KR102542887B1

KR102542887B1 - 피부모사 칩 및 이를 이용한 피부 자극 평가를 위한 동물대체시험방법

Info

Publication number: KR102542887B1
Application number: KR1020210052266A
Authority: KR
Inventors: 최태현; 오현직; 윤준원; 전병준; 이종권; 김영민; 김정아; 연 황; 김다은; 헌 김; 윤현지; 명새미; 매이단강오보이
Original assignee: (주) 마이크로핏; 대한민국 (식품의약품안전처장); 서울대학교산학협력단
Priority date: 2021-04-22
Filing date: 2021-04-22
Publication date: 2023-06-15
Also published as: KR20220145552A

Abstract

본 발명은 피부모사 칩 및 이를 이용한 피부 자극성 평가방법에 관한 것으로, 본 발명에 따른 피부모사 칩은 실제 인체 피부의 각 층을 모사할 수 있을 뿐만 아니라, 현재 동물실험을 대체할 수 있는 시험법으로 각광받는 시험관 측정법보다 부종에 대한 추가적인 모사도 가능하며, 이를 통해 시험물질에 대한 전체적인 피부 자극정도를 정확하게 산출, 비교할 수 있다.

Description

피부모사 칩 및 이를 이용한 피부 자극 평가를 위한 동물대체시험방법{Model mimicking human skin and alternative to animal testing method for estimating irritation for Human skin using the same}

본 발명은 피부모사 칩 및 이를 이용한 피부 자극 평가를 위한 동물대체시험방법에 관한 것이다.

피부조직은 인체의 외부를 이루고, 표피층, 진피층, 피하층을 이루고 있으며, 피부에 의한 외관은 개개인의 자신감과 삶의 질에 지대한 영향을 미친다.

피부 상태를 치료하거나 개선하기 위한 다양한 제품을 개발하고자 하는 많은 연구가 지속되어 왔다. 이들 제품의 상용화를 위해서는 피부에 미치는 자극의 정도가 평가될 필요가 있다.

자극 측정을 위해서는 시험관내 또는 생체내 측정법이 널리 알려져 있다. 시험관내 방법은, 각질세포 및 섬유모세포의 사람 피부 공동-배양을 포함하는 시험관내 모델에, 제품을 적용한 후, 생존력을 측정하는 것으로, 안정성 문제에 관한 직접적 정보를 제공할 수는 있으나, 사람 피부에 의해 나타나는 자극을 정확하게는 나타내지 못하는 단점이 있다.

생체내 방법은, 제품을 패칭하여 사람 모델에 직접 테스트함으로써, 피부 자극 정도를 측정하는 것이다. 이들은 진행동안 과도한 사용 조건 또는 높은 수준의 침해성을 내포하고 있으며, 임상 평가 도구로서 유용성이 제한된다는 문제점이 있다.

게다가, 동물실험에 대한 윤리적인 개념이 강화되고 있고, 세계적인 동물보호단체인 휴메인 소사이어티 인터내셔널(HSI)은 전세계 각국에서 검증된 동물대체시험법의 활용을 요구하고 있다.

이에, 점차 국내에서 동물실험을 실시한 화장품을 유통 및 판매가 금지될 전망이며, 2017년 2월 농림축산식품부의 '화장품 동물실험 금지' 입법 추진 발표를 통해 화장품의 완제품 및 원료에 대한 단계적 제한 5개년 종합계획의 수립이 공표된 바 있으며, 화장품에 대한 동물실험 금지가 더욱 속도를 내어 정책화될 것으로 보인다.

동물실험에 대한 위화감으로 인해, 기존 시험관내 측정법이 부각되고 있으나, 상기 시험관내 측정법으로는 내피세포의 확장과 투과성의 증가, 피부 부종 등을 관찰하지 못할 뿐만 아니라, MTT를 통한 생존력 분석 후에는 독성으로 인해 추가적인 분석이 불가능해진다는 단점이 있다.

따라서, 동물시험을 하지 않으면서도 생체 내에 나타나는 염증 및 자극을 비교적 정확히 예측할 수 있는 새로운 동물대체시험방법에 대한 필요성이 절실히 요구되고 있는 실정이다.

특허문헌 1. 대한민국 공개특허공보 제10-2007-0094111호

본 발명은 상술한 바와 같은 종래기술의 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로서, 본 발명의 목적은 실제 사람 피부와 유사하여, 피부 자극 정도를 정확히 평가할 수 있는 피부모사 칩을 제공하고자 하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 동물시험을 하지 않으면서도 생체 내에 나타나는 염증 및 자극을 비교적 정확히 예측할 수 있는 새로운 동물실험대체시험법을 제공하기 위한 것으로, 구체적으로 상기 피부모사 칩을 이용한 피부 자극 평가방법을 제공하고자 하는 것이다.

본 발명은 제1 플레이트와 상기 제1 플레이트의 내부로 제1 세포가 모이는 제1 배양부를 구비한 제1 레어층; 상기 제1 플레이트의 상부에 배치된 제2 플레이트, 상기 제2 플레이트의 내부로 제2 세포가 모이는 제2 배양부 및 상기 제1 배양부와 제2 배양부가 서로 연결되는 제2 레어층; 상기 제1 배양부와 상기 제2 배양부 사이에 배치되고, 상기 제1 세포와 상기 제2 세포 간의 혼합을 방지하면서 상기 제1 세포와 상기 제2 세포가 각각 분비물질과 미디어가 상호작용하도록 제1 다공성이 형성된 제1 미세막; 상기 제2 플레이트의 상부에 배치된 제3 플레이트와 상기 제3 플레이트의 내부로 제3 세포가 모이는 제3 배양부, 상기 제2 배양부와 제3 배양부가 서로 연결되는 제3 레어층; 및 상기 제2 배양부와 상기 제3 배양부 사이에 배치되고, 상기 제2 세포와 상기 제3 세포 간의 혼합을 방지하면서 상기 제2 세포와 상기 제3 세포가 각각 분비물질과 미디어가 상호작용하도록 제2 다공성이 형성된 제2 미세막;을 포함하되, 상기 제1 다공성의 하면에는 상기 제1 세포가 부착되고, 상기 제1 세포의 상기 분비물질이 상기 제2 배양부로 공급되고, 상기 제3 레어층은 상기 제3 배양부를 사이에 두고 형성되어 유로를 통해 상기 제3 배양부와 각각 연결되는 주입구 및 배출구와, 상기 주입구 및 배출구와 이웃하게 형성되어 상기 제1 배양부 및 상기 제2 배양부로 각각 세포를 공급하거나 배출시키는 복수의 관통구를 포함하며, 상기 제1 배양부와 상기 제2 배양부 및 상기 제3 배양부는 동일한 타원의 평면형상을 가지고 높이방향으로 동일 위치에 배치되며, 상기 제1 배양부와 상기 제2 배양부 및 상기 제3 배양부 각각은 높이가 50 내지 1000 ㎛이고, 장축의 길이가 15 내지 20 ㎜이며, 단축의 길이가 장축 길이의 0.8 내지 0.9배인 것을 특징으로 하는 피부모사 칩을 제공한다.

또한, 상기 제1 레어층은, 상기 제1 플레이트의 하면에 형성된 함몰홈을 더 포함하며, 상기 제1 플레이트의 하방에서 볼때 상기 함몰홈의 내부에 상기 제1 배양부가 위치되는 것일 수 있다.

또한, 제1 다공성의 하면에는 상기 제1 세포가 부착되고, 상기 제1 세포의 상기 분비물질이 상기 제2 배양부로 공급되고, 상기 제1 세포는 제대정맥혈관 내피세포(endothelial cell)이고, 상기 제2 세포는 섬유아세포(fibroblast), 콜라겐 세포 및 이들의 혼합물이며, 상기 제3 세포는 케라틴 세포(keratinocyte)일 수 있다.

또한, 상기 제1 배양부, 제2 배양부 및 제3 배양부로 각각 제1 세포, 제2 세포 및 제3 세포가 주입되면, 상기 제1 배양부, 제2 배양부 및 제3 배양부의 내부에는 상기 분비물질 및 미디어가 확산되어 상호작용한다.

또한, 상기 제1, 제2 미세막의 지름은 0.4 내지 1.0 ㎛이고, 두께는 10 내지 15 ㎛일 수 있다.

또한, 상기 제1 및 제3 플레이트의 평균 두께는 4 내지 7 ㎜일 수 있다.

또한, 상기 제2 플레이트의 평균 두께는 0.5 내지 1.0 ㎛일 수 있다.

본 발명은 동물시험을 하지 않으면서도 생체 내에 나타나는 염증 및 자극을 비교적 정확히 예측할 수 있는 새로운 동물대체시험법에 관한 것으로, 기존 동물실험을 대체할 수 있는 피부 자극 평가방법을 제공하고자 하는 것이다. 구체적으로 본 발명은 다음 단계들을 포함하는 피부 자극 평가방법을 제공한다.

a) 상기 제1항에 따른 피부모사 칩을 준비하는 단계;

b) 상기 피부모사 칩의 제3 배양부에 시험물질을 처리하는 단계;

c) 상기 b) 단계로부터 얻은 피부모사 칩의 제3 배양부에 세포생존율(viability)을 측정하는 단계;

d) 상기 c) 단계의 피부모사 칩의 제3 배양부와 제2 배양부로부터 상등액을 회수한 후, OD_450㎚(optical density)를 측정하고, 이를 통해 식 1에 의하여 세포 생존률(Cell viability, CV, %)을 산출하는 단계;

e) 상기 d) 단계의 피부모사 칩 세척하는 단계;

f) 상기 e) 단계의 피부모사 칩의 제1 배양부에 FITC-dxtran을 투입하고, 제2 배양부로부터 시료를 채취하여 형광세기를 측정하고, 식 2에 의하여 부종 정도(Edema, E)를 산출하는 단계; 및

g) 상기 세포 생존율과 부종 정도를 통해 하기 식 3에 의하여 상기 시험물질의 피부 자극정도(p 값)를 산출하는 단계.

[식 1]

[식 2]

[식 3]

상기 식 3에서, score는 하기 식 4로부터 산출된다.

[식 4]

또한, 상기 시험물질의 피부 자극정도(p 값)가 0.3 내지 0.7이면 피부 자극성을 나타내는 피부 자극성 물질로 분류할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 피부 자극 평가 방법을 활용한 피부 안전 소재의 스크리닝 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 제1, 제2, 제3 세포는 피측정자로부터 유래된 것을 특징으로 하는 상기 피부 자극 평가 방법을 활용한 개인 맞춤형 피부 안전 소재의 스크리닝 방법을 제공한다.

본 발명의 특징 및 이점들은 첨부도면에 의거한 다음의 상세한 설명으로 더욱 명백해질 것이다. 이에 앞서, 본 명세서 및 청구범위에 사용된 용어나 단어는 통상적이고, 사전적인 의미로 해석되어서는 아니 되며, 발명자가 그 자신의 발명을 가장 최선의 방법으로 설명하기 위해 용어의 개념을 적절하게 정의할 수 있다는 원칙에 입각하여 본 발명의 기술적 사상에 부합되는 의미와 개념으로 해석되어야만 한다.

본 발명에 따른 피부모사 칩은 실제 인체 피부의 각 층을 모사할 수 있을 뿐만 아니라, 현재 동물실험을 대체할 수 있는 시험법으로 각광받는 시험관 측정법보다 부종에 대한 추가적인 모사도 가능하며, 이를 통해 시험물질에 대한 전체적인 피부 자극정도를 정확하게 산출, 비교할 수 있다.

본 발명에 따른 피부모사 칩과 이를 이용한 평가방법은 세포 생존율(독성)과 FITC-dextran를 이용한 paracellular transport도 측정할 수 있으므로, 이를 통해 피부 자극성 정도를 명확하게 적용할 수 있다. 게다가 상기 두가지 평가로 도출된 값을 이용하여 logistic model에 적용, 전체적인 시험물질의 자극성 여부를 판단할 수 있다.

이러한 본 발명에 의해 종래 알려진 다양한 화학물질, 화장품, 식약품, 의류 소재에 대한 피부 자극성 여부를 객관적이고 정확하게 파악할 수 있어 피부 자극에 대한 품질 표준화가 가능하게 되며, 소비자는 자신에게 적절한 소재를 선택할 수 있게 된다.

도 1은 본 발명에 따른 피부모사 칩의 사시도이다.
도 2는 도 1에 대한 조립도이다.
도 3은 도 1에 대한 평면도로, 도 3a는 제1 레어층(100)에 대한 평면도이고, 도 3b는 제2 레어층(200)에 대한 평면도이며, 도 3c는 제3 레어층(300)에 대한 평면도이다.
도 3d는 함몰홈(140)이 추가 구비된 제1 레어층(100)을 갖는 피부모사 칩의 조립도이다.
도 3e는 함몰홈(140)이 추가 구비된 제1 레어층(100)에 대한 사시도이다.
도 4는 본 발명의 다른 실시예에 따른 피부모사 칩의 실험 방법 예시도이다.
도 5는 도 4에 각층별 세포의 실사진이다.
도 6은 도 1의 실사용 예시도이다.
도 7은 도 1에 따른 피부모사 칩으로부터 세포 생존율(CV) 평가 방법 예시도이다.
도 8은 도 1에 따른 피부모사 칩으로부터 부종(E) 평가 방법 예시도이다.
도 9는 도 1에 따른 피부모사 칩으로부터 세포 생존율(CV) 평가 방법으로 측정한 30종 시험물질에 대한 세포 생존율 결과 산점도이다.
도 10은 도 1에 따른 피부모사 칩으로부터 부종(E) 평가 방법으로 측정한 30종 시험물질에 대한 부종(Edema, E) 결과 산점도이다.
도 11은 도 1에 따른 피부모사 칩으로부터 Logistic Model 평가 방법으로 측정한 30종 시험물질에 대한 Logistic Model 결과 산점도이다.

본 발명의 목적, 특정한 장점들 및 신규한 특징들은 첨부된 도면들과 연관되는 이하의 상세한 설명과 바람직한 실시예로부터 더욱 명백해질 것이다. 본 명세서에서 각 도면의 구성요소들에 참조번호를 부가함에 있어서, 동일한 구성 요소들에 한해서는 비록 다른 도면상에 표시되더라도 가능한 한 동일한 번호를 가지도록 하고 있음에 유의하여야 한다. 또한, 제1, 제2 등의 용어는 다양한 구성요소들을 설명하는데 사용될 수 있지만, 상기 구성요소들은 상기 용어들에 의해 한정되어서는 안 된다. 상기 용어들은 하나의 구성요소를 다른 구성요소로부터 구별하는 목적으로만 사용된다. 또한, 본 발명을 설명함에 있어서, 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명은 생략한다.

이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 바람직한 일실시예를 상세히 설명하기로 한다. 도 1은 본 발명의 일실시예에 따른 피부모사 칩의 사시도, 도 2는 도 1에 대한 조립도, 도 3은 도 1에 대한 평면도로, 도 3a는 제1 레어층(100)에 대한 평면도이고, 도 3b는 제2 레어층(200)에 대한 평면도이며, 도 3c는 제3 레어층(300)에 대한 평면도이며, 도 3d는 함몰홈(140)이 추가 구비된 제1 레어층(100)을 갖는 피부모사 칩의 조립도이며, 도 3e는 함몰홈(140)이 추가 구비된 제1 레어층(100)에 대한 사시도이다. 도 4는 본 발명의 다른 일실시예에 따른 피부모사 칩의 실험 방법 예시도, 도 5는 도 4에 각층별 세포의 실사진, 도 6은 도 1의 실사용 예시도이다.

도 1 내지 3을 참조하여 설명하면, 본 발명의 일실시예에 따른 피부모사 칩(10)은, 제1 플레이트(111)와 상기 제1 플레이트(111)의 내부로 제1 세포(500)가 모이는 제1 배양부(130)를 구비한 제1 레어층(100); 상기 제1 플레이트(111)의 상부에 배치된 제2 플레이트(211)와 상기 제2 플레이트(211)의 내부로 제2 세포(600)가 모이는 제2 배양부(230) 및 상기 제1 배양부(130)와 제2 배양부(230)가 서로 연결되는 제2 레어층(200); 상기 제1 배양부(130)와 상기 제2 배양부(230) 사이에 배치되고, 상기 제1 세포(500)와 상기 제2 세포(600) 간의 혼합을 방지하면서 상기 제1 세포(500)와 상기 제2 세포(600)간의 분비물질이 상호작용하도록 제1 다공성(410)이 형성된 제1 미세막(400); 상기 제2 플레이트(211)의 상부에 배치된 제3 플레이트(311)와 상기 제3 플레이트(311)의 내부로 제3 세포(700)가 모이는 제3 배양부(330), 상기 제2 배양부(230)와 제3 배양부(330)가 서로 연결되는 제3 레어층(300); 및 상기 제2 배양부(230)와 상기 제3 배양부(330) 사이에 배치되고, 상기 제2 세포(600)와 상기 제3 세포(700) 간의 혼합을 방지하면서 상기 제2 세포(600)와 상기 제3 세포(700) 간의 분비물질이 상호작용하도록 제2 다공성(431)이 형성된 제2 미세막(430);을 포함한다.

도 1 내지 3을 참조하여 설명하면, 제1 레어층(100)은 제1 플레이트(111), 제1 주입구(110), 제1 배양부(130) 및 제1 배출구(150)를 포함한다. 제1 플레이트(111)는 일측에 제1 주입구(110)가 형성되고, 타측에 제1 배출구(150)가 형성된다. 제1 플레이트(111)는 제1 주입구(110)와 제1 배출구(150) 사이에는 제1 배양부(130)가 형성된다. 또한, 제1 플레이트(111)는 평면으로 형성되는 것이 적절하다. 이때, 제1 주입구(110), 제1 배양부(130) 및 제1 배출구(150)는 포토레지스트 공정을 이용하여 제1 플레이트(111) 내부로 음각되어 형성될 수도 있다. 이는, 제1 주입구(110), 제1 배양부(130) 및 제1 배출구(150)의 생성공정을 포토레지스트 공정으로 한정하기 위함은 아니다. 제1 플레이트(111)는 몰드 방식으로 제작되어 대량으로 생산될 수도 있다.

상기 제1 레어층(100)은, 상기 제1 플레이트(111)의 하면에 형성된 함몰홈(140)을 더 포함하며, 상기 제1 플레이트(111)의 하방에서 볼때 상기 함몰홈(140)의 내부에 상기 제1 배양부(130)가 위치되도록 함으로써, 현미경 등의 이미지 장치에서 고배율 관찰 및 분석 효율을 높이고, 바닥의 접촉 면적을 최소화하여 칩의 외관 상태를 장시간 양호하게 유지시키는 효과를 갖도록 할 수 있다. 상기 함몰홈(140)을 형성함으로써, 상기 제1 배양부(130)가 위치한 제1 플레이트(111)의 두께를 3.5 내지 6.7 mm가 되도록 할 수 있다. 상기 함몰홈(140)이 형성된, 상기 제1 배양부(130)가 위치한 제1 플레이트(111)의 두께가 3.5 mm 미만이면 외부 압력에 의해 제1 배양부(130)가 쉽게 파손될 수 있기 때문에 바람직하지 않다(도 3d, e).

제1 플레이트(111)의 재질은 폴리디메티실록산(PDMS:polydimethylsiloxane), 에폭시(epoxy), 폴리머(polymer), 폴리카보네이트(PC:polycarbnonate), 폴리메틸메타크릴레이트(PMMA:Polymethylmethacrylate), 폴리스티렌(PS:polystyrene), 환형 올레핀 공중합체(cyclo olefin copolymer, COC) 중 어느 하나의 재질 또는, 이들 중 둘 이상이 혼합된 재질로 이루어져서 제작된다. 제1 플레이트(111)는 투명재질을 사용하는 것이 적절하다. 이는, 제1 플레이트(111)의 내부를 관측하기 위함이다. 즉, 제1 플레이트(111)는 제1 세포(500)의 성장 과정을 관측할 수 있다(도 5d 참조).

상기 제1 플레이트(111)의 평균 두께는 4 내지 7 ㎜인 것이 바람직한데, 이는 특정 제1 세포를 배양하고, 이로부터 시료의 채취가 용이한 두께 요건으로, 상기 범위를 초과하거나 만족하지 못할 경우에는 추후 평가를 위한 시험물질의 투여 및 채취가 어려워지는 문제가 발생할 수 있다.

제1 주입구(110)는 제1 플레이트(111)의 일측에서 제1 세포(500)을 주입한다. 즉, 제1 주입구(110)는 제1 플레이트(111)의 내부로 형성되고, 유로에 연결된다. 이때, 제1 주입구(110)는 유로에 연결되어 제1 세포(500)를 제1 배양부(130)로 이동한다. 제1 주입구(110)는 후술할 제1 관통구(220)에 연결된다.

상기 제1 주입구(110)의 평균 직경은 0.5 내지 1.5 ㎛일 수 있다.

이때, 상기 유로는 높이 0.5 내지 1 ㎛, 평균 직경 0.5 내지 1.5 ㎛인 것이 바람직한데, 상기 유로의 크기는 배양액과 다양한 용액의 주입과 제거가 용이하기 위해 요구되는 유동 조건을 충족하기 위한 것이다. 유로의 크기가 상기 조건보다 작을 경우에는 내부의 유입과 배출이 어려워 강한 압력을 가해져야 하므로, 강한 압력에 의한 교차오염이 발생할 수 있고, 클 경우에는 외부 압력에 의해 쉽게 각 층의 교차 오염이 발생할 수 있다.

제1 배출구(150)는 제1 플레이트(111)의 타측에서 제1 세포(500)를 외부로 배출한다. 즉, 제1 배출구(150)는 유로에 연결되고, 제1 배양부(130)에 연결되면 제1 세포(500)를 외부로 배출하기 위한 통로역할을 한다.

상기 제1 배출구(150)의 평균 직경은 0.5 내지 1.5 ㎛일 수 있다.

제1 배양부(130)는 제1 플레이트(111) 내부에 원기둥으로 형성되고, 제1 주입구(110)와 제1 배출구(150) 사이에 형성된다. 이때, 제1 배양부(130)는 사각기둥, 다각기둥 및 반원 기둥으로 다양하게 형성될 수 있음을 밝혀 둔다. 제1 배양부(130)는 제1 주입구(110)와 제1 배출구(150)에 각각 연결된다. 제1 배양부(130)는 제1 세포(500)가 성장하기 위한 공간을 제공한다. 이때, 상기 제1 배양부(130)와 상기 제2 배양부(230) 및 상기 제3 배양부(330)는 동일한 타원의 평면형상을 가지고 높이방향으로 동일 위치에 배치되는 것이 적절하다(도 3을 참조).

상기 제1 배양부(130)는 반원 기둥인 것이 바람직하고, 상기 제1 배양부(130) 내에서 시험물질 및 시약이 세포와 균등하게 적용 및 배양되기 위해서는 타원형의 반원 기둥인 것이 보다 바람직하며, 상기 제1 배양부(130)는 높이는 50 내지 1000 ㎛이고, 장축의 길이는 15 내지 20 ㎜이며, 단축의 길이는 장축 길이의 0.8 내지 0.9 배인 것이 가장 바람직하다. 즉, 상기 제1 배양부(130)의 높이, 장축 길이 및 단축의 길이 조건을 만족할 경우 평가 방법의 재현성이 현저히 향상됨을 알 수 있다.

즉, 제1 플레이트(111)의 횡단면을 기준으로, 제1 배양부(130), 제2 배양부(230) 및 제3 배양부(350)는 동일한 타원의 평면형상을 가지고, 높이방향으로 동일 위치에 배치된다. 따라서 제1 배양부(130), 제2 배양부(230) 및 제3 배양부(350)는 면적이 동일하게 형성된다. 이는, 제1 배양부(130) 면적, 제2 배양부(230) 면적 및 제3 배양부(350) 면적이 동일하고, 각층별로 세포의 성장을 보다 정확하게 제어 및 확인할 수 있다(도 5a 참조).

상기 제2 배양부(230), 제3 배양부(350) 역시 타원형의 반원 기둥인 것이 바람직하며, 가장 바람직하게는 제1 배양부(130)와 높이, 장축 길이 및 단축의 길이 조건이 모두 동일하면서, 동일 위치에 배치되는 것일 수 있다.

상기 배양부의 면적이 상이하거나, 조금이라고 위치가 벗어날 경우, 멤브레인 결합시, 각 층의 결합 부위가 일정하지 않아 불량이 발생할 수 있다. 이에, 횡단면을 기준으로, 제1 배양부, 제2 배양부, 제3 배양부의 면적이 동일하게 설계되는 것이, 각 층에 분포하는 세포의 수 그리고 반응하는 독성물질의 양을 균일화함으로써, 재현성이 있는 데이터를 유도하는 장점을 갖도록 할 수 있다.

제1 배양부(130)의 내부에는 제1 미세막(400)을 지지하기 위해, 제1 플레이트(111)로부터 제1 미세막(400)까지 연장되어 있는 돌출부가 적어도 하나 이상 형성될 수 있다. 그러나 돌출부가 형성되는 경우, 약물 분포가 제1 배양부(130) 내에 균일하게 분포되지 않는다는 큰 단점이 있으므로, 제1 배양부(130) 내부에는 제1 미세막(400)을 지지하기 위한 돌출부와 같은 구조물이 구비하지 않는 것이 바람직하다. 본 발명의 일실시예에 따른 피부모사 칩(10)은 제1 배양부(130) 내부에 별도의 구조물이나 돌출부없이도, 제1 배양부(130), 제2 배양부(230) 및 제3 배양부(350)가 동일한 면적, 동일한 형태를 가지고 있어, 서로 밀착되므로, 제1 미세막(400)이 제1 배양부(130)와 제2 배양부(230)에 고정되어 있을 수 있다.

도 1 내지 3을 참조하여 설명하면, 제2 레어층(200)은 제1 레어층(100)의 상부에 배치된다. 제2 레어층(200)은 제2 플레이트(211)와 제2 배양부(230)를 포함한다.

제2 플레이트(211)는 제2 주입구(210), 제2 배양부(230) 및 제2 배출구(250)를 형성한다. 이때, 제2 플레이트(211)는 제2 주입구(210), 제2 배양부(230) 및 제2 배출구(250)가 관통되어 형성된다. 제2 플레이트(211)는 일측에 제2 주입구(210)가 형성되고, 타측에 제2 배출구(250)가 형성된다. 제2 플레이트(211)는 제2 주입구(210)와 제2 배출구(250) 사이에는 제2 배양부(230)가 형성된다. 또한, 제2 플레이트(211)는 평면으로 형성되는 것이 적절하다. 이때, 제2 주입구(210), 제2 배양부(230) 및 제2 배출구(250)는 포토레지스트 공정을 이용하여 제2 플레이트(211)를 관통하여 형성된다. 이는, 제2 주입구(210), 제2 배양부(230) 및 제2 배출구(250)의 생성공정을 포토레지스트 공정으로 한정하기 위함은 아니다. 제2 플레이트(211)는 몰드 방식으로 제작되어 대량으로 생산될 수도 있다.

제2 플레이트(211)의 재질은 제1 플레이트(111) 재질과 동일하게 형성되는 것이 적절하다. 제2 플레이트(211)는 투명재질을 사용하면서, 제1 세포(500)와 제2 세포(600) 간에 발생하는 상호작용을 관측한다. 제2 플레이트(211)의 일측은 제1 관통구(220)가 형성된다. 제1 관통구(220)는 제1 주입구(110)와 제1 배출구(150)에 연결된다. 제1 관통구(220)는 후술할 제2 관통구(320)에 연결된다.

상기 제1 관통구(220), 제2 관통구(320), 제2 주입구(210) 및 제2 배출구(250)의 평균 직경은 0.5 내지 1.5 ㎛일 수 있다.

상기 제2 플레이트(211)의 평균 두께는 0.5 내지 1.5 ㎛인 것이 바람직하다. 상기 제2 플레이트(211)는 제2 세포가 배양되는 제2 배양부(230)의 공간이 되므로, 피부조직에서 제2 세포의 두께 요건과 일치되도록 설계 제조되는 것이 바람직하기 때문에, 평균 두께는 0.5 내지 1.5 ㎛인 것이 좋다.

제2 주입구(210)는 제2 플레이트(211)의 일측에서 제2 세포(600)를 주입한다. 즉, 제2 주입구(210)는 제2 플레이트(211)의 내부로 형성되고, 유로에 연결된다. 제2 주입구(210)는 유로에 연결되어 제2 세포(600)를 제2 배양부(230)로 이동한다. 제2 배출구(250)는 제2 플레이트(211)의 타측에서 제2 세포(600)를 외부로 배출한다. 즉, 제2 배출구(250)는 유로에 연결된다. 제2 배출구(250)는 제2 배양부(230)에 연결되고, 제2 세포(600)를 외부로 배출하기 위한 통로역할을 한다.

제2 배양부(230)는 제2 플레이트(211) 내부에 원기둥으로 형성되고, 제2 주입구(210)와 제2 배출구(250) 사이에 형성된다. 이때, 제2 배양부(230)는 사각기둥, 다각기둥 및 반원 기둥으로 다양하게 형성될 수 있음을 밝혀 둔다. 제2 배양부(230)는 제2 주입구(210)와 제2 배출구(250)에 각각 연결된다. 제2 배양부(230)는 제2 세포(600)가 성장하기 위한 공간을 제공한다.

제2 배양부(230)는 제1 배양부(130)와 제3 배양부(330) 사이에 배치되면서, 제1 배양부(130)와 제3 배양부(330)를 연결해 준다. 즉, 제2 배양부(230)는 제1 배양부(130)와 제3 배양부(330)내로 세포 분비물 및 미디어가 확산하기 위한 통로 역할을 한다.

도 2 또는 도 4를 참조하여 설명하면, 제1 미세막(400)은 제1 배양부(130)와 제2 배양부(230) 사이에 배치되고, 중앙에 제1 다공성(410)이 형성된다. 제1 다공성(410)은 제1 세포(500)와 제2 세포(600)의 분비물질과 미디어를 통과시키는 역할을 한다. 즉, 제1 다공성(410)은 제1 세포(500)와 제2 세포(600)가 섞이는 것을 방지하면서, 제1 세포(500)와 제2 세포(600)에서 발생한 분비물질이 이동하는 통로역할을 한다.

제1 다공성(410)의 지름은 서로 다른 세포가 이동하지 않도록 수십 나노로 형성될 수도 있다. 예를 들어 설명하면, 제1 세포(500)는 제대정맥혈관 내피세포를 사용하고, 제2 세포(600)는 섬유아세포 및 콜라겐을 사용하는 것이 적절하다. 제1 다공성(410)의 지름은 제1 세포(500)와 제2 세포(600)보다 작도록 형성된다. 즉, 제1 다공성(410)의 지름은 제대정맥혈관 내피세포, 섬유아세포 및 콜라겐보다 작도록 형성된다. 이때, 제1 다공성(410)의 지름은 1.5 ㎛, 바람직하게는 1.0 ㎛이하로 형성되는 것이 적절하다. 즉, 제1 다공성(410)의 지름은 제1 세포(500)와 제2 세포(600)가 주입된 세포의 크기에 따라 조절 가능하나. 가장 바람직하게는 0.4 내지 1.0 ㎛일 수 있다. 또한, 상기 제1 미세막(400)의 평균 두께는 10 내지 15 ㎛로, 칩 내부 및 외부의 압력에 의해 쉽게 파손 및 손상되지 않도록 두께 요건을 맞추는 것이 바람직하다.

제1 미세막(400)의 하면에는 제1 세포(500)가 부착되고, 제2 세포(600)로 미디어, 분비물질 및 싸이토카인을 공급한다(도 4a 참조). 이는, 제1 미세막(400)의 하면에 제1 세포(500)가 부착되고 제1 다공성(410)을 통과하면서 안정되게 제2 배양부(230)로 미디어 및 싸이토카인을 포함하는 분비물질을 공급하기 위함이다. 만약, 제1 세포(500)가 제1 배양부(130)의 하면에 부착되면, 제1 미세막(400)과 제1 세포(500)간에 거리간격이 발생하여 원할한 공급이 되지 못한다.

또한, 제1 미세막(400)의 재질은 폴리카보네이트(PC:Polycarbonate, 도 7b 참조) 및 폴리에스테르(PET:polyester, 도 7a 참조) 중에 하나로 이루어지는 것이 적절하다. 제1 미세막(400)의 테두리를 따라 접착제가 형성된다. 접착제는 제1 플레이트(111)와 제2 플레이트(211)를 접착한다.

도 1 내지 3을 참조하여 설명하면, 제3 레어층(300)은 제3 플레이트(311), 제3 주입구(310), 제3 배양부(330) 및 제3 배출구(350)를 포함한다.

제3 플레이트(311)는 일측에 제3 주입구(310)가 형성되고, 타측에 제3 배출구(350)가 형성된다. 제3 플레이트(311)는 제3 주입구(310)와 제3 배출구(350) 사이에는 제3 배양부(330)가 형성된다. 또한, 제3 플레이트(311)는 평면으로 형성되는 것이 적절하다. 이때, 제3 주입구(310), 제3 배양부(330) 및 제3 배출구(350)는 포토레지스트 공정을 이용하여 제3 플레이트 내부로 음각되어 형성될 수도 있다. 이는, 제3 주입구(310), 제3 배양부(330) 및 제3 배출구(350)의 생성공정을 포토레지스트 공정으로 한정하기 위함은 아니다. 제3 플레이트(311)는 몰드 방식으로 제작되어 대량으로 생산될 수도 있다.

제3 플레이트(311) 재질은 제1 플레이트(111) 및 제2 플레이트(211)의 재질과 동일하게 사용한다. 이때, 제3 플레이트(311)는 투명재질을 사용하는 것이 적절하다. 이는, 제3 플레이트(311)의 내부를 관측하기 위함이다. 즉, 제3 플레이트(311)는 제1 세포(500), 제2 세포(600) 및 제3 세포(700)의 세포성장을 각각 관측하기 위함이다(도 5를 참조).

제3 플레이트(311)는 제1 주입구(110)와 제1 배출구(150)에 각각 연결되는 제1 관통구(220)와 연결된 제2 관통구(320)가 형성된다. 제3 플레이트(311)는 제2 주입구(210)와 제2 배출구(250)에 각각 연결되는 제3 관통구(340)가 형성된다. 제2 관통구(320)와 제3 관통구(340)는 각각의 세포를 주입하기 위한 통로 및 배출구로 사용된다.

상기 제2 관통구(320), 제3 관통구(340)의 평균 직경은 0.5 내지 1.5 ㎛일 수 있다.

상기 제3 플레이트(311)의 평균 두께는 4 내지 7 ㎜인 것이 바람직한데, 이는 특정 제3 세포를 배양하고, 이로부터 시료의 채취가 용이한 두께 요건으로, 상기 범위를 초과하거나 만족하지 못할 경우에는 추후 평가를 위한 시험물질의 투여 및 채취가 어려워지는 문제가 발생할 수 있다.

제3 주입구(310)는 제3 플레이트(311)의 일측에서 제3 세포(700)를 주입한다. 즉, 제3 주입구(310)는 제3 플레이트(311)의 내부로 형성되고, 유로에 연결된다. 제3 주입구(310)는 유로에 연결되어 제3 세포(700)를 제3 배양부(330)로 이동한다.

제3 배출구(350)는 제3 플레이트(311)의 타측에서 제3 세포(700)를 외부로 배출한다. 즉, 제3 배출구(350)는 유로에 연결된다. 즉, 제3 배출구(350)는 제3 배양부(330)에 연결되어 제3 세포(700)를 외부로 배출하기 위한 통로역할을 한다.

상기 제3 주입구(310), 제3 배출구(350)의 평균 직경은 0.5 내지 1.5 ㎛일 수 있다.

제3 배양부(330)는 제3 플레이트(311) 내부에 원기둥으로 형성되고, 제3 주입구(310)와 제3 배출구(350) 사이에 형성된다. 이때, 제3 배양부(330)는 사각기둥, 다각기둥 및 반원 기둥으로 다양하게 형성될 수 있음을 밝혀 둔다. 제3 배양부(330)는 제3 주입구(310)와 제3 배출구(350)에 각각 연결된다. 제3 배양부(330)는 제3 세포(700)가 성장하기 위한 공간을 제공한다.

제3 배양부(330)의 내부에는 약물의 균일한 분포를 위해, 별도의 구조물이나 돌출물이 존재하지 않는 것이 적절하다.

도 3을 참조하여 설명하면, 제3 배양부(330)의 면적은 제2 배양부(230)와 제1 배양부(130)의 면적과 동일하게 형성된다. 예를 들어 설명하면, 제3 배양부(330)의 지름은 18 ㎜로 형성되면, 제2 배양부(230) 지름은 18 ㎜ 및 제1 배양부(130) 지름은 18 ㎜로 형성되는 것이 적절하다. 이는, 각각의 배양부 별로 세포들 간의 상호작용 및 성장과정을 간섭현상을 방지하고, 서로 밀착 배치되어 제1 미세막(400)과 제2 미세막(430)이 지지될 수 있도록 한다.

제2 미세막(430)은 제2 배양부(230)와 제3 배양부(330) 사이에 배치되고, 중앙에 제2 다공성(431)이 형성된다. 제2 다공성(431)은 제2 세포(600)와 제3 세포(700)의 분비물질 및 미디어를 통과시키는 역할을 한다. 즉, 제2 다공성(431)은 제2 세포(600)와 제3 세포(700)가 섞이는 것을 방지하면서, 제2 세포(600)와 제3 세포(700)에서 발생한 분비물질과 미디어가 이동하면서 상호 작용한다.

제2 다공성(431)의 지름은 서로 다른 세포가 이동하지 않도록 수십 나노로 형성될 수도 있다. 예를 들어 설명하면, 제2 세포(600)는 섬유아세포와 케라틴세포를 사용하고, 제3 세포(700)는 케라틴세포를 사용하는 것이 적절하다. 즉, 제2 다공성(430)의 지름은 섬유아세포, 케라틴세포보다 작도록 형성된다. 이때, 제2 다공성(431)의 지름은 1.5 ㎛이하, 바람직하게는 1.0 ㎛이하로 형성되는 것이 적절하다. 즉, 제2 다공성(431)의 지름은 주입되는 제2 세포(600)와 제3 세포(700)의 크기에 따라 조절 가능하나, 가장 바람직하게는 0.4 내지 1.0 ㎛일 수 있다. 또한, 상기 제2 미세막(430)의 평균 두께는 10 내지 15 ㎛로, 칩 내부 및 외부의 압력에 의해 쉽게 파손 및 손상되지 않도록 두께 요건을 맞추는 것이 바람직하다.

제2 미세막(430)의 재질은 제1 미세막(400)과 동일한 재질을 사용하는 것이 적절하다. 제2 미세막(430)의 테두리를 따라 접착제가 형성된다. 접착제는 제2 플레이트(211)와 제3 플레이트(311)를 접착한다.

도 4 내지 6을 참조하여 설명하면, 본 발명의 일실시예에 따른 피부모사 칩과 동일 구성요소는 생략하고, 피부모사 칩의 실험방법을 자세히 설명한다. 본 발명의 다른 일실시예에 따른 피부모사 칩을 이용한 피부생성 방법은, 피부모사 칩(10)에 제1 세포(500)를 주입하는 단계; 상기 피부모사 칩(10)을 뒤집어서 제1 세포(500)를 제1 미세막(400)에 부착시키고, 상기 피부모사 칩(10)을 원위치하는 단계; 상기 피부모사 칩(10)에 제2 세포(600)를 주입하는 단계; 및 상기 피부모사 칩(10)에 제3 세포(700)를 주입하는 단계를 포함한다.

우선, 제1 세포(500)는 제대정맥혈관 내피세포를 사용한다. 제대정맥혈관 내피세포(HUVEC)는 일반적으로 콜라게나아제-두-단계(collagenase-two-step)방법을 이용하여 분리된 세포를 사용한다. 제2 세포(600)는 섬유아포 및 콜라겐을 사용한다. 섬유아세포는 일반적으로 사람 피부로부터 얻었으며 트립신/이디티에이(trypsin/EDTA) 처리를 하여 계대배양을 하여 얻는다. 제3 세포(700)는 케라틴세포를 사용한다. 케라틴 세포는 일반적으로 0.25% 트립신(trypsin)(Difco 1: 250; Gibco), 0.02% EDTA and 0.1% 글루코스(glucose)를 포함한 용액으로 트립신 처리를 하여 배양하였으며 세포들은 페트리디시에 계대배양을 하여 사용한다. 이는, 제1 세포(500), 제2 세포(600) 및 제3 세포(700)의 종류를 한정하지 않음을 밝혀둔다.

피부모사 칩(10)의 내부를 멸균시킨다. 이후, 피부모사 칩(10)에 제1 세포(500)를 주입한다. 이때, 제1 세포(500)인 제대정맥혈관 내피세포를 파이펫을 이용하여 제1 주입구(110)에 주입한다(도 4b, 도 5a 참조). 제1 세포(500)가 제1 배양부(250)에 충진된다.

피부모사 칩(10)을 뒤집어서 제1 세포(500)를 제1 미세막(400)에 부착시킨다. 이때, 제1 세포(500)는 제1 다공성(410)에 부착할 수 있도록 뒤집어서 30분에서 4시간을 유지한다. 또한, 피부모사 칩(10)을 뒤집은 상태로 37 ℃ 의 5% CO₂ 인큐베이터에서 8시간 인큐베이션을 사용할 수도 있다. 제1 세포(500)가 제1 다공성(410)에 부착되면 피부모사 칩(10)을 원위치한다.

피부모사 칩(10)에 제2 세포(600)를 주입한다(도 4c, 도 5b 참조). 제2 배양부(230)에 제2 세포(600)가 모이면, 제1 세포(500)와 제2 세포(600)는 제1 다공성(410)을 통과한 분비물과 미디어를 통해 상호 작용을 한다. 즉, 제2 세포(600)와 제1 세포(500)는 제1 다공성(410)을 통과하여 세포 분비물과 미디어가 공급된다.

피부모사 칩(10)에 제3 세포(700)를 주입한다(도 4d 및 도 5c 참조). 제3 배양부(330)에 제3 세포(700)가 충진되면, 제2 세포(600)와 제3 세포(700)는 제2 다공성(431)을 통과한 분비물과 미디어를 통해 상호 작용을 한다. 즉, 제2 세포(600)와 제3 세포(700)는 제2 다공성(431)을 통과하여 세포 분비물과 미디어가 공급된다. 이때, 제1 배양부(130), 제2 배양부(230) 및 제3 배양부(350)는 내부에서 확산현상을 통하여 분비물과 미디어가 전체적으로 공급되고 있다. 또한, 제1 주입구(110)와 제2 주입구(210) 및 제3 주입구(310)에서 각각 별도로 연속적으로 미디어를 공급해줄 수도 있다.

본 발명의 다른 측면은 동물시험을 하지 않으면서도 생체 내에 나타나는 염증 및 자극을 비교적 정확히 예측할 수 있는 새로운 동물대체시험방법으로, 기존 동물실험을 대체할 수 있는 피부 자극 평가방법을 제공하고자 하는 것이다. 구체적으로 본 발명은 다음 단계들을 포함하는 피부 자극 평가방법에 관한 것이다.

a) 피부모사 칩을 준비하는 단계;

c) 상기 b) 단계로부터 얻은 피부모사 칩의 제3 배양부에 CCK-8 용액을 처리하는 단계;

e) 상기 d) 단계의 피부모사 칩 세척하는 단계;

[식 1]

[식 2]

[식 3]

상기 식 3에서, score는 하기 식 4로부터 산출된다.

[식 4]

본 발명의 상기 a) 단계에서 피부모사 칩은 본 발명의 일실시예에 따른 피부모사 칩인 것을 특징으로 한다. 상기 피부모사 칩은 3층 구조의 실제 인체 피부 각 층을 모사할 수 있으며, 부종의 생리학적 모사까지 가능하므로, 동물실험을 대체하여 피부 자극성 정도를 평가할 수 있다.

다음, 상기 피부모사 칩(10)의 제3 배양부(330)에 시험물질을 처리한다(b 단계). 상기 시험물질은 피부 자극성 여부를 판정받기 위한 어떠한 물질이라도 제한되지 않으며, 생체물질, 유전자 재조합 물질, 합성 화합물 등의 여부에 관계없으며, 또한 이들로 한정되지 않는다.

시험물질의 처리는, 피부 자극성을 갖는 여부를 판정받기 위한 물질을 준비하고, 이를 파이펫으로 피부모사 칩(10)의 제3 배양부(330)와 연결된 제3 주입구(310)에 주입한다(도 2, 도 7a 및 도 8a 참조).

상기 b) 시험물질 처리 단계는, 시험물질에 따라 반응시간 및 온도를 적절히 제어할 수 있음을 밝혀 둔다. 바람직하게 상기 시험물질은 1 내지 10 분간 수행되는 것이 바람직하다.

상기 c) 단계를 수행하기 이전에, b') 시험물질이 처리된 피부모사 칩(10)을 PBS 또는 HBSS(Hanks' Balanced Salt Solution) 완충액을 사용하여 잔여물을 세척하는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 세척 단계는 최소 1회 이상 수행되는 것이 바람직하다. 상기 세척은 피부모사 칩(10)의 제3 배양부(330), 제2 배양부(230) 및 제1 배양부(130)를 각각 순차적으로 수행하는 것이 바람직하다.

다음 b'') 세척한 피부모사 칩(10)에 새로운 배지를 주입하는 하는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 배지는 세포에 따라 적절히 선택하여 사용될 수 있다. 본 단계에서는 제1 세포(500)에 통상적으로 사용가능한 배지라면 특별히 한정되지 않으나, 바람직하게 DMEM 배지일 수 있다.

이후, c) 상기 b) 단계로부터 얻은 피부모사 칩의 제3 배양부(330)에서 세포생존율(viability)을 측정한다. 상기 세포생존율 측정하는 방법은 일반적으로 세포생존율을 측정하는데 사용하는 방법이라면 특별히 제한되지 않는다. 예를 들어 MTT assay, MTS assay, WST-1 assay, XTT assay, Luminescent ATP assay 및 CCK-8 assay으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있고, 바람직하게는 CCK-8 용액을 사용할 수 있다.

구체적으로, b) 단계로부터 얻은 피부모사 칩(10)의 제3 배양부(330)에 세포생존율 측정용 시약을 처리한다. 세포생존율 측정용 시약의 처리는 앞서 시험물질과 동일하게 파이펫을 이용하여 피부모사 칩(10)의 제3 배양부(330)와 연결된 제3 주입구(310)에 주입한다(도 7b 참조). 상기 c) 단계의 조건은 세포생존율 측정용 시약을 이용한 세포 생존율 분석방법과 동일하게 수행할 수 있다. 바람직하게는 1 내지 5 시간동안, 20 내지 40 ℃에서 수행될 수 있다.

d) 상기 c) 단계의 피부모사 칩(10)의 제3 배양부(330)와 제2 배양부(230)로부터 상등액을 회수한 후, OD_450㎚(optical density)를 측정하고, 이를 통해 식 1에 의하여 세포 생존률(Cell viability, CV, %)을 산출한다(도 7c).

c) 단계의 피부모사 칩(10)의 제3 배양부(330)와 제2 배양부(230)로부터 상등액을 회수하기 위해, 파이펫을 사용하여 제3 배출구(350);와 제2 배출구(250)과 연결된 제3 관통구(340)로부터 상등액을 회수하였다. 이때 상기 제3 배양부(330)로부터 회수한 상등액과 제2 배양부(230)로부터 회수한 상등액은 혼합 중량비가 1:1인 것이 바람직하다.

[식 1]

식 1에서, O.D treated는 회수한 상등액으로부터 측정된 OD값이고, O.D blank는 블랭크(blank)로부터 측정된 OD 값이다. O.D control은 대조구로부터 측정된 OD값이다.

e) 상기 d) 단계의 피부모사 칩(10)을 세척한다. 상기 d) 단계의 피부모사 칩(10)은 PBS 또는 HBSS(Hanks' Balanced Salt Solution) 완충액을 사용하여 잔여물을 세척할 수 있다. 상기 세척 단계는 최소 1회 이상 수행되는 것이 바람직하다. 상기 세척은 피부모사 칩(10)의 제3 배양부(330), 제2 배양부(230) 및 제1 배양부(130)를 각각 순차적으로 수행하는 것이 바람직하다.

f) 상기 e) 단계의 피부모사 칩(10)의 제1 배양부(130)에 FITC-dxtran을 투입하고, 제2 배양부(230)로부터 시료를 채취하여 형광세기를 측정하고, 식 2에 의하여 부종 정도(Edema, E)를 산출한다.

상기 e) 단계의 피부모사 칩(10)의 제1 배양부(130)에 FITC-dxtran 용액을 처리하기 위해, 앞서 시험물질과 동일하게 파이펫을 이용하여 피부모사 칩(10)의 제1 배양부(130)와 연결된 제1 주입구(110)에 주입한다(도 8a 참조). 상기 f) 단계의 조건은 FITC-dxtran을 이용한 통상의 분석방법과 동일하게 수행할 수 있다. FITC-dxtran의 처리하고, 제2 배양부(230)에서 FITC의 농도를 측정함으로써, 제3 배양부(330)에 존재하는 제3 세포의 밀착정도를 확인할 수 있다. 즉, 제2 배양부(230)에서 FITC에 의해 높은 형광세기가 관찰되면, 시험물질에 의해 제3 배양부(330)의 제3 세포들이 밀착되지 못하고 FITC-dextran을 투과함을 의미한다고 볼 수 있고, 이를 통해 시험물질 처리에 따른 피부의 부종 정도를 확인할 수 있다. 바람직하게는 1 내지 5 시간동안, 20 내지 40 ℃에서 수행될 수 있다.

FITC-dxtran을 투입한 피부모사 칩(10)의 제2 배양부(230)로부터 시료를 채취하는데, 파이펫을 사용하여 제2 배출구(250)과 연결된 제3 관통구(340)로부터 상등액을 회수한다(도 8c 참조).

상기 회수한 시료를 형광 리더기(fluorescence reader)로 형광도(Ex: 485nm, Em: 535nm)를 측정한다(도 8d 참조). 식 2에 따라 부종(Edema, E)을 산출한다.

[식 2]

식 2에서, fluorescence unit of chem treated chip은 시료로부터 측정된 형광값이고, fluorescence unit of control chip은 대조구로부터 측정된 형광값이다.

본 발명에서 대조구는 시험물질을 처리하지 않은 시료이다.

최종적으로 g) 상기 세포 생존율(CV)과 부종 정도(E)를 통해 하기 식 3에 의하여 상기 시험물질의 피부 자극정도(p 값)를 산출한다.

[식 3]

상기 식 3에서 score는 하기 식 4로부터 산출된다.

[식 4]

상기 식 3에서 score 지수는 식 4의 score 공식에 의해서 도출되고, 따라서 식 4에서 P 값은 식 3의 score 지수에 의해 영향을 받는다. 즉 식 3에서의 P 값은 식 4의 CV, E 값에 따라 영향을 받으므로, 모든 변수를 고려하였을 때, P 값은 0.3 내지 0.7 범위에 해당하면 자극성을 평가할 수 있는 측정영역이 될 수 있다.

상기 시험물질의 피부 자극정도(p 값)가 0.3 이상, 바람직하게는 0.3 내지 0.7, 바람직하게는 0.35 내지 0.65, 가장 바람직하게는 0.4755이면 피부 자극성을 나타내는 피부 자극성 물질로 분류하고, 피부 자극정도(p 값)이 상기 수치를 초과하지 않으면 피부 자극성을 나타내지 않는 피부 무자극성 물질 또는 피부 안전 소재(혹은 물질)로 분류할 수 있다.

본 발명의 피부 자극 평가 방법은 컴퓨팅 시스템에서 실행 혹은 관리자에 의해 수행가능하다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 시험물질 처리로부터 얻을 수 있는 세포 생존율(CV, %)와 부종(E) 정보를 관리자를 통해 컴퓨팅 시스템의 유저 인터페이스부에 입력하고, 상기 컴퓨팅 시스템에서 피부 자극정도(p 값)를 계산하도록 하여 시험물질의 피부 자극 정도를 평가할 수 있다.

이상과 같은 본 발명에 의한 피부 자극 평가 방법은, 피부 자극성 여부가 알려지지 않는 화장품, 식약품, 의류 분야에서 피부 안전 소재 스크리닝 방법으로 활용될 수 있다. 본 발명에 따른 피부 자극 평가 방법은 동물모델을 사용하지 않고도 보다 빠르고 정확하게 피부 자극성 여부를 도출할 수 있다.

또한 피측정자로부터 유래된 세포, 예를 들어 제1 세포, 제2 세포 및 제3 세포를 피측정자로부터 유래된 제대정맥혈관 내피세포(endothelial cell), 섬유아세포(fibroblast), 콜라겐 세포, 케라틴 세포(keratinocyte)를 적용하는 경우에는 개인 맞춤형 피부 안전 소재 선별방법으로도 활용될 수 있을 것으로 예견된다.

본 발명의 기술사상은 상기 바람직한 실시예에 따라 구체적으로 기술되었으나, 전술한 실시예들은 그 설명을 위한 것이며, 그 제한을 위한 것이 아님을 주의하여야 한다. 또한, 본 발명의 기술분야의 통상의 전문가라면 본 발명의 기술사상의 범위 내에서 다양한 실시가 가능함을 이해할 수 있을 것이다.

실험예 1. 피부모사 칩을 이용한 피부자극성 시험

1. 인공피부모델 제조

본 발명의 일실시예에 따른 피부모사 칩을 이용하여, 제대정맥혈관 내피세포(endothelial cell), 섬유아세포(fibroblast), 케라틴 세포(keratinocyte)가 3차원 적으로 배양되어 피부의 구조를 모사한 인공피부모델을 제조할 수 있다.

먼저, 상기 피부모사 칩의 제1 배양부 내로 제대정맥혈관 내피세포(endothelial cell) 배양액을 주입하고, 상기 피부모사 칩의 제2 배양부 내로 섬유아세포(fibroblast) 배양액을 주입한 후, 피부모사 칩을 뒤집어서 3 시간동안 37 ℃에서 배양하였다, 배양이 완료된 후 원상태로 다시 뒤집어서 배양하였다.

이후, 피부모사 칩의 제2 배양부 내에 섬유아세포(fibroblast) 배양액을 주입하고, 피부모사 칩의 제3 배양부 내에 케라틴 세포(keratinocyte) 배양액을 주입한 다음, 뒤집지 않은 상태에서 37 ℃에서 3~4 시간동안 배양하였다.

이때, 상기 세포의 배양액을 얻기 위해, DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium) 배양배지로 각각의 세포를 100 mm dish에 따로 배양한 후, 트립신 처리하여 배양 접시로부터 회수한 후 수를 측정하고 원침하여 한 millicell 당 1x10⁵cell/200㎕로 넣어 접종 후 배양하였다. 배지교환은 1일에 3번씩 이루어졌다. 기존의 배양은 배양하는 모든 기간에 걸쳐 37℃에서 이루어졌다.

2. 시험물질의 적용

실험예 1-1에서 준비된 피부모사 칩을 준비한다. 상기 피부모사칩 각각에 시험물질(표 1 참조) 200 ㎕을 제3 배양부에 주입하고, 반대편으로 나오는 잔여물은 피펫 혹은 흡입기를 이용하여 제거한다. 시험물질의 주입이 완료된 시점부터 3 분간 실온에 방치하였다. 반응이 완료된 후, 피부모사 칩에서 시험물질을 제거하기 위해, 1 ㎖의 HBSS(Hanks' Balanced Salt Solution)을 제3 배양부에 주입하고, 반대편으로 나오는 잔여물을 제거하는 세척과정을 3 회 반복한다. 다음 1ml의 HBSS(Hanks' Balanced Salt Solution)를 제2 배양부에 주입하고, 반대편으로 나오는 잔여물을 제거하는 세척과정을 1 회 반복한다. 다음 1ml의 HBSS(Hanks' Balanced Salt Solution)를 제1 배양부에 주입하고, 반대편으로 나오는 잔여물을 제거하는 세척과정을 1 회 반복한다. 다음 1 ml의 HBSS(Hanks' Balanced Salt Solution)를 제3 배양부에 다시 주입하고, 반대편으로 나오는 잔여물을 제거하는 세척과정을 1 회 반복한다(세척 단계).

이후, 상기 피부모사 칩의 제3 배양부와 제2 배양부에 준비된 DMEM 배지를 200 ㎕ 주입하고, 반대편으로 나오는 잔여물을 제거하는 과정을 2 회 반복한다. 피부모사 칩의 제1 배양부는 EGM-2(Endothelial Cell Growth Medium)를 200 ㎕ 주입하고, 반대편으로 나오는 잔여물을 제거하는 과정을 1 회 반복한다.

최종적으로, 피부모사 칩을 37 ℃, 5% CO₂ 인큐베이터에서 4 시간 동안 배양하였다. 다음으로 배지를 새로 교체해주면서 생선된 버블(bubble)을 제거하고, 37 ℃, 5% CO₂인큐베이터에서 42 시간 배양하였다.

3. 세포 생존율(CV, %) 측정

시험물질이 적용된 피부모사 칩을 클린 벤치(clean bench)로 옮긴 후, DMEM 배지와 CCK-8 용액을 9:1의 중량비로 혼합한 혼합액 200 ㎕를 제3 배양부에 주입하였다(이때, 반대편으로 나오는 잔여물은 피펫이나 흡입기를 이용하여 제거하였다).

3 시간 동안 37 ℃, 5% CO₂ 인큐베이터에서 배양하고, CCK-8 반응이 완료된 피부모사 칩을 클린 벤치(clean bench)로 옮긴 후, 피부모사 칩의 제3 배양부와 제2 배양부의 상등액(supernatant)을 피펫으로 회수한 후 혼합하여, 총 350 ㎕ 정도의 시료를 얻었다.

상기 시료 100 ㎕에 DMEM 배지와 CCK-8 용액을 9:1의 중량비로 혼합한 혼합액(blank) 100 ㎕를 첨가하고, 이를 96 웰 플레이트의 2개 웰에 나눠 넣은 후, 각각에 대한 450 ㎚에서 O.D.를 측정하고, 식 1에 따라 세포 생존율(CV, %)를 산출하였다.

이때, 블랭크(blank)로써 CCK-8 용액을 9:1의 중량비로 혼합한 혼합액 200 ㎕에 대한 O.D도 측정하였다. 대조구(control)로는 시험물질을 처리하지 않은 제3 배양부와 제2 배양부의 상등액(supernatant)의 혼합액에 대한 O.D를 측정하였다.

[식 1]

식 1에서, O.D treated는 시료로부터 측정된 OD값이고, O.D blank는 블랭크로부터 측정된 OD 값이다. O.D control은 대조구로부터 측정된 OD값이다.

4. 세포의 부종 정도 측정

FITC-dextran를 HBSS(Hanks' Balanced Salt Solution)에 녹여 500 ㎍/㎖의 농도로 FITC-dextran 용액을 제조하였다. 세포생존율을 측정한 피부모사 칩으로부터 CCK-8 용액을 제거하기 위하여 다음과 같이 세척과정을 수행하였다.

500 ㎕의 HBSS(Hanks' Balanced Salt Solution)을 제3 배양부에 주입하고, 반대편으로 나오는 잔여물을 제거하는 세척과정을 수행하였다. 다음 500 ㎕의 HBSS(Hanks' Balanced Salt Solution)를 제2 배양부에 주입하고, 반대편으로 나오는 잔여물을 제거하는 세척과정을 수행하였다. 다음 500 ㎕의 HBSS(Hanks' Balanced Salt Solution)를 제1 배양부에 주입하고, 반대편으로 나오는 잔여물을 제거하는 세척과정을 수행하였다(세척 단계).

세척이 완료된 후, 제조된 FITC-dextran 용액 200 ㎕를 피부모사 칩의 제1 배양부에 주입하고, 반대편으로 나오는 잔여물은 피펫이나 흡입기로 제거하였다. 2 시간 동안 37 ℃, 5% CO₂인큐베이터에서 반응시키고, 피부모사 칩의 제2 배양부로부터 시료를 피펫으로 획득하였다. 상기 시료 100 ㎕를 형광측정용 96 웰 플레이트에 옮긴 후, 형광도를 측정하고(Ex: 485nm, Em: 535nm), 식 2에 따라 부종(Edema, E)를 산출하였다.

이때, 대조구(control)로는 시험물질을 처리하지 않은 제2 배양부의 상등액(supernatant)에 대한 O.D를 측정하였다.

[식 2]

5. 물질의 피부자극성 여부 판정

실험예 1-3, 1-4로부터 측정된 세포 생존율(CV, %), 부종(E)을 식 3의 losgistic model에 대입하여 시험물질의 자극정보를 산출하였다.

[식 3]

상기 식 3에서, score는 하기 식 4로부터 산출된다.

[식 4]

구체적으로 식 4로 구해진 score값을 식 3에 대입하여 최종 p 값을 도출하였고, 이는 하기 표 1에 나타내었다. Logistic model로부터 도출된 p 값이 0.4755 이상이면 최종 자극성으로 판단하였고, 표 내에는 "I"로 표기하였다. NI는 피부 자극성이 없음을 의미한다. 이때 실험은 총 3번을 반복하였고, 3번 중 2번 이상으로 나온 결과를 바탕으로 최정적으로 자극성/비자극성을 판단하였다. 시험법의 평가를 위해 서로 다른 3 기관(서울대, 의생명연구원, 가톨릭대)에서 표준물질에 대한 자극성을 평가하였고, 그 결과를 통해 전수가능성, 실험실 간 재현성 및 예측력 평가를 각각 수행하였다.

위 수식의 모델은 SPSS와 같은 통계 프로그램을 이용하여 도출된 모델로 각 값은 raw data에 따라 변경될 수 있다.

1) 10종의 시험물질에 대한 평가

Test Substances	구분	In vivo GHS Classification	수행기관
Test Substances	구분	In vivo GHS Classification	서울대학교	의생명연구원	가톨릭대학교
Diethyl phthalate	1	NI	NI (3/3)	NI (3/3)	NI (3/3)
Allyl phenoxy-acetate	2	NI	NI (3/3)	NI (3/3)	NI (3/3)
Isopropanol	3	NI	NI (3/3)	NI (3/3)	NI (3/3)
Heptyl butyrate	4	NI	NI (3/3)	NI (3/3)	NI (3/3 )
Hexyl salicylate	5	NI	NI (3/3)	NI (3/3)	NI (3/3 )
1-decanol	6	I	I (3/3)	I (3/3)	I (3/3)
2-Methyl-3-(p-isopropylphenyl)propionaldehyde	7	I	I (3/3)	I (3/3)	I (3/3)
1-bromohexane	8	I	I (3/3)	I (3/3)	I (3/3)
5% potassium hydroxide	9	I	I (3/3)	I (3/3)	I (3/3)
Tetrachloroethylene	10	I	I (3/3)	I (3/3)	I (3/3)

시험물질의 피부자극성을 평가하기 위한 본원발명의 피부모사 칩과 방법은 피부 자극 평가에 대해 우수한 정확도, 민감도, 특이도를 갖는 것으로 확인되었다. 따라서 본 발명의 피부모사 칩과 이를 이용한 피부 자극성 평가방법은 동물실험을 대체할 수 있는, 우수한 정확성, 감도 및 특이성을 갖는 피부 자극성 평가방법을 알 수 있다. 이를 통해 다양한 시험물질에 대한 피부 자극성을 평가할 수 있음을 확인하였다.

또한, 10 종의 시험물질에 대하여 3 기관 모두 100% 동일한 결과를 나타냄을 확인하였고, 이를 통해 전수가능성 뿐만 아니라, 실험실간 재현성 역시 매우 우수함을 확인하였다.

2) 각 실험실에서의 결과

동일한 조건과 방법으로 서울대학교, 의생명연구원 및 가톨릭대학교에서 각각 측정하였고, 그 수치를 하기 표 2에 나타내었다.

서울대학교
시험물질 구분	Cell Viability		Result	Edema	Result	Logistic Model	Result	Chip			In vivo
1	0.9318		NI	1.2046	NI	0.1263	NI	NI			NI
	0.9422		NI	0.9236	NI	0.1006	NI
	0.9536		NI	0.5565	NI	0.0747	NI
2	0.9855		NI	1.2602	I	0.1110	NI	NI			NI
	0.9619		NI	1.0946	NI	0.1066	NI
	0.8774		NI	0.8469	NI	0.1170	NI
3	0.6866		NI	1.1462	NI	0.2474	NI	NI			NI
	0.4390		I	0.5213	NI	0.2176	NI
	0.6215		NI	0.6370	NI	0.3264	NI
4	0.8337		NI	1.0099	NI	0.1494	NI	NI			NI
	1.0552		NI	0.7452	NI	0.0613	NI
	0.9272		NI	0.8818	NI	0.1025	NI
5	0.7867		NI	0.7287	NI	0.1428	NI	NI			NI
	0.9072		NI	0.9881	NI	0.1175	NI
	0.7783		NI	1.0211	NI	0.1774	NI
6	0.2730		I	4.3921	I	0.9471	I	I			I
	0.2571		I	4.4466	I	0.9519	I
	0.2100		I	1.8265	I	0.7511	I
7	0.3876		I	1.1086	NI	0.4790	I	I			I
	0.4933		I	1.8171	I	0.5238	I
	0.4237		I	1.6658	I	0.5556	I
8	0.0944		I	4.8522	I	0.9797	I	I			I
	0.1480		I	1.6058	I	0.7598	I
	0.2969		I	2.5659	I	0.7981	I
9	0.0576		I	2.3230	I	0.8841	I	I			I
	0.0401		I	2.3400	I	0.8916	I
	0.0089		I	3.1557	I	0.9455	I
10	0.6006		NI	1.7147	I	0.4099	NI	I			I
	0.3245		I	1.5361	I	0.6160	I
	0.2647		I	2.0711	I	0.7507	I
의생명연구원
1		0.6385	NI	1.0700	NI	0.2686	NI		NI	NI
		0.6973	NI	1.3675	I	0.2734	NI
		0.7866	NI	0.3916	NI	0.1135	NI
2		1.0609	NI	1.4376	I	0.0475	NI		NI	NI
		0.9855	NI	1.2602	I	0.0710	NI
		0.9619	NI	1.0946	NI	0.1101	NI
3		0.5335	NI	0.5279	NI	0.2585	NI		NI	NI
		0.4612	I	0.6815	NI	0.3367	NI
		0.4587	I	0.8459	NI	0.3680	NI
4		0.9852	NI	0.9875	NI	0.0918	NI		NI	NI
		0.6402	NI	0.8350	NI	0.2331	NI
		0.4502	I	1.0897	NI	0.4206	NI
5		0.8013	NI	0.9679	NI	0.1601	NI		NI	NI
		0.4004	I	1.1128	NI	0.4685	NI
		0.7727	NI	1.1470	NI	0.1953	NI
6		0.2725	I	2.8197	I	0.8402	I		I	I
		0.2969	I	2.9610	I	0.8434	I
		0.1547	I	3.1332	I	0.9106	I
7		0.9290	NI	1.2096	NI	0.1278	NI		I	I
		0.3545	I	1.4463	I	0.5736	I
		0.2043	I	0.8373	NI	0.5872	I
8		0.3347	I	3.8374	I	0.9033	I		I	I
		0.3098	I	0.6046	NI	0.4495	I
		0.3061	I	2.0017	I	0.7113	I
9		0.1687	I	2.2633	I	0.8309	I		I	I
		0.1122	I	3.0771	I	0.9189	I
		0.2383	I	3.0237	I	0.8743	I
10		0.6006	NI	1.7147	I	0.4099	NI		I	I
		0.3245	I	1.5361	I	0.6160	I
		0.2647	I	2.0711	I	0.7507	I
가톨릭대학교
1	1.0810		NI	0.5353	NI	0.0481	NI	NI		NI
	0.8544		NI	0.6350	NI	0.1086	NI
	0.8270		NI	1.3704	I	0.1925	NI
2	0.7337		NI	1.1411	NI	0.2170	NI	NI		NI
	0.7780		NI	0.8587	NI	0.1597	NI
	0.7381		NI	1.2669	I	0.2315	NI
3	0.4796		I	0.1939	NI	0.2453	NI	NI		NI
	0.5511		NI	0.5601	NI	0.2514	NI
	0.6620		NI	0.2499	NI	0.1512	NI
4	0.3890		I	1.0951	NI	0.4751	NI	NI		NI
	0.7273		NI	1.0406	NI	0.2077	NI
	0.5972		NI	1.3910	I	0.3532	NI
5	0.3603		I	0.9220	NI	0.4668	NI	NI		NI
	0.7221		NI	1.2035	NI	0.2327	NI
	0.7246		NI	0.9262	NI	0.1949	NI
6	0.3579		I	1.3574	I	0.5536	I	I		I
	0.2735		I	1.6440	I	0.6764	I
	0.3189		I	1.8890	I	0.6831	I
7	0.0960		I	0.9744	NI	0.6990	I	I		I
	0.0942		I	0.9815	NI	0.7015	I
	0.0771		I	0.9456	NI	0.7082	I
8	0.3757		I	1.6671	I	0.5973	I	I		I
	0.3379		I	2.0247	I	0.6915	I
	0.2172		I	0.5001	NI	0.5109	I
9	0.2086		I	2.5383	I	0.8410	I	I		I
	0.2152		I	2.5423	I	0.8383	I
	0.1067		I	2.8380	I	0.9055	I
10	0.6626		NI	1.1538	NI	0.2647	NI	I		I
	0.1027		I	1.0412	NI	0.7049	I
	0.3257		I	5.4211	I	0.9708	I

표 2에 나타난 바와 같이, 세포 생존율과 부종 측정방법은 실험실마다 그 결과가 전혀 다르게 형성될 수 있을 뿐만 아니라, 시험물질에 대한 자극성과 비자극성 여부 역시 정확하게 측정되지 않음을 알 수 있다.

살펴보면, In vivo GHS 자극성 분류와 비교한 결과, 세포 생존율과 부종 측정방법은 각 실험실마다 진행된 3회의 실험에 대한 실험실 내 재현성이 현저히 낮음을 확인하였다. 또한 실험실 간 재현성 역시 현저히 낮음을 알 수 있다.

이에 반해, 동일한 조건이라도 본 발명의 평가방법을 사용한다면 서로 다른 실험실이라도 동일한 결과를 얻을 수 있을 뿐만 아니라, 높은 정확도를 확보할 수 있음을 확인할 수 있다.

실험예 2. 피부모사 칩을 이용한 예측력 평가

OECD TG 492 Performance standard에 제시된 20 종 참조 물질에 대하여 3 개 기관에서 3 반복 실험을 시행하였다. 실험 결과 얻어진 logistic model로 자극성을 판정한 결과는 다음의 표와 같다. 실험과정은 실험예 1과 모두 동일하게 수행하였다.

시험물질	In vivo GHS Classification	수행기관
시험물질	In vivo GHS Classification	서울대학교	의생명연구원	가톨릭대학교
Naphthalene acetic acid	NI	NI (3/3)	-	-
Methyl stearate	NI	NI (3/3)	-	-
1,9-decadiene	NI	NI (3/3)	-	-
Tween 80	NI	I (0/3 )	-	-
Dimethylsulfoxide	NI	NI (3/3)	-	-
Cinnamaldehyde	NI	I (0/3 )	-	I (0/3)
1-bromo-4-chlorobutane	NI	-	NI (3/3)	-
4-methyl-thio-benzaldehyde	NI	-	NI (3/3)	-
Eugenol	NI	-	-	I (0/3)
Ethanol	NI	-	-	NI (3/3)
Propylene glycol	NI	-	-	NI (3/3)
2-chloromethyl-3,5-dimethyl-4-methoxypyridine HCl	I	I (3/3)	-	-
Di-n-propyl disulphide	I	NI (0/3)	NI (0/3)	-
1-methyl-3-phenyl-1-piperazine	I	I (3/3)	-	-
10% sodium dodecyl sulphate	I	I (3/3)	-	-
0.5% sodium hydroxide	I	I (3/3)	-	-
1-bromohexane	I	I (2/3)	-	-
10-undcenoic acid	I	-	I (3/3)	-
Lactic acid	I	-	I (3/3)	-
Benzenethiol, 5-(1,1-dimethylethyl)-2-methyl	I	-	-	I (2/3)

표 3에 나타난 바와 같이, 20종의 물질 중에서 1종의 Irritant와 3종의 Non-irritant를 제외하고 모두 정확히 구분하였다.

표 3의 실험결과를 In vivo GHS 자극성 분류와 비교하여 OECD TG439 기준에 따라 예측력을 평가하여 표 4에 나타내었다. 평가결과 민감도, 특이도, 정확도가 각각 80%, 70%, 75% 이상이면 유효한 시험법으로 간주한다고 명시되어 있으므로, 이 기준을 만족시키는지 확인하였다.

Test Methods	Sensitivity	Specificity	Accuracy
Cell Viability	92.9%	75.0%	83.3%
Edema	85.7%	81.3%	83.3%
Logistic Model	92.9%	81.3%	86.7%

표 4에 나타난 바와 같이, 본 발명의 평가방법은 민감도, 특이도 및 정확도가 상기 기준치 이상이므로 추후 검증자료로 충분히 활용 가능할 것임을 알 수 있다.

또한 각 실험실마다 진행된 3회의 실험에 대해 실험실 내 재현성과 실험실 간 재현성을 평가하였고, 그 결과 실험실 내 재현성은 90% 이상, 실험실 간 재현성도 90% 이상을 나타내는 것을 확인하였다.

실험예 3. 30종의 시험물질에 대한 통합결과

본 발명의 평가방법으로 하기 30종 시험물질에 대한 측정결과를 정리하였고(표 5), 세포 생존율 결과에 대한 산점도, 부종(Edema, E) 결과에 대한 산점도, Logistic Model 결과에 대한 산점도를 각각 도 9, 10, 11에 나타내었다. 평가방법은 실험예 1과 동일하게 수행하였다. 본 발명의 평가방법에 따른 30종 시험물질에 대한 측정결과를 비교하기 위해, In vivo GHS 자극성 분류 결과(In vivo)를 표 5에 도시하였다.

Number	Test Substances (TS)	In vivo	Chip
TS 1	1-bromo-4-chlorobutane	NI	NI
TS 2	Isopropanol	NI	NI
TS 3	4-methyl-thio-benzaldehyde	NI	NI
TS 4	Hexyl salicylate	NI	NI
TS 5	Heptyl butyrate	NI	NI
TS 6	Naphthalene acetic acid	NI	NI
TS 7	Allyl phenoxy -acetate	NI	NI
TS 8	Diethyl phthalate	NI	NI
TS 9	Cinnamaldehyde	NI	I
TS 10	Methyl stearate	NI	NI
TS 11	1,9-decadiene	NI	NI
TS 12	Tween 80	NI	I
TS 13	Dimethylsulfoxide	NI	NI
TS 14	Eugenol	NI	I
TS 15	Ethanol	NI	NI
TS 16	Propylene glycol	NI	NI
TS 17	1-decanol	I	I
TS 18	1-bromohexane	I	I
TS 19	5% potassium hydroxide	I	I
TS 20	Di-n-propyl disulphide	I	NI
TS 21	Heptanal	I	I
TS 22	Tetrachloroethylene	I	I
TS 23	2-chloromethyl-3,5-dimethyl-4-methoxypyridine HCl	I	I
TS 24	1-methyl-3-phenyl-1-piperazine	I	I
TS 25	10% sodium dodecyl sulphate	I	I
TS 26	0.5% sodium hydroxide	I	I
TS 27	2-Methyl-3-(p-isopropylphenyl)propionaldehyde	I	I
TS 28	Benzenethiol , 5-(1,1-dimethylethyl)-2-methyl	I	I
TS 29	10-undcenoic acid	I	I
TS 30	Lactic acid	I	I

표 5, 도 9 내지 11에 나타난 바와 같이, 실제 실험결과 매우 흡사한 결과를 도출할 수 있음을 알 수 있다.

시험물질의 피부자극성을 평가하기 위한 본원발명의 피부모사 칩과 방법은 피부 자극 평가에 대해 86.7%의 정확도, 92.9% 민감도 및 81.3% 특이도를 갖는 것으로 확인되었다. 즉, 항-ZO-1 타이트 접합 단백질 항체(ZO-1 Tight Junction antibody)(ZO1-1A12, Invitrogen)를 사용하는 면역형광염색을 통한 ZO-1 밀착연접 수치를 계산하여 피부자극성을 평가하는 방법은 정확도를 비롯하여 감소 및 특이성 모두 실험예 1의 평가방법에 비해 현저히 낮다.

게다가 ZO-1 Tight Junction 방법으로 측정한 부종(E)의 데이터는 그 자체적으로 실제 생체 내 실험값과 현저히 다른 결과를 나타낼 수 있으며, ZO-1 밀착연접을 통한 피부자극성 평가방법은 칩으로부터 미세막을 분리하는 과정이 필수적으로 동반되기 때문에, 반복된 실험이 불가능할 뿐만 아니라, 평가에 많은 시간과 비용이 소모되는 절차적인 문제가 존재한다는 큰 단점들이 존재함을 확인하였다.

이에 반해, 본 발명의 피부모사 칩을 이용한 피부 자극성 평가방법은 동물실험을 대체할 정도로, 보다 우수한 정확성, 감도 및 특이성을 갖는 피부 자극성 평가방법을 알 수 있다. 이를 통해 다양한 시험물질에 대한 피부 자극성을 평가할 수 있음을 확인하였다.

10: 피부모사 칩 100: 제1 레어층
110: 제1 주입구 111: 제1 플레이트
130: 제1 배양부 140: 함몰홀
150: 제1 배출구 200: 제2 레어층
210: 제2 주입구 211: 제2 플레이트
230: 제2 배양부 250: 제2 배출구
220: 제1 관통구 300: 제3 레어층
310: 제3 주입구 311: 제3 플레이트
320: 제2 관통구 330: 제3 배양부
340: 제3 관통구 350: 제3 배출구
400: 제1 미세막 410: 제1 다공성
430: 제2 미세막 431: 제2 다공성
500: 제1 세포 600: 제2 세포
700: 제3 세포

Claims

제1 플레이트와 상기 제1 플레이트의 내부로 제1 세포가 모이는 제1 배양부를 구비한 제1 레어층;
상기 제1 플레이트의 상부에 배치된 제2 플레이트, 상기 제2 플레이트의 내부로 제2 세포가 모이는 제2 배양부 및 상기 제1 배양부와 제2 배양부가 서로 연결되는 제2 레어층;
상기 제1 배양부와 상기 제2 배양부 사이에 배치되고, 상기 제1 세포와 상기 제2 세포 간의 혼합을 방지하면서 상기 제1 세포와 상기 제2 세포가 각각 분비물질과 미디어가 상호작용하도록 제1 다공성이 형성된 제1 미세막;
상기 제2 플레이트의 상부에 배치된 제3 플레이트와 상기 제3 플레이트의 내부로 제3 세포가 모이는 제3 배양부, 상기 제2 배양부와 제3 배양부가 서로 연결되는 제3 레어층; 및
상기 제2 배양부와 상기 제3 배양부 사이에 배치되고, 상기 제2 세포와 상기 제3 세포 간의 혼합을 방지하면서 상기 제2 세포와 상기 제3 세포가 각각 분비물질과 미디어가 상호작용하도록 제2 다공성이 형성된 제2 미세막;을 포함하되,
상기 제3 레어층은 상기 제3 배양부를 사이에 두고 형성되어 유로를 통해 상기 제3 배양부와 각각 연결되는 주입구 및 배출구와, 상기 주입구 및 배출구와 이웃하게 형성되어 상기 제1 배양부 및 상기 제2 배양부로 각각 세포를 공급하거나 배출시키는 복수의 관통구를 포함하며,
상기 제1 배양부와 상기 제2 배양부 및 상기 제3 배양부는 동일한 타원의 평면형상을 가지고 높이방향으로 동일 위치에 배치되며,
상기 제1 레어층은, 상기 제1 플레이트의 하면에 형성된 함몰홈을 더 포함하며, 상기 제1 플레이트의 하방에서 볼때 상기 함몰홈의 내부에 상기 제1 배양부가 위치되며,
상기 제1 및 제3 플레이트의 평균 두께는 4 내지 7 ㎜이고, 상기 제2 플레이트의 평균 두께는 0.5 내지 1.0 ㎛이며,
상기 제1 배양부는 높이가 50 내지 1000 ㎛이고, 장축의 길이가 15 내지 20 ㎜이며, 단축의 길이가 장축 길이의 0.8 내지 0.9배이며, 제2 배양부와 제3 배양부는 상기 제1 배양부와 높이, 장축 길이 및 단축의 길이 조건이 모두 동일한 것을 특징으로 하고,
상기 유로는 높이 0.5 내지 1 ㎛, 평균 직경 0.5 내지 1.5 ㎛이며,
상기 제1 세포는 제대정맥혈관 내피세포(endothelial cell)이고, 상기 제2 세포는 섬유아세포(fibroblast), 콜라겐 세포 및 이들의 혼합물이며, 상기 제3 세포는 케라틴 세포(keratinocyte)이며,
상기 제1 배양부, 제2 배양부 및 제3 배양부로 각각 제1 세포, 제2 세포 및 제3 세포가 주입되면, 상기 제1 미세막을 기준으로 상면과 하면에 제1 세포와 제2 세포가 부착되어 상호작용하고, 제2 미세막을 기준으로 상면과 하면에 제2 세포와 제3 세포가 부착되어 상호작용하는 것을 특징으로 하는 피부모사 칩.
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다음 단계들을 포함하는 피부 자극 평가방법:
a) 상기 제1항에 따른 피부모사 칩을 준비하는 단계;
b) 상기 피부모사 칩의 제3 배양부에 시험물질을 처리하는 단계;
c) 상기 b) 단계로부터 얻은 피부모사 칩의 제3 배양부에 CCK-8 용액을 처리하는 단계;
d) 상기 c) 단계의 피부모사 칩의 제3 배양부와 제2 배양부로부터 상등액을 회수한 후, OD_450㎚(optical density)를 측정하고, 이를 통해 식 1에 의하여 세포 생존률(Cell viability, CV, %)을 산출하는 단계;
e) 상기 d) 단계의 피부모사 칩 세척하는 단계;
f) 상기 e) 단계의 피부모사 칩의 제1 배양부에 FITC-dxtran을 투입하고, 제2 배양부로부터 시료를 채취하여 형광세기를 측정하고, 식 2에 의하여 부종 정도(Edema, E)를 산출하는 단계; 및
g) 상기 세포 생존율과 부종 정도를 통해 하기 식 3에 의하여 상기 시험물질의 피부 자극정도(p 값)를 산출하는 단계;를 포함하는 피부 자극 평가 방법.
[식 1]

[식 2]

[식 3]

상기 식 3에서, score는 하기 식 4로부터 산출된다.
[식 4]
제8항에 있어서,
상기 시험물질의 피부 자극정도(p 값)가 0.3 내지 0.7이면 피부 자극성을 나타내는 피부 자극성 물질로 분류하는 것을 특징으로 하는 피부 자극 평가 방법.
제8항 내지 제9항 중 어느 한 항에 의한 피부 자극 평가 방법을 활용한 피부 안전 소재의 스크리닝 방법.
제10항에 있어서,
상기 제1, 제2, 제3 세포는 피측정자로부터 유래된 것을 특징으로 하는, 피부 자극 평가 방법을 활용한 개인 맞춤형 피부 안전 소재의 스크리닝 방법.