WO2015152025A1 - シート状細胞培養物の品質評価方法 - Google Patents

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WO2015152025A1
WO2015152025A1 PCT/JP2015/059551 JP2015059551W WO2015152025A1 WO 2015152025 A1 WO2015152025 A1 WO 2015152025A1 JP 2015059551 W JP2015059551 W JP 2015059551W WO 2015152025 A1 WO2015152025 A1 WO 2015152025A1
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sheet
label
container
cells
cell culture
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PCT/JP2015/059551
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English (en)
French (fr)
Inventor
進弥 佐野
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テルモ株式会社
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M21/00—Bioreactors or fermenters specially adapted for specific uses
    • C12M21/08—Bioreactors or fermenters specially adapted for specific uses for producing artificial tissue or for ex-vivo cultivation of tissue
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M41/00—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation
    • C12M41/30—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation of concentration
    • C12M41/36—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation of concentration of biomass, e.g. colony counters or by turbidity measurements
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms

Definitions

  • the present invention relates to a method, kit, system, and the like for quality evaluation of sheet-shaped cell culture or determination of completion of sheet formation.
  • Non-Patent Document 1 fetal cardiomyocytes, skeletal myoblasts, mesenchymal stem cells, cardiac stem cells, ES cells, etc. have been tried to repair myocardial tissue damaged by ischemic heart diseases such as angina pectoris and myocardial infarction.
  • Patent Document 1 cell structures formed using scaffolds and sheet-shaped cell cultures in which cells are formed into sheets have been developed.
  • sheet cell culture For the application of sheet cell culture to the treatment, use of cultured epidermis sheet for skin damage caused by burns, use of corneal epithelial sheet cell culture for corneal injury, oral mucosa sheet for endoscopic resection of esophageal cancer Studies such as the use of cell cultures are ongoing.
  • Patent Document 1 describes that the strength was estimated qualitatively and empirically from the ease of desorption of the cell culture from the culture substrate.
  • Patent Document 2 discloses a method in which a sheet-shaped cell culture is subjected to a dissociation treatment, and the strength of the sheet-shaped cell culture is measured from the time of dissociation treatment and the dissociation state.
  • Patent Document 4 A method for determining the quality of a sheet-shaped cell culture based on the roundness of the outline of the sheet-shaped cell culture is disclosed in Patent Document 4, which measures the concentration of non-adherent cells in a liquid medium in sheet culture or a change thereof.
  • the method for determining the sheet-like state of the sheet-shaped cell culture by calculating the adhesion rate between the sheet-forming cells and the culture container in Patent Document 5, and forming the sheet-shaped cell culture based on this Patent Document 6 discloses a determination method in which a fragile sample such as a sheet-shaped cell culture is fixed to a fixed surface connected to a load measuring device in a state where the sample is located in a liquid or a liquid surface. Measure tensile properties
  • Patent Document 7 a method of forming a sheet containing magnetic particles at least in part and applying a tensile load by applying a magnetic force to the sheet to evaluate the tensile properties of the sheet, Each is listed.
  • the present invention includes cell density, presence or absence of minute tears or holes that cannot be detected with the naked eye, adhesion between cells, presence or absence of peeling from the culture substrate during sheeting,
  • the purpose is to provide a method for evaluating the viability of cells, the vitality of cells, a method for determining the completion of sheeting of a sheet-shaped cell culture, a method for detecting abnormal sheeting of a sheet-shaped cell culture, etc. To do.
  • the present inventor While studying the quality evaluation method of the sheet-shaped cell culture, the present inventor, in addition to the strength of the sheet-shaped cell culture, the uniformity of the cell density in the sheet-shaped cell culture, and the sheet-shaped cell culture Compatibility with transplantation includes micro-breaks and holes that cannot be detected with the naked eye, adhesion between cells, separation from culture substrate during sheeting, cell viability, and cell vitality. As a result of diligent research to develop a method for evaluating these items, the cells cannot pass cells but have a semi-permeable part that allows molecules of a given size to pass through.
  • the sheet-like cell culture is formed so as to cover the semipermeable portion, the semipermeable portion of the culture vessel is accommodated in a liquid-impermeable recovery vessel, and a label is added to the culture vessel. For a specified period After, by detecting the amount of label has moved to the collection container from the culture vessel, it found that it is possible to evaluate the above items at a time. As a result of further research, the amount of label moving to the collection container decreased with the progress of sheeting, and when the sheeting was completed, the amount of label moving to the collection container became constant. Completed the invention.
  • the present invention relates to the following. ⁇ 1> (1) a step of seeding cells in a first container having a semipermeable portion that passes through a label but does not pass cells, and forms a sheet so as to cover the semipermeable portion; (2) adding a label to the first container or a liquid-impermeable second container that can be in fluid communication with the first container via the semi-permeable portion; (3) In a state where the first container and the second container are in liquid communication via the semipermeable portion, the label is a container to which the label is not added among the first container and the second container.
  • Transitioning through a semi-permeable part (4) including a step of detecting the label transferred to the container to which the label is not added, wherein the label is inhibited from passing between cells by cell-cell adhesion, and step (2) includes step (1) Simultaneously with step (1), or after step (1), quality evaluation of sheet-shaped cell culture, determination of completion of sheet formation, evaluation of cell sheet-forming ability, or sheet-shaped cell culture Method for detection of sheet peeling in the manufacturing process.
  • ⁇ 2> (1) a step of seeding cells in a first container having a semipermeable portion that passes through the label but does not pass cells, and cultivating the sheet so as to cover the semipermeable portion; (2) adding a label to the first container or a liquid-impermeable second container that can be in fluid communication with the first container via the semi-permeable portion; (3) In a state where the first container and the second container are in liquid communication via the semipermeable portion, the label is a container to which the label is not added among the first container and the second container.
  • step (2) includes steps (1) and A method for producing a sheet-like cell culture for transplantation, which may be performed before step (1) or after step (1) at the same time.
  • ⁇ 3> The method according to ⁇ 1> or ⁇ 2>, wherein the label has a molecular weight of 100 to 150,000.
  • ⁇ 4> The method according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 3>, wherein the label is selected from the group consisting of a fluorescent label, an enzyme label, a luminescent label, a radioactive label, a magnetic label, and a colorimetric label.
  • ⁇ 5> The method according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 4>, wherein the semipermeable portion has pores having a pore diameter of about 0.01 ⁇ m to about 50.0 ⁇ m.
  • the quality of the sheet-shaped cell culture is selected from the group consisting of the strength of the sheet-shaped cell culture, the degree of sheeting, the cell density, the viability of the cells, the adhesion state between the cells, and the vitality of the cells.
  • ⁇ 7> The method according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 6>, wherein the cells are selected from the group consisting of myoblasts and mesenchymal stem cells.
  • a label that inhibits passage between cells by adhesion between cells (2) a first container having a semi-permeable portion through which the label passes but cells do not pass, and (3) a liquid-impermeable second container capable of containing the semi-permeable portion.
  • quality evaluation of sheet cell culture determination of completion of sheet formation, evaluation of cell sheet forming ability, and / or detection of detachment in the production process of sheet cell culture kit.
  • a label that inhibits passage between cells by adhesion between cells (2) a first container having a semipermeable portion through which the label passes but cells do not pass; (3) Production of sheet-shaped cell culture, sheet-shaped cell culture, comprising a liquid-impermeable second container capable of accommodating the semi-permeable portion, and (4) a detector for detecting a label
  • the quality evaluation method of the present invention not only the strength of the sheet-shaped cell culture but also the presence or absence of minute tears or holes that cannot be detected with the naked eye, the adhesion state between cells, and from the culture substrate during the sheeting process It is possible to evaluate the quality such as detachment, cell viability, and cell vitality at the same time, and without damaging the sheet cell culture. it can.
  • cells are cultured until cell adhesion is completed, but the donor cells have the time until sheet formation is completed and a sheet-shaped cell culture suitable for transplantation is completed.
  • the sheeting completion determination method of the present invention makes it possible to accurately detect completion of sheeting and has a high therapeutic effect suitable for transplantation. Sheet cell cultures can be reliably produced without time loss.
  • the sheeting abnormality detection method of the present invention it is possible to quickly detect an abnormality that has occurred in the sheeting process, and it is possible to prevent time loss by quickly taking necessary measures.
  • FIG. 1 is a diagram showing an algorithm (algorithm 1) relating to a specific embodiment of the method for producing a sheet-shaped cell culture according to the present invention.
  • FIG. 2 is a diagram showing a modification of algorithm 1.
  • FIG. 3 is a diagram showing an algorithm (algorithm 2) relating to a specific embodiment of the method for producing a sheet-shaped cell culture according to the present invention.
  • FIG. 4 is a diagram showing an algorithm (algorithm 3) relating to a specific embodiment of the method for producing a sheet-shaped cell culture according to the present invention.
  • FIG. 5 is a graph showing that the amount of label transferred to the second container changes depending on the cell density.
  • FIG. 6 is a graph showing that the amount of the label transferred to the second container changes according to the survival rate of the cells constituting the sheet-shaped cell culture.
  • FIG. 7 is a graph showing the transition of the amount of label transferred to the second container as the sheet-shaped cell culture is made into a sheet.
  • FIG. 8 is a graph showing that the amount of label transferred to the second container changes due to abnormal sheet formation.
  • FIG. 9 is a graph showing that the amount of label transferred to the second container changes depending on the difference in cell purity.
  • One aspect of the present invention is as follows: (1) seeding cells in a first container having a semi-permeable portion through which a label passes but cells do not pass, and forming the sheet so as to cover the semi-permeable portion. , (2) adding a label to the first container or a liquid-impermeable second container that can be in fluid communication with the first container via the semi-permeable portion; (3) In a state where the first container and the second container are in liquid communication via the semipermeable portion, the label is a container to which the label is not added among the first container and the second container.
  • Transitioning through a semi-permeable part (4) including a step of detecting the label transferred to the container to which the label is not added, wherein the label is inhibited from passing between cells by cell-cell adhesion, and step (2) includes step (1)
  • quality evaluation method a method for evaluating the quality of a sheet-shaped cell culture (hereinafter sometimes abbreviated as “quality evaluation method”), which may be performed before step (1) or after step (1).
  • the “sheet-shaped cell culture” refers to a sheet in which cells are connected to each other by intercellular adhesion or the like, and is typically composed of one cell layer. In addition, those composed of a stack of cell layers are also included.
  • the cells may be linked to each other directly (including those via cell elements such as adhesion molecules) and / or via intervening substances.
  • the intervening substance is not particularly limited as long as it is a substance that can connect cells at least physically (mechanically), and examples thereof include an extracellular matrix.
  • the intervening substance is preferably derived from cells, particularly derived from cells constituting the sheet-shaped cell culture.
  • the cells are at least physically (mechanically) connected, but may be further functionally, for example, chemically or electrically connected.
  • Adherent cells include, for example, adherent cells (adherent cells).
  • Adherent cells include, for example, adherent somatic cells (eg, cardiomyocytes, fibroblasts, epithelial cells, endothelial cells, hepatocytes, pancreatic cells, kidney cells, adrenal cells, periodontal cells, gingival cells, periosteum cells, skin Cells, synovial cells, chondrocytes, etc.) and stem cells (eg, tissue stem cells such as myoblasts, cardiac stem cells, embryonic stem cells, pluripotent stem cells such as iPS (induced pluripotent stem) cells, mesenchymal stem cells, etc.) Etc.
  • adherent somatic cells eg, cardiomyocytes, fibroblasts, epithelial cells, endothelial cells, hepatocytes, pancreatic cells, kidney cells, adrenal cells, periodontal cells, gingival cells, periosteum cells, skin Cells, synovial
  • Somatic cells may be differentiated from stem cells, particularly iPS cells.
  • Non-limiting examples of cells that can form a sheet-like cell culture include, for example, myoblasts (eg, skeletal myoblasts), mesenchymal stem cells (eg, bone marrow, adipose tissue, peripheral blood, skin, hair roots) , Muscle tissue, endometrium, placenta, cord blood, etc.), cardiomyocytes, fibroblasts, cardiac stem cells, embryonic stem cells, iPS cells, synovial cells, chondrocytes, epithelial cells (eg, oral mucosal epithelium) Cells, retinal pigment epithelial cells, nasal mucosal epithelial cells, etc.), endothelial cells (eg, vascular endothelial cells), hepatocytes (eg, liver parenchymal cells), pancreatic cells (eg, islet cells), kidney cells, adrenal glands Examples include cells, periodontal ligament cells, ging
  • the label used in the present invention includes any label in which passage between cells is inhibited by cell-cell adhesion.
  • cell-cell adhesion devices eg, tight junctions, adhesive junctions, desmosome junctions, gap junctions, etc.
  • the cell gap in the sheet-shaped cell culture is expanded for some reason, the passage of molecules that are normally inhibited from passing between the cells becomes easy, and the sheet-shaped cell culture can be removed within a predetermined time.
  • the amount of molecules passing through increases. Therefore, by using a label that inhibits passage between cells due to cell-cell adhesion, the amount of label that passes through the cell gap of the sheet-like cell culture can be used as an index of the size of the cell gap.
  • Non-limiting examples of a label that inhibits passage between cells due to cell-cell adhesion include, for example, a label having a molecular weight in a predetermined range.
  • the molecular weight range is not limited, and is, for example, about 100 to about 1500,000, about 300 to about 1,000,000, about 1000 to about 500,000, about 5000 to about 200,000, about 10,000 to about 100,000, about 30,000 to about 90,000, Examples include about 40,000 to about 80,000.
  • the label may also have a positive charge or a negative charge.
  • Non-limiting examples of such labels include, for example, fluorescein sodium (Na—F).
  • a sheet cell culture is usually formed by seeding cells that can form a sheet cell culture in a culture vessel and allowing the cells to interact with each other for a predetermined period of time (this specification)
  • this process is sometimes referred to as “sheeting”), and as shown in the results of Example 5, the cell gap at the time of seeding is gradually reduced by cell-to-cell adhesion in this sheeting process.
  • sheeting the sheet is stabilized at a certain size by completing the sheet formation.
  • the label will adhere between cells by cell-cell adhesion. It can be said that the passage of is inhibited.
  • the result of Example 4 shows, when the viability of the cell which comprises this sheet-like cell culture falls, the connection between cells will become weak and a cell gap
  • the amount of label that passes through the sheet cell culture that does not reduce cell viability is less than the amount of label that passes through the sheet cell culture with reduced cell viability, then the label is It can be said that cell-cell adhesion is inhibited by cell-cell adhesion.
  • the label used in the present invention includes any one that can be quantified by a known measuring method, and non-limiting examples include, for example, fluorescent labels, enzyme labels, luminescent labels, radioactive labels, magnetic labels, and colorimetric labels. It is done.
  • the label may be a known detectable labeling substance, such as a fluorescent substance, an enzyme, a luminescent substance, a radioisotope, a magnetic particle, a dye, etc., and the labeling substance may be combined with another substance (for example, a carrier such as dextran). It may be a labeling substance that binds and inhibits passage between cells by cell-cell adhesion.
  • substances that absorb electromagnetic waves of a specific wavelength such as nucleic acids and proteins, antibodies and antigen-binding fragments thereof, antigens recognized by antibodies (eg, DIG), solubilized receptors, ligands for receptors, lectins, Sugar chains recognized by lectins, biotin and derivatives thereof, avidin and derivatives thereof, and the like may be used as labels.
  • antibodies, antigen-binding fragments, solubilized receptors, lectins, biotin and their derivatives as labels detect them with antigens, ligands, sugar chains, avidin and their derivatives bound to the labeling substances.
  • an antigen recognized by an antibody a ligand for a receptor, a sugar chain recognized by a lectin, avidin or a derivative thereof is used as a label
  • the antibody bound to the labeling substance or its antigen-binding fragment, solubilized receptor Body, lectin, biotin and derivatives thereof.
  • label used in the present invention include substances that color or emit light by an enzymatic reaction.
  • fluorescent substances examples include the Cy TM series (eg, Cy TM 2, 3, 5, 5.5, 7, etc.), the DyLight TM series (eg, DyLight TM 405, 488, 549, 594). 633, 649, 680, 750, 800, etc.), Alexa Fluor (R) series (eg Alexa Fluor (R) 405, 488, 549, 594, 633, 647, 680, 750 etc.), HiLyte Fluor TM series ( For example, HiLyte Fluor TM 488, 555, 647, 680, 750, etc.), ATTO series (eg, ATTO 488, 550, 633, 647N, 655, 740, etc.), FAM, FITC, Texas Red, Rhodamine, GFP, RFP, Qdot , Lucifer Yellow, Fluorescein, DRAQ7 TM, etc., as enzymes, HRP, ⁇ -galactosidas
  • fluorescent substances include fluorescent proteins such as YFP, CFP, OFP.
  • further enzymes include luciferase, alkaline phosphatase, glucuronidase, peroxidase and the like.
  • the substance that colors or emits light by an enzymatic reaction include, but are not limited to, a luciferase substrate, an alkaline phosphatase substrate, a ⁇ -galactosidase substrate, a glucuronidase substrate, a peroxidase substrate, and the like.
  • the label is preferably less toxic and less toxic and less toxic. Examples of such a label include a cell membrane impermeable label.
  • the label is biocompatible. By using a biocompatible label, even if the label is attached to the sheet culture, it can be safely used for transplantation or the like.
  • the label includes a carrier coupled to a detectable substance.
  • the carrier examples include, but are not limited to, dextran, biotin, albumin, agarose, polylactic acid (PLA), polyglycolic acid (PGA), lactic acid-glycolic acid copolymer (PLGA), polyethyleneimine (PEI), polyethylene Polymers such as glycol (PEG) and polylysine (eg, poly-L-lysine (PLL)), polystyrene, silica, acrylic, quartz, chitosan, gold, silver, albumin, agarose, polylactic acid, polyethyleneimine, platinum, oxidation Examples thereof include fine particles composed of aluminum, borosilicate glass, soda lime glass, PLA, PLGA, iron oxide, palladium, and sugar alcohols such as mannitol and erythritol.
  • the label comprises dextran conjugated with a fluorescent substance.
  • the molecular weight of dextran may be about 1,000 to about 1,000,000, about 5,000 to about 500,000, about 10,000 to about 200,000, about 20,000 to about 100,000, about 30,000 to about 90,000, about 40,000 to about 80,000, etc.
  • the label comprises [ 3 H] mannitol, [ 14 C] mannitol, sodium fluorescein (Na—F), lucifer yellow CH (eg, dilithium salt, dipotassium salt, etc.) and the like.
  • the first container is not particularly limited as long as cells can form a sheet-shaped cell culture therein, and includes, for example, cell culture containers of various materials.
  • the first container preferably has a structure / material that does not allow permeation of a liquid such as a culture solution except for the semipermeable portion.
  • examples of such materials include, but are not limited to, polyethylene, polypropylene, Teflon (registered trademark), polycarbonate, polyethylene terephthalate, polymethyl methacrylate, nylon 6,6, polyvinyl alcohol, cellulose, silicon, polystyrene, glass, polyacrylamide, Examples thereof include polydimethylacrylamide, metal (for example, iron, stainless steel, aluminum, copper, brass).
  • the first container preferably has at least one flat surface.
  • the first container may be made using the above materials, or a commercially available one may be used.
  • the first container may be in the form of a dish or a multi-well plate with a plurality of wells, and may be opaque, translucent or transparent.
  • a 1st container is comprised with the material suitable for the detection of a label
  • the label is a fluorescent label
  • the first container is preferably colorless and transparent or has at least a colorless and transparent portion suitable for fluorescence detection.
  • the first container includes a sheet-shaped cell culture forming surface for forming a sheet-shaped cell culture.
  • the surface may be an adhesive surface suitable for the formation of a sheet-like cell culture, such as, but not limited to, a hydrophilic surface, such as a surface coated with serum, corona discharge treated polystyrene, gelatin, Collagen gel, Matrigel-coated surface, surfaces coated with hydrophilic compounds such as hydrophilic polymers, and extracellular substrates such as collagen, fibronectin, laminin, vitronectin, proteoglycan, glycosaminoglycan, cadherin family, selectin It may be a surface coated with a cell adhesion factor such as family or integrin family.
  • Cell culture vessel having such surface are commercially available (e.g., Corning (R) TC-Treated Culture Dish, etc. manufactured by Corning), it can be prepared according to known methods.
  • the sheet-shaped cell culture forming surface may be coated with a material whose physical properties change in response to stimulation, for example, temperature or light.
  • materials include, but are not limited to, (meth) acrylamide compounds, N-alkyl-substituted (meth) acrylamide derivatives (eg, N-ethylacrylamide, Nn-propylacrylamide, Nn-propylmethacrylamide, N-isopropylacrylamide, N-isopropylmethacrylamide, N-cyclopropylacrylamide, N-cyclopropylmethacrylamide, N-ethoxyethylacrylamide, N-ethoxyethylmethacrylamide, N-tetrahydrofurfurylacrylamide, N-tetrahydrofurfurylmethacrylate Amide), N, N-dialkyl-substituted (meth) acrylamide derivatives (eg, N, N-dimethyl (meth) acrylamide, N, N-e
  • the physical properties for example, hydrophilicity and hydrophobicity can be changed, and peeling of the cell culture adhered on the materials can be promoted.
  • a component such as serum can be further coated on the coating with the stimulus-responsive material as described above.
  • the first container has a semi-permeable portion through which the label passes but no cells pass.
  • the semipermeable portion is not particularly limited as long as it has a property that the label can pass but the cell does not pass through it, and may be composed of, for example, a culture substrate having pores of a predetermined size. .
  • the size of the pore (pore diameter) is not particularly limited as long as it passes through the label but does not pass through the cells.
  • a person skilled in the art can appropriately select pores suitable for the label to be used and the cell size. The density of the pores may vary depending on the pore diameter.
  • the density is about 1 ⁇ 10 3 / cm 2 to about 1 ⁇ 10 8 / cm 2 , about 1 ⁇ 10 4 pieces / cm 2 to about 1 ⁇ 10 7 pieces / cm 2 , about 2.5 ⁇ 10 4 pieces / cm 2 to about 8 ⁇ 10 6 pieces / cm 2 , about 5 ⁇ 10 5 pieces / cm 2 It may be about 5 ⁇ 10 6 pieces / cm 2 , about 8 ⁇ 10 5 pieces / cm 2 to about 2.5 ⁇ 10 6 pieces / cm 2, etc.
  • the density of the pores is expressed in terms of open area ratio, for example, about 0.1% to about 95%, about 0.5% to about 90%, about 1% to about 1% of the area of the semipermeable portion 90%, about 2% to about 90%, about 3% to about 85%, etc.
  • the semipermeable part may constitute a part or all of the sheet-like cell culture forming surface of the first container.
  • the proportion can be any proportion ranging from about 1% to about 99% of the surface area of the sheet-like cell culture-forming surface, eg, about 90%, about It may be 80%, about 70%, about 60%, about 50%, about 40%, about 30%, about 20%, about 10%, etc.
  • the semipermeable part may exist in one place on the sheet-like cell culture formation surface, or may exist separately in a plurality of places.
  • the material and thickness of the semipermeable part may be the same as or different from other parts of the first container.
  • the first container may be one in which part or all of the surface of the sheet-shaped cell culture forming surface is subjected to pore treatment, or a culture substrate having pores at the bottom. It may be attached.
  • the culture substrate constituting the semipermeable part is not particularly limited as long as cells can form a sheet-like cell culture thereon, and includes, for example, plates and films of various materials.
  • the culture substrate may be made of a material that does not allow liquid to pass through, such as a culture solution.
  • Non-limiting examples of such materials include those described for the first container, urethane, polyethylene terephthalate (PET), non-woven fabric, polytetrafluoroethylene (PTFE), cellulose mixed esters (eg, cellulose acetate and nitrocellulose) And the like suitable for pore treatment.
  • the culture substrate may be produced using these materials, or commercially available ones may be used.
  • Preferable culture substrates include, but are not limited to, substrates having an adhesive surface suitable for the formation of sheet cell cultures. Non-limiting examples of such surfaces are as described above for sheet cell culture formation.
  • a porous structure can also be used as a culture substrate. For example, if a sheet-like cell culture is formed on a culture substrate of a porous structure composed of a biological material such as a collagen sponge, the culture substrate is not peeled off from the culture substrate. The whole material can be used for transplantation as it is. In this case, even if the semipermeable portion is composed of only the porous structure, the semipermeable portion is composed of the porous structure and the support that is fixed to the first container and holds the porous structure in a separable manner. May be.
  • the second container has a form capable of accommodating the semi-permeable portion of the first container, and is liquid impermeable. Therefore, the second container can be made of any material that is liquid impermeable.
  • the second container may be opaque, translucent or transparent.
  • the second container is made of a material suitable for detection of the sign or at least has a portion made of the material.
  • the label is a fluorescent label
  • the second container is preferably colorless and transparent or has at least a colorless and transparent portion suitable for fluorescence detection.
  • the second container may be configured to be separable from the first container or may be integrated.
  • the second container may include a label detection unit configured so that the detection of the label is not inhibited by the first container.
  • the sign detection unit is made of a material suitable for detection of the sign, or has at least a part made of such a material.
  • the second container may have a form of a dish or a plate in accordance with the form of the first container.
  • the second container may include a member for preventing discoloration or discoloration of the labeling substance, for example, a detachable cover or the like.
  • a photodegradable substance such as a fluorescent substance or a dye is used as the labeling substance
  • a light shielding cover or the like may be provided.
  • the member for preventing discoloration or discoloration of the labeling substance is not limited, for example, a removable cover, etc.
  • the entire first container and the second container that accommodates the first container can be covered.
  • the second container may include a port for collecting the liquid in the container.
  • a port for collecting the liquid in the container.
  • the port is not particularly limited as long as it enables collection of the liquid from the second container, and the liquid contained in the second container provided between the first container and the second container. Even the opening that allows access to the liquid is a conduit provided at a position where one opening contacts the liquid in the second container, allowing the liquid in the second container to be aspirated. May be.
  • the port is preferably one that allows collection of liquid from the second container without separating the first container and the second container.
  • the seeding of cells in the present invention can be performed by any known method and conditions.
  • the seeding of the cells may be performed, for example, by injecting a cell suspension in which the cells are suspended in the sheeting medium into the first container.
  • an apparatus suitable for the operation of injecting the cell suspension such as a dropper or a pipette, can be used.
  • the step of forming the seeded cells into a sheet can also be performed by any known method and condition.
  • Non-limiting examples of such methods include, for example, Patent Document 1, JP 2010-081829, JP 2010-226962, JP 2010-226991, JP 2011-110368, JP 2011-115058, JP 2011-172925, and the like. It is described in.
  • the step of forming a sheet can be achieved, for example, by culturing cells under conditions that form cell-cell adhesion. Such conditions may be any as long as cell-cell adhesion can be formed, but cell-cell adhesion can usually be formed under the same conditions as general cell culture conditions. A person skilled in the art can select optimal conditions according to the type of cells to be seeded. In the present specification, the culture for forming the seeded cells into a sheet may be referred to as “sheet culture”.
  • Sheeting can be performed so as to cover all or part of the semi-permeable portion.
  • uniform experimental conditions such as comparison between a plurality of samples, it may be preferable to form a sheet so as to cover all of the semi-permeable portion.
  • evaluating changes over time in the same sheet-shaped cell culture for example, a method for determining completion of sheet formation described later, a method for producing a sheet-shaped cell culture for transplantation, a process for producing a sheet-shaped cell culture
  • a good evaluation is possible even if the sheet is formed so as to cover a part of the semi-permeable portion.
  • Examples of the sheeting medium used for sheeting include, but are not limited to, water, physiological saline, various physiological buffers (for example, PBS, HBSS, etc.), and various basal media for cell culture. Etc. may be used.
  • a basal medium is not limited, for example, DMEM, MEM, F12, DME, RPMI 1640, MCDB (MCDB102, 104, 107, 120, 131, 153, 199 etc.), L15, SkBM, RITC80-7, DMEM / F12 and the like are included. Many of these basal media are commercially available, and their compositions are also known.
  • the basal medium may be used in a standard composition (for example, as it is commercially available), or the composition may be appropriately changed depending on the cell type and cell conditions. Therefore, the basal medium used in the present invention is not limited to those having a known composition, and includes one in which one or more components are added, removed, increased or decreased.
  • the sheeting medium may contain additives such as serum (for example, bovine serum such as fetal bovine serum, horse serum, human serum, etc.) and various growth factors (for example, FGF, EGF, VEGF, HGF, etc.).
  • serum for example, bovine serum such as fetal bovine serum, horse serum, human serum, etc.
  • growth factors for example, FGF, EGF, VEGF, HGF, etc.
  • the step of adding a label can also be performed by any known technique and conditions.
  • the label may be added to the first container, for example, by adding the label directly to the sheeting medium contained in the first container, or by replacing the sheeting medium with another medium to which the label is added.
  • the sheet-forming medium may be replaced with another medium, and a label may be added to the medium after replacement.
  • a low-nutrition medium for example, HBSS
  • the state of the sheet-shaped cell culture can be maintained as it is, which is suitable for confirming the state of the completed sheet-shaped cell culture.
  • hypoxic conditions for example, oxygen concentration of about 0.1 to about 10%
  • cell growth can be stopped and the state of the sheet-shaped cell culture can be maintained as it is. it can.
  • the label may be added to the second container by directly adding the label to the second container that is in fluid communication with the first container through the semipermeable portion.
  • the first container may be in fluid communication with the second container containing the prepared medium through the semi-permeable portion.
  • the label may be added to the first container or the second container simultaneously with the seeding of the cells in the first container, before the seeding, and / or after the seeding.
  • the label may be added only once or a plurality of times.
  • the amount of the label to be added may vary depending on the label to be used, the amount of the medium contained in the container, the transfer period, etc., but those skilled in the art can find an appropriate amount to be added by routine experimentation.
  • the liquid communication between the first container and the second container via the semi-permeable part is, for example, that the first container is completely immersed in the liquid medium contained in the second container. As described above, it can be performed by arranging the second container. By allowing the first container and the second container to communicate with each other through the semi-permeable portion, the label added to the first container or the second container is diffused through the semi-permeable portion. This makes it possible to move to the second container or the first container.
  • the medium in the second container may be the same as or different from the sheeted medium.
  • the medium in the second container is different from the sheeting medium, remove the sheeting medium contained in the first container before immersing the semi-permeable portion in the medium in the second container, or The same medium as that in the two containers may be substituted. Further, when the medium in the second container is different from the sheeted medium, it is preferable to use a medium having a small osmotic pressure difference from the sheeted medium.
  • the medium contained in the container to which the label is transferred (hereinafter sometimes referred to as a label detection medium) is preferably one that does not adversely affect the detection of the label. For example, when the label is a fluorescent label or a colorimetric label, the medium preferably has no dye or autofluorescence.
  • the labeling is performed except that the labeling substance is not contained in the second container or the first container to which the label is transferred when the label is added to the first container or the second container.
  • the same unlabeled substance as the substance for example, when using fluorescently labeled dextran as a label, unlabeled dextran
  • the influence of osmotic pressure can be eliminated and more accurate evaluation can be performed.
  • the step of transferring the label to the first container and the second container to which the label is not added through the semipermeable portion includes adding the label to the first container or the second container. Thereafter, the first container and the second container can be incubated for a predetermined period in a state where the first container and the second container are in fluid communication via the semipermeable portion. Liquid communication between the first container and the second container may be performed before the label is added, after the label is added, or at the same time as the label is added. The transfer of the label is caused by the diffusion of the label.
  • the transition period is not particularly limited, and may be, for example, 1 minute to 72 hours, 5 minutes to 48 hours, 10 minutes to 36 hours, 15 minutes to 24 hours, and the like.
  • the incubation temperature is not particularly limited as long as it does not inhibit the diffusion of the label.
  • the incubation temperature is about 2 ° C to about 45 ° C, about 4 ° C to about 40 ° C, about 8 ° C to about 38 ° C, about 10 ° C to about It may be 38 ° C., about 15 ° C. to about 30 ° C., and the like.
  • the transition step is performed in a state where the level difference between the level of the liquid stored in the first container and the level of the liquid stored in the second container is small. From the viewpoint of the above.
  • the situation in which there is a difference in level between the liquid level of the liquid stored in the first container and the liquid level of the liquid stored in the second container is the liquid level of the liquid stored in the first container Is higher than the liquid level of the liquid stored in the second container, and the liquid level of the liquid stored in the first container is lower than the liquid level of the liquid stored in the second container.
  • the height difference is preferably as small as possible, and is not limited.
  • the height difference does not substantially exist, and it is most preferable that the height difference does not exist at all (that is, the height difference is 0 mm). In one embodiment, the height difference is in the range of 0-10 mm.
  • the height difference can be adjusted, for example, by adjusting the amount of liquid added to the first container and / or the second container.
  • the step of detecting the label transferred to the first container or the second container to which no label is added can be performed by any known technique capable of detecting the label.
  • the label is a fluorescent label
  • the first or second container that may contain the transferred label is irradiated with light of a predetermined wavelength, and the intensity of the generated fluorescence is measured to It can be quantified.
  • the transferred label that can be contained in the first container or the second container may be detected in the container, or the medium contained in the container is taken out and the label is detected. You may detect out of a container.
  • the semi-permeable portion may be sealed with a suitable member, such as a film or a cap, to prevent leakage of the medium.
  • the enzyme When the label is detected with another substance (detection agent) (for example, when a substance that is colored or luminescent by an enzymatic reaction is used as a label and this is detected by reacting with the enzyme, the enzyme is used as the label,
  • the enzyme substrate for example, when detecting by reacting with a substance that is colored or luminescent by an enzymatic reaction
  • the detection agent may be reacted with the label in the step of detecting the transferred label
  • a detection agent is put in a container to be transferred in advance before the detection step, and in the detection step, a signal (for example, coloration, luminescence, etc.) generated by the reaction between the label and the detection agent may be detected. .
  • the quality of the formed sheet cell culture can be evaluated from the measured amount of label.
  • the quality of the sheet-shaped cell culture includes the strength of the sheet-shaped cell culture, the degree of sheet formation, the cell density, the viability of the cells, the vitality of the cells, the adhesion state between the cells, and the like.
  • the greater the cell gap present in the sheet cell culture the greater the amount of label that migrates, but the greater the cell gap, the lower the strength of the sheet cell culture.
  • the less the sheet is formed, the lower the cell density, and the lower the viability and vitality of the cells the greater the amount of label transferred.
  • Quality evaluation can be performed by, for example, comparing the amount of detected label with a predetermined reference value. More specifically, for example, when the amount of the detected label is equal to or less than a predetermined reference value, the quality is evaluated as good, and when the amount exceeds the reference value, the quality is evaluated as poor. Can do.
  • the reference value can be obtained by experiments or the like.
  • the amount of the label includes numerical values related thereto, for example, numerical values such as absorbance, fluorescence intensity, emission intensity, RFU, and radiation dose according to the property of the label.
  • the quality evaluation method of the present invention can be applied to a sheet-like cell culture actually used for transplantation or the like, but a sheet-like cell culture representing a lot consisting of a plurality of sheet-like cell cultures produced under the same conditions You may apply to. In the latter case, the result of quality evaluation by this method can be applied to the whole lot to which the culture belongs.
  • (1) cells are seeded in a first container having a semipermeable portion that allows a label to pass but cells do not pass, and is formed into a sheet so as to cover the semipermeable portion.
  • the present invention relates to a method for determining completion of sheeting (hereinafter, sometimes referred to as “sheeting completion determination method”).
  • Steps (1) to (4) in the sheeting completion determination method of the present invention are as described above for the quality evaluation method of the present invention.
  • Example 5 shows, the amount of transition label per unit time gradually decreases with the progress of sheeting, and is maintained at a substantially constant amount when sheeting is completed. Therefore, the completion of sheeting can be detected by periodically measuring or monitoring the amount of label transferred. For the measurement of the amount of transfer label etc., only step (4) is repeated regularly, or steps (2) to (4) are repeated periodically, or steps (3) to (4) are repeated periodically. May be. When only step (4) is repeated periodically, the amount of the label increases with the passage of time because the label continuously moves to and accumulates in a container to which no label has been added.
  • the amount of increase per unit time gradually decreases with the progress, and becomes almost constant when the sheeting is completed. Therefore, for example, the amount of increase in the label is calculated from the amount of the label measured periodically, and when the increase becomes substantially constant in a plurality of consecutive measurements, it can be determined that the sheeting is completed. .
  • steps (2) to (4) are periodically repeated, for example, if the transferred label is removed after step (4), the label is newly added in step (2) of the next cycle. ), The amount of the detected label gradually decreases with time, and becomes almost constant when the sheeting is completed. Accordingly, it can be determined that the sheeting is completed when the amount of the marker measured periodically becomes substantially constant in a plurality of consecutive measurements.
  • steps (3) to (4) are periodically repeated, for example, if the transferred label is removed after step (4), the label is newly transferred in step (3) of the next cycle. Therefore, the amount of the detected label gradually decreases with time, and becomes almost constant when the sheeting is completed. Accordingly, it can be determined that the sheeting is completed when the amount of the marker measured periodically becomes substantially constant in a plurality of consecutive measurements.
  • the fluctuation range of the label amount or the increase amount in a plurality of consecutive measurements at this time is not limited, for example, about ⁇ 20% / hour, within about ⁇ 10% / hour, within about ⁇ 8% / hour, It may be within about ⁇ 6% / hour, within about ⁇ 5% / hour, within about ⁇ 4% / hour, within about ⁇ 3% / hour, within about ⁇ 2% / hour, and the like.
  • the determination of completion of sheeting can also be made based on the average rate of change or differential coefficient.
  • the absolute value of the rate of change over time of the amount of label detected (for example, the total amount of transition and the amount of transition per unit time) becomes smaller as the sheeting progresses.
  • the amount is expressed as a function of time, and when the change rate or the absolute value of the differential coefficient becomes smaller than a predetermined value, it can be determined that the sheeting is completed.
  • the absolute value of the differential coefficient is not limited, for example, about 1.0 or less, about 0 9.9 or less, about 0.8 or less, about 0.7 or less, about 0.6 or less, about 0.5 or less, about 0.4 or less, about 0.3 or less, about 0.2 or less, about 0.1 It may be the following.
  • the method for determining completion of sheeting includes the step of periodically measuring or monitoring the amount of the transferred label and / or when the amount or increase of the label becomes substantially constant in a plurality of consecutive measurements.
  • the method may further include a step of determining that the sheet formation is completed when the absolute value of the change rate of the amount of the label with time becomes equal to or less than the reference value.
  • the sheet formation completion judging method of the present invention is a sheet-like cell representing a lot consisting of a plurality of sheet-like cell cultures produced under the same conditions even when applied to a sheet-like cell culture actually used for transplantation or the like. It may be applied to cultures. In the latter case, the determination result by the present method can be applied to the entire lot to which the culture belongs, and the timing at which the sheet-shaped cell culture is peeled from the culture substrate can be optimized.
  • (1) cells are seeded in a first container having a semipermeable portion through which a label passes but cells do not pass, and the sheet culture is performed so as to cover the semipermeable portion.
  • Step to do (2) adding a label to the first container or a liquid-impermeable second container capable of being in fluid communication with the first container via the semi-permeable portion; (3) In a state where the first container and the second container are in liquid communication via the semipermeable portion, the label is a container to which the label is not added among the first container and the second container.
  • the present invention relates to a method for producing a transplanted sheet-like cell culture (hereinafter sometimes abbreviated as “manufacturing method”), which may be performed before step (1) or after step (1).
  • Steps (1) to (4) in the sheeting completion determination method of the present invention are as described above for the quality evaluation method of the present invention. Also, in step (5), “when the amount or increase of the label becomes substantially constant in a plurality of consecutive measurements” and “when the absolute value of the rate of change of the amount of the label over time is below the reference value "Is as described above for the sheet formation completion determination method of the present invention.
  • the recovery of the sheet-shaped cell culture from the first container in step (5) is free (detachment) from the culture substrate serving as a scaffold while the sheet-shaped cell culture is at least partially maintained in the sheet structure.
  • it can be carried out by enzymatic treatment with a proteolytic enzyme (such as trypsin) and / or mechanical treatment such as pipetting.
  • a proteolytic enzyme such as trypsin
  • a cell culture is formed by culturing a cell on a culture surface coated with a material that changes its physical properties in response to stimulation, for example, temperature or light, a predetermined stimulation can be applied. It can also be released non-enzymatically.
  • the production method of the present invention may further include a step of washing the sheet-shaped cell culture during, before or after step (5). By this step, the label attached to the sheet-shaped cell culture can be removed.
  • (1) cells are seeded in a first container having a semipermeable portion through which a label passes but cells do not pass, and the sheet culture is performed so as to cover the semipermeable portion.
  • Step to do (2) adding a label to the first container or a liquid-impermeable second container capable of being in fluid communication with the first container via the semi-permeable portion; (3) In a state where the first container and the second container are in liquid communication via the semipermeable portion, the label is a container to which the label is not added among the first container and the second container.
  • step (2) may be performed simultaneously with step (1), before step (1) or after step (1).
  • the present invention relates to a good method for evaluating the sheet-forming ability of cells (hereinafter sometimes abbreviated as “sheet-forming ability evaluation method”).
  • Steps (1) to (4) in the sheet forming ability evaluation method of the present invention are as described above for the quality evaluation method of the present invention.
  • Example 6 it was revealed that cells that cause abnormalities in sheet formation, such as peeling during sheet formation, have a large amount of label transfer after sheet formation. Therefore, by performing steps (1) to (4), whether or not cells of a certain subject (for example, a patient) have a sheet forming ability suitable for preparation of a clinical sheet-like cell culture used for transplantation or the like. Can be assessed in advance based on the amount of label detected. Thereby, it is possible to avoid the start of production of an incomplete sheet-like cell culture.
  • the sheet forming ability means the ability of cells to form a sheet.
  • the ability of cells to adhere to the culture substrate for the formation of a sheet, the ability of cells to adhere to the culture substrate, the ability to adhere to each other, the secretion ability of extracellular matrix, the ability to spread, the ability to move, etc. It is considered that various abilities of cells and cell vitality are involved.
  • the evaluation of the sheet forming ability can be performed, for example, by comparing the amount of the detected label with a predetermined reference value. More specifically, for example, when the amount of the detected label is less than or equal to a predetermined reference value, the cell sheet forming ability is evaluated as sufficient, and when the amount exceeds the reference value, the cell sheet forming ability is evaluated. Can be evaluated as insufficient.
  • the reference value can be obtained by experiments or the like.
  • the evaluation result that the sheet forming ability is insufficient by the sheet forming ability evaluation method of the present invention is used as a material for determining whether a certain object is suitable for the treatment using the sheet-like cell culture. Can do.
  • (1) cells are seeded in a first container having a semipermeable portion through which a label passes but cells do not pass, and the sheet culture is performed so as to cover the semipermeable portion.
  • Step to do (2) adding a label to the first container or a liquid-impermeable second container capable of being in fluid communication with the first container via the semi-permeable portion; (3) In a state where the first container and the second container are in liquid communication via the semipermeable portion, the label is a container to which the label is not added among the first container and the second container.
  • the present invention relates to a method for detecting sheet peeling in the production process of a sheet-shaped cell culture (hereinafter, sometimes abbreviated as “peeling detection method”).
  • Steps (1) to (4) in the peeling detection method of the present invention are as described above for the quality evaluation method of the present invention.
  • the amount of label transfer is measured at multiple points in the manufacturing process of the sheet-shaped cell culture, and the amount of transfer gradually decreases as the sheeting progresses, the amount of transfer increases (or the rate of decrease decreases) It can be determined that peeling has occurred.
  • Another aspect of the present invention is: (1) a label that inhibits passage between cells by cell-cell adhesion; (2) a first container having a semi-permeable portion through which the label passes but cells do not pass, and (3) a liquid-impermeable second container capable of containing the semi-permeable portion.
  • Production of sheet cell culture, quality evaluation of sheet cell culture, determination of completion of sheet formation of sheet cell culture, evaluation of cell sheet forming ability, and / or in production process of sheet cell culture The present invention relates to a kit for detection of peeling.
  • kit of the present invention has an arbitrary configuration suitable for one or more of the above-mentioned applications, for example, a medium added to each container, a coloring reagent, a light shielding cover, an instruction manual for each application, and information on a usage method. May be further included, for example, a flexible disk, CD, DVD, Blu-ray disk, memory card, USB memory, and the like.
  • Another aspect of the present invention is: (1) a label that inhibits passage between cells by cell-cell adhesion; (2) a first container having a semipermeable portion through which the label passes but cells do not pass; (3) Production of sheet-shaped cell culture, sheet-shaped cell culture, comprising a liquid-impermeable second container capable of accommodating the semi-permeable portion, and (4) a detector for detecting a label
  • the present invention relates to a system for quality evaluation, determination of completion of sheet formation of a sheet-shaped cell culture, evaluation of the sheet-forming ability of cells, and / or detection of detachment in the manufacturing process of the sheet-shaped cell culture.
  • Components (1) to (3) of the system of the present invention are as described above for the quality evaluation method of the present invention.
  • the detector of the component (4) is not particularly limited as long as it can detect the label.
  • a photometer such as a spectrophotometer, an absorptiometer, a turbidimeter, a colorimeter, a scintillation counter or the like Including detectors.
  • One skilled in the art can select a detector suitable for the label used.
  • the system of the present invention may include only one type of detector or a plurality of types of detectors.
  • the system of the present invention has an arbitrary configuration suitable for one or more of the above applications, for example, a processor for processing a signal from a detector and controlling an actuator, an interface such as a display device or an input device, a sign May be further provided with an injector for adding the above to the container, a manipulator for moving each container, an incubator for cell culture, a stirrer, and the like.
  • a first container having a semi-permeable portion through which a label passes but cells do not pass is coated with the isolated sheet-shaped cell culture on the semi-permeable portion.
  • Step to arrange (2) adding a label to the first container or a liquid-impermeable second container that can be in fluid communication with the first container via the semi-permeable portion; (3) In a state where the first container and the second container are in liquid communication via the semipermeable portion, the label is a container to which the label is not added among the first container and the second container.
  • Transitioning through a semi-permeable part (4) including a step of detecting the label transferred to the container to which the label is not added, wherein the label is inhibited from passing between cells by cell-cell adhesion, and step (2) includes step (1) And a method for evaluating the quality of an isolated sheet-shaped cell culture (hereinafter referred to as “quality evaluation method for isolated sheet-shaped cell culture”, which may be performed before or after step (1). "May be abbreviated as”).
  • Each step of the quality evaluation method of the isolated sheet-shaped cell culture of the present invention consists in that the cells are seeded in a first container and instead of sheeting so as to cover the semipermeable part, the isolated sheet
  • the cell-like cell culture is the same as the quality evaluation method of the present invention except that the cell-like culture is arranged so as to cover the semipermeable portion on the first container, and the quality of the same sheet-like cell culture, for example,
  • the strength of the sheet-shaped cell culture, the degree of sheet formation, the cell density, the viability of the cells, the vitality of the cells, the adhesion state between the cells, and the like can be evaluated.
  • An “isolated sheet cell culture” typically refers to a sheet cell culture that has been released (peeled) from a culture substrate after sheeting.
  • the arrangement of the isolated sheet cell culture can be performed over a predetermined period so that the isolated sheet cell culture adheres to the semipermeable portion. Adhesion of the isolated sheet-shaped cell culture to the semipermeable portion can be achieved, for example, by culturing the isolated sheet-shaped cell culture in a state where it is in contact with the semipermeable portion for a predetermined period. .
  • the arrangement period (for example, the culture period) is not particularly limited as long as it enables adhesion to the semipermeable portion of the isolated sheet-shaped cell culture, and for example, 5 minutes to 24 hours, 10 minutes to 12 The time may be 15 minutes to 6 hours, 30 minutes to 3 hours, or the like.
  • the isolated sheet-shaped cell culture is composed of two or more cell layers, even if it is composed of one cell layer (single-layer sheet-shaped cell culture).
  • (Layered sheet cell culture) may be used.
  • a laminated sheet-shaped cell culture is produced, for example, by superposing two or more sheet-shaped cell cultures directly or via an intervening substance to form a single sheet-shaped cell culture.
  • the intervening substance include, but are not limited to, a substance that promotes and / or strengthens adhesion between sheet-like cell cultures, and non-limiting examples thereof include, for example, an extracellular matrix component or the like.
  • compositions eg, collagen, fibronectin, laminin, vitronectin, proteoglycan, glycosaminoglycan, hydrogel, gelatin, etc.
  • adhesion proteins eg, cadherin family, selectin family, integrin family, etc.
  • a plurality of sheet-like cell cultures are coated on a semi-permeable portion in a first container having a semi-permeable portion through which a label passes but a cell does not pass.
  • Step of laminating (2) adding a label to the first container or a liquid-impermeable second container that can be in fluid communication with the first container via the semi-permeable portion; (3) In a state where the first container and the second container are in liquid communication via the semipermeable portion, the label is a container to which the label is not added among the first container and the second container.
  • Transitioning through a semi-permeable part (4) including a step of detecting the label transferred to the container to which the label is not added, wherein the label is inhibited from passing between cells by cell-cell adhesion, and step (2) includes step (1) Simultaneously with step (1) or after step (1), the method for quality evaluation of the laminated sheet-like cell culture (hereinafter referred to as “the quality evaluation method of laminated sheet-like cell culture”) May be abbreviated).
  • Steps (2) to (4) in the quality evaluation method for the laminated sheet-shaped cell culture of the present invention are as described above for the quality evaluation method of the present invention.
  • the stacking of a plurality of sheet-like cell cultures is performed by first seeding cells in a first container and forming a sheet so as to cover the semipermeable portion. From the above, even if the isolated sheet-shaped cell culture prepared separately is stacked on the sheet-shaped cell culture formed into a sheet, the first isolated sheet-shaped cell culture is first placed in the first container. The second isolated sheet-shaped cell culture prepared separately may be placed on the semi-permeable portion and then laminated on the first isolated sheet-shaped cell culture. Good.
  • the isolated sheet-shaped cell culture may be a single layer or a layered one, and one or two or more single-layer cell cultures are formed on the isolated sheet-shaped cell culture stacked in the first container.
  • a release sheet-shaped cell culture may be further laminated.
  • the number of sheet-like cell cultures to be laminated is not particularly limited, and may be, for example, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 or 10, or 11 or more.
  • the lamination of the sheet-shaped cell culture is not limited, and can be achieved, for example, by placing the isolated sheet-shaped cell culture on the sheet-shaped cell culture in the first container.
  • the arrangement is not limited, and can be achieved, for example, by superimposing two or more sheet-like cell cultures directly or via an intervening substance.
  • the intervening substance it is as having mentioned above about the quality evaluation method of the isolated sheet-like cell culture of this invention.
  • the overlapping sheet-like cell cultures may be cultured for a predetermined period.
  • the culture period is not particularly limited as long as it allows adhesion between the overlapping sheet-like cell cultures, for example, 5 minutes to 24 hours, 10 minutes to 12 hours, 15 minutes to 6 hours, 30 minutes to 30 minutes to It may be 3 hours.
  • the culturing may be performed every time one isolated sheet-shaped cell culture is stacked, or after all the desired number of isolated sheet-shaped cell cultures are stacked.
  • the laminated sheet-like cell culture after evaluation may be peeled off from the first container and used for transplantation or the like.
  • the strength of the laminated sheet-shaped cell culture can be evaluated.
  • the degree of sheeting for example, the cell density, the viability of the cells, the vitality of the cells, the adhesion state between the cells, the sheet-like cells.
  • the number of cultures stacked, stacking defects for example, bending, wrinkle formation, tearing, etc. of the sheet-shaped cell culture during stacking.
  • cells are seeded in a first container having a semipermeable portion that allows a label to pass but cells do not pass, and is formed into a sheet so as to cover the semipermeable portion. Or placing an isolated sheet cell culture in the first container so as to cover the semipermeable part; (2) adding a label to the first container or a liquid-impermeable second container capable of being in fluid communication with the first container via the semi-permeable portion; (3) In a state where the first container and the second container are in liquid communication via the semipermeable portion, the label is a container to which the label is not added among the first container and the second container.
  • the present invention relates to a method for evaluating the cell purity or cell composition ratio of a sheet-shaped cell culture (hereinafter, sometimes abbreviated as “cell purity evaluation method”).
  • Steps (1) to (4) in the cell purity evaluation method of the present invention are as described above for the quality evaluation method of the present invention and the quality evaluation method of the isolated sheet cell culture.
  • Example 8 it has now been clarified that the amount of transfer label per unit time varies depending on the type of cells constituting the sheet-shaped cell culture. Therefore, the amount of transfer label in a sheet-shaped cell culture whose cell purity or cell composition ratio is unknown is detected, and this is the same as the amount of transfer label in a sheet-like cell culture whose cell purity or cell composition ratio is measured under the same conditions. By comparing, it is possible to estimate the cell purity or cell constituent ratio of the sheet-like cell culture to be evaluated, or to detect an abnormality in the cell purity or cell constituent ratio.
  • the cells to be seeded may contain a plurality of cell types, and typically the cell purity and / or cell composition ratio is unknown.
  • the cell purity evaluation method of the present invention may further include a step of comparing the detected amount of transferred label with a reference value.
  • the reference value is not limited, and may be, for example, a transfer label amount in a sheet-shaped cell culture having a known cell purity or cell composition ratio measured under the same conditions as the sheet-shaped cell culture to be evaluated. There may be one or more reference values to be compared.
  • the reference value may be a transfer label amount for a sheet-shaped cell culture having one kind of desired cell purity, or two kinds of sheet-shaped cell cultures having an upper limit and a lower limit cell purity of an allowable range.
  • the deviation between the detected transfer marker amount and the reference value is larger than a predetermined level, or the detected transfer marker amount is not included in the predetermined range composed of a plurality of reference values It can be evaluated that there is an abnormality in the cell purity or cell composition ratio of the sheet-like cell culture to be evaluated.
  • the evaluation target it can be evaluated that the cell purity or cell composition ratio of the sheet-like cell culture is normal. Furthermore, based on a plurality of reference values, a calibration curve showing the relationship between the cell purity or cell composition ratio and the amount of transfer label is prepared, and from the detected amount of transfer label, the sheet-like cell culture to be evaluated The cell purity or cell composition ratio can be estimated.
  • the cell purity is that of skeletal myoblasts. In one embodiment, the cell purity is that of fibroblasts. In one embodiment, the cell component ratio is a component ratio between skeletal myoblasts and fibroblasts.
  • (1) cells are seeded in a first container having a semipermeable portion through which a label passes but cells do not pass, and the sheet culture is performed so as to cover the semipermeable portion.
  • Step to do (2) adding a label to the first container or a liquid-impermeable second container capable of being in fluid communication with the first container via the semi-permeable portion; (3) In a state where the first container and the second container are in liquid communication via the semipermeable portion, the label is a container to which the label is not added among the first container and the second container.
  • the method includes a step of detecting an abnormality in the manufacturing process of the sheet-shaped cell culture based on the comparison result, and the label is inhibited from passing between cells due to cell-cell adhesion.
  • a method for detecting an abnormality in the production process of a sheet-shaped cell culture that may be performed prior to step (1) or after step (1) at the same time as (1) (hereinafter sometimes abbreviated as “abnormality detection method”) Is).
  • Steps (1) to (4) in the abnormality detection method of the present invention are as described above for the quality evaluation method of the present invention.
  • Reference values in step (5) are abnormalities in various parameters of the sheet-shaped cell culture being produced, for example, the strength of the sheet-shaped cell culture, the degree of sheeting, the cell density, the viability of the cells, and the vitality of the cells Including those related to abnormalities such as the state of adhesion between cells.
  • Non-limiting examples of reference values include, for example, the amount of migration label in a standard sheet-shaped cell culture that has been sheeted (for example, the average value of the amount of migration label in a plurality of sheet-shaped cell cultures that have been sheeted Etc.), the amount of migration label in a standard sheet-like cell culture after the lapse of a predetermined period from the start of sheeting (for example, the average value of the amount of migration label in a plurality of sheet-like cell cultures after the lapse of a predetermined period from the start of sheeting Etc.), differential coefficient with respect to the time of the amount of migration label in the standard sheet-shaped cell culture after the lapse of a predetermined period from the start of sheeting (for example, transition in a plurality of sheet-shaped cell cultures after the lapse of the predetermined period from the start of sheeting The average value of the derivative of the labeled amount with respect to the time of the transferred label amount, etc.), the amount of change in the transition label over time and the rate of change (for example, the
  • the detected amount of transferred label is compared with a reference value. For example, if the reference value is a single numerical value, whether the detected amount of transferred label is larger or smaller than the reference value. Or if they are the same, or if the reference value is in the numerical range, output whether the detected transition marker amount is included in the reference value, greater than the upper limit of the reference value, or less than the lower limit of the reference value To do.
  • step (6) in response to the comparison result in step (5), an abnormality in the manufacturing process of the sheet-shaped cell culture (for example, the presence or absence of abnormality, the presence or absence of a possibility of abnormality) is detected.
  • an abnormality in the manufacturing process of the sheet-shaped cell culture for example, the presence or absence of abnormality, the presence or absence of a possibility of abnormality
  • the lower the cell density the greater the amount of transfer label after the elapse of the predetermined period. Therefore, if the amount of transfer label after the elapse of the predetermined period from the start of sheeting is greater than the reference value, the cell density It is possible to detect the presence of anomaly or the possibility of low.
  • Example 4 shows, the lower the viability of cells, the greater the amount of migration label after the lapse of the predetermined period.
  • Example 5 shows, as the sheet-like cell culture progresses to sheeting, the amount of transfer label per unit time decreases and gradually approaches 0, and the integrated amount of transfer label gradually increases to a constant value.
  • the amount of change or rate of change per unit time of the amount of transition marker is the largest at the beginning of sheeting and gradually decreases with time.
  • the differential coefficient with respect to the time of the transition marker amount after the lapse of a predetermined period from the start of sheeting, the change amount and rate of change of the transition marker over time within the predetermined period after the start of sheeting, and between two different time points after the start of sheeting When the amount of change and the rate of change in the amount of transition marker in the are larger than the reference value, it is possible to detect the presence of abnormality or the possibility of sheet formation failure.
  • Example 6 since the amount of transfer label increases when cell detachment occurs during sheet formation, if the amount of transfer label after the elapse of a predetermined period from the start of sheet formation is greater than the reference value, It is possible to detect the presence of an abnormality or the possibility that peeling has occurred.
  • Detection of the amount of transfer label is relatively early in the production process (without limitation, for example, within 1 hour, within 2 hours, within 3 hours, within 4 hours, within 5 hours, within 6 hours, within 7 hours after cell seeding) , Within 8 hours, within 9 hours or within 10 hours, etc.), it becomes possible to detect abnormalities at an early stage and take necessary measures.
  • (1) cells are seeded in a first container having a semipermeable portion through which a label passes but cells do not pass, and the sheet culture is performed so as to cover the semipermeable portion.
  • Step to do (2) adding a label to the first container or a liquid-impermeable second container capable of being in fluid communication with the first container via the semi-permeable portion; (3) In a state where the first container and the second container are in liquid communication via the semipermeable portion, the label is a container to which the label is not added among the first container and the second container.
  • Step (2) includes step (1).
  • the present invention relates to a method for producing a sheet-shaped cell culture (hereinafter sometimes abbreviated as “controlled production method”).
  • Steps (1) to (5) in the controlled manufacturing method of the present invention are as described above for the quality evaluation method and abnormality detection method of the present invention.
  • step (6) the manufacturing process of the sheet-shaped cell culture is variously controlled based on the comparison result in step (5).
  • an abnormality in the manufacturing process of the sheet-shaped cell culture or the presence or absence of the abnormality is detected. If the possibility is not detected, continue the production. If the abnormality or the possibility is detected, stop the production, stop the production, investigate the abnormality, and take measures to resolve it. Can do.
  • Non-limiting examples of measures for eliminating abnormalities include, for example, if the abnormalities are insufficient in cell density, discontinuing production, seeding more cells and re-staging, etc. If it is abnormal, replace the medium, etc. If the abnormality is cell detachment, stop manufacturing, re-sheeting, etc. If the abnormality is poor sheeting, extend the sheeting period And stop manufacturing and redo the sheet.
  • Non-limiting examples of specific aspects of the controlled manufacturing method of the present invention are described in more detail with reference to the algorithms shown in FIGS.
  • algorithm 1 after the start of the treatment (Start), cells are first seeded (Plating), and sheet culture (Incubation 1) is performed so as to cover the semipermeable portion. ).
  • the first transition label amount X is detected (Detection 1), and X is compared with the first reference value (Reference value 1). If X is larger than the first reference value (in the case of “No”), it is determined that there has been a problem in cell seeding (for example, a shortage of the number of cells), and seeding is performed again.
  • the reseeding of seeding is not limited.
  • the cell culture in sheet culture is treated with a single cell by enzyme treatment or the like. After adjusting the number of cells by adding additional cells from the suspension, discard the cell culture in the sheet culture and seed with new cells even if it is performed by seeding in a container. May be performed.
  • X is not more than the first reference value (“Yes”), the sheet culture is continued (Incubation 2).
  • the second transition marker amount Y is detected (Detection 2), and Y is compared with the second reference value (Reference value 2). If Y is larger than the second reference value (in the case of “No”), it is determined that the sheet culture time is insufficient, and sheet culture is performed for a predetermined period. After a predetermined period, the second transfer label amount Y is detected again and compared with the second reference value. This process is repeated until Y becomes equal to or smaller than the second reference value. If Y is less than or equal to the second reference value (“Yes”), it is determined that sheeting has been completed, and an appearance inspection is performed.
  • the sheet-like cell culture is detached from the culture substrate (Detachment), and the processing is ended (End). If an abnormality is observed in the appearance inspection (in the case of “No”), the medium is replaced (Medium replacement), and the sheet culture is resumed. If abnormalities are observed in the appearance inspection even in the sheet culture after the medium replacement, the processing may be terminated without further medium replacement.
  • Partially peeled if the whole sheet-shaped cell culture is peeled from the culture substrate while maintaining the integrity of the sheet-shaped cell culture, fully peeled (Fully). No (No) can be made. In addition, when the sheet-like cell culture is agglomerated after a certain period of time after peeling, the sheet-like cell culture may be discarded without being used.
  • the cells can be used effectively by correcting the abnormalities by replacing the medium or adding cells instead of discarding the cells. It can be reduced and the yield can be increased.
  • the state of the medium is inspected, and if abnormalities (for example, discoloration, turbidity, abnormal pH, etc.) are observed (in the case of “No”), the medium is replaced (Medium replacement), restart the sheet culture. If X is below the reference value (if “Yes”), perform visual inspection, and if there are no abnormalities (if “Yes”), peel off the cell culture from the culture substrate (Detachment) and treat End (End).
  • abnormalities for example, discoloration, turbidity, abnormal pH, etc.
  • Detection 2 After a predetermined period of time, detect the amount of transition marker (Detection 2), calculate the absolute value Y of the amount of change or rate of change with the amount of transition marker detected immediately before (Detection 1 or Detection 2), and set Y as the second Compare with the reference value (Reference value 2).
  • the sheet-shaped cell culture is detached from the culture substrate (Detachment), and the process is ended (End).
  • the reference ranges A to B are not particularly limited, and may be, for example, 24 hours to 72 hours. Appearance inspection can be performed before peeling to further detect appearance abnormalities. In this algorithm, when the completion of sheeting is late, it is possible to take appropriate measures according to the length of the total sheeting culture period, and it is possible to improve the production efficiency.
  • the above algorithm represents a specific aspect of the controlled manufacturing method of the present invention, and it goes without saying that the controlled manufacturing method of the present invention includes not only these aspects but also various other aspects. . Further, the above or other algorithms relating to the controlled production method of the present invention may be implemented in a system for controlled production of a sheet-shaped cell culture described below.
  • Another aspect of the present invention is: (1) a label that inhibits passage between cells by cell-cell adhesion; (2) a first container having a semi-permeable portion through which the label passes but cells do not pass, and (3) a liquid-impermeable second container capable of containing the semi-permeable portion.
  • Quality evaluation of isolated sheet cell culture quality evaluation of laminated sheet cell culture, evaluation of cell purity or cell composition ratio of sheet cell culture, detection of abnormalities in manufacturing process of sheet cell culture, and And / or a kit for the controlled production of sheet cell cultures.
  • kit of the present invention has an arbitrary configuration suitable for one or more of the above-mentioned applications, for example, a medium added to each container, a coloring reagent, a light shielding cover, an instruction manual for each application, and information on a usage method. May be further included, for example, a flexible disk, CD, DVD, Blu-ray disk, memory card, USB memory, and the like.
  • Another aspect of the present invention is: (1) a label that inhibits passage between cells by cell-cell adhesion; (2) a first container having a semipermeable portion through which the label passes but cells do not pass; (3) Quality evaluation of an isolated sheet-like cell culture, laminated sheet-like, comprising a liquid-impermeable second container capable of accommodating the semi-permeable portion, and (4) a detector for detecting a label
  • quality evaluation of cell culture evaluation of cell purity or cell composition ratio of sheet-shaped cell culture, detection of abnormality in manufacturing process of sheet-shaped cell culture, and / or control production of sheet-shaped cell culture About the system.
  • Components (1) to (3) of the system of the present invention are as described above for the quality evaluation method of the present invention.
  • the detector of the component (4) is not particularly limited as long as it can detect the label of the present invention.
  • a photometer such as a spectrophotometer, an absorptiometer, a turbidimeter, a colorimeter, a scintillation counter Including radiation detectors.
  • One skilled in the art can select a detector suitable for the label used.
  • the system of the present invention may include only one type of detector or a plurality of types of detectors.
  • the system of the present invention has an arbitrary configuration suitable for one or more of the above applications, for example, a processor for processing a signal from a detector and controlling an actuator, an interface such as a display device or an input device, a sign May be further provided with an injector for adding the above to the container, a manipulator for moving each container, an incubator for cell culture, a stirrer, and the like.
  • the processor may be implemented with the above or other algorithms relating to the controlled production method of the present invention.
  • Example 1 Examination of pore density of semipermeable part As a first container, a pore diameter of 3 ⁇ m, a pore density of 8.0 ⁇ 2 ⁇ 10 5 pieces / cm 2 (low density) or 2.0 ⁇ 0.2 ⁇ 10 A transparent / transparent 6-well culture insert (BD) made of PET having a density of 5 / cm 2 (high density) was used as a second container. The culture insert was inserted into a plate well containing 2.7 ml of DMEM-F12 medium (Life Technologies) containing 20% human serum, and 4.4 ⁇ 10 6 skeletal myoblasts prepared from human muscle tissue by a conventional method were used.
  • DMEM-F12 medium Life Technologies
  • the culture insert was suspended and seeded in 1.5 ml of the same medium as in the plate well at the density of the culture insert.
  • Sheet culture was performed at 37 ° C. and 5% CO 2 for about 17 hours.
  • the medium in the insert was added to an HBSS (+) solution containing 50 ⁇ g / ml FITC-labeled dextran (SIGMA, average molecular weight 3000 to 5000), and the medium in the plate well was mixed with 50 ⁇ g / ml unlabeled dextran. Labels were added by replacing each with an HBSS (+) solution containing (SIGMA, molecular weight ⁇ 6000) and incubated at 25 ° C. for 1 hour. Next, the insert was taken out, and the absorbance of FITC contained in the well on the plate side was read with a plate reader (485 nm / 538 nm). The results are shown in Table 1.
  • the amount of FITC-labeled dextran migrating to the plate side is significantly reduced by the presence of the sheet-shaped cell culture. Moreover, although the difference by the difference in the pore density of an insert was hardly seen, the tendency for a better sensitivity to be obtained was seen that the density was high.
  • Example 2 Examination of label diffusion time A 6-well culture insert (BD) having a pore size of 3 ⁇ m and a pore density of 2.0 ⁇ 0.2 ⁇ 10 5 cells / cm 2 was used as the first container, and incubation after label addition was performed. The same experiment as in Example 1 was performed except that the time was 20 minutes, 6 hours, or 23 hours. The results are shown in Table 2.
  • Example 1 it was confirmed that the amount of FITC-labeled dextran transferred to the plate side was significantly reduced by the presence of the sheet-like cell culture. From this, by measuring the amount of FITC-labeled dextran that migrates to the plate side, how much the sheet-like cell culture permeates FITC-labeled dextran, that is, how much cell gap in the sheet-like cell culture. Can be evaluated. In addition, since the label continues to move to the plate side for 23 hours after the addition, it can be seen that the change in permeability can be monitored for a relatively long time by this method.
  • Example 3 Examination of influence by cell density A 6-well culture insert (BD) having a pore diameter of 3 ⁇ m and a pore density of 2.0 ⁇ 0.2 ⁇ 10 5 cells / cm 2 was used as a first container, and the cell density to be seeded was determined. 4.4 ⁇ 10 6 cells / well (Normal), 2.2 ⁇ 10 6 cells / well (1/2 density), 8.8 ⁇ 10 5 cells / well (1/5 density) or 4.4 ⁇ 10 The same experiment as in Example 1 was performed except that the number of cells was 5 / well (1/10 density) and the incubation time after addition of the label was 3 hours. Measurement with only the insert was taken as Control. The results are shown in relative fluorescence units (RFU) with Control as 100. From the results shown in FIG. 1, it can be seen that the amount of FITC-labeled dextran transferred increases as the cell density decreases. Therefore, the cell density of the sheet-like cell culture can be evaluated by this method.
  • ROU relative fluorescence units
  • Example 4 Examination of influence of cell viability
  • a 6-well culture insert (BD) having a pore diameter of 3 ⁇ m and a pore density of 2.0 ⁇ 0.2 ⁇ 10 5 cells / cm 2 was used.
  • the cell viability is increased after seeding skeletal myoblasts in the same manner as in Example 1 except that the number of cells is 2.2 ⁇ 10 6 cells / well, performing sheet culture, and forming a sheet-like cell culture.
  • Served under reduced conditions room temperature storage: HBSS (+), stored at 27 ° C for 24 hours) or non-reduced conditions (refrigerated storage: HBSS (+), stored at about 4 ° C (2-8 ° C) for 24 hours) did.
  • FITC-labeled dextran was added in the same manner as in Example 1, and after 2 hours of incubation, the amount transferred to the plate side was measured. Measurement with only the insert was taken as Control. The results are shown in relative fluorescence units (RFU) with Control as 100. From the results shown in FIG. 2, it can be seen that the amount of FITC-labeled dextran transferred to the plate side increases as the viability of the cells decreases. Therefore, the viability of the cells constituting the sheet-like cell culture can be evaluated by this method.
  • Each numerical value represents the amount of change ⁇ standard error (% point) relative to the viability (%) of the unstored group.
  • the difference in viability due to storage temperature increases with time, but is relatively small at 24 hours after storage. Nevertheless, in the quality evaluation method of the present invention, there is a large difference in the amount of migration between room temperature storage and refrigerated storage at 24 hours after storage. It can be seen that the difference can be evaluated with higher sensitivity.
  • Example 5 Determination of Completion of Sheeting The following experiment was conducted to verify how the amount of label transferred to the second container changes as the sheeting progresses.
  • a 6-well culture insert (BD) having a pore diameter of 3 ⁇ m and a pore density of 2.0 ⁇ 0.2 ⁇ 10 5 cells / cm 2 was used. Seeding was performed at a density of 10 6 cells / well. Cells were seeded at the same time in 4 wells, and sheet culture was performed. After 3 hours, 6 hours, 21 hours and 28 hours after seeding, a label was added to each different well in the same manner as in Example 1. After incubating at 25 ° C.
  • Example 6 Detection of Abnormality of Sheet Formation
  • a 6-well culture insert (BD) with a pore diameter of 3 ⁇ m and a pore density of 2.0 ⁇ 0.2 ⁇ 10 5 pieces / cm 2 was used as the first container, and the sheet culture time was 21 to 27 hours.
  • the amount of label transferred to the second container was measured in the same manner as in Example 1 except that the incubation time was 2 hours.
  • Sheet exfoliation in sheet culture is considered to be due to the vitality of the cells constituting the sheet and insufficient sheet-forming ability, so that the sheet-forming ability of cells is evaluated by the method of the present invention, Whether or not it is suitable for use in producing a sheet-shaped cell culture can be determined before actually producing the sheet-shaped cell culture.
  • Example 7 Detection of the number of laminated sheet-like cell cultures The following experiment was conducted to examine whether the number of laminated sheet-like cell cultures can be detected by the method of the present invention.
  • Translucent PET 24-well culture insert (BD) having a pore diameter of 3 ⁇ m and a pore density of 2.0 ⁇ 0.2 ⁇ 10 5 / cm 2 as the first container, and colorless and transparent polystyrene as the second container
  • BD 24-well plate
  • Temperature responsive culture vessel UpCell (R), 48-well multi-well, CellSeed
  • the seeded skeletal myoblasts were prepared by a conventional method from human muscle tissue at a density of 1.3 ⁇ 10 6 cells / well, 20% Sheet culture was performed at 37 ° C.
  • the formed sheet-shaped cell culture was peeled off by temperature treatment to room temperature, washed with HBSS +, and transferred to the first container.
  • the cells were cultured at 37 ° C. and 5% CO 2 for 1 hour, and the sheet-like cell culture was adhered to the container and further cultured overnight.
  • the laminated sheet-shaped cell culture was prepared by placing the formed sheet-shaped cell culture on the sheet-shaped cell culture adhered to the container and culturing overnight.
  • the medium in the insert was changed to an HBSS (+) solution containing 100 ⁇ g / ml FITC-labeled dextran (SIGMA, average molecular weight 3000 to 5000), and the medium in the plate well was changed to 100 ⁇ g / ml unlabeled dextran (SIGMA).
  • SIGMA FITC-labeled dextran
  • the label was added by substituting each with an HBSS (+) solution containing ⁇ 6000 molecular weight, and incubated at room temperature for 2 hours.
  • the insert was taken out, and the absorbance of FITC contained in the well on the plate side was read with a plate reader (485 nm / 538 nm). The results are shown in Table 4.
  • RFU represents relative fluorescence units with a measured value in a control experiment using an insert not containing a sheet-like cell culture as 100. From the above results, it can be seen that the quality of the already formed sheet-shaped cell culture can be evaluated by the method of the present invention. In addition, since the RFU is smaller in the case of the laminated sheet-shaped cell culture in which two sheet-shaped cell cultures are stacked, the RFU is smaller than the number of the sheet-shaped cell cultures. It turns out that it becomes small depending on this, and the number of laminated
  • Example 8 Detection of Cell Purity
  • Translucent PET 24-well culture insert having a pore diameter of 3 ⁇ m and a pore density of 2.0 ⁇ 0.2 ⁇ 10 5 / cm 2 as the first container, and colorless and transparent polystyrene as the second container
  • a 24-well plate (BD) was used.
  • Skeletal myoblasts prepared from human muscle tissue by a conventional method and fibroblasts (TIG-2M-30, Human Science Foundation) are mixed, and the ratio of CD56 positive cells, which are markers of skeletal myoblasts, is 69. %, 32% or 0% specimens were prepared.
  • the ratio of CD56 positive cells was measured by a flow cytometry method using a PE-labeled anti-CD56 antibody (BD, 555516) (BD, FACS Calibur). Each specimen was seeded in a first container at a density of 7.93 ⁇ 10 4 cells / well, and 6 in a DMEM-F12 medium (Life Technologies) containing 20% human serum at 37 ° C. and 5% CO 2 . Time sheet culture was performed. After the culture, the absorbance of FITC contained in the well on the plate side was measured in the same manner as in Example 7. The results are shown in FIG. In the figure, RFU represents relative fluorescence units with the measured value in a control experiment using an insert not containing a sheet-like cell culture as 100.

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Abstract

　本発明は、（１）標識は通過するが、細胞は通過しない半透過性部分を有する第１の容器に細胞を播種し、該半透過性部分を被覆するようにシート化するステップ、（２）第１の容器、または、前記半透過性部分を介して第１の容器と液体連通し得る液体不透過性の第２の容器に、標識を添加するステップ、（３）標識を、第１の容器および第２の容器のうち、標識が添加されていない容器に移行させるステップ、（４）前記標識が添加されていない容器に移行した標識を検出するステップを含み、標識が細胞間接着により細胞間の通過が阻害されるものである、シート状細胞培養物の品質評価またはシート化完了判定のための方法等に関する。

Description

シート状細胞培養物の品質評価方法
　本発明は、シート状細胞培養物の品質評価またはシート化完了判定のための方法、キットおよびシステムなどに関する。
　近年、損傷した組織等の修復のために、種々の細胞を移植する試みが行われている。例えば、狭心症、心筋梗塞などの虚血性心疾患により損傷した心筋組織の修復のために、胎児心筋細胞、骨格筋芽細胞、間葉系幹細胞、心臓幹細胞、ＥＳ細胞等の利用が試みられている（非特許文献１）。
　このような試みの一環として、スキャフォールドを利用して形成した細胞構造物や、細胞をシート状に形成したシート状細胞培養物が開発されてきた（特許文献１）。
　シート状細胞培養物の治療への応用については、火傷などによる皮膚損傷に対する培養表皮シートの利用、角膜損傷に対する角膜上皮シート状細胞培養物の利用、食道ガン内視鏡的切除に対する口腔粘膜シート状細胞培養物の利用などの検討が進められている。
　このような細胞培養物を臨床応用する場合には、その適用可能性や有効性、安全性、保存性、移送性などを担保するため、製造方法を最適化する指標の設定や、品質管理の一環としてシート状細胞培養物の強度などの品質を評価することが必要である。シート状細胞培養物の強度などの評価に関し、特許文献１には、細胞培養物の培養基材からの脱着の容易性などから定性的・経験的にその強度を推定したことが記載されている。また、特許文献２には、シート状細胞培養物を解離処理に供し、解離処理の時間および解離状態からシート状細胞培養物の強度を測定する方法が、特許文献３には、円形に製造したシート状細胞培養物の輪郭の真円度に基づいてシート状細胞培養物の品質を判定する方法が、特許文献４には、シート化培養における液体培地中の非接着細胞濃度またはその変化を測定することにより、シート状細胞培養物のシート化状態を判定する方法が、特許文献５には、シート形成細胞と培養容器との接着率を算出し、これに基づきシート状細胞培養物の形成を判定する方法が、特許文献６には、シート状細胞培養物などの脆弱試料を、該試料が液中もしくは液面に位置する状態で、荷重測定装置に連結された固定表面に固定し、その引張特性を測定する方法が、特許文献７には、少なくとも一部に磁性粒子を含むシートを形成し、当該シートに対して磁力を作用させることにより引張荷重を負荷して、シートの引張特性を評価する方法が、それぞれ記載されている。
特表２００７－５２８７５５号公報 特開２０１２－０２９５９８号公報 特開２０１２－０３９９４４号公報 特開２０１２－１５２１８８号公報 特開２０１２－１５２１８９号公報 特開２０１２－１５９４０８号公報 特開２０１３－１９８４３８号公報
Haraguchi et al., Stem Cells Transl Med. 2012 Feb;1(2):136-41
　本発明は、シート状細胞培養物の強度に加え、細胞密度、肉眼では検出できない微小な破れや穴の有無、細胞同士の接着状態、シート化過程での培養基材からの剥離の有無、細胞のバイアビリティ、細胞の活力などを合わせて評価する方法、シート状細胞培養物のシート化の完了を判定する方法、シート状細胞培養物のシート化の異常を検出する方法などの提供を目的とする。
　本発明者は、シート状細胞培養物の品質評価手法を研究する中で、シート状細胞培養物の強度以外にも、シート状細胞培養物における細胞密度の均一性や、シート状細胞培養物に生じ得る肉眼では検出できない微小な破れや穴の有無、細胞同士の接着状態、シート化過程での培養基材からの剥離の有無、細胞のバイアビリティ、細胞の活力などが、移植への適合性や治療効果に影響をもたらすと考え、これらの項目を評価する手法を開発すべく鋭意研究を進めたところ、細胞は通過できないが、所定のサイズの分子は通過できる半透過性部分を有する培養容器内で、該半透過性部分を被覆するようにシート状細胞培養物を形成し、当該培養容器の半透過性部分を、液体不透過性の回収容器に収容し、培養容器に標識を添加して所定の期間放置後、培養容器から回収容器に移動した標識の量を検出することで、上記の項目を一度に評価することができることを見出した。そして、さらに研究を進めたところ、シート化の進行に伴い回収容器に移動する標識の量が減少し、シート化が完了すると、回収容器に移動する標識の量が一定になることを見出し、本発明を完成させた。
　すなわち、本発明は以下に関する。
　＜１＞（１）標識は通過するが、細胞は通過しない半透過性部分を有する第１の容器に細胞を播種し、該半透過性部分を被覆するようにシート化するステップ、
（２）第１の容器、または、前記半透過性部分を介して第１の容器と液体連通し得る液体不透過性の第２の容器に、標識を添加するステップ、
（３）第１の容器と第２の容器とが前記半透過性部分を介して液体連通した状態で、標識を、第１の容器および第２の容器のうち、標識が添加されていない容器に、半透過性部分を介して移行させるステップ、
（４）前記標識が添加されていない容器に移行した標識を検出するステップ
を含み、標識が細胞間接着により細胞間の通過が阻害されるものであり、ステップ（２）は、ステップ（１）と同時、ステップ（１）より前またはステップ（１）より後に行ってもよい、シート状細胞培養物の品質評価、シート化完了判定、細胞のシート形成能の評価、または、シート状細胞培養物の製造過程におけるシート剥離の検出のための方法。
　＜２＞（１）標識は通過するが、細胞は通過しない半透過性部分を有する第１の容器に細胞を播種し、該半透過性部分を被覆するようにシート化培養するステップ、
（２）第１の容器、または、前記半透過性部分を介して第１の容器と液体連通し得る液体不透過性の第２の容器に、標識を添加するステップ、
（３）第１の容器と第２の容器とが前記半透過性部分を介して液体連通した状態で、標識を、第１の容器および第２の容器のうち、標識が添加されていない容器に、半透過性部分を介して移行させるステップ、
（４）前記標識が添加されていない容器に移行した標識を検出するステップ、
（５）標識の量もしくは増加量が複数の連続する測定においてほぼ一定になったとき、または、標識の量の経時的な変化率の絶対値が基準値以下となったときに、シート化培養を終了し、シート状細胞培養物を第１の容器から回収するステップ
を含み、標識が細胞間接着により細胞間の通過が阻害されるものであり、ステップ（２）は、ステップ（１）と同時、ステップ（１）より前またはステップ（１）より後に行ってもよい、移植用シート状細胞培養物の製造方法。
　＜３＞標識が、１００～１５００００の分子量を有する、＜１＞または＜２＞に記載の方法。
　＜４＞標識が、蛍光標識、酵素標識、発光標識、放射性標識、磁気標識および比色標識からなる群から選択される、＜１＞～＜３＞のいずれか１つに記載の方法。
　＜５＞半透過性部分が、孔径約０．０１μｍ～約５０．０μｍの細孔を有する、＜１＞～＜４＞のいずれか１つに記載の方法。
　＜６＞シート状細胞培養物の品質が、シート状細胞培養物の強度、シート化の程度、細胞密度、細胞のバイアビリティ、細胞同士の接着状態および細胞の活力からなる群から選択される、＜１＞～＜５＞のいずれか１つに記載の方法。
　＜７＞細胞が、筋芽細胞および間葉系幹細胞からなる群から選択される、＜１＞～＜６＞のいずれか１つに記載の方法。
　＜８＞（１）細胞間接着により細胞間の通過が阻害される標識、
（２）前記標識は通過するが、細胞は通過しない半透過性部分を有する第１の容器、および
（３）前記半透過性部分を収容可能な液体不透過性の第２の容器
を含む、シート状細胞培養物の製造、シート状細胞培養物の品質評価、シート化完了の判定、細胞のシート形成能の評価、および／または、シート状細胞培養物の製造過程における剥離の検出のためのキット。
　＜９＞（１）細胞間接着により細胞間の通過が阻害される標識、
（２）前記標識は通過するが、細胞は通過しない半透過性部分を有する第１の容器、
（３）前記半透過性部分を収容可能な液体不透過性の第２の容器、および
（４）標識を検出する検出器
を備えた、シート状細胞培養物の製造、シート状細胞培養物の品質評価、シート状細胞培養物のシート化完了の判定、細胞のシート形成能の評価、および／または、シート状細胞培養物の製造過程における剥離の検出のためのシステム。
　本発明の品質評価方法により、シート状細胞培養物の強度のみならず、細胞密度や肉眼では検出できない微小な破れや穴の有無、細胞同士の接着状態、シート化過程での培養基材からの剥離の有無、細胞のバイアビリティ、細胞の活力などの品質を同時に簡便に、しかも、シート状細胞培養物を損傷させずに評価することができ、シート状細胞培養物の品質管理の向上が期待できる。また、細胞のシート化には、細胞間の接着が完了するまで培養を行うが、シート化が完了し、移植に適したシート状細胞培養物が完成するまでの時間は、ドナーの細胞が持つ性質によって異なり、従来はシート化完了の検出が不可能であったところ、本発明のシート化完了判定方法により、シート化完了を正確に検出することが可能となり、移植に適した治療効果の高いシート状細胞培養物を、時間のロスなしに確実に製造することができる。さらに、本発明のシート化異常検出方法により、シート化過程で生じた異常をいち早く検出することができ、必要な対応を迅速に講じることで、時間のロスを防ぐことができる。
図１は、本発明によるシート状細胞培養物の製造方法の特定の態様に関するアルゴリズム（アルゴリズム１）を示した図である。 図２は、アルゴリズム１の変形態様を示した図である。 図３は、本発明によるシート状細胞培養物の製造方法の特定の態様に関するアルゴリズム（アルゴリズム２）を示した図である。 図４は、本発明によるシート状細胞培養物の製造方法の特定の態様に関するアルゴリズム（アルゴリズム３）を示した図である。 図５は、第２の容器に移行する標識の量が、細胞密度に応じて変化することを示したグラフである。 図６は、第２の容器に移行する標識の量が、シート状細胞培養物を構成する細胞の生存率に応じて変化することを示したグラフである。 図７は、シート状細胞培養物のシート化の進行に伴う、第２の容器に移行する標識の量の推移を示したグラフである。 図８は、第２の容器に移行する標識の量が、シート形成の異常によって変化することを示したグラフである。 図９は、第２の容器に移行する標識の量が、細胞純度の違いによって変化することを示したグラフである。
　本明細書において別様に定義されない限り、本明細書で用いる全ての技術用語および科学用語は、当業者が通常理解しているものと同じ意味を有する。本明細書中で参照する全ての特許、出願および他の出版物や情報は、その全体を参照により本明細書に援用する。
　本発明の一側面は、（１）標識は通過するが、細胞は通過しない半透過性部分を有する第１の容器に細胞を播種し、該半透過性部分を被覆するようにシート化するステップ、
（２）第１の容器、または、前記半透過性部分を介して第１の容器と液体連通し得る液体不透過性の第２の容器に、標識を添加するステップ、
（３）第１の容器と第２の容器とが前記半透過性部分を介して液体連通した状態で、標識を、第１の容器および第２の容器のうち、標識が添加されていない容器に、半透過性部分を介して移行させるステップ、
（４）前記標識が添加されていない容器に移行した標識を検出するステップ
を含み、標識が細胞間接着により細胞間の通過が阻害されるものであり、ステップ（２）は、ステップ（１）と同時、ステップ（１）より前またはステップ（１）より後に行ってもよい、シート状細胞培養物の品質評価のための方法（以下、「品質評価方法」と略す場合がある）に関する。
　本発明において、「シート状細胞培養物」は、細胞が細胞間接着などにより互いに連結してシート状になったものをいい、典型的には１の細胞層からなるものであるが、２以上の細胞層の積層から構成されるものも含む。細胞同士は、直接（接着分子などの細胞要素を介するものを含む）および／または介在物質を介して、互いに連結していてもよい。介在物質としては、細胞同士を少なくとも物理的（機械的）に連結し得る物質であれば特に限定されないが、例えば、細胞外基質などが挙げられる。介在物質は、好ましくは細胞由来のもの、特に、シート状細胞培養物を構成する細胞に由来するものである。細胞は少なくとも物理的（機械的）に連結されるが、さらに機能的、例えば、化学的、電気的に連結されてもよい。
　シート状細胞培養物を形成し得る細胞は、限定されずに、例えば、接着細胞（付着性細胞）を含む。接着細胞は、例えば、接着性の体細胞（例えば、心筋細胞、線維芽細胞、上皮細胞、内皮細胞、肝細胞、膵細胞、腎細胞、副腎細胞、歯根膜細胞、歯肉細胞、骨膜細胞、皮膚細胞、滑膜細胞、軟骨細胞など）および幹細胞（例えば、筋芽細胞、心臓幹細胞などの組織幹細胞、胚性幹細胞、ｉＰＳ（induced pluripotent stem）細胞などの多能性幹細胞、間葉系幹細胞等）などを含む。体細胞は、幹細胞、特にｉＰＳ細胞から分化させたものであってもよい。シート状細胞培養物を形成し得る細胞の非限定例としては、例えば、筋芽細胞（例えば、骨格筋芽細胞など）、間葉系幹細胞（例えば、骨髄、脂肪組織、末梢血、皮膚、毛根、筋組織、子宮内膜、胎盤、臍帯血由来のものなど）、心筋細胞、線維芽細胞、心臓幹細胞、胚性幹細胞、ｉＰＳ細胞、滑膜細胞、軟骨細胞、上皮細胞（例えば、口腔粘膜上皮細胞、網膜色素上皮細胞、鼻粘膜上皮細胞など）、内皮細胞（例えば、血管内皮細胞など）、肝細胞（例えば、肝実質細胞など）、膵細胞（例えば、膵島細胞など）、腎細胞、副腎細胞、歯根膜細胞、歯肉細胞、骨膜細胞、皮膚細胞等が挙げられる。
　本発明に用いる標識は、細胞間接着により細胞間の通過が阻害される任意のものを含む。シート状細胞培養物において、細胞同士は細胞間接着により結合しており、細胞間隙は狭くなっているため、サイズの小さな分子であればかかる細胞間隙（すなわち、細胞間経路）を介して、シート状細胞培養物を自由に通過することができるが、ある程度のサイズを超えると、細胞間接着を担う細胞間接着装置（例えば、密着結合、接着結合、デスモゾーム結合、ギャップ結合など）により、細胞間の通過が阻害されるようになる。一方、何らかの原因で、シート状細胞培養物における細胞間隙が拡大すると、通常であれば細胞間の通過が阻害される分子の細胞間の通過が容易となり、所定時間内にシート状細胞培養物を通過する分子の量が増大する。したがって、細胞間接着により細胞間の通過が阻害される標識を用いることで、シート状細胞培養物の細胞間隙を通過する標識の量を、細胞間隙の大きさの指標とすることができる。
　細胞間接着により細胞間の通過が阻害される標識の非限定的な例としては、例えば、所定の範囲の分子量を有する標識が挙げられる。かかる分子量の範囲としては、限定されずに、例えば、約１００～約１５０００００、約３００～約１００００００、約１０００～約５０００００、約５０００～約２０００００、約１００００～約１０００００、約３００００～約９００００、約４００００～約８００００等が挙げられる。また、標識は陽性電荷または陰性電荷を有していてもよい。かかる標識の非限定例としては、例えば、フルオレセインナトリウム（Ｎａ－Ｆ）などが挙げられる
　ある標識が、細胞間接着により細胞間の通過が阻害されるものであるかどうかは、例えば、次のようにして判定することができる。シート状細胞培養物は、通常、培養容器にシート状細胞培養物を形成し得る細胞を播種し、所定の期間細胞同士を相互作用させることにより、細胞同士を連結させて形成するが（本明細書では、この過程を「シート化」と呼ぶことがある）、実施例５の結果が示すとおり、このシート化の過程で、播種時の細胞間隙は、細胞同士の細胞間接着により徐々に縮小し、シート化の完了によりある一定の大きさで安定すると考えられる。したがって、シート化が不十分なシート状細胞培養物を通過する標識の量より、シート化が完了したシート状細胞培養物を通過する標識の量が少なければ、その標識は細胞間接着により細胞間の通過が阻害されるものであるということができる。また、実施例４の結果が示すとおり、シート状細胞培養物は、これを構成する細胞のバイアビリティが低下すると、細胞同士の連結が弱くなり、細胞間隙が拡大すると考えられる。したがって、細胞のバイアビリティを低下させたシート状細胞培養物を通過する標識の量より、細胞のバイアビリティを低下させていないシート状細胞培養物を通過する標識の量が少なければ、その標識は細胞間接着により細胞間の通過が阻害されるものであるということができる。
　本発明に用いる標識は、既知の測定方法により定量可能な任意のものを含み、非限定例としては、例えば、蛍光標識、酵素標識、発光標識、放射性標識、磁気標識および比色標識などが挙げられる。標識は、既知の検出可能な標識物質、例えば、蛍光物質、酵素、発光物質、放射性同位体、磁気粒子、色素などからなっても、標識物質を他の物質（例えば、デキストランなどの担体）と結合し、細胞間接着により細胞間の通過が阻害されるようにした標識化物質であってもよい。また、核酸やタンパク質など、特定の波長の電磁波を吸収する物質や、抗体やその抗原結合性断片、抗体が認識する抗原（例えば、ＤＩＧなど）、可溶化受容体、受容体に対するリガンド、レクチン、レクチンが認識する糖鎖、ビオチンおよびその誘導体、アビジンおよびその誘導体などを標識として用いてもよい。抗体やその抗原結合性断片、可溶化受容体、レクチン、ビオチンおよびその誘導体などを標識として利用した場合は、標識物質が結合した抗原、リガンド、糖鎖、アビジンおよびその誘導体などでそれぞれ検出することができ、抗体が認識する抗原、受容体に対するリガンド、レクチンが認識する糖鎖、アビジンおよびその誘導体などを標識として利用した場合は、標識物質が結合した抗体やその抗原結合性断片、可溶化受容体、レクチン、ビオチンおよびその誘導体などでそれぞれ検出することができる。
　本発明に用いる標識のさらなる例としては、酵素反応によって呈色または発光する物質などが挙げられる。
　標識に用いることができる蛍光物質としては、例えば、ＣｙTMシリーズ（例えば、ＣｙTM２、３、５、５．５、７など）、DyLightTMシリーズ（例えば、DyLightTM 405、488、549、594、633、649、680、750、800など）、Alexa Fluor(R)シリーズ（例えば、Alexa Fluor(R) 405、488、549、594、633、647、680、750など）、HiLyte FluorTMシリーズ（例えば、HiLyte FluorTM 488、555、647、680、750など）、ATTOシリーズ（例えば、ATTO488、550、633、647N、655、740など）、ＦＡＭ、ＦＩＴＣ、テキサスレッド、ローダミン、ＧＦＰ、ＲＦＰ、Ｑｄｏｔ、ルシファーイエロー、フルオレセイン、DRAQ7TMなどが、酵素としては、ＨＲＰ、βガラクトシダーゼなどが、発光物質としては、ルミノール、ルシフェリン、ルシゲニン、イクオリンなどが、放射性同位体としては、テクネチウム－９９ｍ（９９ｍＴｃ）、インジウム－１１１（１１１Ｉｎ）、ヨウ素－１２３（１２３Ｉ）、ヨウ素－１２４（１２４Ｉ）、ヨウ素－１２５（１２５Ｉ）、ヨウ素－１３１（１３１Ｉ）、タリウム－２０１（２０１Ｔｌ）、炭素－１１（１１Ｃ）、窒素－１３（１３Ｎ）、酸素－１５（１５Ｏ）、フッ素－１８（１８Ｆ）、銅－６４（６４Ｃｕ）、ガリウム－６７（６７Ｇａ）、クリプトン－８１ｍ（８１ｍＫｒ）、キセノン－１３３（１３３Ｘｅ）、ストロンチウム－８９（８９Ｓｒ）、イットリウム－９０（９０Ｙ）などが、色素としては、ナイルブルー、ニュートラルレッド、ヤヌスグリーン、カルセイン、プロピジウムイオダイドなどの生体染色用色素などが挙げられる。
　さらなる蛍光物質の例としては、ＹＦＰ、ＣＦＰ、ＯＦＰなどの蛍光タンパク質が挙げられる。さらなる酵素の例としては、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ、グルクロニダーゼ、ペルオキシダーゼなどが挙げられる。酵素反応によって呈色または発光する物質としては、限定されずに、例えば、ルシフェラーゼ基質、アルカリホスファターゼ基質、βガラクトシダーゼ基質、グルクロニダーゼ基質、ペルオキシダーゼ基質などが挙げられる。
　標識は、細胞による取り込み、吸着、分解などが少なく、毒性の低いものが好ましい。かかる標識としては、例えば、細胞膜不透過性の標識などが挙げられる。一態様において、標識は、生体適合性である。生体適合性の標識を用いることにより、シート状培養物に標識が付着していても、移植などに安全に使用することができる。一態様において、標識は、検出可能な物質と結合した担体を含む。担体の例としては、限定されずに、例えば、デキストラン、ビオチン、アルブミン、アガロース、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、乳酸－グリコール酸コポリマー（ＰＬＧＡ）、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリリジン（例えば、ポリ－Ｌ－リジン（ＰＬＬ））などのポリマーや、ポリスチレン、シリカ、アクリル、石英、キトサン、金、銀、アルブミン、アガロース、ポリ乳酸、ポリエチレンイミン、白金、酸化アルミニウム、ホウケイ酸ガラス、ソーダライムガラス、ＰＬＡ、ＰＬＧＡ、酸化鉄、パラジウムなどで構成された微粒子、マンニトール、エリストールなどの糖アルコールなどが挙げられる。
　特定の態様において、標識は、蛍光物質と結合したデキストランを含む。デキストランの分子量は、約１０００～約１００００００、約５０００～約５０００００、約１００００～約２０００００、約２００００～約１０００００、約３００００～約９００００、約４００００～約８００００等であってよい。別の特定の態様において、標識は、［３Ｈ］マンニトール、［１４Ｃ］マンニトール、フルオレセインナトリウム（Ｎａ－Ｆ）、ルシファーイエローＣＨ（例えば、二リチウム塩、二カリウム塩等）などを含む。
　第１の容器は、細胞がその内部でシート状細胞培養物を形成し得るものであれば特に限定されず、例えば、種々の材質の細胞培養容器を含む。第１の容器は、半透過性部分を除き培養液などの液体を透過させない構造・材料のものが好ましい。かかる材料としては、限定することなく、例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン、テフロン（登録商標）、ポリカーボネート、ポリエチレンテレフタレート、ポリメチルメタクリレート、ナイロン６，６、ポリビニルアルコール、セルロース、シリコン、ポリスチレン、ガラス、ポリアクリルアミド、ポリジメチルアクリルアミド、金属（例えば、鉄、ステンレス、アルミニウム、銅、真鍮）等が挙げられる。また、第１の容器は、少なくとも１つの平坦な面を有することが好ましい。かかる容器の例としては、限定することなく、例えば、細胞培養皿、細胞培養ボトルなどが挙げられる。第１の容器は、上記材料を用いて作製してもよいし、市販のものを利用してもよい。第１の容器は、ディッシュの形態であっても、複数のウェルを備えたマルチウェルプレートの形態であってもよく、不透明、半透明または透明であってもよい。また、第１の容器内で標識を検出する場合、第１の容器は、標識の検出に適した材質で構成されるか、少なくともかかる材質で構成された部分を有することが好ましい。例えば、標識が蛍光標識である場合、第１の容器は無色透明であるか、蛍光の検出に適した無色透明の部分を少なくとも有することが好ましい。
　第１の容器は、シート状細胞培養物を形成するためのシート状細胞培養物形成表面を備えている。該表面は、シート状細胞培養物の形成に適した、接着性の表面、例えば、限定されずに、親水性の表面、例えば、血清を表面にコーティングした表面、コロナ放電処理したポリスチレン、ゼラチンやコラーゲンゲル、マトリゲルをコーティングした表面、親水性ポリマーなどの親水性化合物をコーティングした表面、さらには、コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニン、ビトロネクチン、プロテオグリカン、グリコサミノグリカンなどの細胞外基質や、カドヘリンファミリー、セレクチンファミリー、インテグリンファミリーなどの細胞接着因子などをコーティングした表面などであってよい。かかる表面を有する細胞培養容器は市販されており（例えば、Corning(R) TC-Treated Culture Dish、Corning製など）、既知の方法に従い作製することもできる。
　シート状細胞培養物形成表面は、刺激、例えば、温度や光に応答して物性が変化する材料で被覆されていてもよい。かかる材料としては、限定されずに、例えば、（メタ）アクリルアミド化合物、Ｎ－アルキル置換（メタ）アクリルアミド誘導体（例えば、Ｎ－エチルアクリルアミド、Ｎ－ｎ－プロピルアクリルアミド、Ｎ－ｎ－プロピルメタクリルアミド、Ｎ－イソプロピルアクリルアミド、Ｎ－イソプロピルメタクリルアミド、Ｎ－シクロプロピルアクリルアミド、Ｎ－シクロプロピルメタクリルアミド、Ｎ－エトキシエチルアクリルアミド、Ｎ－エトキシエチルメタクリルアミド、Ｎ－テトラヒドロフルフリルアクリルアミド、Ｎ－テトラヒドロフルフリルメタクリルアミド等）、Ｎ，Ｎ－ジアルキル置換（メタ）アクリルアミド誘導体（例えば、Ｎ，Ｎ－ジメチル（メタ）アクリルアミド、Ｎ，Ｎ－エチルメチルアクリルアミド、Ｎ，Ｎ－ジエチルアクリルアミド等）、環状基を有する（メタ）アクリルアミド誘導体（例えば、１－（１－オキソ－２－プロペニル）－ピロリジン、１－（１－オキソ－２－プロペニル）－ピペリジン、４－（１－オキソ－２－プロペニル）－モルホリン、１－（１－オキソ－２－メチル－２－プロペニル）－ピロリジン、１－（１－オキソ－２－メチル－２－プロペニル）－ピペリジン、４－（１－オキソ－２－メチル－２－プロペニル）－モルホリン等）、またはビニルエーテル誘導体（例えば、メチルビニルエーテル）のホモポリマーまたはコポリマーからなる温度応答性材料、アゾベンゼン基を有する光吸収性高分子、トリフェニルメタンロイコハイドロオキシドのビニル誘導体とアクリルアミド系単量体との共重合体、および、スピロベンゾピランを含むＮ－イソプロピルアクリルアミドゲル等の光応答性材料などの公知のものを用いることができる（例えば、特開平2-211865、特開2003-33177参照）。これらの材料に所定の刺激を与えることによりその物性、例えば、親水性や疎水性を変化させ、同材料上に付着した細胞培養物の剥離を促進することができる。また、上記のような刺激応答材料によるコーティング上に、血清などの成分をさらにコーティングすることもできる。
　第１の容器は、標識は通過するが、細胞は通過しない半透過性部分を有する。半透過性部分は、標識は通過するが、細胞は通過しない性質を有していれば特に限定されず、例えば、所定の大きさの細孔を有する培養基材などで構成されていてもよい。細孔のサイズ（孔径）は、標識は通過するが、細胞は通過しないものであれば特に限定されず、例えば、約０．０１μｍ～約５０．０μｍ、約０．０１μｍ～約２０．０μｍ、約０．０１μｍ～約１０．０μｍ、約０．０２μｍ～約５．０μｍ、約０．０３μｍ～約４．０μｍ、約０．０５μｍ～約３．５μｍ、約０．１μｍ～約３．０μｍ等であってよい。当業者であれば、使用する標識や細胞のサイズに適合した細孔を適切に選択することができる。また、細孔の密度は、細孔の孔径によって異なり得るが、例えば、孔径が３．０μｍであれば、約１×１０３個/ｃｍ２～約１×１０８個/ｃｍ２、約１×１０４個/ｃｍ２～約１×１０７個/ｃｍ２、約２．５×１０４個/ｃｍ２～約８×１０６個/ｃｍ２、約５×１０５個/ｃｍ２～約５×１０６個/ｃｍ２、約８×１０５個/ｃｍ２～約２．５×１０６個/ｃｍ２等であってよい。また、細孔の密度は、開孔率で表した場合、例えば、半透過性部分の面積の約０．１％～約９５％、約０．５％～約９０％、約１％～約９０％、約２％～約９０％、約３％～約８５％等であってよい
　半透過性部分は、第１の容器のシート状細胞培養物形成表面の一部または全部を構成してもよい。シート状細胞培養物形成表面の一部を構成する場合、その割合は、シート状細胞培養物形成表面の表面積の約１％～約９９％の範囲の任意の割合、例えば、約９０％、約８０％、約７０％、約６０％、約５０％、約４０％、約３０％、約２０％、約１０％等であってよい。また、半透過性部分は、シート状細胞培養物形成表面上の１ヶ所に存在していても、複数の箇所に分かれて存在していてもよい。半透過性部分の材料や厚さは、第１の容器の他の部分と同じであっても異なっていてもよい。具体的には、例えば、第１の容器は、シート状細胞培養物形成表面の一部または全部に細孔処理を施したものであってもよいし、細孔を有する培養基材を底部に取り付けたものであってもよい。
　半透過性部分を構成する培養基材は、細胞がその上でシート状細胞培養物を形成し得るものであれば特に限定されず、例えば、種々の材質のプレートやフィルムなどを含む。培養基材は、培養液などの液体を透過させない材料で構成されてもよい。かかる材料の非限定例としては、第１の容器について記載したもののほか、ウレタン、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、不織布、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、セルロース混合エステル（例えば、セルロースアセテートとニトロセルロースとの混合物）など、細孔処理に適したものなどが挙げられる。培養基材は、これらの材料を用いて作製してもよいし、市販のものを利用してもよい。好ましい培養基材としては、限定することなく、例えば、シート状細胞培養物の形成に適した、接着性の表面を有する基材が挙げられる。かかる表面の非限定例は、シート状細胞培養物形成について上記したとおりである。また、培養基材として、多孔質構造体を用いることもできる。例えば、コラーゲンスポンジなどの生物由来物質などで構成された多孔質構造体の培養基材上でシート状細胞培養物を形成すれば、シート状培養物を培養基材から剥離することなく、培養基材ごとそのまま移植などに使用することもできる。この場合、半透過性部分は、多孔質構造体のみで構成されても、多孔質構造体と、第１の容器に固定された、多孔質構造体を分離可能に保持する支持体とで構成されてもよい。
　第２の容器は、第１の容器の半透過性部分を収容可能な形態を有し、液体不透過性である。したがって、第２の容器は、液体不透過性の任意の材料で構成することができる。第２の容器は、不透明、半透明または透明であってもよい。第２の容器内で標識を検出する場合、第２の容器は、標識の検出に適した材質で構成されるか、少なくともかかる材質で構成された部分を有することが好ましい。例えば、標識が蛍光標識である場合、第２の容器は無色透明であるか、蛍光の検出に適した無色透明の部分を少なくとも有することが好ましい。第２の容器は、第１の容器と分離可能に構成されていても、一体となっていてもよい。第２の容器内で標識を検出する場合、第２の容器は、第１の容器により標識の検出が阻害されないように構成された標識検出部を備えていてもよい。標識検出部は、標識の検出に適した材質で構成されるか、少なくともかかる材質で構成された部分を有する。第２の容器は、第１の容器の形態に合わせて、ディッシュやプレートの形態を有してもよい。第２の容器に標識を移行させる場合、第２の容器は、標識物質の褪色や変色を防ぐための部材、限定されずに、例えば、着脱可能なカバー等を備えていてもよい。例えば、標識物質として蛍光物質や色素などの光劣化性物質を用いる場合は遮光カバー等を備えていてもよい。また、第１の容器に標識を移行させる場合でも、第２の容器に標識を移行させる場合でも、標識物質の褪色や変色を防ぐための部材、限定されずに、例えば、着脱可能なカバー等で、第１の容器およびこれを収容する第２の容器の全体を覆うことができる。
　第２の容器は、当該容器内の液体を採取するためのポートを備えていてもよい。かかる構成は、第２の容器内の液体に含まれ得る標識を当該容器外で検出する場合に有利である。ポートは、第２の容器からの液体の採取を可能にするものであれば特に限定されず、第１の容器と第２の容器との間に設けられた、第２の容器に含まれる液体へのアクセスを可能にする開口であっても、第２の容器内の液体の吸引を可能にする、一方の開口部が第２の容器内の液体に接触する位置に設けられた導管であってもよい。ポートは、第１の容器と第２の容器とを分離することなく、第２の容器からの液体の採取を可能にするものが好ましい。
　本発明における細胞の播種は、既知の任意の手法および条件で行うことができる。細胞の播種は、例えば、細胞をシート化媒体に懸濁した細胞懸濁液を第１の容器に注入することにより行ってもよい。細胞懸濁液の注入には、スポイトやピペットなど、細胞懸濁液の注入操作に適した器具を用いることができる。
　播種した細胞をシート化するステップも、既知の任意の手法および条件で行うことができる。かかる手法の非限定例は、例えば、特許文献１、特開2010-081829、特開2010-226962、特開2010-226991、特開2011-110368、特開2011-115058、特開2011-172925などに記載されている。シート化するステップは、例えば、細胞を、細胞間接着を形成する条件下で培養することにより達成することができる。かかる条件は、細胞間接着を形成することができればいかなるものであってもよいが、通常は一般的な細胞培養条件と同様の条件であれば細胞間接着を形成することができる。当業者であれば、播種する細胞の種類に応じて最適な条件を選択することができる。本明細書において、播種した細胞をシート化するための培養を、「シート化培養」と呼ぶ場合もある。
　シート化は、半透過性部分の全てまたは一部を被覆するように行うことができる。複数のサンプル間の比較など、実験条件を揃えることが求められる場合は、半透過性部分の全てを被覆するようにシート化を行うことが好ましいことがある。一方、同一のシート状細胞培養物の経時変化などを評価する場合（例えば、後述のシート化完了判定のための方法、移植用シート状細胞培養物の製造方法、シート状細胞培養物の製造過程におけるシートの剥離を検出する方法など）、シート化を半透過性部分の一部を被覆するように行っても良好な評価が可能である。
　シート化に用いるシート化媒体としては、例えば、限定することなく、水、生理食塩水、種々の生理緩衝液（例えば、ＰＢＳ、ＨＢＳＳ等）、種々の細胞培養用の基礎培地をベースにしたものなどを使用してもよい。かかる基礎培地には、限定されずに、例えば、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、Ｆ１２、ＤＭＥ、ＲＰＭＩ１６４０、ＭＣＤＢ（ＭＣＤＢ１０２、１０４、１０７、１２０、１３１、１５３、１９９など）、Ｌ１５、ＳｋＢＭ、ＲＩＴＣ８０－７、ＤＭＥＭ／Ｆ１２などが含まれる。これらの基礎培地の多くは市販されており、その組成も公知となっている。基礎培地は、標準的な組成のまま（例えば、市販されたままの状態で）用いてもよいし、細胞種や細胞条件に応じてその組成を適宜変更してもよい。したがって、本発明に用いる基礎培地は、公知の組成のものに限定されず、１または２以上の成分が追加、除去、増量もしくは減量されたものを含む。
　シート化媒体は、血清（例えば、ウシ胎仔血清などのウシ血清、ウマ血清、ヒト血清等）、種々の成長因子（例えば、ＦＧＦ、ＥＧＦ、ＶＥＧＦ、ＨＧＦ等）などの添加物を含んでもよい。
　標識を添加するステップも、既知の任意の手法および条件で行うことができる。
　第１の容器への標識の添加は、例えば、第１の容器に含まれるシート化媒体に直接標識を添加して行ってもよいし、シート化媒体を標識を添加した別の媒体に置換して行ってもよいし、シート化媒体を別の媒体に置換し、置換後の媒体に標識を添加して行ってもよい。シート化媒体を、例えば低栄養の媒体（例えば、ＨＢＳＳ等）などに置換すると、シート状細胞培養物の状態をそのまま維持することができるため、完成したシート状細胞培養物の状態の確認に適している。また、シート状細胞培養物を低酸素条件（例えば、酸素濃度約０．１～約１０％など）におくことにより、細胞の増殖を止め、シート状細胞培養物の状態をそのまま維持することができる。
　第２の容器への標識の添加は、例えば、第１の容器と半透過性部分を介して液体連通した状態の第２の容器に直接標識を添加して行ってもよいし、標識が添加された媒体を含む第２の容器に第１の容器を半透過性部分を介して液体連通させて行ってもよい。
　第１の容器または第２の容器への標識の添加は、第１の容器への細胞の播種と同時、播種より前、および／または、播種より後に行ってもよい。標識の添加は、１回のみ行っても、複数回行ってもよい。
　添加する標識の量は、使用する標識や、容器に含まれる媒体の量、移行させる期間などにより変動し得るが、当業者であれば、ルーチンの実験で適切な添加量を見出すことができる。
　半透過性部分を介した第１の容器と第２の容器との液体連通は、例えば、第１の容器を、半透過性部分が、第２の容器に含まれる液体媒体により完全に浸漬されるように、第２の容器に対して配置することなどにより行うことができる。半透過性部分を介して第１の容器と第２の容器とを液体連通させることにより、第１の容器または第２の容器に添加された標識が、半透過性部分を介して、拡散などにより第２の容器または第１の容器に移行することが可能となる。第２の容器中の媒体は、シート化媒体と同じであっても異なっていてもよい。第２の容器中の媒体がシート化媒体と異なる場合は、半透過性部分を第２の容器中の媒体に浸漬する前に、第１の容器に含まれるシート化媒体を除去、または、第２の容器中の媒体と同じ媒体に置換してもよい。また、第２の容器中の媒体がシート化媒体と異なる場合は、シート化媒体との浸透圧差が小さい媒体を用いることが好ましい。標識を移行させる容器に含まれる媒体（以下、標識検出媒体と称する場合がある）は、標識の検出に悪影響を与えないものが好ましい。例えば、標識が蛍光標識や比色標識である場合、当該媒体は色素や自家蛍光を有しないものが好ましい。
　標識として標識化物質を用いる場合、第１の容器または第２の容器に標識を添加する際に、標識を移行させる第２の容器または第１の容器に、標識物質を含まない以外は標識化物質と同じ非標識物質（例えば、標識として蛍光標識デキストランを用いる場合は、非標識デキストラン）を添加することにより、浸透圧の影響を排除し、より正確な評価を行うことができる。
　標識を、第１の容器および第２の容器のうち、標識が添加されていない容器に半透過性部分を介して移行させるステップは、例えば、標識を第１の容器または第２の容器に添加後、半透過性部分を介して第１の容器と第２の容器とを液体連通させた状態で、第１の容器および第２の容器を所定の期間インキュベートすることにより行うことができる。第１の容器と第２の容器との液体連通は、標識を添加する前に行っても、標識添加後に行っても、標識の添加と同時に行ってもよい。標識の移行は、標識の拡散などにより生じる。移行期間は特に限定されず、例えば、１分～７２時間、５分～４８時間、１０分～３６時間、１５分～２４時間等であってよい。インキュベーション温度は、標識の拡散を阻害しないものであれば特に限定されず、例えば、約２℃～約４５℃、約４℃～約４０℃、約８℃～約３８℃、約１０℃～約３８℃、約１５℃～約３０℃等であってよい。
　上記移行ステップは、第１の容器に収容された液体の液面と、第２の容器に収容された液体の液面との高低差が小さい状態で行われることが、浸透圧による影響の排除などの観点から好ましい。第１の容器に収容された液体の液面と、第２の容器に収容された液体の液面との間に高低差が存在する状況は、第１の容器に収容された液体の液面が第２の容器に収容された液体の液面より高い場合、および、第１の容器に収容された液体の液面が第２の容器に収容された液体の液面より低い場合を含む。上記高低差は、小さければ小さいほど好ましく、限定されずに、例えば、２０ｍｍ以下、１５ｍｍ以下、１２ｍｍ以下、１０ｍｍ以下、８ｍｍ以下、６ｍｍ以下、５ｍｍ以下、４ｍｍ以下、３ｍｍ以下、２ｍｍ以下、１ｍｍ以下、０．５ｍｍ以下などであってよい。高低差は、実質的に存在しないことが好ましく、全く存在しないこと（すなわち高低差が０ｍｍであること）が最も好ましい。一態様において、上記高低差は０～１０ｍｍの範囲内である。上記高低差の調節は、例えば、第１の容器および／または第２の容器に添加する液体の量を調節することなどにより行うことができる。
　標識が添加されていない第１の容器または第２の容器に移行した標識を検出するステップは、標識の検出が可能な既知の任意の手法で行うことができる。例えば、標識が蛍光標識であれば、移行した標識を含み得る第１の容器または第２の容器に所定の波長の光を照射し、発生した蛍光の強度を測定することで、移行した標識を定量することができる。標識の検出は、上記のように、第１の容器または第２の容器に含まれ得る移行した標識を、当該容器内で検出してもよいし、当該容器に含まれる媒体を取り出して、当該容器外で検出してもよい。標識を第１の容器内で検出する場合、媒体の漏出を防ぐために、半透過性部分を適切な部材、例えば、フィルムやキャップなどでシールしてもよい。
　標識を、他の物質（検出剤）で検出する場合（例えば、酵素反応によって呈色または発光する物質を標識として用い、これを酵素と反応させて検出する場合、酵素を標識として用い、これを当該酵素の基質（例えば、酵素反応によって呈色または発光する物質）と反応させて検出する場合など）、検出剤は、移行した標識を検出するステップにおいて標識と反応させてもよいし、標識が移行する容器に、検出するステップより前に予め検出剤を入れておき、検出するステップにおいて、標識と検出剤との反応で生じたシグナル（例えば、呈色、発光など）を検出してもよい。
　本発明の方法により、測定した標識の量から、形成されたシート状細胞培養物の品質を評価することができる。ここで、シート状細胞培養物の品質としては、シート状細胞培養物の強度、シート化の程度、細胞密度、細胞のバイアビリティ、細胞の活力、細胞同士の接着状態などが挙げられる。シート状細胞培養物に存在する細胞間隙が大きい程、移行する標識の量が多くなるが、細胞間隙が大きい程、シート状細胞培養物の強度は低下する。また、下記の実施例が示すとおり、シート化が不十分であるほど、細胞密度が少ないほど、そして、細胞のバイアビリティや活力が低いほど、移行する標識の量は多くなる。
　品質の評価は、例えば、検出された標識の量と、所定の基準値とを比較することにより行うことができる。より具体的には、例えば、検出された標識の量が、所定の基準値以下の場合に、品質が良好であると評価し、基準値を超える場合に、品質が不良であると評価することができる。前記基準値は、実験などにより求めることができる。なお、標識の量は、標識の質量や濃度のほか、これに関連する数値、例えば、標識の性質に応じて、吸光度、蛍光強度、発光強度、ＲＦＵ、放射線量等の数値を含む。
　本発明の品質評価方法は、移植などに実際に使用するシート状細胞培養物に適用しても、同一条件で作製される複数のシート状細胞培養物からなるロットを代表するシート状細胞培養物に適用してもよい。後者の場合、本方法による品質評価の結果を、当該培養物が属するロット全体に適用することができる。
　本発明の別の側面は、（１）標識は通過するが、細胞は通過しない半透過性部分を有する第１の容器に細胞を播種し、該半透過性部分を被覆するようにシート化するステップ、
（２）第１の容器、または、前記半透過性部分を介して第１の容器と液体連通し得る液体不透過性の第２の容器に標識を添加するステップ、
（３）第１の容器と第２の容器とが前記半透過性部分を介して液体連通した状態で、標識を、第１の容器および第２の容器のうち、標識が添加されていない容器に、半透過性部分を介して移行させるステップ、
（４）前記標識が添加されていない容器に移行した標識を検出するステップ、
を含み、標識が細胞間接着により細胞間の通過が阻害されるものであり、ステップ（２）は、ステップ（１）と同時、ステップ（１）より前またはステップ（１）より後に行ってもよい、シート化完了判定のための方法（以下、「シート化完了判定方法」と略す場合がある）に関する。
　本発明のシート化完了判定方法におけるステップ（１）～（４）は、本発明の品質評価方法について上記したとおりである。実施例５が示すとおり、単位時間当たりの移行標識量は、シート化の進行に伴い徐々に減少し、シート化が完了するとほぼ一定の量に維持される。したがって、移行した標識の量を定期的に測定すること、または、モニターすることにより、シート化の完了を検出することができる。移行標識量等の測定は、ステップ（４）のみを定期的に繰り返しても、ステップ（２）～（４）を定期的に繰り返しても、ステップ（３）～（４）を定期的に繰り返してもよい。ステップ（４）のみを定期的に繰り返す場合、標識は、標識が添加されていない容器に継続的に移行し、蓄積されていくため、標識の量は時間の経過とともに増加するが、シート化の進行に伴い単位時間当たりの増加量は徐々に低下していき、シート化が完了するとほぼ一定となる。したがって、例えば、定期的に測定した標識の量から、標識の増加量を算出し、増加量が複数の連続する測定においてほぼ一定になったときに、シート化が完了したと判定することができる。ステップ（２）～（４）を定期的に繰り返す場合、例えば、移行した標識をステップ（４）の後に除去すれば、次のサイクルのステップ（２）で標識が新たに添加され、ステップ（３）で移行してくるため、検出される標識の量は時間の経過とともに徐々に減少し、シート化が完了するとほぼ一定となる。したがって、定期的に測定した標識の量が複数の連続する測定においてほぼ一定になったときに、シート化が完了したと判定することができる。また、ステップ（３）～（４）を定期的に繰り返す場合、例えば、移行した標識をステップ（４）の後に除去すれば、次のサイクルのステップ（３）で標識が新たに移行してくるため、検出される標識の量は時間の経過とともに徐々に減少し、シート化が完了するとほぼ一定となる。したがって、定期的に測定した標識の量が複数の連続する測定においてほぼ一定になったときに、シート化が完了したと判定することができる。
　「標識の量または増加量が複数の連続する測定においてほぼ一定になったとき」は、シート化培養初期の第１の容器または第２の容器に移行する標識の量または増加量の急速な減少が終わり、時間が経過しても大幅に変化しなくなったときを意味する。このときの複数の連続する測定における標識の量または増加量の変動幅は、限定されずに、例えば、約±２０％／時間、約±１０％／時間以内、約±８％／時間以内、約±６％／時間以内、約±５％／時間以内、約±４％／時間以内、約±３％／時間以内、約±２％／時間以内等であってよい。
　シート化完了の判定は、平均変化率や微分係数を基準に行うこともできる。検出される標識の量（例えば、積算移行量や単位時間当たりの移行量など）の経時的な変化率の絶対値は、シート化の進行に伴い小さくなるため、複数の時点で検出した標識の量を時間の関数として表し、変化率や微分係数の絶対値が所定の値より小さくなったときに、シート化が完了したと判定することができる。標識の単位時間当たりの移行量と時間との関数における微分係数を基準としてシート化の完了を判定する場合、微分係数の絶対値は、限定されずに、例えば、約１．０以下、約０．９以下、約０．８以下、約０．７以下、約０．６以下、約０．５以下、約０．４以下、約０．３以下、約０．２以下、約０．１以下などであってよい。
　したがって、本発明のシート化完了判定方法は、移行した標識の量を定期的に測定またはモニターするステップ、および／または、標識の量または増加量が複数の連続する測定においてほぼ一定になったとき、もしくは、標識の量の経時的な変化率の絶対値が基準値以下となったときに、シート化が完了したと判定するステップを、さらに含んでもよい。
　本発明のシート化完了判定方法は、移植などに実際に使用するシート状細胞培養物に適用しても、同一条件で作製される複数のシート状細胞培養物からなるロットを代表するシート状細胞培養物に適用してもよい。後者の場合、本方法による判定結果を、当該培養物が属するロット全体に適用し、シート状細胞培養物を培養基材から剥離するタイミングを最適化することができる。
　本発明の別の側面は、（１）標識は通過するが、細胞は通過しない半透過性部分を有する第１の容器に細胞を播種し、該半透過性部分を被覆するようにシート化培養するステップ、
（２）第１の容器、または、前記半透過性部分を介して第１の容器と液体連通し得る液体不透過性の第２の容器に標識を添加するステップ、
（３）第１の容器と第２の容器とが前記半透過性部分を介して液体連通した状態で、標識を、第１の容器および第２の容器のうち、標識が添加されていない容器に、半透過性部分を介して移行させるステップ、
（４）前記標識が添加されていない容器に移行した標識を検出するステップ、
（５）標識の量もしくは増加量が複数の連続する測定においてほぼ一定になったとき、または、標識の量の経時的な変化率の絶対値が基準値以下となったときに、シート化培養を終了し、シート状細胞培養物を第１の容器から回収するステップ
を含み、標識が細胞間接着により細胞間の通過が阻害されるものであり、ステップ（２）は、ステップ（１）と同時、ステップ（１）より前またはステップ（１）より後に行ってもよい、移植用シート状細胞培養物の製造方法（以下、「製造方法」と略す場合がある）に関する。
　本発明のシート化完了判定方法におけるステップ（１）～（４）は、本発明の品質評価方法について上記したとおりである。また、ステップ（５）における「標識の量もしくは増加量が複数の連続する測定においてほぼ一定になったとき」および「標識の量の経時的な変化率の絶対値が基準値以下となったとき」は、本発明のシート化完了判定方法について上記したとおりである。
　ステップ（５）における第１の容器からのシート状細胞培養物の回収は、シート状細胞培養物が少なくとも部分的に、シート構造を保ったまま、足場となっている培養基材から遊離（剥離）できれば特に限定されず、例えば、タンパク質分解酵素（例えばトリプシンなど）による酵素処理および／またはピペッティングなどの機械的処理によって行うことができる。また、細胞を、刺激、例えば、温度や光に応答して物性が変化する材料で表面を被覆した培養表面上で培養して細胞培養物を形成した場合には、所定の刺激を加えることで、非酵素的に遊離することもできる。
　本発明の製造方法は、ステップ（５）の最中、前または後に、シート状細胞培養物を洗浄するステップをさらに含んでもよい。当該ステップにより、シート状細胞培養物に付着した標識を除去することができる。
　本発明の別の側面は、（１）標識は通過するが、細胞は通過しない半透過性部分を有する第１の容器に細胞を播種し、該半透過性部分を被覆するようにシート化培養するステップ、
（２）第１の容器、または、前記半透過性部分を介して第１の容器と液体連通し得る液体不透過性の第２の容器に標識を添加するステップ、
（３）第１の容器と第２の容器とが前記半透過性部分を介して液体連通した状態で、標識を、第１の容器および第２の容器のうち、標識が添加されていない容器に、半透過性部分を介して移行させるステップ、
（４）前記標識が添加されていない容器に移行した標識を検出するステップ、
を含み、標識が細胞間接着により細胞間の通過が阻害されるものであり、ステップ（２）は、ステップ（１）と同時、ステップ（１）より前またはステップ（１）より後に行ってもよい、細胞のシート形成能を評価する方法（以下、「シート形成能評価方法」と略す場合がある）に関する。
　本発明のシート形成能評価方法におけるステップ（１）～（４）は、本発明の品質評価方法について上記したとおりである。実施例６に示すとおり、シート形成中に剥離を生じるなど、シート形成に異常をきたす細胞は、シート形成後の標識の移行量が多いことが明らかとなった。したがって、ステップ（１）～（４）を行うことにより、ある対象（例えば患者）の細胞が、移植などに用いる臨床用のシート状細胞培養物の作製に適したシート形成能を有するか否かを、検出した標識の量に基づいて事前に評価することができる。これにより、不完全なシート状細胞培養物の製造への着手を回避することが可能となる。シート形成能は、細胞がシートを形成する能力を意味する。特定の理論に拘束されることは望まないが、シートの形成には、細胞の、培養基材と接着する能力、細胞同士で接着する能力、細胞外基質の分泌能力、伸展能力、移動能力などの様々な能力や、細胞の活力などが関与していると考えられる。シート形成能の評価は、例えば、検出された標識の量と、所定の基準値とを比較することにより行うことができる。より具体的には、例えば、検出された標識の量が、所定の基準値以下の場合に、細胞のシート形成能が十分であると評価し、基準値を超える場合に、細胞のシート形成能が不十分であると評価することができる。前記基準値は、実験などにより求めることができる。また、本発明のシート形成能評価方法による、シート形成能が不十分であるとする評価結果を、ある対象が、シート状細胞培養物を用いた処置に適しているかを判断する材料とすることができる。
　本発明の別の側面は、（１）標識は通過するが、細胞は通過しない半透過性部分を有する第１の容器に細胞を播種し、該半透過性部分を被覆するようにシート化培養するステップ、
（２）第１の容器、または、前記半透過性部分を介して第１の容器と液体連通し得る液体不透過性の第２の容器に標識を添加するステップ、
（３）第１の容器と第２の容器とが前記半透過性部分を介して液体連通した状態で、標識を、第１の容器および第２の容器のうち、標識が添加されていない容器に、半透過性部分を介して移行させるステップ、
（４）前記標識が添加されていない容器に移行した標識を検出するステップ、
を含み、標識が細胞間接着により細胞間の通過が阻害されるものであり、ステップ（２）は、ステップ（１）と同時、ステップ（１）より前またはステップ（１）より後に行ってもよい、シート状細胞培養物の製造過程におけるシートの剥離を検出する方法（以下、「剥離検出方法」と略す場合がある）に関する。
　本発明の剥離検出方法におけるステップ（１）～（４）は、本発明の品質評価方法について上記したとおりである。シート状細胞培養物の製造過程において、シート形成中に剥離が生じると、正常なシート化が行われず、品質の低いシート状細胞培養物となる。したがって、シート状細胞培養物の製造過程の複数の時点で標識の移行量を測定し、シート化の進行に伴い移行量が次第に減少する中、移行量が増加（または減少率が鈍化）したときに、剥離が生じたと判定することができる。剥離が生じたシート状細胞培養物については、剥離が検出され次第製造を中止し、新たな細胞で製造をやり直すなどの措置をいち早く講じることができ、製造の最終段階で品質チェックを行う場合に比べ、時間などのロスを回避することが可能となる。
　本発明の別の側面は、
（１）細胞間接着により細胞間の通過が阻害される標識、
（２）前記標識は通過するが、細胞は通過しない半透過性部分を有する第１の容器、および
（３）前記半透過性部分を収容可能な液体不透過性の第２の容器
を含む、シート状細胞培養物の製造、シート状細胞培養物の品質評価、シート状細胞培養物のシート化完了の判定、細胞のシート形成能の評価、および／または、シート状細胞培養物の製造過程における剥離の検出のためのキットに関する。
　本発明のキットの構成要素（１）～（３）は、本発明の品質評価方法について上記したとおりである。また、本発明のキットは、上記の１または２以上の用途に適した任意の構成、例えば、各容器に添加する媒体、発色試薬、遮光カバー、各用途に関する使用説明書や、使用方法に関する情報を記録した媒体、例えば、フレキシブルディスク、ＣＤ、ＤＶＤ、ブルーレイディスク、メモリーカード、ＵＳＢメモリーなどをさらに含んでもよい。
　本発明の別の側面は、
（１）細胞間接着により細胞間の通過が阻害される標識、
（２）前記標識は通過するが、細胞は通過しない半透過性部分を有する第１の容器、
（３）前記半透過性部分を収容可能な液体不透過性の第２の容器、および
（４）標識を検出する検出器
を備えた、シート状細胞培養物の製造、シート状細胞培養物の品質評価、シート状細胞培養物のシート化完了の判定、細胞のシート形成能の評価、および／または、シート状細胞培養物の製造過程における剥離の検出のためのシステムに関する。
　本発明のシステムの構成要素（１）～（３）は、本発明の品質評価方法について上記したとおりである。また、構成要素（４）の検出器は、標識を検出することができれば特に限定されず、例えば、分光光度計などの光度計、吸光度計、濁度計、色度計、シンチレーションカウンターなどの放射線検出器などを含む。当業者であれば、使用する標識に適した検出器を選択することができる。本発明のシステムは、検出器を１種のみ備えていても、複数種備えていてもよい。本発明のシステムは、上記の１または２以上の用途に適した任意の構成、例えば、検出器からの信号の処理や、アクチュエータの制御などを行うプロセッサ、表示装置や入力装置などのインターフェース、標識を容器に添加するためのインジェクタ、各容器を移動させるマニピュレータ、細胞培養用インキュベータ、撹拌器などをさらに備えていてもよい。
　本発明の別の側面は、（１）標識は通過するが、細胞は通過しない半透過性部分を有する第１の容器に、単離シート状細胞培養物を、該半透過性部分を被覆するように配置するステップ、
（２）第１の容器、または、前記半透過性部分を介して第１の容器と液体連通し得る液体不透過性の第２の容器に、標識を添加するステップ、
（３）第１の容器と第２の容器とが前記半透過性部分を介して液体連通した状態で、標識を、第１の容器および第２の容器のうち、標識が添加されていない容器に、半透過性部分を介して移行させるステップ、
（４）前記標識が添加されていない容器に移行した標識を検出するステップ
を含み、標識が細胞間接着により細胞間の通過が阻害されるものであり、ステップ（２）は、ステップ（１）と同時、ステップ（１）より前またはステップ（１）より後に行ってもよい、単離シート状細胞培養物の品質評価のための方法（以下、「単離シート状細胞培養物の品質評価方法」と略す場合がある）に関する。
　本発明の、単離シート状細胞培養物の品質評価方法の各ステップは、細胞を第１の容器に播種し、半透過性部分を被覆するようにシート化する代わりに、単離されたシート状細胞培養物を、第１の容器に半透過性部分を被覆するように配置する点が異なる以外は、本発明の品質評価方法と同様であり、同様のシート状細胞培養物の品質、例えば、シート状細胞培養物の強度、シート化の程度、細胞密度、細胞のバイアビリティ、細胞の活力、細胞同士の接着状態などを評価することができる。「単離シート状細胞培養物」は、典型的には、シート化後に、培養基材から遊離（剥離）されたシート状細胞培養物を指す。
　単離シート状細胞培養物の配置は、単離シート状細胞培養物が半透過性部分に接着するよう、所定の期間にわたって行うことができる。単離シート状細胞培養物の半透過性部分への接着は、例えば、単離シート状細胞培養物を半透過性部分に接触させた状態で所定の期間培養することなどにより達成することができる。配置期間（例えば、培養期間）は、単離シート状細胞培養物の半透過性部分への接着を可能にするものであれば特に限定されず、例えば、５分～２４時間、１０分～１２時間、１５分～６時間、３０分～３時間などであってよい。
　単離シート状細胞培養物は、本発明の品質評価方法について上記したとおり、１の細胞層からなるもの（単層シート状細胞培養物）であっても、２以上の細胞層の積層から構成されるもの（積層シート状細胞培養物）であってもよい。積層シート状細胞培養物は、例えば、２以上のシート状細胞培養物を直接、または、介在物質を介して重ね合わせ、１枚のシート状細胞培養物とすることなどによって作製される。介在物質としては、限定されずに、例えば、シート状細胞培養物同士の接着を促進および／または強化する物質などが挙げられ、その非限定例としては、例えば、細胞外基質構成成分またはこれを含む組成物（例えば、コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニン、ビトロネクチン、プロテオグリカン、グリコサミノグリカン、ハイドロゲル、ゼラチン等）、接着タンパク質（例えば、カドヘリンファミリー、セレクチンファミリー、インテグリンファミリー等）などが挙げられる。評価対象の単離シート状細胞培養物が積層シート状細胞培養物である場合は、上記の品質項目に加え、シート状細胞培養物の積層枚数や、積層の欠陥（例えば、積層時のシート状細胞培養物の折れ曲がり、皺形成、破れなど）などを評価することも可能である。
　本発明の別の側面は、（１）標識は通過するが、細胞は通過しない半透過性部分を有する第１の容器に、複数のシート状細胞培養物を、該半透過性部分を被覆するように積層するステップ、
（２）第１の容器、または、前記半透過性部分を介して第１の容器と液体連通し得る液体不透過性の第２の容器に、標識を添加するステップ、
（３）第１の容器と第２の容器とが前記半透過性部分を介して液体連通した状態で、標識を、第１の容器および第２の容器のうち、標識が添加されていない容器に、半透過性部分を介して移行させるステップ、
（４）前記標識が添加されていない容器に移行した標識を検出するステップ
を含み、標識が細胞間接着により細胞間の通過が阻害されるものであり、ステップ（２）は、ステップ（１）と同時、ステップ（１）より前またはステップ（１）より後に行ってもよい、積層シート状細胞培養物の品質評価のための方法（以下、「積層シート状細胞培養物の品質評価方法」と略す場合がある）に関する。
　本発明の積層シート状細胞培養物の品質評価方法におけるステップ（２）～（４）は、本発明の品質評価方法について上記したとおりである。
　ステップ（１）における、複数のシート状細胞培養物の積層は、本発明の品質評価方法と同様、まず第１の容器に細胞を播種し、半透過性部分を被覆するようにシート化させてから、別途作製した単離シート状細胞培養物を、シート化したシート状細胞培養物上に積層することにより達成しても、まず第１の容器に第１の単離シート状細胞培養物を半透過性部分を被覆するように配置してから、別途作製した第２の単離シート状細胞培養物を、第１の単離シート状細胞培養物に上に積層することにより達成してもよい。単離シート状細胞培養物は、単層のものであっても積層されたものであってもよく、第１の容器に積層した単離シート状細胞培養物上に、１または２以上の単離シート状細胞培養物をさらに積層してもよい。積層するシート状細胞培養物の枚数は特に限定されず、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０枚または１１枚以上などであってよい。
　シート状細胞培養物の積層は、限定されずに、例えば、第１の容器内のシート状細胞培養物上に、単離シート状細胞培養物を配置することなどにより達成することができる。前記配置は、限定されずに、例えば、２枚以上のシート状細胞培養物を直接、または、介在物質を介して重ね合わせることなどによって達成することができる。介在物質については、本発明の単離シート状細胞培養物の品質評価方法について上記したとおりである。シート状細胞培養物同士を接着させるため、単離シート状細胞培養物を配置後、重なり合ったシート状細胞培養物を所定の期間培養してもよい。培養期間は、重なり合ったシート状細胞培養物同士の接着を可能にするものであれば特に限定されず、例えば、５分～２４時間、１０分～１２時間、１５分～６時間、３０分～３時間などであってよい。培養は、単離シート状細胞培養物を１枚積層するごとに行っても、所望の枚数の単離シート状細胞培養物を全て積層した後に行ってもよい。評価後の積層シート状細胞培養物は、第１の容器から剥離し、移植などに用いてもよい。
　本発明の積層シート状細胞培養物の品質評価方法により、積層シート状細胞培養物の強度、シート化の程度、細胞密度、細胞のバイアビリティ、細胞の活力、細胞同士の接着状態、シート状細胞培養物の積層枚数、積層の欠陥（例えば、積層時のシート状細胞培養物の折れ曲がり、皺形成、破れなど）などを評価することができる。
　本発明の別の側面は、（１）標識は通過するが、細胞は通過しない半透過性部分を有する第１の容器に細胞を播種し、該半透過性部分を被覆するようにシート化する、または、前記第１の容器に、単離シート状細胞培養物を、該半透過性部分を被覆するように配置するステップ、
（２）第１の容器、または、前記半透過性部分を介して第１の容器と液体連通し得る液体不透過性の第２の容器に標識を添加するステップ、
（３）第１の容器と第２の容器とが前記半透過性部分を介して液体連通した状態で、標識を、第１の容器および第２の容器のうち、標識が添加されていない容器に、半透過性部分を介して移行させるステップ、
（４）前記標識が添加されていない容器に移行した標識を検出するステップ、
を含み、標識が細胞間接着により細胞間の通過が阻害されるものであり、ステップ（２）は、ステップ（１）と同時、ステップ（１）より前またはステップ（１）より後に行ってもよい、シート状細胞培養物の細胞純度または細胞構成比を評価する方法（以下、「細胞純度評価方法」と略す場合がある）に関する。
　本発明の細胞純度評価方法におけるステップ（１）～（４）は、本発明の品質評価方法および単離シート状細胞培養物の品質評価方法について上記したとおりである。
　実施例８が示すとおり、単位時間当たりの移行標識量は、シート状細胞培養物を構成する細胞の種類によって異なることが今回明らかとなった。したがって、細胞純度または細胞構成比が未知のシート状細胞培養物における移行標識量を検出し、これを同じ条件で測定した細胞純度または細胞構成比が既知のシート状細胞培養物における移行標識量と比較することにより、評価対象のシート状細胞培養物の細胞純度または細胞構成比を推定することや、細胞純度または細胞構成比の異常を検出することなどが可能である。
　本発明の細胞純度評価方法において、播種する細胞は複数の細胞種を含んでもよく、典型的には、細胞純度および／または細胞構成比は未知である。本発明の細胞純度評価方法は、検出された移行した標識の量と、基準値とを比較するステップをさらに含んでもよい。基準値は、限定されずに、例えば、評価対象のシート状細胞培養物と同じ条件で測定した、細胞純度または細胞構成比が既知のシート状細胞培養物における移行標識量であってもよい。比較対象となる基準値は、１種または２種以上存在してよい。例えば、基準値は、１種類の所望の細胞純度を有するシート状細胞培養物に関する移行標識量であってもよいし、許容範囲の上限および下限の細胞純度を有する２種類のシート状細胞培養物のぞれぞれに関する移行標識量であってもよいし、検量線が作成できる程度の、既知の異なる細胞純度を有する複数のシート状細胞培養物のぞれぞれに関する移行標識量であってもよい。比較の結果、検出された移行標識量と基準値との乖離が所定の程度より大きい場合、または、検出された移行標識量が、複数の基準値で構成される所定の範囲に含まれない場合、評価対象のシート状細胞培養物の細胞純度または細胞構成比に異常があると評価することができる。また、検出された移行標識量と基準値との乖離が所定の程度より小さい場合、または、検出された移行標識量が、複数の基準値で構成される所定の範囲に含まれる場合、評価対象のシート状細胞培養物の細胞純度または細胞構成比が正常であると評価することができる。さらに、複数の基準値を基に、細胞純度または細胞構成比と、移行標識量との関係を示す検量線を作成することにより、検出された移行標識量から、評価対象のシート状細胞培養物の細胞純度または細胞構成比を推定することができる。
　一態様において、細胞純度は、骨格筋芽細胞の純度である。一態様において、細胞純度は、線維芽細胞の純度である。一態様において、細胞構成比は、骨格筋芽細胞と線維芽細胞との構成比である。
　本発明の別の側面は、（１）標識は通過するが、細胞は通過しない半透過性部分を有する第１の容器に細胞を播種し、該半透過性部分を被覆するようにシート化培養するステップ、
（２）第１の容器、または、前記半透過性部分を介して第１の容器と液体連通し得る液体不透過性の第２の容器に標識を添加するステップ、
（３）第１の容器と第２の容器とが前記半透過性部分を介して液体連通した状態で、標識を、第１の容器および第２の容器のうち、標識が添加されていない容器に、半透過性部分を介して移行させるステップ、
（４）前記標識が添加されていない容器に移行した標識の量を検出するステップ、
（５）検出された移行標識量と基準値とを比較するステップ、
（６）比較結果に基づいてシート状細胞培養物の製造過程における異常を検出するステップ
を含み、標識が細胞間接着により細胞間の通過が阻害されるものであり、ステップ（２）は、ステップ（１）と同時、ステップ（１）より前またはステップ（１）より後に行ってもよい、シート状細胞培養物の製造過程における異常を検出する方法（以下、「異常検出方法」と略す場合がある）に関する。
　本発明の異常検出方法におけるステップ（１）～（４）は、本発明の品質評価方法について上記したとおりである。
　ステップ（５）における基準値は、製造中のシート状細胞培養物の種々のパラメーターの異常、例えば、シート状細胞培養物の強度、シート化の程度、細胞密度、細胞のバイアビリティ、細胞の活力、細胞同士の接着状態などの異常に関連するものを含む。基準値の非限定例としては、例えば、シート化が完了した標準的なシート状細胞培養物における移行標識量（例えば、シート化が完了した複数のシート状細胞培養物における移行標識量の平均値等）、シート化開始から所定期間経過後の標準的なシート状細胞培養物における移行標識量（例えば、シート化開始から所定期間経過後の複数のシート状細胞培養物における移行標識量の平均値等）、シート化開始から所定期間経過後の標準的なシート状細胞培養物における移行標識量の時間に対する微分係数（例えば、シート化開始から所定期間経過後の複数のシート状細胞培養物における移行標識量の移行標識量の時間に対する微分係数の平均値等）、シート化開始後の所定期間内における移行標識の経時的な変化量、変化率（例えば、平均変化率等）、シート化開始後の異なる２時点間における移行標識量の変化量、変化率（例えば、平均変化率等）などが挙げられる。上記基準値は、例えば、実施例３～６に記載の実験などにより適宜求めることができる。基準値は単一の数値であっても、数値範囲であってもよい。
　ステップ（５）においては、検出された移行標識量と基準値とを比較し、例えば、基準値が単一の数値である場合は、検出された移行標識量が基準値より大きいか、小さいかまたは同じであるか、基準値が数値範囲である場合は、検出された移行標識量が基準値に含まれるか、基準値の上限より大きいか、基準値の下限より小さいかなどの結果を出力する。
　ステップ（６）においては、ステップ（５）の比較結果を受けて、シート状細胞培養物の製造過程における異常（例えば、異常の有無、異常の可能性の有無等）を検出する。例えば、実施例３の結果が示すとおり、細胞密度が低いほど所定期間経過後の移行標識量は多くなるため、シート化開始から所定期間経過後の移行標識量が基準値より大きければ、細胞密度が低いという異常またはその可能性の存在を検出できる。また、実施例４が示すとおり、細胞のバイアビリティが低いほど所定期間経過後の移行標識量は多くなるため、シート化開始から所定期間経過後の移行標識量が基準値より大きければ、細胞のバイアビリティが低いという異常またはその可能性の存在を検出できる。さらに、実施例５が示すとおり、シート状細胞培養物のシート化の進行に伴い、単位時間当たりの移行標識量は減少して徐々に０に近づき、移行標識の積算量は徐々に一定の値に近づき、また、移行標識量の単位時間当たりの変化量または変化率は、シート化開始の初期が最も大きく、時間経過とともに徐々に小さくなる。したがって、シート化開始から所定期間経過後の移行標識量の時間に対する微分係数、シート化開始後の所定期間内における移行標識の経時的な変化量や変化率、シート化開始後の異なる２時点間における移行標識量の変化量や変化率が基準値より大きい場合は、シート化の不良という異常またはその可能性の存在を検出できる。また、実施例６が示すとおり、シート化の最中に細胞の剥離が生じると移行標識量が増大するため、シート化開始から所定期間経過後の移行標識量が基準値より大きければ、細胞の剥離が生じたという異常またはその可能性の存在を検出できる。
　シート状細胞培養物の製造過程における異常またはその可能性を検出することにより、シート状細胞培養物の製造過程を制御することが可能となり、製造の効率化（例えば、製造時間の短縮等）、不良発生の防止、品質の改善、細胞の有効利用、歩留まりの向上などを図ることができる。移行標識量の検出を製造過程の比較的早期（限定されずに、例えば、細胞播種後１時間以内、２時間以内、３時間以内、４時間以内、５時間以内、６時間以内、７時間以内、８時間以内、９時間以内または１０時間以内等）に行うことにより、早期に異常を検出し、必要な措置を講じることが可能となる。
　本発明の別の側面は、（１）標識は通過するが、細胞は通過しない半透過性部分を有する第１の容器に細胞を播種し、該半透過性部分を被覆するようにシート化培養するステップ、
（２）第１の容器、または、前記半透過性部分を介して第１の容器と液体連通し得る液体不透過性の第２の容器に標識を添加するステップ、
（３）第１の容器と第２の容器とが前記半透過性部分を介して液体連通した状態で、標識を、第１の容器および第２の容器のうち、標識が添加されていない容器に、半透過性部分を介して移行させるステップ、
（４）前記標識が添加されていない容器に移行した標識の量を検出するステップ、
（５）検出された移行標識量と基準値とを比較するステップ、
（６）比較結果に基づいてシート状細胞培養物の製造過程を制御するステップ
を含み、標識が細胞間接着により細胞間の通過が阻害されるものであり、ステップ（２）は、ステップ（１）と同時、ステップ（１）より前またはステップ（１）より後に行ってもよい、シート状細胞培養物の製造方法（以下、「制御製造方法」と略す場合がある）に関する。
　本発明の制御製造方法におけるステップ（１）～（５）は、本発明の品質評価方法および異常検出方法について上記したとおりである。
　ステップ（６）においては、ステップ（５）の比較結果に基づいてシート状細胞培養物の製造過程を様々に制御する。例えば、ステップ（５）の比較結果に基づいて、本発明の異常検出方法のステップ（５）と同様にシート状細胞培養物の製造過程における異常またはその可能性の有無を検出し、異常またはその可能性が検出されない場合は製造を続行し、異常またはその可能性が検出された場合は製造を中止したり、製造を中断して異常を調査し、その解消のための措置を講じたりすることができる。異常解消のための措置の非限定例としては、例えば、異常が細胞密度の不足であれば、製造を中止し、より多くの細胞を播種してシート化をやり直すことなどが、異常が培地の異常であれば、培地を交換することなどが、異常が細胞の剥離であれば、製造を中止し、シート化をやり直すことなどが、異常がシート化の不良であれば、シート化期間を延長することや、製造を中止し、シート化をやり直すことなどが挙げられる。
　本発明の制御製造方法の特定の態様の非限定例を、図１～３に示すアルゴリズムを参照してより詳細に説明する。
　図１に示すアルゴリズム（アルゴリズム１）においては、処理の開始（Start）後に、まず第１の容器に細胞を播種し（Plating）、該半透過性部分を被覆するようにシート化培養（Incubation 1）を開始する。所定の期間経過後、第１の移行標識量Xを検出し（Detection 1）、Xを第１の基準値（Reference value 1）と比較する。Xが第１の基準値より大きければ（「No」の場合）、細胞の播種に問題があった（例えば、細胞数の不足など）と判定し、播種をやり直す。播種のやり直しは、限定されずに、例えば、シート化培養中の細胞培養物を含む容器に追加の細胞を播種することにより行っても、シート化培養中の細胞培養物を酵素処理などにより単細胞懸濁液としてから、追加の細胞を加えることなどにより細胞数を調整した後、容器に播種することにより行っても、シート化培養中の細胞培養物を廃棄し、新たな細胞を播種することにより行ってもよい。シート化培養の比較的早期に移行標識量を検出することにより、細胞の異常をいち早く検出でき、そのままシート化培養を続けることによる時間のロスを回避することが可能となる。Xが第１の基準値以下であれば（「Yes」の場合）、シート化培養を継続する（Incubation 2）。所定の期間経過後、第２の移行標識量Yを検出し（Detection 2）、Yを第２の基準値（Reference value 2）と比較する。Yが第２の基準値より大きければ（「No」の場合）、シート化培養時間が不足していると判定し、所定期間シート化培養を行う。所定期間後に再度第２の移行標識量Yを検出し、これを第２の基準値と比較する。この処理をYが第２の基準値以下となるまで繰り返す。Yが第２の基準値以下であれば（「Yes」の場合）、シート化が完了したと判定して、外観検査を行う。外観検査で異常がなければ（「Yes」の場合）、シート状細胞培養物を培養基材から剥離し（Detachment）、処理を終了する（End）。外観検査で異常を認めたら（「No」の場合）、培地交換を行い（Medium replacement）、シート化培養を再開する。培地交換後のシート化培養でも外観検査で異常を認める場合は、さらなる培地交換を行うことなく、処理を終了してもよい。
　また、図２に示すように、Xおよび／またはYの値が基準値より大きい場合、外観検査でシート状細胞培養物が培養基材から剥離している（Detached）か否かを調査し、一部剥離している場合（「Partially」の場合）は剥離（Detachment）に進み、完全に剥離している場合（「Fully」の場合）は終了（End）に進む態様も可能である。シート状細胞培養物の培養基材からの剥離状態の判定は、シート状細胞培養物の一部が、シート状細胞培養物としての一体性を保ったまま培養基材から剥離していれば一部剥離（Partially）、シート状細胞培養物の全体が、シート状細胞培養物としての一体性を保ったまま培養基材から剥離していれば完全剥離（Fully）、前記のいずれでもなければ剥離していない（No）とすることができる。なお、シート状細胞培養物が剥離後ある程度時間が経過して塊状になっている場合は、シート状細胞培養物を使用に供さず、廃棄してもよい。
　上記アルゴリズムに従って処理することで、シート化の完了をいち早く検出でき、不要な培養時間をカットすることが可能となる。また、異常が検出された場合、細胞を廃棄するのではなく、培地交換や細胞の追加などにより異常を修正して培養を継続することで細胞を有効利用できるため、使用する細胞数を全体として減らすことができ、歩留まりを高めることができる。
　図２に示すアルゴリズム（アルゴリズム２）においては、処理の開始（Start）後に、まず第１の容器に細胞を播種し（Plating）、該半透過性部分を被覆するようにシート化培養（Incubation）を開始する。所定の期間経過後、移行標識量Xを検出し（Detection）、Xを基準値（Reference value）と比較する。Xが基準値より大きければ（「No」の場合）、細胞数を細胞培養物の外観（肉眼で確認できる程の空隙や剥離細胞の有無）などから検査し、異常があれば（「No」の場合）、播種をやり直す。異常がなければ（「Yes」の場合）、培地の状態を検査し、異常（例えば、変色、混濁、ｐＨの異常等）が認められたら（「No」の場合）、培地交換を行い（Medium replacement）、シート化培養を再開する。Xが基準値以下であれば（「Yes」の場合）、外観検査を行い、異常がなければ（「Yes」の場合）、シート状細胞培養物を培養基材から剥離し（Detachment）、処理を終了する（End）。外観検査で異常（例えば、肉眼で確認できる程の空隙や剥離細胞の存在、異物の混入等）を認めたら（「No」の場合）、シート化培養を中止し（Stop incubation）、処理を終了する（End）。このアルゴリズムでは、移行標識量Xが基準値より大きい場合に、細胞数の異常と培地の異常とを区別し、それぞれに適した措置を行うことなどで、製造の効率化を図るとともに、細胞を有効利用し、使用する細胞数を全体として減らすことができ、歩留まりを高めることができる。
　図３に示すアルゴリズム（アルゴリズム３）においては、処理の開始（Start）後に、まず第１の容器に細胞を播種し（Plating）、該半透過性部分を被覆するようにシート化培養（Incubation 1）を開始する。所定の期間経過後、第１の移行標識量Xを検出し（Detection 1）、Xを第１の基準値（Reference value 1）と比較する。Xが第１の基準値より大きければ（「No」の場合）、培養期間が不足していると判定し、シート化培養（Incubation 1）を繰り返す。Xが第１の基準値以下であれば（「Yes」の場合）、シート化培養を継続する（Incubation 2）。所定の期間経過後、移行標識量を検出し（Detection 2）、直前に検出した（Detection 1またはDetection 2）移行標識量との変化量または変化率の絶対値Yを算出し、Yを第２の基準値（Reference value 2）と比較する。Yが第２の基準値より大きければ（「No」の場合）、合計シート化培養期間（すなわち、シート化培養（Incubation 1）の開始からの経過時間）「t」が基準範囲A～Bに含まれるかを判定し、tが下限値Aより小さければ（「t < A」の場合）、培養期間が不足していると判定し、シート化培養（Incubation 2）を繰り返し、tが基準範囲A～B以内であれば（「A ≦ t ≦ B」の場合）、培地に異常があると判定し、培地交換（Medium replacement）を行ってからシート化培養（Incubation 2）を繰り返し、tが上限値Bより大きければ（「t > B」の場合）、シート化に異常があったと判定し、培養を中止し（Stop incubation）、処理を終了する（End）。一方、Yが第２の基準値より以下であれば（「Yes」の場合）、シート状細胞培養物を培養基材から剥離し（Detachment）、処理を終了する（End）。基準範囲A～Bは特に限定されないが、例えば、２４時間～７２時間等であってよい。剥離の前に、外観検査を行い、外観的な異常をさらに検出することもできる。このアルゴリズムでは、シート化の完了が遅い場合に、合計シート化培養期間の長さに応じて適した措置を取ることなどが可能であり、製造の効率化を図ることができる。
　上記のアルゴリズムは、本発明の制御製造方法の特定の態様を表したものであり、本発明の制御製造方法はこれらの態様のみならず、他の様々な態様を包含することはいうまでもない。また、本発明の制御製造方法に係る上記または他のアルゴリズムを、後述のシート状細胞培養物の制御製造のためのシステムに実装してもよい。
　本発明の別の側面は、
（１）細胞間接着により細胞間の通過が阻害される標識、
（２）前記標識は通過するが、細胞は通過しない半透過性部分を有する第１の容器、および
（３）前記半透過性部分を収容可能な液体不透過性の第２の容器
を含む、単離シート状細胞培養物の品質評価、積層シート状細胞培養物の品質評価、シート状細胞培養物の細胞純度もしくは細胞構成比の評価、シート状細胞培養物の製造過程における異常の検出、および／または、シート状細胞培養物の制御製造のためのキットに関する。
　本発明のキットの構成要素（１）～（３）は、本発明の品質評価方法について上記したとおりである。また、本発明のキットは、上記の１または２以上の用途に適した任意の構成、例えば、各容器に添加する媒体、発色試薬、遮光カバー、各用途に関する使用説明書や、使用方法に関する情報を記録した媒体、例えば、フレキシブルディスク、ＣＤ、ＤＶＤ、ブルーレイディスク、メモリーカード、ＵＳＢメモリーなどをさらに含んでもよい。
　本発明の別の側面は、
（１）細胞間接着により細胞間の通過が阻害される標識、
（２）前記標識は通過するが、細胞は通過しない半透過性部分を有する第１の容器、
（３）前記半透過性部分を収容可能な液体不透過性の第２の容器、および
（４）標識を検出する検出器
を備えた、単離シート状細胞培養物の品質評価、積層シート状細胞培養物の品質評価、シート状細胞培養物の細胞純度もしくは細胞構成比の評価、シート状細胞培養物の製造過程における異常の検出、および／または、シート状細胞培養物の制御製造のためのシステムに関する。
　本発明のシステムの構成要素（１）～（３）は、本発明の品質評価方法について上記したとおりである。また、構成要素（４）の検出器は、本発明の標識を検出することができれば特に限定されず、例えば、分光光度計などの光度計、吸光度計、濁度計、色度計、シンチレーションカウンターなどの放射線検出器などを含む。当業者であれば、使用する標識に適した検出器を選択することができる。本発明のシステムは、検出器を１種のみ備えていても、複数種備えていてもよい。本発明のシステムは、上記の１または２以上の用途に適した任意の構成、例えば、検出器からの信号の処理や、アクチュエータの制御などを行うプロセッサ、表示装置や入力装置などのインターフェース、標識を容器に添加するためのインジェクタ、各容器を移動させるマニピュレータ、細胞培養用インキュベータ、撹拌器などをさらに備えていてもよい。シート状細胞培養物の制御製造のためのシステムにおいて、上記プロセッサには、本発明の制御製造方法に係る上記または他のアルゴリズムが実施されていてもよい。
　以下に、本発明を実施例を参照してより詳細に説明するが、これは本発明の特定の具体例を示すものであり、本発明はこれに限定されるものではない。
実施例１　半透過性部分の細孔密度の検討
　第１の容器として孔径３μｍ、細孔密度８．０±２×１０５個／ｃｍ２（低密度）または２．０±０．２×１０５個／ｃｍ２（高密度）の半透明のＰＥＴ製６ウェルカルチャーインサート（BD）を、第２の容器として無色透明のポリスチレン製６ウェルプレート（BD）を用いた。カルチャーインサートを２０％ヒト血清を含むＤＭＥＭ－Ｆ１２培地（Life Technologies）が２．７ｍｌ入ったプレートウェルに挿入し、ヒト筋組織から定法により調製した骨格筋芽細胞を４．４×１０６個／カルチャーインサートの密度でプレートウェル内と同様の培地１．５ｍｌに懸濁して播種した。３７℃、５％ＣＯ２にて約１７時間シート化培養を行った。シート化培養後、インサート内の培地を、５０μｇ／ｍｌのＦＩＴＣ標識デキストラン（SIGMA、平均分子量３０００～５０００）を含むＨＢＳＳ（＋）溶液に、プレートウェル内の培地を、５０μｇ／ｍｌの非標識デキストラン（SIGMA、分子量～６０００）を含むＨＢＳＳ（＋）溶液にそれぞれ置換することにより標識を添加し、２５℃で１時間インキュベートした。次いで、インサートを取り出し、プレート側のウェルに含まれるＦＩＴＣの吸光度をプレートリーダーで読み取った（４８５ｎｍ／５３８ｎｍ）。結果を表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
 　上記のとおり、シート状細胞培養物の存在により、プレート側に移行するＦＩＴＣ標識デキストランの量が顕著に減少することが分かる。また、インサートの細孔密度の違いによる差はほとんど見られなかったが、密度が高い方が良好な感度が得られる傾向が見られた。
実施例２　標識の拡散時間の検討
　第１の容器として孔径３μｍ、細孔密度２．０±０．２×１０５個／ｃｍ２の６ウェルカルチャーインサート（BD）を用い、標識添加後のインキュベーション時間を２０分、６時間または２３時間とした以外は、実施例１と同様の実験を行った。結果を表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　実施例１と同様、シート状細胞培養物の存在により、プレート側に移行するＦＩＴＣ標識デキストランの量が顕著に減少することが確認された。このことから、プレート側に移行するＦＩＴＣ標識デキストランの量を測定することにより、シート状細胞培養物がどの程度ＦＩＴＣ標識デキストランを透過させるか、すなわち、シート状細胞培養物内にどの程度の細胞間隙が存在するかを評価することができる。また、標識が添加後２３時間にわたってプレート側に移行し続けることから、当該方法により透過性の変化を比較的長時間モニターできることが分かる。
実施例３　細胞密度による影響の検討
　第１の容器として孔径３μｍ、細孔密度２．０±０．２×１０５個／ｃｍ２の６ウェルカルチャーインサート（BD）を用い、播種する細胞密度を４．４×１０６個／ウェル（Normal）、２．２×１０６個／ウェル（1/2 density）、８．８×１０５個／ウェル（1/5 density）または４．４×１０５個／ウェル（1/10 density）とし、標識添加後のインキュベーション時間を３時間とした以外は、実施例１と同様の実験を行った。インサートのみでの測定をControlとした。結果は、Controlを１００とした相対蛍光単位（ＲＦＵ）で示した。図１に示す結果から、ＦＩＴＣ標識デキストランの移行量が、細胞密度が低くなるほど多くなることが分かる。したがって、本方法により、シート状細胞培養物の細胞密度をも評価することができる。
実施例４　細胞のバイアビリティによる影響の検討
　第１の容器として孔径３μｍ、細孔密度２．０±０．２×１０５個／ｃｍ２の６ウェルカルチャーインサート（BD）を用い、播種密度を２．２×１０６個／ウェルとした以外は、実施例１と同様に骨格筋芽細胞を播種し、シート化培養を行い、シート状細胞培養物を形成させた後、細胞のバイアビリティが低下する条件（室温保存：ＨＢＳＳ（＋）、２７℃にて２４時間保管）または低下しない条件（冷蔵保存：ＨＢＳＳ（＋）、約４℃（２～８℃）にて２４時間保管）に供した。次いで、実施例１と同様にＦＩＴＣ標識デキストランを添加し、２時間インキュベートした後、プレート側への移行量を測定した。インサートのみでの測定をControlとした。結果は、Controlを１００とした相対蛍光単位（ＲＦＵ）で示した。図２に示す結果から、ＦＩＴＣ標識デキストランのプレート側への移行量が、細胞のバイアビリティが低くなるほど多くなることが分かる。したがって、本方法により、シート状細胞培養物を構成する細胞のバイアビリティをも評価することができる。
　別な実験で、室温保存または冷蔵保存で細胞のバイアビリティがどのように変化するのかを確認した。実施例１と同様の細胞密度と培地の組み合わせで骨格筋芽細胞を３．５ｃｍ温度応答性培養皿（UpCell(R)、３．５ｃｍディッシュ、CellSeed）に播種し、シート化培養を行い、シート状細胞培養物を形成させた後、培地をＨＢＳＳ（＋）に置換し、２７℃または２℃にて２４時間または４８時間保管した。保管期間終了後、細胞を酵素的に乖離させ、トリパンブルー染色後にセルカウントでバイアビリティを測定した。コントロールとして、保管を行わないシート状細胞培養物（未保管群）のバイアビリティも測定した。実験は、異なる４つのロットの細胞について行った。結果を表３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
 　各数値は、未保管群のバイアビリティ（％）に対する変化量±標準誤差（％ポイント）を表している。保管温度によるバイアビリティの差は時間の経過とともに拡大するが、保管後２４時間の時点では比較的小さい。にもかかわらず、本発明の品質評価方法では、保管後２４時間の時点で、室温保存と冷蔵保存との間で移行量に大きな差が生じていることから、本発明の方法により、バイアビリティの違いをより高感度に評価できることが分かる。
実施例５　シート化完了の判定
　標識の第２の容器への移行量が、シート化の進行に伴いどのように変化するのかを検証するために以下の実験を行った。第１の容器として孔径３μｍ、細孔密度２．０±０．２×１０５個／ｃｍ２の６ウェルカルチャーインサート（BD）を用い、実施例１と同様に骨格筋芽細胞を４．４×１０６個／ウェルの密度で播種した。４個のウェルに同時に細胞を播種してシート化培養を行い、播種の３時間後、６時間後、２１時間後および２８時間後に、それぞれ異なるウェルに、実施例１と同様に標識を添加し、２５℃で２時間インキュベートした後、プレート側のウェルに含まれるＦＩＴＣの吸光度をプレートリーダーで読み取った（４８５ｎｍ／５３８ｎｍ）。結果は、インサートのみの測定を１００とした相対蛍光単位（ＲＦＵ）で示した。図３に示す結果から、ＲＦＵ（すなわち、ＦＩＴＣ標識デキストランのプレート側への移行量）が、シート化培養の時間経過とともに急速に低下し、その後一定のレベルで維持されることが分かる。したがって、ＲＦＵの急速な低下が止まり、ほぼ一定のレベルで維持されるようになったときに、シート化が完了したと判定することができる。したがって、本発明の方法により、従来は判定が困難であった、シート状細胞培養物のシート化の完了を判定することが可能となる。
実施例６　シート形成の異常の検出
　本発明の方法によりシート形成の異常が検出できるかを検討するために、以下の実験を行った。第１の容器として孔径３μｍ、細孔密度２．０±０．２×１０５個／ｃｍ２の６ウェルカルチャーインサート（BD）を用い、シート化培養時間を２１～２７時間とし、標識添加後のインキュベーション時間を２時間とした以外は、実施例１と同様にして、第２の容器への標識の移行量を測定した。また、標識移行実験と同時に、同じロットの細胞を、同じ密度で温度応答性培養容器（UpCell(R)、３．５ｃｍディッシュ、CellSeed）に播種し、シート化培養を行い、その過程でシートの剥離が生じるかを観察した。細胞は、異なる５つのロットについて行った。図４に示す結果から、温度応答性培養容器でのシート化培養の過程で剥離が生じたロットと同ロットの細胞でカルチャーインサート上に作製したシート状細胞培養物における標識の移行量（Detached）が、剥離が生じなかったロットのもの（Normal）より顕著に多いことが分かる。シート化培養におけるシートの剥離は、シートを構成する細胞の活力や、シート形成能が不十分であることによるものと考えられることから、本発明の方法により、細胞のシート形成能を評価し、シート状細胞培養物製造への使用に適しているか否かを、実際にシート状細胞培養物を製造する前に判断することが可能となる。
実施例７　積層シート状細胞培養物の積層枚数の検出
　本発明の方法により積層シート状細胞培養物の積層枚数が検出できるかを検討するために、以下の実験を行った。
　第１の容器として孔径３μｍ、細孔密度２．０±０．２×１０５個／ｃｍ２の半透明のＰＥＴ製２４ウェルカルチャーインサート（BD）を、第２の容器として無色透明のポリスチレン製２４ウェルプレート（BD）を用いた。
　温度応答性培養容器（UpCell(R)、48穴マルチウェル、CellSeed）に、ヒト筋組織から定法により調製した骨格筋芽細胞を１．３×１０６個／ウェルの密度で播種し、２０％ヒト血清を含むＤＭＥＭ－Ｆ１２培地（Life Technologies）中、３７℃、５％ＣＯ２にてシート化培養を行った。形成されたシート状細胞培養物を、室温への温度処理で剥離し、ＨＢＳＳ＋で洗浄後、第１の容器に移した。上記と同じ培地中、３７℃、５％ＣＯ２で１時間培養して、シート状細胞培養物を容器に接着させ、さらに一晩培養した。積層シート状細胞培養物は、容器に接着させたシート状細胞培養物上に、形成されたシート状細胞培養物を載せ、一晩培養して作製した。培養後、インサート内の培地を、１００μｇ／ｍｌのＦＩＴＣ標識デキストラン（SIGMA、平均分子量３０００～５０００）を含むＨＢＳＳ（＋）溶液に、プレートウェル内の培地を、１００μｇ／ｍｌの非標識デキストラン（SIGMA、分子量～６０００）を含むＨＢＳＳ（＋）溶液にそれぞれ置換することにより標識を添加し、室温で２時間インキュベートした。次いで、インサートを取り出し、プレート側のウェルに含まれるＦＩＴＣの吸光度をプレートリーダーで読み取った（４８５ｎｍ／５３８ｎｍ）。結果を表４に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
 　表中、ＲＦＵは、シート状細胞培養物を含まないインサートを用いたコントロール実験における測定値を１００とした相対蛍光単位を表す。上記結果から、既に形成されたシート状細胞培養物についても、本発明の方法で品質評価が可能であることが分かる。また、シート状細胞培養物を２枚重ねた積層シート状細胞培養物の方が、シート状細胞培養物１枚のみの場合よりＲＦＵが小さいことから、ＲＦＵがシート状細胞培養物の積層枚数に依存して小さくなること、そして、本発明の方法により積層シート状細胞培養物の積層枚数を判定できることが分かる。
実施例８　細胞純度の検出
　本発明の方法により、シート状細胞培養物を構成する細胞の純度が検出できるかを検討するために、以下の実験を行った。
　第１の容器として孔径３μｍ、細孔密度２．０±０．２×１０５個／ｃｍ２の半透明のＰＥＴ製２４ウェルカルチャーインサート（BD）を、第２の容器として無色透明のポリスチレン製２４ウェルプレート（BD）を用いた。
　ヒト筋組織から定法により調製した骨格筋芽細胞と、線維芽細胞（TIG-2M-30、ヒューマンサイエンス振興財団）とを混合し、骨格筋芽細胞のマーカーであるＣＤ５６陽性の細胞の比率が６９％、３２％または０％の検体を調製した。なお、ＣＤ５６陽性細胞の比率は、ＰＥ標識抗ＣＤ５６抗体（BD、555516）を用いたフローサイトメトリー法で測定した（BD、FACS Calibur）。それぞれの検体を７．９３×１０４個/ウェルの密度で第１の容器に播種し、２０％ヒト血清を含むＤＭＥＭ－Ｆ１２培地（Life Technologies）中、３７℃、５％ＣＯ２にて６時間シート化培養を行った。培養後、実施例７と同様にしてプレート側のウェルに含まれるＦＩＴＣの吸光度を測定した。結果を図９に示す。なお、図中のＲＦＵは、シート状細胞培養物を含まないインサートを用いたコントロール実験における測定値を１００とした相対蛍光単位を表す。前記結果から、骨格筋芽細胞の比率が高くなるにつれて、ＲＦＵが大きくなること、すなわち、骨格筋芽細胞の比率が高くなるほど、標識の移行量が増大し、線維芽細胞の比率が高くなるほど標識の移行量が減少すること、そして、シート状細胞培養物の標識透過性は、構成細胞の種類や構成比によって変化することが分かる。
　本明細書に記載された本発明の種々の特徴は様々に組み合わせることができ、そのような組合せにより得られる態様は、本明細書に具体的に記載されていない組合せも含め、すべて本発明の範囲内である。また、当業者は、本発明の精神から逸脱しない多数の様々な改変が可能であることを理解しており、かかる改変を含む均等物も本発明の範囲に含まれる。したがって、本明細書に記載された態様は例示にすぎず、これらが本発明の範囲を制限する意図をもって記載されたものではないことを理解すべきである。

Claims (9)

  1. 　（１）標識は通過するが、細胞は通過しない半透過性部分を有する第１の容器に細胞を播種し、該半透過性部分を被覆するようにシート化するステップ、
    （２）第１の容器、または、前記半透過性部分を介して第１の容器と液体連通し得る液体不透過性の第２の容器に、標識を添加するステップ、
    （３）第１の容器と第２の容器とが前記半透過性部分を介して液体連通した状態で、標識を、第１の容器および第２の容器のうち、標識が添加されていない容器に、半透過性部分を介して移行させるステップ、
    （４）前記標識が添加されていない容器に移行した標識を検出するステップ
    を含み、標識が細胞間接着により細胞間の通過が阻害されるものであり、ステップ（２）は、ステップ（１）と同時、ステップ（１）より前またはステップ（１）より後に行ってもよい、シート状細胞培養物の品質評価、シート化完了判定、細胞のシート形成能の評価、または、シート状細胞培養物の製造過程におけるシート剥離の検出のための方法。
  2. 　（１）標識は通過するが、細胞は通過しない半透過性部分を有する第１の容器に細胞を播種し、該半透過性部分を被覆するようにシート化培養するステップ、
    （２）第１の容器、または、前記半透過性部分を介して第１の容器と液体連通し得る液体不透過性の第２の容器に、標識を添加するステップ、
    （３）第１の容器と第２の容器とが前記半透過性部分を介して液体連通した状態で、標識を、第１の容器および第２の容器のうち、標識が添加されていない容器に、半透過性部分を介して移行させるステップ、
    （４）前記標識が添加されていない容器に移行した標識を検出するステップ、
    （５）標識の量もしくは増加量が複数の連続する測定においてほぼ一定になったとき、または、標識の量の経時的な変化率の絶対値が基準値以下となったときに、シート化培養を終了し、シート状細胞培養物を第１の容器から回収するステップ
    を含み、標識が細胞間接着により細胞間の通過が阻害されるものであり、ステップ（２）は、ステップ（１）と同時、ステップ（１）より前またはステップ（１）より後に行ってもよい、移植用シート状細胞培養物の製造方法。
  3. 　標識が、１００～１５０００００の分子量を有する、請求項１または２に記載の方法。
  4. 　標識が、蛍光標識、酵素標識、発光標識、放射性標識、磁気標識および比色標識からなる群から選択される、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
  5. 　半透過性部分が、孔径約０．０１μｍ～約５０．０μｍの細孔を有する、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
  6. 　シート状細胞培養物の品質が、シート状細胞培養物の強度、シート化の程度、細胞密度、細胞のバイアビリティ、細胞同士の接着状態および細胞の活力からなる群から選択される、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
  7. 　細胞が、筋芽細胞および間葉系幹細胞からなる群から選択される、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
  8. 　（１）細胞間接着により細胞間の通過が阻害される標識、
    （２）前記標識は通過するが、細胞は通過しない半透過性部分を有する第１の容器、および
    （３）前記半透過性部分を収容可能な液体不透過性の第２の容器
    を含む、シート状細胞培養物の製造、シート状細胞培養物の品質評価、シート化完了の判定、細胞のシート形成能の評価、および／または、シート状細胞培養物の製造過程における剥離の検出のためのキット。
  9. 　（１）細胞間接着により細胞間の通過が阻害される標識、
    （２）前記標識は通過するが、細胞は通過しない半透過性部分を有する第１の容器、
    （３）前記半透過性部分を収容可能な液体不透過性の第２の容器、および
    （４）標識を検出する検出器
    を備えた、シート状細胞培養物の製造、シート状細胞培養物の品質評価、シート状細胞培養物のシート化完了の判定、細胞のシート形成能の評価、および／または、シート状細胞培養物の製造過程における剥離の検出のためのシステム。
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