CN117903937A - 一种用于细胞自动化灌流培养的微流控卡盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于细胞自动化灌流培养的微流控卡盒，属于生物工程及自动控制领域，包括：基板、卡盒主体及盖板；卡盒主体包括至少一个培养腔室，培养腔室内设置有细胞滤网；培养腔室包括与之相连的灌流入口和灌流出口，灌流入口位置高于灌流出口；卡盒主体还包括液体单向阀组件、内部设置的灌流管道和出口管道，灌流管道位置高于出口管道，液体单向阀组件限定培养基单向流动；基板上固定多个用于监测细胞灌流培养相关工艺参数的传感器。本发明公开的一种用于细胞自动化灌流培养的微流控卡盒旨在提供细胞自动化灌流培养功能，连续监测和调控细胞灌流培养环境。该微流控卡盒可提高细胞培养通量、缩短发酵时间并减小细胞培养体系体积。

Description

一种用于细胞自动化灌流培养的微流控卡盒

技术领域

本申请实施例涉及生物工程及自动控制领域，具体而言，涉及一种用于细胞自动化灌流培养的微流控卡盒。

背景技术

分子生物学和基因编辑技术对生物工程行业产生了巨大的影响，该技术的许多工业化应用得益于细菌、酵母、真菌和昆虫等细胞体系的大规模培养和合成能力。传统的细胞放大培养是从给定的细胞株开始，通常需要在大批微量滴定板中进行初步筛选，然后使用摇瓶进行二次筛选，选出性能最佳的候选细胞株，并在实验室规模的反应器条件下进行进一步工艺开发，最后再进行过程验证和中试规模试验。该过程中涉及的生物反应器在尺寸上有着量级上的差异，比如，微孔板(微升至数毫升)，摇瓶(100-1000mL)，实验室发酵罐(1-50L)，中试规模(300-1000L)和工厂规模(2-500立方米)。因此，在工业生产放大过程中需要根据产量规模优化所需的条件，并筛选所需要的特定细胞株，例如在摇瓶或者实验室发酵罐中提前筛选出能耐受后续高盐、高温、高酸/高碱、高产物累积的环境，该过程涉及大量的平行对照实验。

现有的微型生物反应器，主要包括微孔板和摇瓶，可以进行分批培养，可以手动或通过移液臂定期补料完成分批补料培养，其中微孔板培养生长周期长、生物合成产量低，采用摇床能缩短发酵时间，但不能实时检测培养过程中的参数。近期出现了与摇瓶尺寸相当的平行生物反应器(工作体积在250mL上下)，具有与实验室数升规模反应器等同的参数采集和控制功能，可以分批培养、分批补料培养，但由于培养体积较大难以实现高通量。为此，Sartorius公司近期推出了国际上较前沿、髙通量微型生物反应器ambr，其培养条件类似于大规模发酵系统，由12个或24个并行使用的一次性生物反应器系统，培养体积为10–15mL。可以由机械手臂进行自动液体处理，包括多种液体的取样和补料；同时该机械臂补料所需时间太长，24个孔一轮液体处理大约1个小时；所有反应器为整体控温，不能单独控制；且在运行的过程当中不能修改其控制参数。因此，细胞微型反应器的自动化灌流培养需求尚未得到充分满足。

除此以外，在本领域也出现了面向器官芯片、类器官等细胞团培养的新需求，这类生物工程细胞是具备三维立体结构的、可自我更新的细胞群，已经分化或将分化为多个器官特异性的细胞类型，可以提供一个高度生理相关的微型模拟器官。现有的器官芯片、类器官的三维培养方法多采用孔板进行培养，这种培养方式虽然能使得细胞在培养基中存活并生长，但由于孔板的培养方式是培养液不流通的静态培养，细胞代谢的产物不易排出，又缺少精确控制培养液加入的调节方式，使得培养的细胞成活率很低。

发明内容

本申请实施例在于提供一种用于细胞自动化灌流培养的微流控卡盒，旨在提供细胞灌流培养功能，完成多个生长周期的细胞株培养，并真实模拟细胞体内的连续供血环境，重建细胞株或细胞群在体内的生理环境，可以提高细胞培养通量、缩短发酵时间与减小培养体系体积。

本申请实施例提供一种用于细胞自动化灌流培养的微流控卡盒，包括：

基板、卡盒主体以及盖板；

所述卡盒主体设置在所述基板上，所述盖板设置在所述卡盒主体背离所述基板的一侧；

所述卡盒主体包括至少一个培养腔室，所述培养腔室在第一方向贯穿所述卡盒主体，所述培养腔室内设置有细胞滤网；

所述培养腔室包括灌流入口和灌流出口，所述灌流入口和所述灌流出口与所述培养腔室连通；

所述卡盒主体还包括侧向设置的灌流液入口和灌流液出口，内部设置的灌流管道和出口管道，所述灌流入口与所述灌流液入口之间通过所述灌流管道连接，所述灌流出口与所述灌流液出口之间通过所述出口管道连接；

其中，在所述第一方向上，所述灌流出口比所述灌流入口更靠近所述基板，所述出口管道相比所述灌流管道更靠近所述基板；所述第一方向为垂直于所述基板的方向。

可选地，所述灌流入口与所述灌流管道之间设置有灌流下弯管道，所述灌流下弯管道的一端与所述灌流入口连接，另一端与所述灌流管道连接；

所述灌流出口与所述出口管道之间设置有灌流上弯管道，所述灌流上弯管道的一端与所述灌流出口连接，另一端与所述出口管道连接。

可选地，所述培养腔室设置有多个，且多个所述培养腔室阵列分布在所述卡盒主体上；

所述灌流液入口设置有多个，且多个所述灌流液入口与多个所述培养腔室的灌流入口一一对应；所述灌流管道设置有多个，且多个所述灌流管道与多个所述培养腔室的灌流入口一一对应；

所述灌流液出口和所述出口管道设置有多个，多个所述灌流液出口与多个所述出口管道一一对应；位于同一列或同一行的多个所述培养腔室的所述灌流出口与多个所述出口管道中的一个所述出口管道连接。

可选地，所述细胞滤网设置为一端开口的杯状结构，所述杯状结构的侧壁或远离所述开口的底壁上设置有至少一个滤网；

所述滤网的孔洞的孔径小于所述细胞滤网内目标培养细胞的直径。

可选地，所述微流控卡盒还包括：液体单向阀组件，所述液体单向阀组件与所述灌流液入口连接；

所述液体单向阀件组件包括单向过滤膜，所述单向过滤膜朝向所述灌流液入口的一侧为第一侧，所述单向过滤膜背离所述灌流液入口的一侧为第二侧；

其中，在液体渗透所述单向过滤膜时，由所述第二侧朝向所述第一侧渗透的流阻小于由所述第一侧朝向所述第二侧渗透的流阻。

可选地，所述基板上设置有至少一个闭合的密封沟槽，所述培养腔室位于对应的所述密封沟槽内，且所述密封沟槽内设置有密封圈。

可选地，所述基板上设置有至少一组固定件，所述固定件包括多个螺钉，所述螺钉穿设于所述基板设置，且多个所述螺钉位于所述密封沟槽的外侧；

所述卡盒主体上内嵌地设置有与多个所述螺钉一一对应的磁铁管，所述螺钉可穿入所述磁铁管中央，以实现所述基板与所述卡盒主体的固定连接。

可选地，所述基板上位于所述密封沟槽内设置有多个传感器固定孔；

所述基板和所述盖板均包括透光材料。

可选地，所述盖板上设置有多个进气孔，所述进气孔贯穿所述盖板设置；

所述进气孔与所述培养腔室连通，且所述进气孔内设置有气体单向阀。

可选地，所述进气孔内设置有针状气管，所述针状气管的一端与所述进气孔连接，另一端位于所述细胞滤网内。

有益效果：

本申请提供一种用于细胞自动化灌流培养的微流控卡盒，通过设置基板、卡盒主体和盖板，卡盒主体内包括至少一个培养腔室，培养腔室内设置有细胞滤网，培养腔室包括灌流入口和灌流出口，卡盒主体包括灌流液入口和灌流液出口，灌流液入口与灌流入口通过灌流管道连接，灌流出口和灌流液出口通过出口管道连接，且在第一方向上，灌流出口比灌流入口更靠近基板，出口管道相比灌流管道更靠近基板；在使用该微流控卡盒时，将细胞样本置于培养腔室的细胞滤网内，利用灌流液入口、灌流管道和灌流入口可以朝向培养腔室注入培养基，利用灌流出口、出口管道和灌流液出口可以排出细胞的代谢产物，灌流入口与灌流出口的位置差异以及灌流管道和出口管道之间的位置差异可以避免培养基液体反流，并结合单向滤膜，来自动控制灌流培养及分批补料的培养基的运动流向，避免串扰和交叉污染。

培养腔室体积小(5mL以下)，并设置细胞滤网，以将细胞与新加入的培养基分隔开，并为细胞团的培养提供附着基质。灌流培养基从较高位置进入提供营养物质，目标代谢产物或旧培养基从较低位置流出；这样，便实现了细胞的动态培养。培养腔从顶部至底部为完全透明设计，并通过集成传感器贴箔，可在线监测培养液中pH、OD、氧气、二氧化碳等状态参数，与传统大型发酵罐功能保持一致。并且利用该微流控卡盒可以提供细胞灌流培养功能，完成多个生长周期的细胞株培养，并真实模拟细胞体内的连续供血环境，重建细胞株或细胞群在体内的生理环境，可以提高细胞培养通量、缩短发酵时间与减小培养体系体积。通过对多个培养腔室的自动化灌流培养不仅可以精确控制培养条件，还可以提高相关定量试验的通量需求。

附图说明

为了更清楚地说明本申请实施例的技术方案，下面将对本申请实施例的描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1A是本申请一实施例提出的一种用于细胞自动化灌流培养的微流控卡盒的整体结构示意图；

图1B是本申请一实施例提出的一种用于细胞自动化灌流培养的微流控卡盒隐藏基板后的仰视结构示意图；

图2是本申请一实施例提出的一种用于细胞自动化灌流培养的微流控卡盒的卡盒主体的结构示意图；

图3是图1A中E-E截面的剖视图；

图4是图1A中F-F截面的剖视图；

图5是本申请一实施例提出的一种用于细胞自动化灌流培养的微流控卡盒的细胞滤网的结构示意图；

图6是本申请一实施例提出的一种用于细胞自动化灌流培养的微流控卡盒的透视结构示意图；

图7A是本申请一实施例提出的一种用于细胞自动化灌流培养的微流控卡盒的基板的仰视结构示意图；

图7B是本申请一实施例提出的一种用于细胞自动化灌流培养的微流控卡盒的基板的俯视结构示意图；

图8是图1B中D-D截面的剖视图；

图9A是本申请一实施例提出的一种用于细胞自动化灌流培养的微流控卡盒的盖板的仰视结构示意图；

图9B是本申请一实施例提出的一种用于细胞自动化灌流培养的微流控卡盒的盖板的俯视结构示意图；

图10是本申请一实施例提出的一种用于细胞自动化灌流培养的微流控卡盒的液体单向阀组件的剖视结构示意图；

图11是本申请一实施例提出的一种环境检测及控制装置的结构示意图。

附图标记说明：1、基板；11、密封圈；111、密封沟槽；112、螺孔；113、沉头孔；151、第一传感器固定孔；152、第二传感器固定孔；153、第二传感器固定孔；2、卡盒主体；21、培养腔室；22、灌流液入口；23、灌流液出口；222、灌流入口；232、灌流出口；223、灌流管道；233、出口管道；224、灌流下弯管道；234、灌流上弯管道；26、卡槽；28、磁铁管；3、盖板；31、进气孔；32、气体单向阀；34、双面胶；35、针状气管；4、液体单向阀组件；41、外单向阀组装体；42、螺母；43、螺钉；44、内侧O形密封圈；45、外侧O形密封圈；46、单向过滤膜；47、内单向阀组装体；5、液路接头；50、出口接头；51、溶氧传感器；52、PH值传感器；53、二氧化碳传感器；6、细胞滤网；61、开口；62、突出部；63、滤网；631、微孔；7、机械控制平台；72、电动载物台；73、温度传感器；75、透明温控板；8、控制器；9、环境检测及控制装置；91、照明光源；921、第一传感检测器；922、第二传感检测器；923、第三传感检测器；901、第一滤色镜组；902、第二滤色镜组；903、第三滤色镜组；93、聚焦镜头。

具体实施方式

下面将结合本申请实施例中的附图，对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。

相关技术中，细胞株及细胞团的培养和筛选主要依赖于微孔板、培养皿或摇瓶，其中微孔板、培养平皿中细胞生长周期长、生物产量低，采用摇瓶能缩短培养或发酵时间；但三者均不能实时检测培养过程中的参数。同时现有基于微孔板、摇瓶的细胞培养模式均需要手动或通过移液臂定期补料，因此主要采用分批培养/发酵，或者分批补料培养/发酵的模式，无法模拟大中型发酵罐的连续灌流培养或发酵的模式。大型发酵罐能提供连续灌流培养、流加发酵等批量生产模式，但其实验样品用量较大。

有鉴于此，本申请实施例提出一种用于细胞自动化灌流培养的微流控卡盒，通过设置基板、卡盒主体和盖板，卡盒主体内包括至少一个培养腔室，培养腔室内设置有细胞滤网，培养腔室包括灌流入口和灌流出口，卡盒主体包括灌流液入口和灌流液出口，灌流液入口与灌流入口通过灌流管道连接，灌流出口和灌流液出口通过出口管道连接，且在第一方向上，灌流出口比灌流入口更靠近基板，出口管道相比灌流管道更靠近基板；在使用该微流控卡盒时，将细胞样本置于培养腔室的细胞滤网内，利用灌流液入口、灌流管道和灌流入口可以朝向培养腔室注入培养基，利用灌流出口、出口管道和灌流液出口可以排出细胞的代谢产物，灌流入口与灌流出口的位置差异以及灌流管道和出口管道之间的位置差异可以避免培养基液体反流，从而实现培养基液体的单向流动；这样，整体实现了细胞的动态培养，并且利用该微流控卡盒可以完成多个生长周期的细胞株培养，并真实模拟细胞体内的连续供血环境，重建细胞株或细胞群在体内的生理环境，可以提高细胞培养通量、缩短发酵时间与减小培养体系体积。

参照图1A所示，为本申请实施例公开的一种用于细胞自动化灌流培养的微流控卡盒，该微流控卡盒包括基板1、卡盒主体2以及盖板3。

具体地，参照图1A和图2所示，卡盒主体2设置在基板1上，盖板3设置在卡盒主体2背离基板1的一侧，卡盒主体2整体为长方体形状，卡盒主体2包括至少一个培养腔室21，培养腔室21在第一方向贯穿卡盒主体2，可以理解的是，培养腔室21在卡盒主体2上为一个孔，通过基板1和盖板3将其两端封闭后，便形成了封闭的培养腔室212。培养腔1室的横截面形状可以为圆形或方形等等。在本申请实施例中，培养腔室21的横截面形状为方形。其中，第一方向为垂直于基板1的方向。

在实际应用时，基板1可以采用激光切割或机加工的方式制作，基板1的材料可以包括PMMA、PC或COP，使得基板1具有良好的透光性。盖板3可以采用激光切割或机加工的方式制作，盖板3的材料可以包括硅、玻璃、石英或塑料，使得盖板3具有良好的透光性；从而使得培养腔室21贯穿面的上下方均为透明材料，并且除细胞滤网6外，无其他遮挡干扰物，便于成像与检测。

参照图2所示，培养腔室21侧壁包括一个灌流入口222和一个灌流出口232，同时卡盒主体2四侧的侧壁上设置有灌流液入口22和灌流液出口23，灌流液入口22与灌流入口222之间通过灌流管道223连接，灌流液出口23与灌流出口232之间通过出口管道233连接，这样培养基便可以通过灌流液入口22进入灌流通道223，再通过灌流入口222进入培养腔室21内，而细胞生长代谢产物则会通过灌流出口232进入出口管道233，并最终通过灌流液出口23排出。

需要说明的是，卡盒主体2可以通过增材制造工艺，例如3D打印的方式进行生产制造，因此培养腔室21、灌流入口222、灌流出口232、灌流液入口22、灌流液出口23、灌流管道223和出口管道233均可以在打印的过程中形成，其具体的制备过程在本申请实施例中不过多赘述。卡盒主体2的材料可以包括PLA或ABS，并且卡盒主体2可以选用透明、半透明或不透明材料。

同时，在第一方向上，灌流出口232比灌流入口222更靠近基板1，出口管道233比灌流管道223更靠近基板1，从而使得灌流出口232与灌流入口222之间以及出口管道233与灌流管道223之间形成一定的液位差，可以避免培养基液体出现反流的情况，保证了培养基液体的单向流动。

进一步地，参照图3和图4所示，灌流入口222与灌流管道223之间设置有灌流下弯管道224，灌流下弯管道224的一端与灌流入口22连接，另一端与灌流管道223连接；灌流出口232与出口管道233之间设置有灌流上弯管道234，灌流上弯管道234的一端与灌流出口232连接，另一端与出口管道233连接。利用灌流下弯管道224和灌流上弯管道234可以更好地保证培养基液体的单向流动。

进一步地，参照图4所示，该微流控卡盒还包括多个液路接头5和多个出口接头50，液路接头5分别与灌流液入口22连接，出口接头50分别与灌流液出口23连接，并且液路接头5和出口接头50连接至外部的多通道灌流液控制装置。利用多通道灌流液控制装置，可实现培养基液体的自动化注入与流出，使得微流控卡盒的使用更加方便。液路接头5的材料可以包括聚四氟乙烯、PTFE。

进一步地，参照图1B和图5所示，在培养腔室21内设置有细胞滤网6。细胞滤网6设置为一端开口的杯状结构，该杯状结构的侧壁或远离开口61的底壁上设置有至少一个滤网63。

具体地，滤网63的形状可以为蜂窝状，滤网63包括多个微孔631，且微孔631的孔径小于细胞滤网6内目标培养细胞的直径，这样便可以将细胞与外层培养基分隔开，并具有良好的溶液通透性。新加入培养基从较高位置的灌流入口222进入，并经由滤网63进入，为细胞株或细胞团提供营养物质；目标代谢产物或旧培养基经由滤网63从较低位置的灌流出口232流出。同时细胞滤网6还可以为细胞团的培养提供附着基质，细胞滤网6底部可预先放置细胞团培养的细胞和基质胶，培养基液从四周或/和底部的滤网63，浸入细胞中，为细胞的生长环境提供所需的营养，以实现三维培养。

在实际应用中，滤网63可采用不同孔径和经过处理的聚碳酸酯膜，孔径大小可以为0.4微米至3微米，聚碳酸酯膜的处理方式包括但不限于亲水处理、纤维连接蛋白包被等。并且，在本申请实施例中，细胞滤网6为一次性无菌耗材，可以在装配完成后分批灭菌备用，或采用商业化耗材。细胞滤网6的材料可以包括生物相容塑料、铝合金或聚四氟乙烯，使得细胞滤网6具有一定的耐高温和耐酸碱度特性。本申请中细胞滤网6为一次性无菌耗材，可以在制造装配完成后分批灭菌备用。

并且，参照图2和图5所示，在细胞滤网6上部设置有突出部62，在培养腔室21上部设置有与突出部相适配的卡槽26，将细胞滤网6上的突出部62嵌入卡槽26内，便可以将细胞滤网6固定在培养腔室21内。

通过本申请实施例提供的微流控卡盒，可以实现细胞的动态培养，并且利用该微流控卡盒可以完成多个生长周期的细胞株培养，并且真实模拟细胞体内的连续供血环境，重建细胞株或细胞群在体内的生理环境，可以提高细胞培养通量、缩短发酵时间与减小培养体系体积。

此外，该微流控卡盒可经过灭菌后，在层流通风橱中进行无菌操作，并用于后续无菌化培养，可取样做进一步分析。具备与实验室机器人或其他设备进行硬件和软件集成的可能性。

在一种可选的实施方式中，参照图6所示，培养腔室21设置为多个，且多个培养腔室21以一定间隔、阵列分布在卡盒主体2内。

具体地，在该实施方式中，灌流液入口22与灌流管道223均设置有多个，且多个灌流液入口222与多个所述培养腔室21的灌流入口222一一对应，多个灌流管道223与多个培养腔室21的灌流入口222一一对应。也即是，每个培养腔室21均通过一个单独的灌流液入口22和灌流管道223注入培养基液体，这样可以独立地将不同的培养基液体分别注入到不同的培养腔室21内，用于不同实验条件的并行测试。多个灌流液入口22和多个灌流液出口23分别设置在卡盒主体2的四个侧面。

同时，灌流出口23和出口管道233也设置有多个，多个灌流出口23与多个出口管道233一一对应，多个出口管道233和多个灌流管道223可以在卡盒主体2内水平地交错设置，包括位于较高位置的灌流管道223，位于较低位置的出口管道233。位于同一列或同一行的多个培养腔室221的灌流出口232与多个出口管道233中的一个出口管道233连接。这样，位于同一列或同一行的培养腔室21内细胞产生的培养基废液便可以通过同一个出口管道233一次性排出，进而提高了培养基废液的排出效率。

在本申请实施例中，培养腔室21设置有4*5个，出口管道233设置有4个，因此每条出口管道233与5个培养腔室21的灌流出口23连接。

在一种可选的实施方式中，参照图7B所示，基板1上设置有至少一个闭合的密封沟槽111，培养腔室21位于对应的密封沟槽111内，且密封沟槽内111设置有密封圈11。

具体地，密封沟槽111的形状可以包括圆形或方形等等，在本申请实施例中，密封沟槽111的形状为圆形。在卡盒主体2连接到基板1上后，每个培养腔室21位于闭合的密封沟槽111所围成的封闭区域内，并由对应的密封圈11密封；从而增加基板1与培养腔室21之间的整体密封性。

进一步地，参照图7B和图8所示，基板1上设置有至少一组固定件，每组固定件与每个密封沟槽111相对应，固定件包括多个螺钉43，螺钉43穿设于基板1上的螺孔112内，且多个螺钉43位于密封沟槽的外侧。同时，在卡盒主体2上每个培养腔室的周围设置有与一组固定件中的螺钉相对应内嵌地设置有磁铁管28，螺钉43穿入磁铁管28内后，便可以实现基板1与卡盒主体2的固定连接。

优先的，本申请所述每组固定件，可以包括4个螺钉43和4个磁铁管28，并分别设置在对应密封沟槽111的四角。

这样，多个密封沟槽111同培养腔室21相对设置，每个密封沟槽111固定一个密封圈11，并由对应的固定件逐一配合，在磁吸附的预紧力下，对培养腔室21底部的周围环境区域进行密封；并实现微流控卡盒主体2与微流控卡盒基板的整体液体密封，如图2所示。本申请设置的多个螺钉43和磁铁管48，可以一次性完成所有孔位的固定和密封，避免后续使用过程中需要手动拧固大量螺丝；该固定是可逆的，通过在卡盒主体2和基板1上下面施加适当外力，可以将该磁性固定分开，以进行快速的拆卸。

在实际应用时，螺孔112可采用M2内六角螺丝孔，相应的螺钉43采用M2内六角螺钉。密封沟槽111可设置为内径14.5mm，线宽1.2mm的密封沟槽。磁铁管28为中空的环状圆管，中孔可插入并磁吸附螺钉43，并在磁吸附的作用下提供相互吸引力。磁铁管28可以在增材制造过程中，内嵌至微流控卡盒主体2。

同时，参照图7A所示，在基板1背离卡盒主体2的一侧，与螺孔相对地开设有多个沉头孔113，沉头孔113的形状可以包括圆柱形或腰形，沉头孔113可以预先固定螺钉43，并使螺钉43的顶部陷入进孔中而不突出表面，以保证装配后基板1的平滑底面。

进一步地，在基板1上每个密封沟槽111内均设置有多个传感器固定孔。

具体地，参照图7B所示，多个传感器固定孔可以包括用于固定第一传感器的固定孔151、用于固定第二传感器的固定孔152、固定第三传感器的固定孔153，所述传感器固定孔152、152、153为与对应传感器尺寸相当的凹孔。

示例性地，参照图3所示，在本申请实施例中，所述传感器固定孔151用于粘贴固定溶氧传感器51，传感器固定孔152用于粘贴固定PH值传感器52，传感器固定孔152用于粘贴固定二氧化碳传感器53，溶氧传感器51、PH值传感器52和二氧化碳传感器53均为薄片贴箔，用于动态检测细胞培养的环境条件。

在一种可选的实施方式中，参照图9B所示，盖板3上与培养腔室21相对地设置有多个进气孔31，进气孔31贯穿盖板3设置，进气孔31与培养腔室21连通，且进气孔31外连接地设置有气体单向阀32。

具体地，进气孔31与培养腔室21一一对应。气体单向阀32允许气体向进气孔31方向单向流动，以避免相互干扰。并且气体单向阀32可单独与外部多通道气路控制装置连接。示例性地，气体单向阀32可采用带无菌滤膜的膜式单向阀。在细胞培养的过程中，多通道气路控制装置可控制流向气体单向阀32的环境气体的通入量和比例，为细胞的培养提供必要的气体环境；环境气体可以包括二氧化碳、氧气和氮气等气体的组合。

进一步地，参照图9A所示，在进气孔31内设置有针状气管35，针状气管35的一端与进气孔31连接，另一端位于细胞滤网6内。

具体地，在对细胞进行灌流培养时，针状气管35可以将气体单向阀32通入的环境气体，导入细胞滤网6内的溶液中，从而有助于细胞生长。

进一步地，参照图9A所示，盖板3背面设有预先粘贴的双面胶34，双面胶34区域可覆盖卡盒主体2的多个培养腔室21之外的区域。通过双面胶34使盖板3与卡盒主体2进行可逆封装。双面胶34可采用耐高温、中等粘度和中等剥离强度的双面胶。

在一种可选的实施方式中，参照图4所示，该微流控卡盒还包括液体单向阀组件4，液体单向阀组件4与灌流液入口22连接，并设置于灌流液入口22和液路接头5之间。

具体地，参照图10所示，液体单向阀组件4可以包括外单向阀组装体41、螺母42、内六角螺钉43、内侧O形密封圈44、外侧O形密封圈45、单向过滤膜46和内单向阀组件体47，螺母42和内六角螺钉43将外单向阀组装体41和内单向阀组装体47固定连接，形成整个液体单向阀组件4的壳体。

所述外单向阀组装体41开设内侧O形密封圈槽，用于放置内侧O形密封圈，防止废液从外单向阀组装体41和内单向阀组件体47之间泄露出去，并且其前端有一段M2螺纹；所述外单向阀组装体41的前端有一段M2的螺柱，将外侧O形密封圈45套进螺柱，螺柱与微流控卡盒主体2固定连接，从而实现端面密封，防止废液从连接处泄露出去，所述内单向阀组件体47的内部开设与液路接头5连接的螺纹孔，用于两者的连接。

外单向阀组装体41开设放置单向过滤膜46的过滤槽。单向过滤膜46放置于过滤槽内，单向过滤膜46为两侧流向流阻不同的过滤膜。具体来说，单向过滤膜46朝向灌流液入口22的一侧为第一侧，单向过滤膜46背离灌流液入口22的一侧为第二侧。在液体渗透单向过滤膜46时，液体从第二侧朝向第一侧渗透的流阻小于液体从第一侧朝向第二侧渗透的流阻。因此单向过滤膜46可以将培养基废液中有用的游离态养分液拦截在培养腔室21内，从而限定了液体的流动方向，避免串扰和交叉污染。

在一种可选的实施方式中，还可配备多参数的在线监测传感器，包括溶氧传感器51、PH值传感器52、二氧化碳传感器53，用于检测培养细胞的环境条件。

具体地，在培养腔室21的孔底部密封圈11内部的端面内，预先包埋对pH值、氧气、二氧化碳敏感的发光染料分别作为溶氧传感器51、PH值传感器52、二氧化碳传感器53，然后通过底部光源进行激发，并同时测量其发射的荧光衰减信号(基于荧光猝熄效应)，通过和对照组、线性组解算得到待测物理量的实际值。

本申请实施例的上述传感器的原理是：基于荧光猝熄原理，例如蓝光照射到荧光物质上使荧光物质激发并发出红光，由于敏感分子(例如氧分子)可以带走能量，所以激发的红光的时间和强度与敏感分子的浓度成反比。通过测量激发红光与参比光的相位差，并与内部标定值对比，从而可计算出敏感分子的浓度。

示例性地，本申请采用的溶氧传感器51为Oxygen Sensor Foil SF-RPSu4，PH值传感器52为pH Sensor Foils，二氧化碳传感器53为CO2 Sensor Foil SF-CD1R。这些传感器均基于荧光猝熄原理，将特殊的铂金属卟啉复合物的聚酯箔片(允许气体分子通过)，裁剪为传感器固定孔151、152、153大小尺寸，通过透明胶探测面向下固定，透明胶可以为SG2Silicone Glue,transparent,ColorCode。

在本申请实施例中，培养腔室21为贯穿孔，贯穿面的上下方均为透明材料，为上述传感器的检测预留了底部透明窗口，可采用荧光激发和成像的方法进行扫描式、在线测量OD值、溶解氧(DO)、PH值、二氧化碳等参数，并对微流控卡盒的温度进行控制，从而可以提高细胞株及细胞团培养相关的定量试验，提高灌流实验通量的需求。

基于上述内容，本申请的细胞自动化灌流培养的微流控卡盒使用过程如下：

1、首先，在外部将液体单向阀组件4安装完毕。

2、然后，在基板1上的密封沟槽111内部，互成120°的固定孔151/152/153内贴上三个传感器贴箔(溶氧传感器51、PH值传感器52和二氧化碳传感器53)用于检测培养细胞的环境条件，后将基板1与微流控卡盒主体2用密封圈11和螺钉43连接固定。

3、其次，将液路接头5和液体单向阀组件4组装连接，并将两者组合体连接至卡盒主体2中对应的灌流液入口22，将其余液路接头5连接至卡盒主体2中对应的灌流液出口23，完成组装。

4、再将已安装针状气管35的盖板3放置于卡盒主体2上部，整体进行灭菌。

5、接着，在无菌操作台里进行细胞接种，包括两种情况：

5A、对器官芯片等细胞团培养，从动物细胞或者组织中经过分离、提取、纯化等步骤获取一定数量的待培养的细胞，并和培养基质，例如基质胶(水凝胶)，以一定的比例混匀，并一起加入预灭菌的细胞滤网6中；

5B、对酵母、哺乳动物细胞等细胞株培养，将复苏的或提前培养的细胞株，加入预灭菌的细胞滤网6中；

6、再次，在无菌操作台里，将细胞滤网6放入卡盒主体2的突出部62中，并揭开盖板上连接固定用的双面胶，紧接着接着将盖板和卡盒主体2用双面胶连接，将预先灭菌的气体单向阀32安装到盖板对应的进气孔31中。

7、最后，将多通道灌流液控制装置的灌流和废液液管分别插入到液路接头5和出口接头50，将外部多通道气路控制装置的气管分别连接至气体单向阀32；设置对应参数，并将培养液，二氧化碳气体等输送到卡盒主体2的培养腔室21中，进行细胞的培养。

基于上述内容，用于细胞自动化灌流培养的微流控卡盒使用完成后，基板1、卡盒主体2、部分液体单向阀组件4、液路接头5重复利用前预计先经过以下再生步骤：

1、酸碱浸泡，增大微孔内粘附的微生物及培养基残留的溶解度；

2、超声清洗，将微孔内粘附的微生物及培养基残留从微孔内剥离下来；

3、多次水清洗，以及离心甩干；

4、基板1和卡盒主体2分别灭菌，灭菌方案可以采用：

4a)采用压力蒸汽灭菌；

4b)采用环氧乙烷、等离子射线灭菌等方法。

5、在无菌环境下组装在一起，对气路入口封0.22um膜。

参照图11所示，本申请实施例还公开一种培养环境检测及控制装置，该培养环境检测及控制装置9包括机械控制平台7、照明光源91、第一传感检测器921，第二传感检测器922，第三传感检测器923，第一滤色镜组901、第二滤色镜组902、第三滤色镜组903、聚焦镜头93等。

其中第一传感检测器921与第一滤色镜组901、溶氧传感器51配合使用，第一传感检测器921可发出溶氧检测激发光，照射至培养腔室21的孔底部的溶氧传感器51，并由第一滤色镜组901选择对应的荧光至第一传感检测器921的面探测器。

第二传感检测器922与第二滤色镜组902、PH值传感器52配合使用，第二传感检测器922可发出溶氧检测激发光，照射至培养腔室21的孔底部的PH值传感器52，并由第一滤色镜组902选择对应的荧光至第二传感检测器922的面探测器。

第三传感检测器923与第三滤色镜组903、二氧化碳传感器53配合使用，第三传感检测器921可发出二氧化碳检测激发光，照射至培养腔室21的孔底部的第三二氧化碳传感器53，并由第三滤色镜组903选择对应的荧光至第三传感检测器923的面探测器。

本申请中，照明光源91提供细胞吸光度检测的照射光，可以选用600nm波长的照射光，经过聚焦镜头93照射至培养腔室21，并由第二传感检测器922检测其透射光，以获得培养腔室的细胞培养液浓度信息(OD600)；此时第二传感检测器922的激发光关闭，只进行检测。

本申请的培养环境检测及控制装置9由控制器8进行信号采集与控制，上述信号采集中，可采用与激发光同步的红光光源作为参比，测量激发光与参比光之间的相位差，并与内部标定值比对，从而计算出敏感分子的浓度，经过线性化和温度补偿，输出最终值。

参照图11所示，本申请的机械控制平台7为带温控功能的电动载物台，包括电动载物台73、透明温控板75、温度传感器72，用于微流控卡盒的温控、移动和定位，以及振荡摇匀。透明温控板75位于微流控卡盒下方可进行加热，优先采用ITO透明玻璃；温度传感器72可设置于培养腔室21内部。电动载物台73承载微流控卡盒并在水平方向XY轴精确移动，并辅助培养环境检测及控制装置9对不同的培养腔室21进行检测，以及整个培养过程中均伴随连续振荡，适用于有氧和厌氧培养。

本申请中，细胞培养过程中的温度可以通过透明温控板75、温度传感器72、控制器8进行闭环控制；同时每个孔均可以独立地通入环境气体，环境气体可选择二氧化碳、氧气和氮气组合，因此配合溶液中预先包埋的pH、溶氧和二氧化碳传感器，还可以进行溶氧量等参数的闭环控制。

通过上述培养环境检测及控制装置，每个培养腔的体积小(5ml以下)，可以在很少或没有人员监督的情况下可进行自动化灌流培养中的检测及控制操作，节省了实验期间的人力成本，通过微流控管道连续进样及气压进样的方法，实现了分批补料和连续补料功能，并在培养腔底部集成pH、氧气和二氧化碳传感器，以高分辨率监测生物过程变量，具备向标准发酵罐、实验室规模生物反应器的可扩展性。

需要说明的是，本说明书中的各个实施例均采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似的部分互相参见即可。

还需要说明的是，在本文中，术语“中心”、“上”、“下”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“内”、“外”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本申请和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本申请的限制。此外，诸如“第一”和“第二”之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序，也不能理解为指示或暗示相对重要性。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者终端设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者终端设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括要素的过程、方法、物品或者终端设备中还存在另外的相同要素。

以上对本申请所提供的技术方案进行了详细介绍，本文中应用了具体个例对本申请的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本申请，本说明书内容不应理解为对本申请的限制。同时，对于本领域的一般技术人员，依据本申请，在具体实施方式及应用范围上均会有不同形式的改变之处，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举，而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本申请的保护范围之中。

Claims (10)

1.一种用于细胞自动化灌流培养的微流控卡盒，其特征在于，包括：

基板、卡盒主体以及盖板；

所述卡盒主体设置在所述基板上，所述盖板设置在所述卡盒主体背离所述基板的一侧；

所述卡盒主体包括至少一个培养腔室，所述培养腔室在第一方向贯穿所述卡盒主体，所述培养腔室内设置有细胞滤网；

所述培养腔室包括灌流入口和灌流出口，所述灌流入口和所述灌流出口与所述培养腔室连通；

所述卡盒主体还包括侧向设置的灌流液入口和灌流液出口，内部设置的灌流管道和出口管道，所述灌流入口与所述灌流液入口之间通过所述灌流管道连接，所述灌流出口与所述灌流液出口之间通过所述出口管道连接；

其中，在所述第一方向上，所述灌流出口比所述灌流入口更靠近所述基板，所述出口管道相比所述灌流管道更靠近所述基板；所述第一方向为垂直于所述基板的方向。

2.根据权利要求1所述的用于细胞自动化灌流培养的微流控卡盒，其特征在于：

所述灌流入口与所述灌流管道之间设置有灌流下弯管道，所述灌流下弯管道的一端与所述灌流入口连接，另一端与所述灌流管道连接；

所述灌流出口与所述出口管道之间设置有灌流上弯管道，所述灌流上弯管道的一端与所述灌流出口连接，另一端与所述出口管道连接。

3.根据权利要求1所述的用于细胞自动化灌流培养的微流控卡盒，其特征在于：

所述培养腔室设置有多个，且多个所述培养腔室阵列分布在所述卡盒主体上；

所述灌流液入口设置有多个，且多个所述灌流液入口与多个所述培养腔室的灌流入口一一对应；所述灌流管道设置有多个，且多个所述灌流管道与多个所述培养腔室的灌流入口一一对应；

所述灌流液出口和所述出口管道设置有多个，多个所述灌流液出口与多个所述出口管道一一对应；位于同一列或同一行的多个所述培养腔室的所述灌流出口与多个所述出口管道中的一个所述出口管道连接。

4.根据权利要求1所述的用于细胞自动化灌流培养的微流控卡盒，其特征在于：

所述细胞滤网设置为一端开口的杯状结构，所述杯状结构的侧壁或远离所述开口的底壁上设置有至少一个滤网；

所述滤网的孔洞的孔径小于所述细胞滤网内目标培养细胞的直径。

5.根据权利要求1所述的用于细胞自动化灌流培养的微流控卡盒，其特征在于，所述微流控卡盒还包括：

液体单向阀组件，所述液体单向阀组件与所述灌流液入口连接；

所述液体单向阀件组件包括单向过滤膜，所述单向过滤膜朝向所述灌流液入口的一侧为第一侧，所述单向过滤膜背离所述灌流液入口的一侧为第二侧；

其中，在液体渗透所述单向过滤膜时，由所述第二侧朝向所述第一侧渗透的流阻小于由所述第一侧朝向所述第二侧渗透的流阻。

6.根据权利要求1-5任一项所述的用于细胞自动化灌流培养的微流控卡盒，其特征在于：

所述基板上设置有至少一个闭合的密封沟槽，所述培养腔室位于对应的所述密封沟槽内，且所述密封沟槽内设置有密封圈。

7.根据权利要求6所述的用于细胞自动化灌流培养的微流控卡盒，其特征在于：

所述基板上设置有至少一组固定件，所述固定件包括多个螺钉，所述螺钉穿设于所述基板设置，且多个所述螺钉位于所述密封沟槽的外侧；

所述卡盒主体上内嵌地设置有与多个所述螺钉一一对应的磁铁管，所述螺钉可穿入所述磁铁管中央，以实现所述基板与所述卡盒主体的固定连接。

8.根据权利要求6所述的用于细胞自动化灌流培养的微流控卡盒，其特征在于：

所述基板上位于所述密封沟槽内设置有多个传感器固定孔；

所述基板和所述盖板均包括透光材料。

9.根据权利要求1-5任一项所述的用于细胞自动化灌流培养的微流控卡盒，其特征在于：

所述盖板上设置有多个进气孔，所述进气孔贯穿所述盖板设置；

所述进气孔与所述培养腔室连通，且所述进气孔外设置有气体单向阀。

10.根据权利要求9所述的用于细胞自动化灌流培养的微流控卡盒，其特征在于：

所述进气孔内设置有针状气管，所述针状气管的一端与所述进气孔连接，另一端位于所述细胞滤网内。