CN117106699A - 基于器官芯片的妊娠期母胎界面zika病毒感染模型构建方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于器官芯片的妊娠期母胎界面ZIKA病毒感染模型构建方法。该方法包括：插件式器官芯片的制备；插件式器官芯片上胎盘类器官‑血管内皮屏障模型构建；模拟母胎界面ZIKA病毒感染。本发明将体内胎盘发育的基本原理和工程技术结合，在动态培养微系统中成功建立了母体侧胎盘类器官‑胎儿侧血管内皮屏障体外模型，更加仿生地模拟了胎盘早期发育的动态血流微环境，以及母胎界面胎盘绒毛结构和功能特征，有利于胎盘类器官的长期培养和功能维持；通过在胎盘类器官侧加入ZIKA病毒颗粒，模拟母胎界面ZIKA病毒感染，研究胎盘在早期发育过程中对病毒的易感性和免疫应答反应，为模拟人胎盘早期发育、母胎疾病研究、药物筛选和测试提供了一个新的平台。
Description
技术领域
本发明涉及器官芯片技术、干细胞和组织工程领域，具体涉及一种基于器官芯片的妊娠期母胎界面ZIKA病毒感染模型构建方法。
背景技术
胎盘是妊娠期连接母体与胎儿的重要器官，它是一种高度血管化的胚外组织，调控母胎之间物质交换，具有代谢和分泌等生理功能。胎盘绒毛作为分隔母体血液和胎儿循环的母胎界面，包含多种滋养层细胞、基底膜和胎儿毛细血管内皮等多层结构，它作为母体和胎儿之间的物理和免疫屏障，可保护发育中的胎儿免受病毒的垂直传播，对维持胎儿正常发育有重要作用。
妊娠期母体病毒感染，如寨卡(ZIKA)病毒，可以透过胎盘保护屏障影响胎儿发育，对胎儿健康构成威胁，与胎儿小头症、中枢神经系统异常或其他先天性异常的发生有一定的相关性，并可能导致多种妊娠并发症，如先兆子痫、胎儿生长限制、流产和早产等。有研究表明，人足月胎盘分离出的原代滋养层细胞具有一定的抗病毒感染能力，如疱疹病毒、巨细胞病毒和黄病毒等。其中合胞体滋养层细胞可自分泌干扰素(IFNs)，增强适应性免疫，起到抑制病毒感染作用。然而，在妊娠早期，母胎界面胎盘对于ZIKA和其他病毒感染的防御能力和垂直传播的机制尚不清楚。因此，建立体外仿生胎盘组织模型对于深入了解胎盘早期发育，母胎感染性疾病研究以及早期诊断和治疗等具有重要意义。
目前，人胎盘疾病研究主要依赖传统的二维细胞培养和动物模型。二维细胞培养无法模拟生理条件下细胞的微环境，不能完全反映细胞在生理或病理条件下的形态学和分子水平的改变。动物模型如啮齿类动物由于种属差异，与人胎盘发育过程和组织结构差异巨大，很难完全反映人胎盘组织的微环境和生理情况。因此，它们难以真实模拟人胎盘组织的生理和病理反应，具有一定局限性。近年来，原代胎盘组织或多种干细胞(如滋养层干细胞、胚胎干细胞、诱导多能干细胞)衍生的胎盘类器官建立起来，它是由组织细胞在静态3D培养条件下增殖、分化并自组装形成的三维结构，在一定程度上模拟了胎盘早期发育特点，可有效弥补二维细胞培养体系以及动物模型的局限，在模拟胎盘发育、疾病模型建立和药物筛选等方面具有广泛的应用前景。
尽管胎盘类器官作为母胎界面的生理相关模型具有很大的应用潜力，但由于缺乏关键的细胞类型(如血管内皮细胞)和可控的动态微环境，在重现胎盘组织结构和表型的复杂性等方面仍面临很多局限和不足。首先，孔板中静态培养类器官的方法无法模拟体内胎盘发育过程中的动态细胞微环境，缺乏可控的生化和物理微环境因素。其次，由于3D细胞球的结构特点，使得内部细胞由于缺少氧气和营养，容易出现中心细胞坏死现象，限制了胎盘类器官发育的程度，包括体积大小、功能成熟度等。器官芯片是一种以微流控技术为核心构建的器官微生理系统，具有三维细胞动态培养和理化微环境因素精确调控等优势，可通过模拟组织-组织界面、流体剪切力、机械应力、生化浓度梯度等因素实现仿生组织器官构建。因此，结合器官芯片工程技术和干细胞发育学协同策略，有望优化和改善胎盘类器官的复杂结构和功能，为体外建立具有高保真度的胎盘类器官模型系统提供新的思路，突破类器官传统研究模式和方法的局限。但是将器官芯片技术与胎盘类器官相结合，建立胎盘相关疾病模型领域尚属空白。
发明内容
本发明提供一种基于器官芯片的妊娠期母胎界面ZIKA病毒感染模型构建方法，该方法通过整合干细胞自组织、三维培养、组织-组织界面和动态流体控制等要素，很好地模拟了体内胎盘早期发育的血流动态微环境和胎盘绒毛结构特点，实现了胎盘类器官-血管内皮屏障体外模型的构建。通过在胎盘类器官侧加入ZIKA病毒颗粒，模拟母胎界面ZIKA病毒感染，研究胎盘在早期发育过程中对病毒的易感性和免疫应答反应。本发明为模拟人胎盘早期发育、母胎疾病研究、药物筛选和测试提供了一个新的平台。
本发明提供了一种基于器官芯片的妊娠期母胎界面ZIKA病毒感染模型构建方法，包括：
S1、插件式器官芯片的制备；
S2、插件式器官芯片上胎盘类器官-血管内皮屏障模型构建，模拟母胎界面胎盘绒毛结构和多细胞组分以及动态血流微环境；
S3、模拟母胎界面ZIKA病毒感染，研究胎盘组织的病毒易感性和免疫应答反应。
可选的，所述插件式气管芯片包括上盖、插件和芯片本体，所述上盖覆盖于所述芯片本体的上方；
所述芯片本体由上至下设置有通孔层和通道层，所述通道层设置在对应的通孔层下方，且所述通孔层和通道层一体成型；所述插件放置在所述通孔内。
可选的，所述通孔层上设置有至少一排通孔，每排通孔至少包括3个通孔，通孔相互独立，垂直于通道层设置，每一排通孔作为一个培养单元；
所述通道层上设有多个通道槽，每个通道槽对应于一个培养单元；所述通道层和通孔层闭合后，每个培养单元底部四周与通道槽四周闭合，使每一培养单元均为独立结构。
可选的，所述插件从上至下依次包括设置在顶部的支撑结构、与所述支撑结构下方连接的中空的腔室，以及设置在腔室底部的多孔薄膜；所述多孔薄膜的材料为聚碳酸酯或聚酯，多孔薄膜的孔径为0.1-12.0μm；
每一个培养单元中间位置的通孔为插件池，所述支撑结构用于将插件卡在每一个插件池中，插件池两边的通孔为流动培养基储液池，用于放置培养基，当插件置于插件池后，插件底部的多孔薄膜浸润于通道的槽液面下。
可选的，所述多孔薄膜的正侧接种胎盘类器官，反侧接种血管内皮细胞单层，进行胎盘类器官和血管内皮细胞层共培养，形成母体侧和胎儿侧培养通道；所述插件式器官芯片在应用时，放在配套的精密摇床上，随摇床上下摇摆为细胞或组织提供流体环境，促进母体侧和胎儿侧细胞的物质交换。
可选的，所述S2具体包括：
S21、插件式器官芯片上胎盘类器官的产生，包括：将人滋养层干细胞在包被5-10μg/ml IV型胶原的孔板中进行扩增培养，待细胞生长70％-90％后，消化，离心，细胞沉淀重悬，加到带有凹陷结构的微孔板中使滋养层干细胞自组装成细胞球，形成的细胞球大小为50-200μm；将人滋养层干细胞球使用浓度为8-10mg/ml的Matrigel重悬，Matrigel终浓度的体积比为60％-80％，在孔板中制备细胞球/Matrigel胶滴，每个胶滴体积为20-40μl，每个胶滴中包含的细胞球个数为60-120个；将孔板置于培养箱中15-30min，使Matrigel胶滴凝固，补加分化培养基TOM，静置培养6-8h；
静置培养后进行动态培养，将含有细胞球的胶滴转移到插件式器官芯片中间通孔内的插件中，插件池两边的通孔为培养基储液池，补加分化培养基TOM，将插件式器官芯片放在配套的精密摇床上，随摇床上下摇摆为胎盘类器官提供流体动态培养环境并促进营养物质交换，继续培养5-8天后，实时追踪，鉴定发现芯片上滋养层干细胞可以持续地生长和分化，可形成含有不同滋养层细胞亚型和类似绒毛结构的胎盘类器官，模拟胎盘早期发育过程；
S22、血管内皮屏障形成，包括：插件式器官芯片通孔内插件的多孔薄膜预先用20～200μg/ml I型胶原包被，将插件倒置，将2×105～6×105个血管内皮细胞接种到多孔薄膜反侧，静置2-3小时，使内皮细胞贴附在多孔膜上；在培养基储液池中补加内皮培养基EGM-2，过夜静置培养，形成单层致密的内皮组织屏障；
S23、胎盘类器官与内皮细胞动态共培养，包括：胎盘类器官分化第6天时，将含有类器官的胶滴转移到含有内皮组织屏障插件的多孔膜正侧，放置在摇床上进行胎盘类器官与内皮细胞的动态共培养；插件式器官芯片通道内培养基替换为共同培养基，插件式器官芯片放在摇床上，随摇床上下摇摆，可为胎盘类器官和内皮组织屏障提供流体培养环境并促进营养物质交换；
继续培养5-8天后，鉴定发现在与内皮细胞共培养的条件下，胎盘类器官的I型和III型干扰素分泌水平显著升高，反映了共培养体系可促进胎盘类器官的长期培养和功能成熟，改善其固有免疫水平，增强其抗病毒感染能力。
可选的，所述人滋养层干细胞来源于人囊胚滋养外胚层细胞、原代胎盘组织或者其他多能干细胞诱导的滋养层干细胞。
可选的，所述共同培养基为TOM和EGM-2培养基体积比为1：1的混合液。
可选的，所述S3具体包括：
S31、胎盘类器官在芯片上发育到第6天时，在上层通道加入ZIKA病毒颗粒，孵育2h后冲洗，作为实验组；对照组为不感染ZIKA病毒的胎盘类器官；
S32、将对照组和实验组的胎盘类器官转移到含有内皮组织屏障插件的多孔薄膜正侧，放置在摇床上进行胎盘类器官与内皮细胞的动态共培养；
S33、培养基通道均置换为共同培养基；
S34、继续共培养5-8天后，收样进行后续检测。
进一步地，所述共同培养基为TOM和EGM-2培养基体积比为1：1的混合液。
本发明建立的基于器官芯片的妊娠期母胎界面ZIKA病毒感染模型构建方法，其后续的结构和功能的表征方法如下：
(1)使用冷冻切片技术，将细胞团切成10-20μm厚度，进行免疫荧光染色鉴定胎盘类器官发育过程中不同滋养层细胞亚型分化和胎盘绒毛样结构形成情况；
(2)免疫荧光染色鉴定血管内皮组织屏障的形成情况；
(3)使用RT-qPCR方法检测不同培养条件下胎盘类器官的分化和发育情况。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
(1)本发明设计了一种新型的可动态培养的器官芯片，配合使用可拆卸的插件，通过在芯片外进行细胞的接种和初步培养之后，再装配到芯片上培养，实现不同组织细胞的共培养，插件即插即用，使用灵活；芯片放置于摇床上培养，实现重力作用下的流体驱动，提供了一种简单易用的体外组织动态培养平台。另外，同一个摇床上可以同时进行多个芯片的培养，进一步提高通量；
(2)本发明提供一种基于器官芯片的妊娠期母胎界面ZIKA病毒感染模型构建方法，不仅适用于原代滋养层干细胞来源的胎盘类器官构建，也适用于其他不同类型的干细胞(包括胚胎干细胞)来源的胎盘类器官构建。此外，本发明也适用于妊娠期其他类型病毒的感染研究，如疱疹病毒、巨细胞病毒、肝炎病毒、风疹病毒、新冠病毒等。
(3)该模型作为创新的体外组织器官模型，不仅利于直观观察胎盘早期发育的病理生理特点，也可以借鉴各种检测方法，研究外界刺激因素对胎盘发育和功能影响的分子学和细胞学机制，弥补了传统细胞实验和动物实验的不足，为妊娠期胎盘发育和母胎感染性疾病研究提供了有力的工具。
附图说明
图1为本发明提供的一种基于器官芯片的妊娠期母胎界面ZIKA病毒感染模型构建方法的流程图；
图2为本发明中插件式器官芯片分层结构示意图；
图3为发明中插件式器官芯片的单个插件池截面示意图；
图4为插件式器官芯片上胎盘类器官-血管内皮屏障模型构建流程图；
图5为Luminex多因子检测方法鉴定单独培养和共培养体系下胎盘类器官侧的培养基上清中干扰素分泌水平示意图；
图6为免疫荧光染色和RT-PCR方法检测胎盘类器官对ZIKA病毒的易感性示意图；
图7为RT-qPCR鉴定ZIKA病毒感染后，单独培养和共培养体系下胎盘类器官的干扰素相关基因(IFNλ1,IFNλ2,IFNβ)的表达情况示意图；
图8为Luminex多因子检测方法鉴定ZIKA病毒感染后，共培养体系下胎盘类器官侧的培养基上清中干扰素(IFNλ1,IFNλ2,IFNβ)和细胞因子(Pentraxin-3)的分泌水平示意图；
其中，1-通孔层、11-通孔、2-通道层、21-通道槽、3-插件、31-支撑结构、32-中空的腔室、33-多孔薄膜、4-上盖。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步的详细说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施例仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。另外还需要说明的是，为了便于描述，附图中仅示出了与本发明相关的部分而非全部结构。
参见图1，本发明提供一种基于器官芯片的妊娠期母胎界面ZIKA病毒感染模型构建方法，包括：
S1、插件式器官芯片的制备。
参见图2-3，本发明实施例提供的插件式器官芯片包括：上盖4、插件3和芯片本体，芯片本体由上至下设置有通孔层1和通道层2，上盖覆盖于芯片本体上方。通孔层1为一个基板，基板上设有多个通孔11，通孔数量≥3，每一排通孔为一个培养单元；通道层2在对应的通孔层1下方；通道层2上设有多个通道槽21，每个通道槽21对应于一个培养单元；通道层和通孔层闭合后，每个培养单元底部四周与通道槽四周闭合，使每一培养单元均为独立结构。通孔11内放置插件3，插件上部为支撑结构31用以将插件卡在通孔上边缘，支撑结构下方连接有中空的腔室32，腔室底部为多孔薄膜33。其中，多孔薄膜的材料为聚碳酸酯或聚酯，多孔薄膜的孔径为0.4μm。
每一个培养单元中间位置的通孔为插件池，用以放置插件，插件池两边的通孔为流动培养基储液池，用以放置培养基。芯片在应用时，放在摇床上，随摇床上下摇摆为细胞或组织提供流体环境并促进营养物质交换。
本实施例中，通孔层和通道层一体成型，或通过粘合组装、热压封接成一体结构。通孔相互独立，垂直于通道层设置；插件置于通孔后，插件底部的多孔薄膜浸润于通道的槽液面下。
其中，器官芯片的材质可为聚碳酸酯PC、聚苯乙烯PS、环烯烃共聚物Cyclicolefin copolymer COC或cyclo olefin polymer COP等塑料。
S2、插件式器官芯片上胎盘类器官-血管内皮屏障模型构建，模拟母胎界面胎盘绒毛结构和多细胞组分以及动态血流微环境。
具体的，S2包括以下步骤：
S21、插件式器官芯片上胎盘类器官的产生，包括：将人滋养层干细胞在包被5-10μg/ml IV型胶原的孔板中进行扩增培养，待细胞生长70％-90％后，消化，离心，细胞沉淀重悬，加到带有凹陷结构的微孔板中使滋养层干细胞自组装成细胞球，形成的细胞球大小为50-200μm；将人滋养层干细胞球使用浓度为8-10mg/ml的Matrigel重悬，Matrigel终浓度的体积比为60％-80％，在孔板中制备细胞球/Matrigel胶滴，每个胶滴体积为20-40μl，每个胶滴中包含的细胞球个数为60-120个；将孔板置于培养箱中15-30min，使Matrigel胶滴凝固，补加分化培养基TOM，静置培养6-8h；
静置培养后进行动态培养，将含有细胞球的胶滴转移到插件式器官芯片中间通孔内的插件中，插件池两边的通孔为培养基储液池，补加分化培养基TOM，将插件式器官芯片放在配套的精密摇床上，随摇床上下摇摆为胎盘类器官提供流体动态培养环境并促进营养物质交换，继续培养5-8天后，实时追踪，鉴定发现芯片上滋养层干细胞可以持续地生长和分化，可形成含有不同滋养层细胞亚型和类似绒毛结构的胎盘类器官，模拟胎盘早期发育过程；
S22、血管内皮屏障形成，包括：插件式器官芯片通孔内插件的多孔薄膜预先用20～200μg/ml I型胶原包被，将插件倒置，将2×105～6×105个血管内皮细胞接种到多孔薄膜反侧，静置2-3小时，使内皮细胞贴附在多孔膜上；在培养基储液池中补加内皮培养基EGM-2，过夜静置培养，形成单层致密的内皮组织屏障；
S23、胎盘类器官与内皮细胞动态共培养，包括：胎盘类器官分化第6天时，将含有类器官的胶滴转移到含有内皮组织屏障插件的多孔膜正侧，放置在摇床上进行胎盘类器官与内皮细胞的动态共培养；插件式器官芯片通道内培养基替换为共同培养基，插件式器官芯片放在摇床上，随摇床上下摇摆，可为胎盘类器官和内皮组织屏障提供流体培养环境并促进营养物质交换；
继续培养5-8天后，鉴定发现在与内皮细胞共培养的条件下，胎盘类器官的I型和III型干扰素分泌水平显著升高，反映了共培养体系可促进胎盘类器官的长期培养和功能成熟，改善其固有免疫水平，增强其抗病毒感染能力。
其中，所述人滋养层干细胞来源于人囊胚滋养外胚层细胞、原代胎盘组织或者其他多能干细胞诱导的滋养层干细胞。
上述共同培养基为TOM和EGM-2培养基体积比为1：1的混合液。
S3、模拟母胎界面ZIKA病毒感染，研究胎盘组织的病毒易感性和免疫应答反应。
具体的，S3包括以下步骤：
S31、胎盘类器官在芯片上发育到第6天时，在上层通道加入ZIKA病毒颗粒，孵育2h后冲洗，作为实验组；对照组为不感染ZIKA病毒的胎盘类器官；
S32、将对照组和实验组的胎盘类器官转移到含有内皮组织屏障插件的多孔薄膜正侧，放置在摇床上进行胎盘类器官与内皮细胞的动态共培养；
S33、培养基通道均置换为共同培养基；
S34、继续共培养5-8天后，收样进行后续检测。
实施例1
本发明实施例主要对步骤(1)插件式器官芯片的制备，以及(2)胎盘类器官在器官芯片上的分化和发育进行进一步的细化，具体内容如下：
步骤(1)插件式器官芯片的制备，具体为：如图2所示，插件式器官芯片包括：上盖、插件和芯片本体，芯片本体由上至下设置有通孔层和通道层，上盖覆盖于芯片本体上方。通孔层为一个基板，基板上设有多个通孔，通孔数量≥3，每一排通孔为一个培养单元；通道层在对应的通孔层下方；通道层上设有多个通道槽，每个通道槽对应于一个培养单元；通道层和通孔层闭合后，每个培养单元底部四周与通道槽四周闭合，使每一培养单元均为独立结构。通孔内放置插件，插件上部为支撑结构用以将插件卡在通孔上边缘，支撑结构下方连接有中空的腔室，腔室底部为多孔薄膜。多孔薄膜的材料为聚碳酸酯或聚酯，多孔薄膜的孔径为0.4μm。
如图3所示，每一个培养单元中间位置的通孔为插件池用以放置插件，插件池两边的通孔为流动培养基储液池，用以放置培养基。芯片在应用时，放在摇床上，随摇床上下摇摆为细胞或组织提供流体环境并促进营养物质交换。通孔层和通道层一体成型，或通过粘合组装、热压封接成一体结构。通孔相互独立，垂直于通道层设置；插件置于通孔后，插件底部的多孔薄膜浸润于通道的槽液面下。芯片材质为聚碳酸酯PC。
步骤(2)胎盘类器官在器官芯片上的分化和发育，具体为：将来源于人囊胚滋养外胚层细胞的滋养层干细胞在包被5μg/ml IV型胶原的孔板中进行扩增培养。待细胞生长80％后，消化，离心，细胞沉淀重悬。如图4流程图所示，将细胞悬液加到带有凹陷结构的微孔板中使滋养层干细胞自组装成细胞球，形成的细胞球大小约为100μm。将人滋养层干细胞球使用浓度为8mg/ml的Matrigel重悬，Matrigel终浓度的体积比为60％，在孔板中制备细胞球/Matrigel胶滴，每个胶滴体积为40μl，每个胶滴中包含的细胞球个数约为120个。将孔板置于培养箱中20min，使Matrigel胶滴凝固，补加分化培养基TOM，静置培养6h。
静置培养后进行动态培养，将含有细胞球的胶滴转移到所述芯片中间通孔内的插件中，插件池两边的通孔为培养基储液池(，补加分化培养基TOM。之后，芯片放在摇床上，随摇床上下摇摆为胎盘类器官提供流体动态培养环境并促进营养物质交换，继续培养6天，进行实时追踪。
实施例2
本实施例利用实施例1中的插件式器官芯片进行胎盘类器官的培养和分化，产生胎盘类器官的方法过程如实施例1中所示。在此基础上，建立胎盘类器官-血管内皮屏障体外模型。具体步骤如下：
(1)如图4流程图所示，将5×105个血管内皮细胞接种到芯片通孔内插件的多孔薄膜反侧，多孔薄膜预先用100μg/ml I型胶原包被。将插件倒置2小时，使内皮细胞贴附在多孔薄膜上；在培养基储液池中补加内皮培养基EGM-2，过夜静置培养，形成单层致密的内皮组织屏障。
(2)胎盘类器官分化第6天时，将含有类器官的胶滴转移到含有内皮组织屏障插件内部的多孔薄膜正侧，并进行动态培养，实现胎盘类器官与内皮细胞的共培养。芯片通道内培养基替换为共同培养基，共同培养基为TOM和EGM-2培养基体积比为1：1的混合液。之后，将芯片放在摇床上，随摇床上下摇摆，可为胎盘类器官和内皮组织屏障提供流体培养环境并促进营养物质交换。
(3)继续培养6天后，收集不同培养条件下的胎盘类器官侧的培养基上清进行鉴定。利用Luminex多因子检测方法鉴定培养基中干扰素分泌水平，具体参见图5，发现在与内皮细胞共培养的条件下，胎盘类器官的I型(IFNα2,IFNβ)和III型(IFNλ1,IFNλ2)干扰素分泌水平显著升高，IFNλ2的水平明显高于其他干扰素水平。反映了共培养体系可促进胎盘类器官的长期培养和功能成熟，改善其固有免疫水平，增强其抗病毒感染能力。该体系实现了胎盘类器官的仿生构建，模拟了体内母胎界面的血管流动态微环境和胎盘绒毛结构。
实施例3
本实施例主要介绍：胎盘类器官模型对ZIKA病毒的易感性。
芯片上培养至第6天的胎盘类器官进行不同滴度(MOI＝0.1和MOI＝1)ZIKA病毒的感染，对照组为未感染ZIKA病毒组，孵育2小时后用PBS缓冲液清洗掉残留的病毒颗粒。之后将胎盘类器官再转移到新的芯片上进行单独培养或与血管内皮屏障共培养。继续培养6天后，分别收集胎盘类器官进行免疫荧光染色和RT-qPCR鉴定。其中冷冻切片和免疫荧光染色方法如下：4％多聚甲醛进行细胞固定20min，PBS缓冲液冲洗三次，每次1min；30％蔗糖4℃过夜脱水；OCT包埋，室温存放30min，80℃凝固；冷冻切片，厚度为10μm，并将其贴附在静电吸附的载玻片上。然后进行免疫荧光染色，方法为：将带有切片的载玻片置于PBS缓冲液中浸泡5min；0.1％triton X-100致孔剂作用5min，PBS缓冲液冲洗1次，1min；山羊封闭血清室温作用1h；一抗(E-cadherin，ZIKV NS2B)1:400稀释，4℃过夜孵育，PBS缓冲液冲洗3次。二抗(Fluorescence 488/594标记的山羊抗兔或鼠IgG)1:500稀释，室温孵育1h，PBS缓冲液冲洗3次；冲洗完毕后加入1:4000稀释的DAPI工作液，荧光显微镜下拍照，记录相应蛋白的表达情况，结果如图6中的A部分和B部分所示，ZIKA病毒感染后，不同培养条件下的胎盘类器官都有ZIKV NS2B的显著表达，但相比于单独培养，共培养条件下的胎盘类器官ZIKV NS2B表达明显降低，Scale bars：50μm。结果表明胎盘类器官可感染ZIKA病毒，并且共培养条件下的胎盘类器官对ZIKA病毒的易感性降低，这可能与其干扰素的高水平分泌有关，反映了共培养体系可有利于改善胎盘类器官的固有免疫水平，增强其抗病毒感染能力。
分别收集不同培养条件下感染组和对照组的胎盘类器官样品，用PBS缓冲液清洗1次，并离心。使用Trizol法提取全RNA，方法如下：1ml Trizol重悬细胞，上下吹打直至无细胞块，整个溶液澄清；加入200μl氯仿，上下颠倒充分混匀，室温静置3min，12000rpm离心15min；溶液出现分层，取上层液体至新管中，整个过程小心操作尽量避免接触中间层白色沉淀；在吸取液中加入等量异丙醇，上下颠倒混匀，-20℃静置过夜，利于RNA析出；12000rpm离心10min；保留管底部的白色RNA沉淀，小心去上清；75％乙醇清洗白色沉淀，12000rpm离心5min；尽可能去除75％乙醇，室温让其挥发，以免乙醇污染样品，影响后续实验；DEPC水溶解RNA沉淀；测RNA浓度和纯度，并进行相应的稀释，终浓度为500ng/ml。按照试剂盒要求将mRNA反转录为cDNA，体系为50μl。之后进行RT-qPCR，按照试剂盒要求配体溶液，终体系为5ul，退火温度Tm值统一为58℃。最后统计不同培养条件下胎盘类器官的ZIKA病毒基因ZIKVvRNA的表达，结果如图5中的C部分所示。结果显示，ZIKA病毒感染后，不同培养条件下的胎盘类器官都有ZIKV vRNA的显著表达，且随着病毒滴度的升高，ZIKV vRNA表达显著上调。但相比于单独培养，共培养条件下的胎盘类器官在高滴度(MOI＝1)ZIKA病毒感染后，其ZIKVNS2B表达上调倍数明显降低。这些结果表明，胎盘类器官可感染ZIKA病毒，并且共培养条件下的胎盘类器官对ZIKA病毒的易感性降低，与免疫荧光染色结果一致。反映了共培养体系可有利于改善胎盘类器官的固有免疫水平，抑制病毒感染。
实施例4
本实施例主要涉及：胎盘类器官模型对ZIKA病毒感染的免疫反应。
芯片上培养至第6天的胎盘类器官进行不同滴度(MOI＝0.1和MOI＝1)ZIKA病毒的感染，对照组为未感染ZIKA病毒组，孵育2小时后用PBS缓冲液清洗掉残留的病毒颗粒。之后将胎盘类器官再转移到新的芯片上进行单独培养或与血管内皮屏障共培养。继续培养6天后，分别收集胎盘类器官进行RT-qPCR鉴定。RNA提取，逆转录和RT-qPCR方法具体如实施例3所述，统计不同培养条件下胎盘类器官的干扰素相关基因(IFNλ1,IFNλ2,IFNβ)的表达情况，结果如图7所示。结果显示，ZIKA病毒感染后，单独培养的胎盘类器官IFNλ1,IFNλ2,IFNβ的表达都有显著上调，且随着病毒滴度的升高而升高，具有浓度依赖性。但共培养条件下的胎盘类器官在ZIKA病毒感染后，只有IFNλ1表达有显著上调，IFNλ2,IFNβ基因表达变化不明显。这些结果表明，ZIKA病毒感染可激活胎盘类器官的IFN信号通路，表现出先天免疫反应激活，而共培养条件下，ZIKA病毒诱导胎盘类器官的IFN表达不明显，说明其对ZIKA病毒的易感性降低。
收集不同培养条件下的胎盘类器官侧的培养基上清进行鉴定。利用Luminex多因子检测方法鉴定培养基中干扰素和细胞因子分泌水平。如图8所示，发现在与内皮细胞共培养的条件下，ZIKA病毒感染诱导胎盘类器官的I型(IFNβ)和III型(IFNλ1,IFNλ2)干扰素分泌水平显著升高，并且Pentraxin-3分泌水平也明显上升，Pentraxin-3在先天免疫反应和炎症中可发挥关键作用。这些结果说明，ZIKA病毒感染可诱导胎盘类器官的先天免疫反应激活，主要表现为IFN信号通路的激活，I型和III型IFN以及Pentraxin-3的分泌水平升高。而共培养条件促进了胎盘类器官的功能成熟和固有免疫水平升高，导致其对ZIKA病毒有一定的抗感染能力。该模型为母胎界面抗ZIKA病毒感染研究和治疗提供了新的研究平台和思路。
注意，上述仅为本发明的较佳实施例及所运用技术原理。本领域技术人员会理解，本发明不限于这里所述的特定实施例，对本领域技术人员来说能够进行各种明显的变化、重新调整和替代而不会脱离本发明的保护范围。因此，虽然通过以上实施例对本发明进行了较为详细的说明，但是本发明不仅仅限于以上实施例，在不脱离本发明构思的情况下，还可以包括更多其他等效实施例，而本发明的范围由所附的权利要求范围决定。
Claims (9)
1.一种基于器官芯片的妊娠期母胎界面ZIKA病毒感染模型构建方法，其特征在于，包括：
S1、插件式器官芯片的制备；
S2、插件式器官芯片上胎盘类器官-血管内皮屏障模型构建；
S3、模拟母胎界面ZIKA病毒感染。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述插件式气管芯片包括上盖、插件和芯片本体，所述上盖覆盖于所述芯片本体的上方；
所述芯片本体由上至下设置有通孔层和通道层，所述通道层设置在对应的通孔层下方，且所述通孔层和通道层一体成型；所述插件放置在所述通孔内。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述通孔层上设置有至少一排通孔，每排通孔至少包括3个通孔，通孔相互独立，垂直于通道层设置，每一排通孔作为一个培养单元；
所述通道层上设有多个通道槽，每个通道槽对应于一个培养单元；所述通道层和通孔层闭合后，每个培养单元底部四周与通道槽四周闭合，使每一培养单元均为独立结构。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述插件从上至下依次包括设置在顶部的支撑结构、与所述支撑结构下方连接的中空的腔室，以及设置在腔室底部的多孔薄膜；所述多孔薄膜的材料为聚碳酸酯或聚酯，多孔薄膜的孔径为0.1-12.0μm；
每一个培养单元中间位置的通孔为插件池，所述支撑结构用于将插件卡在每一个插件池中，插件池两边的通孔为流动培养基储液池，用于放置培养基，当插件置于插件池后，插件底部的多孔薄膜浸润于通道的槽液面下。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述多孔薄膜的正侧接种胎盘类器官，反侧接种血管内皮细胞单层，进行胎盘类器官和血管内皮细胞层共培养，形成母体侧和胎儿侧培养通道；所述插件式器官芯片在应用时，放在配套的精密摇床上，随摇床上下摇摆为细胞或组织提供流体环境，促进母体侧和胎儿侧细胞的物质交换。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述S2具体包括：
S21、插件式器官芯片上胎盘类器官的产生，包括：将人滋养层干细胞在包被5-10µg/mlIV型胶原的孔板中进行扩增培养，待细胞生长70%-90%后，消化，离心，细胞沉淀重悬，加到带有凹陷结构的微孔板中使滋养层干细胞自组装成细胞球，形成的细胞球大小为50-200µm；将人滋养层干细胞球使用浓度为8-10 mg/ml的Matrigel重悬，Matrigel终浓度的体积比为60%-80%，在孔板中制备细胞球/Matrigel胶滴，每个胶滴体积为20-40µl，每个胶滴中包含的细胞球个数为60-120个；将孔板置于培养箱中15-30min，使Matrigel胶滴凝固，补加分化培养基TOM，静置培养6-8 h；
静置培养后进行动态培养，将含有细胞球的胶滴转移到插件式器官芯片中间通孔内的插件中，插件池两边的通孔为培养基储液池，补加分化培养基TOM，将插件式器官芯片放在配套的精密摇床上，随摇床上下摇摆为胎盘类器官提供流体动态培养环境并促进营养物质交换，继续培养5-8天后，实时追踪，鉴定发现插件式器官芯片上滋养层干细胞可以持续地生长和分化，可形成含有不同滋养层细胞亚型和类似绒毛结构的胎盘类器官，模拟胎盘早期发育过程；
S22、血管内皮屏障形成，包括：插件式器官芯片通孔内插件的多孔薄膜预先用20~200µg/ml I型胶原包被，将插件倒置，将2×105~6×105个血管内皮细胞接种到多孔薄膜反侧，静置2-3小时，使内皮细胞贴附在多孔膜上；在培养基储液池中补加内皮培养基EGM-2，过夜静置培养，形成单层致密的内皮组织屏障；
S23、胎盘类器官与内皮细胞动态共培养，包括：胎盘类器官分化第6天时，将含有类器官的胶滴转移到含有内皮组织屏障插件的多孔膜正侧，放置在摇床上进行胎盘类器官与内皮细胞的动态共培养；插件式器官芯片通道内培养基替换为共同培养基，插件式器官芯片放在摇床上，随摇床上下摇摆，可为胎盘类器官和内皮组织屏障提供流体培养环境并促进营养物质交换；
继续培养5-8天后，鉴定发现在与内皮细胞共培养的条件下，胎盘类器官的I型和III型干扰素分泌水平显著升高，反映了共培养体系可促进胎盘类器官的长期培养和功能成熟，改善其固有免疫水平，增强其抗病毒感染能力。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述人滋养层干细胞来源于人囊胚滋养外胚层细胞、原代胎盘组织或者其他多能干细胞诱导的滋养层干细胞。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述共同培养基为TOM和EGM-2培养基体积比为1：1的混合液。
9.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述S3具体包括：
S31、胎盘类器官在芯片上发育到第6天时，在上层通道加入ZIKA病毒颗粒，孵育2h后冲洗，作为实验组；对照组为不感染ZIKA病毒的胎盘类器官；
S32、将对照组和实验组的胎盘类器官转移到含有内皮组织屏障插件的多孔薄膜正侧，放置在摇床上进行胎盘类器官与内皮细胞的动态共培养；
S33、培养基通道均置换为共同培养基；
S34、继续共培养5-8天后，收样进行后续检测。
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