktionskinetiken, Erfassungszeit und die Konzentrationen von Reaktanten. Folglich kann der Koeffizient p₃ einen jeglichen Wert in einem großen Bereich von Werten annehmen. Eine bevorzugte erfindungsgemäße Ausführungsform begrenzt folglich den Bereich von Werten, die von p₃ angenommen werden können. Durch diese Vorgehensweise kann die Signifikanz von p₃ sowohl empirisch als auch theoretisch in einer realistischen und vorhersehbaren Weise untersucht werden.
Obwohl verschiedene Wege, bei denen dies erreicht werden kann, dem Fachmann ersichtlich sein werden, ist ein spezifischer Weg, bei dem dies erreicht werden kann, derjenige durch Transformation. In diesem spezifischen Verfahren werden die unabhängige Variable t und die abhängige Variable S(t) von Gleichung (2) in t* bzw. S*(t*) derart transformiert, dass deren Minima jeweils gleich Null sind und deren Maxima jeweils gleich 1 sind. Diese Transformation erreicht zwei wichtige Ziele. Zunächst besteht der Transformationsraum (t*, S*(t*)) aus drei unterschiedlichen Bereichen. Die linearen Wachstumsfunktionen fallen in den ersten Bereich, die quadratischen Wachstumsfunktionen, bei denen p₃ positiv ist, fallen in den zweiten Bereich und die quadratischen Wachstumsfunktionen, in denen p₃ negativ ist, fallen in den dritten Bereich. Zweitens ist der Wert für p₃, der mit Wachstumskurven, die von einer invasiven Spaltung herrühren, verbunden ist, begrenzt.
Unter optimalen Bedingungen beträgt der Wert für p₃ weniger als oder ist gleich 1 (d.h. p₃ ≤ 1). Der Grenzwert für p₃ kann folglich unabhängig von den Bedingungen, unter denen der invasive Test erfolgt, festgesetzt werden. 4 zeigt ein idealisiertes lineares Signalwachstum aufgrund von Hintergrund (negativ) und ein idealisiertes quadratisches Signalwachstum aufgrund einer primären invasiven Spaltung (positiv). 5 zeigt die Wirkung einer Domänentransformation auf eine Familie von Reaktionsfunktionen, die mit zugesetztem zufälligen Rauschen simuliert wurden. Um spezifisch zu sein, zeigt das obere Feld von 5 drei unterschiedliche Reaktionsfunktionen (rot), drei unterschiedliche quadratische Reaktionen mit positiver Krümmung (grün) und drei unterschiedliche quadratische Reaktionen mit negativer Krümmung (gelb). Wie in dem oberen Feld gezeigt, kann die Reaktionsfunk tion in einem jeglichen Bereich des Reaktionsraums liegen, abhängig von Faktoren wie, in nicht begrenzender Weise, der Konzentration des Ziels oder der Matrize, des Moleküls und der Natur des Hintergrundsignals/der Hintergrundsignale. Im Gegensatz dazu bildet die Transformationsdomäne die drei Familien von Kurven auf bestimmte Bereiche in einer neuen Domäne ab. Dies ist in dem unteren Feld von 5 gezeigt, worin die drei linearen Reaktionsfunktionen auf denselben Bereich abgebildet werden und als eine Linie erscheinen und die quadratischen Reaktionsfunktionen auf einer der Seiten dieser Linie erscheinen, abhängig davon, ob deren Krümmung positiv oder negativ ist. Die erfindungsgemäße Domänentransformation erreicht folglich ein natürliches Clustern der Reaktionskurven, was eine einfache Klassifizierung der Daten, die aus dem Invasionstest erhalten werden, ermöglicht. Vergleiche das nachstehende Beispiel 2.
Spezifische erfindungsgemäße Ausführungsformen berücksichtigen die Wirkungen, die Hintergrund (z.B. experimentelles) -Rauschen auf die Verlässlichkeit einer Analyse von Testdaten haben kann. Zum Beispiel wird erwartet, dass der negative Bereich, der durch die rote Linie in 5 angezeigt wird, eine begrenzte Breite aufweist. Die Größe des erlaubten negativen Bereichs wird folglich aufgrund von experimentellen und instrumentellen Bedingungen als auch der gewünschten Rate an Falsch-Positiven bestimmt. Zum Beispiel kann, nachdem die Reaktionsfunktion transformiert ist, das analytische Signal unter Verwendung von linearen und quadratischen Modellen und unter Verwendung der Kriterien der kleinsten Quadrate oder jeglicher anderer Kriterien, die dem Fachmann bekannt sind, modelliert werden. Unter Bezug auf die Gleichung 2 wird die t²-Größe sodann hinsichtlich der Breite des negativen Bereichs untersucht. Die Signifikanz des quadratischen Wachstums kann sodann unter Verwendung des Wachstumsmodells, das auf Hintergrundsrauschkinetiken (z.B. linearem Wachstum) zurückzuführen ist, als ein Bezugswert oder absoluter Standard bestimmt werden. In bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsformen ist die Abweichung von der Linearität ein Maß für die Signifikanz. Dies kann z.B. durch die Reste eines angenommenen linearen Modells bestimmt werden.
Ein spezifisches erfindungsgemäßes Verfahren kann folglich durch die nachstehenden Schritte beschrieben werden: (i) Transformieren der Wachstumskurvendaten auf eine neue Domäne, (ii) Anpassen von linearen oder quadratischen Modellen an den transformierten Wachstumskurvendatensatz, (iii) Vergleich der t²-Größe (p₃ in Gleichung (2)) zu den Grenzwerten, die festgelegt sind, um den negativen Bereich zu definieren, und (iv) falls festgestellt wird, dass die Wachstumskurve in dem positiven Bereich liegt, Bestimmung der Reste, die aus der linearen Modellanpassung erhalten werden, hinsichtlich ihrer Signifikanz. Diese spezifische erfindungsgemäße Ausführungsform ist genauer in dem nachstehenden Beispiel 2 beschrieben.
Die erfindungsgemäß bereitgestellten Verbesserungen können mit einer jeglichen Variante des Invasionstests verwendet werden, wobei die Spaltung einer Struktur die Spaltung mindestens einer zusätzlichen Struktur induziert. Beispiele für solche Tests beinhalten in nicht begrenzender Weise diejenigen, die durch die US-PSen 5,843,669, 5,874,283, 5,888,780, 5,985,557, 5,994,069 und 6,001,567 beschrieben sind. Im Allgemeinen kann die Erfindung jedoch auf einen jeglichen Test gemäß der Ansprüche 1 und 11 angewendet werden, worin das gewünschte Signal ein unterschiedliches Verhalten als eine Funktion der Zeit als das des Hintergrundsignals/der Hintergrundsignale zeigt. Anstatt ein quadratisches Verhalten zu zeigen, kann ein solches Signal z.B. ein Verhalten zeigen, das am besten durch ein Polynom höherer Ordnung dargestellt wird, wie durch die Formel 3 dargestellt: S(t) = Σpjtk (j = 1, 2, ...; k = 0, 1, 2, ...) (3)
Andere mathematische Beziehungen (z.B. exponentiell) können auch am besten das interessierende Signal, das durch einen Kaskadentest erzeugt wird, darstellen. Zur gleichen Zeit muss das zeitabhängige Hintergrundsignal eines Tests nicht linear sein: Alles, was nötig ist, ist ein auf Zeit basierendes Verhalten, das bestimmt werden und von dem des interessierenden Signals unterschieden werden kann.
Hinsichtlich der Breite der Erfindung sollen die nachstehenden Beispiele nicht dahingehend auszulegen sein, dass sie den Umfang der Erfindung begrenzen.
5. BEISPIELE
5.1. BEISPIEL 1: DATENSAMMLUNG UND EINFACHE ANALYSE
Erfindungsgemäß bereitgestellte Vorteile sind aus dem nachstehenden Experiment ersichtlich, das unter Verwendung von Materialien erfolgte, die von Applied Biosystems (Foster City, Kalifornien) und Third Wave Technologies (Madison, Wisconsin) erhältlich sind. Ein ABI PRISM 7700, erhältlich von Applied Biosystems, wurde für eine Datensammlung verwendet.
Unter Verwendung von 100 ng humaner genomischer DNA pro Test wurden die nachfolgenden Reagenzien in dem erfindungsgemäßen Test zum Nachweis eines C/T-Polymorphismus in dem menschlichen MFTHR-Gen verwendet: ein "C"-Sondenmix, der ein Klappbereich-plus-Sonden-Oligonukleotid, das für das MTHFR-C-Alle1 spezifisch ist und das MTHFR-spezifische Invader-Oligonukleotid enthält, ein "T"-Sondenmix, der ein Klappbereich-plus-Sonden-Oligonukleotid, das für das MTHFR-T-Alle1 spezifisch ist, und das MTHFR-spezifische Invader-Oligonukleotid enthält, eine Signalsonde, die ein Fluoreszenz-erzeugendes Oligonukleotid umfasst, das mit einem FAM-Reporter und einem CY3-Quencher markiert ist und das ein Substrat für die sekundäre Invasionsreaktion ist, einen Signalpuffer, der Mg²⁺ beinhaltet, und Cleavase-VIII^TM, die eine Struktur-abhängige Endonuklease ist, die die Spaltungsreaktion durchführt.
Humane genomische DNA von 90 unterschiedlichen Individuen wurde in dem Experiment analysiert. Die DNA von diesen Individuen wurde zuvor in 7700-Reaktionsplatten getrocknet, wobei jedes Well etwa 100 ng DNA enthielt. Jede Platte weist 6 Wells ohne Matrize auf. In einer Platte wurden 10 μl verdünnter "C"-Sondenmix zu jedem Well gegeben. In einer getrennten Platte wurden 10 μl verdünnter "T"-Sondenmix zu jedem Well gegeben. Diese Platten wurden bei 95°C 5 Minuten inkubiert, um die DNA zu denaturieren, und sodann auf Eis gestellt. Die Verwendung der Eisinkubation, die in früheren Invasionstests nicht verwendet wurde, ist dafür entwickelt, um den einzelsträngigen Charakter der denaturierten DNA besser zu konservieren.
Ein Reaktionscocktail wurde dadurch hergestellt, dass Signalsonde, Signalpuffer, Cleavase-VIII^® und ROX-Passiv-Referenz gemischt wurden. Fünf Mikroliter dieses Reaktionscocktails wurden zu jedem Well gegeben. Nach Verschließen der Wells wurde jede Platte bei 65°C 90 Minuten in dem ABI PRISM 7700 inkubiert, wobei Fluoreszenzdaten durchweg gesammelt wurden. Die Fluoreszenzdaten wurden unter Verwendung von Multikomponentenbildung analysiert, um die Beiträge von FAM, CY3 und ROX zu bestimmen. Für jedes Well wurde das FAM-Signal durch das ROX-Signal dividiert und gegenüber der Inkubationszeit aufgetragen.
3 zeigt die Ergebnisse für 5 Wells von der "T"-Reaktionsplatte. Dieses Diagramm zeigt die Ergebnisse von 4 negativen Proben und einer positiven Probe (der gekrümmten Linie). Die negativen Proben zeigen eine lineare Zunahme hinsichtlich des normalisierten FAM-Signals. Dies zeigt an, dass es eine Hintergrundspaltung der Signalsonde ohne die geeignete Matrize gibt. Die gleiche lineare Signalzunahme wird in den Kontrollreaktionen ohne Matrize beobachtet. Für die positive Probe ist die Geschwindigkeit der FAM-Signalzunahme relativ zu der linearen Zunahme, die in den negativen Proben beobachtet wird, beschleunigt. Tatsächlich passt die Zunahme des FAM-Signals, das in positiven Reaktionen beobachtet wird, sehr gut zu einer quadratischen Gleichung. Folglich können positive und negative Reaktionen durch die Größe zweiter Ordnung in der quadratischen Anpassung unterschieden werden. Eine signifikante Größe der zweiten Ordnung zeigt eine positive Reaktion an, wohingegen eine Größe zweiter Ordnung nahe an Null eine negative Reaktion anzeigt. Dies wird durch 6 verdeutlicht, die die Koeffizienten zweiter Ordnung aller Reaktionen zeigt, klassifiziert von den niedrigsten zu den höchsten. In jedem Diagramm zeigt die vertikale Linie, die von dem unteren Teil zu dem oberen Teil der Grafik verläuft, die Auftrennung von positiven und negativen Proben. Der Studenten-t-Test zeigt einen Konfidenzwert von 99,5% für die Auftrennung in jedem Fall an. Basierend auf diesen Auftrennungslinien kann der Genotyp jedes Individuums folglich aus den Koeffizienten der zweiten Ordnung bestimmt werden, wie in Tabelle 1 gezeigt.
TABELLE 1
In Tabelle 1 gibt die Spalte, die mit "TaqMan-Signale" markiert ist, die Genotypen an, die vorher für diese Individuen unter Verwendung eines TaqMan^TM-Tests bestimmt wurden. Wie in dieser Tabelle verwendet, bedeutet "1" C-Homozygot, "2" bedeutet T-Homozygot und "1 und 2" bedeutet C/T-Heterozygot. Der rote Kreis zeigt die einzige Abweichung zwischen den INVADER^TM- und TaqMan^TM-Daten.
5.2. BEISPIEL 2: ALTERNATIVE DATENANALYSE
Ein Vergleich der Koeffizienten, die aus einer Anpassung der in Beispiel 1 erhaltenen Daten bestimmt werden, kann verwendet werden, um die Testergebnisse zu bewerten. Dieses einfache Verfahren kann jedoch fehlerhafte Ergebnisse ergeben, da sogar kleine quadratische Koeffizienten ein positives Signal anzeigen können, wohingegen relativ große einfach Artefakte des Anpassungsverfahren sein können. Folglich ist es bevorzugt, dass sich eine Analyse der Daten, ungeachtet ob an dem Abschluss des Experiments oder in Echtzeit durchgeführt, stattdessen auf die Form der Funktion, an die die Daten angepasst werden, konzentriert, eher als die Koeffizienten, die durch ein einfaches Anpassen der Daten an eine quadratische Gleichung berechnet werden.
Unter Verwendung des hierin beschriebenen Transformationsverfahrens wurden transformierte Reaktionsfunktionen aus den in Beispiel 1 erhaltenen Daten erzeugt. 7 zeigt diese transformierten Reaktionsfunktionen. Die statistische Signifikanz dieser Ergebnisse wurde sodann bestimmt.
Das obere Feld von 8 zeigt die transformierten Signale von Wells 5 (negativ) und 19 (positiv) der in Beispiel 1 beschriebenen Daten. Die mittleren und unteren Felder zeigen die Reste, die aus einem Anpassen eines linearen Wachstumsmodells an die negativen bzw. positiven Profile erhalten werden. In dem Fall von Well 5, bei dem das Signalwachstum linear ist, zeigen die Reste das erwartete Verhalten. Sie sind um Null verteilt und überschreiten die "Nulllinie" sehr häufig. Im Gegensatz dazu clustern die Reste von Well 19 (wo das Signalwachstum quadratisch ist, vergleiche das obere Feld von 8) auf der positiven Seite von Null und der negativen Seite von Null und überschreiten die Nulllinie nicht so häufig. Je größer die Abweichung von der Linearität, desto geringer die Anzahl der Überschneidungen. Folglich ist die Anzahl von Null-Überschneidungen in einer Population von Resten, die nach Anpassen eines linearen Modells an ein Zeit-variierendes Profil erhalten werden, in diesem Fall das transformierte Signal gegenüber der transformierten Zeit, ein Indikator dafür, wie signifikant das Profil von einer geraden Linie abweicht. Vergleiche z.B. S. Siegel, "Nonparametric Statistics", McGraw-Hill, New York, 1956, Seite 52, und N. Draper und H. Smith, "Applied Regression Analysis", dritte Ausgabe, John Wiley & Sons, Inc., New York, 1998, Seite 192.
Die Anzahl von Überschneidungen wurde hinsichtlich der Anzahl von Läufen bei den Resten untersucht. Ein Lauf kann als eine Abfolge von Resten mit dem gleichen Zeichen definiert werden, denen Reste eines unterschiedlichen Zeichens oder keine Zeichen vorangehen und nachfolgen. Vergleiche S. Siegel, "Nonparametric Statistics", McGraw-Hill, New York, 1956, Seite 52. Zum Beispiel soll der nachstehende Satz von 10 Resten, der aus {+0,5, +0,1, –0,2, –0,4, –0,5, –0,6, –0,3, –0,2, –0,1 und +0,2} besteht, drei Läufe enthalten. Die Anzahl von Läufen in einer jeglichen bestimmten Population von Resten ist ein Anzeichen dafür, ob die Reste zufällig verteilt sind oder nicht. Für eine große (z.B. mehr als etwa 20) Probe von Resten, bei denen es n positive Reste, m negative Reste und r Läufe gibt, wird die Signifikanz aus der erwarteten Verteilung von r abgeschätzt, dessen Mittelwert μ_r und Standardabweichung σ_r gegeben sind durch: μr = 1 + (2 nm)/(n + m) (4) σr = (A/B)½ (5)worin A = 2 nm (2 nm – n – m) und B = (n + m)²(n + m – 1) erfüllt ist. Ein normalisierter r-Wert, r*, wird gemäß: r* = (r – μr)/σr (6)berechnet.
Die Gleichung (6) drückt die Anzahl von Läufen, r, hinsichtlich ihrer Abweichung von dem erwarteten Wert aus, wobei die Probengröße, n und m, in Einheiten von Standardabweichungen angegeben ist. Die Signifikanz einer solchen Abweichung wird folglich unter der Nullhypothese untersucht, dass n und m in einer zufälligen Ordnung auftreten. Die Nullhypothese wird zurückgewiesen, wenn r* nicht durch eine zufällige Anordnung bei einem bestimmten Maß an Signifikanz begründet werden kann. In solchen Fällen gelten die Reste als systematisch und das lineare Mo dell als hinfällig, d.h. die Wachstumskurve ist nicht linear bei dem gewünschten Grad an Signifikanz.
Die mittleren und unteren Felder von 8 zeigen die r*-Werte, die durch Gleichung (6) für die Wells 5 und 19 bestimmt wurden. In dem Fall von Well 5 liegt die normalisierte Anzahl von Läufen in der Hälfte einer Standardabweichungseinheit von dem erwarteten Mittelwert. Das lineare Modell wird daher angenommen. In dem Fall von Well 19 liegt die normalisierte Anzahl von Läufen mehr als 23 Standardabweichungseinheiten von dem erwarteten Mittelwert und das lineare Modell wird zurückgewiesen. Obwohl viele statistische Modelle verwendet werden können, stellt das Tchebycheff-Modell einen robusten und konservativen Ansatz bereit. Vergleiche z.B. R. Kirk "Introductory Statistics", Wadsworth Publishing Company, Inc., Belmont, CA, 1978, Seite 83. Tchebycheffs Theorem kann, wie in der Gleichung (7) gezeigt, zusammengefasst werden: P{|x – μ| ≥ kσ} < 1/k2 (7)
Gemäß Gleichung (7) beträgt die Wahrscheinlichkeit, dass eine zufällige Variable größer als k Einheiten an Standardabweichung von ihrem Mittelwert weg liegt, weniger als 1/k². Folglich ist, je größer der absolute Wert von r* in Gleichung (6) ist, desto höher die Wahrscheinlichkeit, dass die Reste nicht zufällig um Null verteilt sind und das lineare Modell bei dem Signifikanzmaß (1 – (1/k²)) (auch als das "Konfidenzmaß" bezeichnet) zurückgewiesen wird.
Der vorstehend zusammengefasste statistische Signifikanztest stellt eine wichtige Rückkopplung zu den Anwendern hinsichtlich des ausgewählten Grenzwerts für p₃ und der Breite des "negativen Bereichs" bereit. Wie vorstehend beschrieben, werden Wachstumskurven mit p₃-Werten, die einen Grenzwert überschreiten, auf ihre Signifikanz getestet. Wenn der Grenzwert zu niedrig festgesetzt wird, wird erwartet, dass die Ergebnisse, die als positiv klassifiziert werden, da die t²-Größe den Grenzwert übersteigt, eine große Anzahl von Läufen und folglich ein niedriges Signifikanzmaß (k in Gleichung (7)) aufweisen. Anwender können folglich das Signifikanzmaß als eine Messlatte beim Festsetzen der Begrenzungen des "negativen Bereichs" verwenden.
Die Verteilung von Läufen in den Resten ermöglicht den Anwendern, robuste und empfindliche statistische Vertrauensabschätzungen zu erhalten. Da das lineare Modell einen "absoluten" Standard bereitstellt, kann eine unvoreingenommene Abschätzung eines Nachweises und einer Klassifizierung von Konfidenz/Signifikanz aus einer einzigen Probe abgeleitet werden.

Claims

Verfahren zum Nachweis eines Ziel-Polynukleotids, das die Schritte umfasst: (a) In-Kontakt-Bringen eines Ziel-Polynukleotids, das einen ersten Teil und einen zweiten Teil, die unmittelbar benachbart zueinander liegen, aufweist, mit: (i) einem Invader-Oligonukleotid, wobei mindestens ein Teil davon fähig ist, spezifisch an den ersten Teil des Ziel-Polynukleotids zu hybridisieren, (ii) einem Sonden-Oligonukleotid, das einen ersten Bereich, der fähig ist, spezifisch an den zweiten Teil des Ziel-Polynukleotids zu hybridisieren, und einen Klappbereich, der benachbart zu dem ersten Bereich liegt, umfasst, und (iii) einem Reagenz, das fähig ist, den Klappbereich des Sonden-Oligonukleotids abzuspalten, wenn das Sonden-Oligonukleotid an den zweiten Teil des Ziel-Polynukleotids hybridisiert ist und das Invader-Oligonukleotid an den ersten Teil des Polynukleotids hybridisiert ist, unter Bedingungen derart, dass der abgespaltene Klappbereich des Sonden-Oligonukleotids und das Reagenz mit einem Reporter-Vorläufer in Kontakt kommen können, wobei der Klappbereich des Sonden-Oligonukleotids fähig ist, an den Reporter-Vorläufer zu hybridisieren, um einen Komplex zu bilden, der durch das Reagenz gespalten werden kann, um einen Reporter bereitzustellen, der fähig ist, nachgewiesen zu werden, (b) Gewinnen eines Datensatzes (t, S(t)), wobei t die Zeit ist und S(t) ein Signal als eine Funktion der Zeit ist, durch Nachweisen des Reporters an einer Vielzahl von Zeitpunkten und (c) Transformieren von (t, S(t)), um einen transformierten Datensatz (t*, S*(t*)) bereitzustellen, wobei t* und S*(t*) Minimalwerte von 0 und Maximalwerte von 1 aufweisen, und Bestimmen, ob der transformierte Datensatz ein nicht lineares Verhalten zeigt, wobei das Ziel-Polynukleotid nachgewiesen ist, falls der transformierte Datensatz ein nicht lineares Verhalten zeigt.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Invader-Oligonukleotid einen ersten Bereich, der fähig ist, spezifisch an den ersten Teil des Ziel-Polynukleotids zu hybridisieren, und einen Klappbereich, der benachbart zu dem ersten Bereich liegt, umfasst.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei der Klappbereich des Invader-Oligonukleotids fähig ist, spezifisch an das Ziel-Polynukleotid zu hybridisieren.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei der Klappbereich des Invader-Oligonukleotids nicht fähig ist, spezifisch an das Ziel-Polynukleotid zu hybridisieren.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei der Klappbereich des Invader-Oligonukleotids einen ersten Abschnitt, der nicht fähig ist, spezifisch an das Ziel-Polynukleotid zu hybridisieren, und einen zweiten Abschnitt, der fähig ist, spezifisch an das Ziel-Polynukleotid zu hybridisieren, umfasst.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei der zweite Teil des Ziel-Polynukleotids unmittelbar 3' zu dem ersten Teil des Ziel-Polynukleotids liegt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 5, wobei der Klappbereich des Invader-Oligonukleotids unmittelbar 3 zu dem ersten Bereich des Invader-Oligonukleotids liegt und der Klappbereich der Sonde unmittelbar 5' zu dem ersten Bereich der Sonde liegt.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Signal Fluoreszenz oder Phosphoreszenz ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Bestimmung, ob der transformierte Datensatz ein nicht lineares Verhalten zeigt, in Echtzeit erfolgt.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das nicht lineare Verhalten quadratisch ist.
Verfahren zum Nachweis eines Ziel-Polynukleotids, das die Schritte umfasst: (a) In-Kontakt-Bringen eines Ziel-Polynukleotids, das einen ersten Teil und einen zweiten Teil, die unmittelbar benachbart zueinander liegen, aufweist, mit: (i) einem Invader-Oligonukleotid, wobei mindestens ein Teil davon fähig ist, spezifisch an den ersten Teil des Ziel-Polynukleotids zu hybridisieren, (ii) einem Sonden-Oligonukleotid, das einen ersten Bereich, der fähig ist, spezifisch an den zweiten Teil des Ziel-Polynukleotids zu hybridisieren, und einen Klappbereich, der benachbart zu dem ersten Bereich liegt, umfasst, und (iii) einem Reagenz, das fähig ist, den Klappbereich des Sonden-Oligonukleotids abzuspalten, wenn das Sonden-Oligonukleotid an den zweiten Teil des Ziel-Polynukleotids hybridisiert ist und das Invader-Oligonukleotid an den ersten Teil des Polynukleotids hybridisiert ist, unter Bedingungen derart, dass der abgespaltene Klappbereich des Sonden-Oligonukleotids und das Reagenz mit einem Reporter-Vorläufer in Kontakt kommen können, wobei der Klappbereich des Sonden-Oligonukleotids fähig ist, an den Reporter-Vorläufer zu hybridisieren, um einen Komplex zu bilden, der durch das Reagenz gespalten werden kann, um einen Reporter bereitzustellen, der fähig ist, nachgewiesen zu werden, (b) Gewinnen eines Datensatzes (t, S(t)), wobei t die Zeit ist und S(t) ein Signal als eine Funktion der Zeit ist, durch Nachweisen des Reporters an einer Vielzahl von Zeitpunkten und (c) Anpassen von (t, S(t)) an eine quadratische Funktion, Transformieren der quadratischen Funktion, um eine transformierte Funktion mit unabhängigen und abhängigen Variablen, die Minimalwerte von 0 und Maximalwerte von 1 aufweisen, zu ergeben, und Bestimmen, ob die transformierte Funktion ein nicht lineares Verhalten zeigt, wobei das Ziel-Polynukleotid nachgewiesen ist, falls die transformierte Funktion ein nicht lineares Verhalten zeigt.
Verfahren nach Anspruch 11, wobei das nicht lineare Verhalten quadratisch ist.