JP5867926B2 - 細胞シート作製方法 - Google Patents

Description

本発明は、平面基材を用いた細胞シート作製方法、特に網膜色素上皮シートの作製方法に関する。本発明はまた、平面基材を用いたブルッフ膜の作製方法に関する。

加齢黄斑変性（ａｇｅ‐ｒｅｌａｔｅｄ ｍａｃｕｌａｒ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ： ＡＭＤ）は、現在、先進国における法的失明の主要原因疾患の一つであり、主に５０歳以上の高齢者に見られる。加齢黄斑変性は黄斑の加齢に伴う変化によっておこる疾患であり、滲出型と萎縮型に大別される。滲出型加齢黄斑変性は高齢者の黄斑に脈絡膜から新生血管が発生し、網膜色素上皮下又は網膜下に出血や滲出性病変を生じ、ついには瘢痕組織を形成する疾患である。萎縮型加齢黄斑変性は黄斑部の萎縮やドルーゼンの蓄積を伴う疾患である。また、滲出型及び萎縮型加齢黄斑変性に到る前駆病変を、特に早期加齢黄斑変性と呼ぶことがあり、本病変も加齢黄斑変性の一病態と考えられている。

加齢黄斑変性の治療は、軽度の滲出型の場合には、光線力学的療法、レーザー光凝固術、新生血管抜去術などの外科的療法、または血管新生に関わる血管内皮増殖因子（ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ：ＶＥＧＦ）に対する阻害剤の投与などの薬物療法による新生血管の退縮・除去を目的とした治療方法を選択することができる。しかし、網膜色素上皮（ｒｅｔｉｎａｌ ｐｉｇｍｅｎｔ ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ：ＲＰＥ）の高度の萎縮や欠損に至るまで進行した滲出型や萎縮型の場合、前記手段で有効性を得ることができない。かかる場合は、網膜色素上皮細胞または網膜色素上皮を網膜下の欠損部位に移植することが有効な治療方法となる（特許文献１、２）。

移植に細胞を用いる場合、網膜色素上皮細胞としては、例えば、ドナーとなる胎児の眼球から分離・培養した網膜色素上皮細胞、患者自身の眼球から分離・培養した虹彩色素上皮細胞、手術中に擦過採取した網膜色素上皮細胞などが挙げられる。しかし、ドナーとして他人の細胞を用いた場合、患者側への拒絶反応が懸念され、また患者自身の細胞であっても、異なる細胞種を移植に用いることは治療上好適ではない。さらに、分離・培養した細胞の移植は生着率に課題があり、上皮として十分な機能を発揮できない。そこで、移植用網膜色素上皮として網膜色素上皮−ブルッフ膜−脈絡膜からなる組織あるいは人工シート上に培養した網膜色素上皮シートも提案されている（特許文献１、３）が、切除された脈絡膜や人工シートが上皮の生着および生体における機能維持障害となることが懸念される。また近年、ｉＰＳ細胞を用いた網膜色素上皮細胞（非特許文献１）または人工シートの移植についても検討されており、抗原性の問題の解決が図られているが、細胞の生着やシートの生体における機能維持に対する障害の問題は依然として残されており、加齢黄斑変性に対する治療上有効かつ調製が簡便な網膜色素上皮の作成が課題となっている。

特表平９−５０１３０３号公報 特開２００８−１７３３３３号公報 特表２００７−５０９６４３号公報

Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｌｅｔｔｅｒｓ， ４５８， ２００９， １２６−１３１

本発明の課題は、人工シートを用いることなく、簡便に哺乳類由来の細胞シートを作成する新たな方法を開発し、以って組織移植の必要な対象に提供することである。特に、網膜色素上皮の欠損を伴う加齢黄斑変性において生着率の高い、機能性に優れた移植用上皮を提供することである。

通常、網膜色素上皮細胞を含む上皮細胞を疎な密度で平面ディッシュ上で培養した場合、細胞の基底部はディッシュとの接触面側に形成される。本発明者らは、ヒト眼球から分離・培養した網膜色素上皮細胞を平面基材上ではなく３次元的に凝集させて培養、即ち、球状（ｓｐｈｅｒｏｉｄ）培養した場合、球状になった細胞塊の内部に存在する細胞はアポトーシスによって死滅し、血清と接触する細胞塊表面にブルッフ膜が形成されることを発見した（データ未公開）。また、細胞表面は網膜色素上皮として分化していることが分かった。このことから、発明者らは、通常の平面培養であっても、細胞外基質より優先的に細胞間接着が生じる環境下では、細胞の脱分化を誘発せず、上皮に分化すること、ならびに血清接触面にブルッフ膜を形成させることの可能性を検討し、網膜色素上皮細胞を高密度な状態で平面培養することで、通常と逆側、即ち血清との接触面側にブルッフ膜が生じることを見出した。また、かかる培養では、網膜色素上皮細胞は脱分化せず、上皮として分化することを見出した。本発明者らは、鋭意検討の結果、これらの発見から本発明を完成させるに至った。すなわち、本発明は、
［１］以下の工程を含む、細胞シートの作製方法；
（１）哺乳動物由来細胞を調製する工程；
（２）調製した細胞を平面基材上に高密度に播種し、培養する工程
［２］工程（１）において、哺乳動物由来細胞が、上皮細胞又は内皮細胞である、上記［１］の方法；
［３］工程（１）において、哺乳動物由来細胞が、角膜内皮細胞、気管上皮細胞、消化管上皮細胞、子宮頚部上皮細胞、角膜上皮細胞、及び網膜色素上皮細胞からなる群から選択される、上記［１］の方法；
［４］得られる細胞シートが、細胞間にタイトジャンクションが形成され、且つ平面基材の接触する側と反対側に基底膜が形成されている、上記［１］の方法；
［５］工程（１）において、哺乳動物由来細胞が、網膜色素上皮細胞である、上記［１］の方法；
［６］工程（２）において、高密度が、正常な眼球において観察される細胞密度以上の密度である、上記［５］の方法；
［７］正常な眼球において観察される細胞密度以上の密度が、少なくとも４，０００細胞数／ｍｍ^２である、上記［６］の方法；
［８］以下の工程（３）をさらに含む、上記［５］〜［７］のいずれか１つの方法；
（３）工程（２）で得られた培養細胞における分化マーカーの発現の有無を確認する工程
［９］工程（３）において、分化マーカーが、ベストロフィン−１、ＲＰＥ−６５、サイトケラチン、オクルディン、ＺＯ−１、エラスチン、アクチン、１型コラーゲンおよび４型コラーゲンからなる群より選択される少なくとも１種である、上記［８］の方法；
［１０］以下の工程（４）をさらに含む、上記［５］〜［９］のいずれか１つの方法；
（４）細胞の平面基材の接触する側と反対側にブルッフ膜の形成を確認する工程
［１１］上記［１０］の方法で形成されたブルッフ膜を分離する工程を含む、ブルッフ膜の作製方法；
［１２］上記［１］〜［１０］のいずれか１つの方法で作製された細胞シート；
［１３］上記［１］〜［１０］のいずれか１つの方法で作製された細胞シートを含む疾患治療用移植材料；
［１４］上記［１１］の方法で作製されたブルッフ膜；
を提供する。

本発明により、通常の培養方法で得られる細胞シートと層構造が逆さとなった、基底膜が表出した構成を有する細胞シートを、簡易に調製することができる。本発明の細胞シートは、シートを裏返すことなく基底膜を移植対象組織に接触させることができるため、移植操作を簡略化でき、しかも生着率に優れるため、移殖用途として極めて有用である。例えば、平面培養によって容易に網膜色素上皮細胞シートを作成することができ、加齢黄斑変性患者に移植適用することができる。特に、培養に用いる細胞をｉＰＳ細胞由来の網膜色素上皮細胞とした場合、患者自身の細胞を利用することで、移植の際の拒絶反応を回避することができる。

４ウェルチャンバースライド（Ｌａｂ−Ｔｅｋ）にヒト網膜色素上皮細胞を５，０００細胞／ｍｍ^２で播種した場合に観察されたシートの写真像を示す。矢印は収縮した細胞シートを示す。 ４ウェルチャンバースライド（Ｌａｂ−Ｔｅｋ）にヒト網膜色素上皮細胞を２０，０００細胞／ｍｍ^２で播種した場合に観察されたシートの写真像を示す。細胞シートに収縮は観察されなかった。 ヒト網膜色素上皮細胞を２０，０００細胞／ｍｍ^２で播種した場合の細胞写真像および染色像を示す。（Ａ）播種後０日における細胞写真像、（Ｂ）播種後１日における硬性ドルーゼン写真像、（Ｃ）播種後１日における細胞写真像、（Ｄ）播種後１日におけるブルッフ膜写真像、（Ｅ）播種後１日における細胞核染色像、（Ｆ）播種後１日におけるブルッフ膜中アクチン染色像 ヒト網膜色素上皮細胞の平面培養２週間における、網状の弾性線維を形成したエラスチンの染色像。 ヒト網膜色素上皮シートから抽出したタンパク質に関して、ＲＰＥ−６５、オクルディン、サイトケラチン−１８、ＺＯ−１、４型コラーゲン、エラスチンの各マーカータンパク質の発現を確認したウエスタンブロッティングの図を示す。 ヒト網膜色素上皮シートの走査型電子顕微鏡像を示す。矢印はコラーゲン線維や弾性線維である。図右下は、露出した基底陥入（基底部の微絨毛）図である。

以下に、本発明を詳細に説明する。
本発明は以下の工程を含む、細胞シートの作製方法を提供する。
（１）哺乳動物由来細胞を調製する工程；
（２）調製した細胞を平面基材上に高密度に播種し、培養する工程

工程（１）において、調製される哺乳動物由来細胞としては、哺乳動物（例：ヒト、サル、マウス、ラット、イヌ、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ネコ、ウサギ、ハムスター、モルモット等）由来の細胞であれば、いずれの哺乳動物由来の細胞であってもよいが、好ましくはヒト由来の細胞である。

また、調製する細胞の細胞種としては、上皮系および内皮系いずれかの接着性を有する細胞が好適に使用される。そのような細胞としては、例えば、肝臓の実質細胞である肝細胞、クッパー細胞、血管内皮細胞や角膜内皮細胞などの内皮細胞、線維芽細胞、骨芽細胞、砕骨細胞、歯根膜由来細胞、表皮基底細胞などの表皮細胞、気管上皮細胞、消化管上皮細胞、子宮頸部上皮細胞、結膜上皮細胞、角膜上皮細胞、虹彩色素上皮細胞、網膜色素上皮細胞などの上皮細胞、乳腺細胞、ペリサイト、平滑筋細胞や心筋細胞などの筋細胞、腎細胞、膵ランゲルハンス島細胞、末梢神経細胞や視神経細胞などの神経細胞、軟骨細胞、骨細胞などが挙げられるが、好ましくは角膜内皮細胞、気管上皮細胞、消化管上皮細胞、子宮頚部上皮細胞、角膜上皮細胞、網膜色素上皮細胞が挙げられ、さらに好ましくは角膜上皮細胞、角膜内皮細胞、網膜色素上皮細胞、最も好ましくは網膜色素上皮細胞が挙げられる。

調製する細胞は、組織や器官から直接採取した初代細胞でもよく、あるいは、それらを何代か継代させたものでもよい。さらにこれら細胞は、未分化細胞である胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、多分化能を有する間葉系幹細胞などの多能性幹細胞、または単分化能を有する血管内皮前駆細胞などの単能性幹細胞を含む幹細胞を分化誘導することによって得られる細胞であっても良い。ＥＳ細胞は体細胞から核初期化されて生じたＥＳ細胞であってもよい。また、近年報告された人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）を分化誘導することにより、目的の細胞を調製してもよい。ｉＰＳ細胞は、ある特定の核初期化物質（核酸、タンパク質、低分子化合物等）を、体細胞に導入することにより作製することができる、ＥＳ細胞と同等の特性を有する体細胞由来の人工の幹細胞である［Ｔａｋａｈａｓｈｉ， Ｋ． ａｎｄ Ｙａｍａｎａｋａ， Ｓ．， Ｃｅｌｌ， １２６： ６６３−６７６ （２００６）；Ｔａｋａｈａｓｈｉ， Ｋ． ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ， １３１： ８６１−８７２ （２００７）］。前記幹細胞を目的の分化細胞に分化させる条件・培地は従来公知の条件・培地に従ってもよいし、当業者が適宜設定してもよい。本発明によって作成される細胞シートを移植用とする場合、移植する対象の体細胞をｉＰＳ細胞のソースとして用いることによって、得られる細胞シートは対象に対して抗原性を持たない細胞シートとなる点でｉＰＳ細胞の使用は好ましい。

本発明の調製する哺乳動物由来細胞が、網膜色素上皮細胞である場合には、哺乳動物は前記と同様であるが、好ましくはヒトである。また、該網膜色素上皮細胞は、幹細胞由来の分化細胞または眼球由来の細胞である。眼球由来の網膜色素上皮細胞は死体眼球摘出後、速やかに赤道部で眼球を分割し、硝子体と網膜を除去した後、セルスクレーパーによる擦過またはトリプシンやＥＤＴＡ溶液にて細胞をブルッフ膜より遊離させて回収した後、培養液の中で静置することにより培養皿への接着、増殖を誘導することにより必要量の細胞を増殖させ、トリプシン処理などで適宜継代し細胞数を確保する。幹細胞を分化誘導させる場合は、ヒトＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞を、Ｄｋｋ−１（Ｗｎｔアンタゴニスト）およびＬｅｆｔｙ Ａ（Ｎｏｄａｌアンタゴニスト）を添加したＥＳ細胞分化培地で培養を行う。一定期間培養することで網膜前駆細胞マーカーであるＲｘ、Ｐａｘ６、Ｍｉｔｆが発現し、光学顕微鏡観察による形態観察から多角性形態を確認することで、ヒト網膜色素上皮細胞を得ることができる。

工程（２）において、前記調製した細胞を平面基材上に高密度に播種し、培養することによって細胞シートを作成することができる。本明細書における平面基材としては、細胞培養用であれば特に限定されないが、例えば、フラスコ、組織培養用フラスコ、ディッシュ、ペトリディッシュ、組織培養用ディッシュ、マルチディッシュ、マイクロプレート、マイクロウエルプレート、マルチプレート、マルチウエルプレート、チャンバースライド、シャーレ、チューブ、トレイ、培養バック、ローラーボトルが挙げられる。本明細書における平面基材の材質としては、例えば、金属、ガラス、セラミック、シリコン等の無機材料、エラストマー、プラスチック（例えば、ポリエステル樹脂、ポリエチレン樹脂、ポリプロピレン樹脂、ＡＢＳ樹脂、ナイロン、アクリル樹脂、フッ素樹脂、ポリカーボネート樹脂、ポリウレタン樹脂、メチルペンテン樹脂、フェノール樹脂、メラミン樹脂、エポキシ樹脂、塩化ビニル樹脂）で代表される有機材料を挙げることができるが、それらに限定されない。また、平面基材は、接着性細胞との接着性を向上させる目的で、表面処理が施されていてもよいが、本発明の細胞シートを平面基材から剥がす工程を容易にするために、なんら処理されていなくてもよい。処理されている場合は、例えば、コラーゲン、ゼラチン、マトリゲル、ポリ−Ｌ−リジン、ポリ−Ｄ−リジン、ラミニン、フィブロネクチンなどによって表面処理されていてもよい。

本明細書における「高密度」とは、調製した細胞が由来する正常組織において観察される細胞密度以上の密度をいう。またその上限は、当業者であれば適宜決定することができるが、例えば、細胞同士が密着し合える密度でかつ過剰な播種によるシート形成不備、細胞死滅しない程度の細胞密度である。より具体的には、「高密度」とは、正常組織において観察される細胞密度に対して、例えば１〜１００倍、好ましくは１．２〜５０倍、より好ましくは２．５〜３０倍程度であり、特に好ましくは５〜１０倍程度の細胞密度をいう。正常組織において観察される細胞密度としては、組織の種類によって異なるが、例えば、角膜内皮では、３，０００細胞数／ｍｍ^２、網膜色素上皮細胞では、４，０００細胞数／ｍｍ^２程度である。

本発明の調製する哺乳動物由来細胞が、網膜色素上皮細胞である場合には、「高密度」とは、「正常な眼球において観察される細胞密度以上の密度」をいう。そのような密度としては、具体的には、少なくとも４，０００細胞数／ｍｍ^２以上である。しかし、下記実施例においても示されるように、正常眼球において観察される細胞密度以上の密度であっても、一定密度以下で平面基材上に播種した場合、形成された細胞シート自身に収縮力が働き、播種時の面積を維持することが出来ない。これは、網膜色素上皮の血清接触面を被覆するために一定数の細胞が動員されていること、細胞密度にムラが存在すること、および細胞自身の生存率から、播種時の面積を維持できないためと推察される。但し、この収縮したシートであっても、特段の不都合なく後述する用途に利用することが可能である。従って、「正常な眼球において観察される細胞密度以上の密度」とは、形成された細胞シートが播種時の面積から収縮することを許容する場合、好ましくは、５，０００細胞数／ｍｍ^２程度以上、より好ましくは、１０，０００細胞数／ｍｍ^２程度以上であり、形成された細胞シートに播種時の面積を維持させる場合、好ましくは、２０，０００細胞数／ｍｍ^２程度以上である。また、その上限としては、過剰に細胞播種することによるシート形成不全、一部細胞の死滅を誘発しない密度である。そのような上限も考慮した場合、「正常な眼球において観察される細胞密度以上の密度」とは、好ましくは、５，０００細胞数／ｍｍ^２〜２００，０００細胞数／ｍｍ^２、より好ましくは、１０，０００細胞数／ｍｍ^２〜１２０，０００細胞数／ｍｍ^２、特に好ましくは、２０，０００細胞数／ｍｍ^２〜４０，０００細胞数／ｍｍ^２である。

前記高密度で播種した細胞を培養液中で培養することにより、単層状の細胞集団を形成することができる。培養液としては、当技術分野で通常用いられる細胞培養用培地であれば特に制限なく用いることができる。例えば、用いる細胞の種類に応じて、Ｆ−１０培地、Ｆ１２培地、ＭＥＭ、ＢＭＥ培地、ＤＭＥＭ、αＭＥＭ、ＩＭＤ培地、ＥＳ培地、ＤＭ−１６０培地、Ｆｉｓｈｅｒ培地、ＷＥ培地およびＲＰＭＩ１６４０培地等、朝倉書店発行「日本組織培養学会編 組織培養の技術第三版」５８１頁に記載されているような基礎培地を用いることができる。さらに、基礎培地に血清（ウシ胎児血清等）、各種増殖因子、抗生物質、アミノ酸などを加えてもよい。培地のｐＨは、好ましくは約６〜約８である。培養は、通常約３０〜約４０℃で、約１５〜約６０時間行なわれる。必要に応じて通気や撹拌を行ってもよい。

本発明の方法で得られる細胞シートは、細胞間にタイトジャンクションが形成され、且つ平面基材の接触する側と反対側に基底膜が形成される。平面基材の接触する側と反対側とは、細胞と血清との接触面側である。タイトジャンクション形成は、６角形状の密着しあう細胞形態と、免疫染色により細胞間のオクルディンやＺＯ−１等の発現を観察することで確認できる。基底膜を含むブルッフ膜の形成は、免疫染色によりエラスチン、１型コラーゲンまたは４型コラーゲン等の細胞表面での発現を観察することや、走査型電子顕微鏡による観察により確認することができる。

本発明の調製する哺乳動物由来細胞が、網膜色素上皮細胞である場合には、以下の工程（３）をさらに含んでもよい。
（３）工程（２）で得られた培養細胞における分化マーカーの発現の有無を確認する工程

工程（３）において、工程（２）で得られた培養細胞における分化マーカーの発現の有無を確認することによって、細胞シートが完成したことを判定することができる。本明細書において、分化マーカーは細胞の任意の箇所（例えば、細胞質、細胞膜、核膜など）で発現していてもよいが、好ましくは、播種した細胞と血清との接触面側で発現しているマーカーを対象とする。

本明細書における「分化マーカー」としては、分化した細胞において特異的に発現しているか、他の分化細胞または未分化細胞、前駆細胞と比較して発現が増幅あるいは減衰している遺伝子の転写産物、翻訳産物またはその分解産物が含まれる。そのような遺伝子としては、例えば、神経細胞分化マーカーとしては、チューブリン（特にβチューブリン）、ＭＡＰ２、ニューロフィラメント、ニューロン特異的エノラーゼ、脂肪細胞分化マーカーとしては、ａＰ２、グリセロリン酸脱水素酵素、アディプシン、レプチン、骨芽細胞分化マーカーとしては、プロコラーゲン１α１、ＲＵＮＸ２、アルカリホスファターゼ、オステオポンチン、オステオカルシン、網膜色素上皮細胞分化マーカーとしては、ベストロフィン−１（ＶＭＤ２）、ＲＰＥ−６５、サイトケラチン、オクルディン、ＺＯ−１、エラスチン、アクチン、１型コラーゲンまたは４型コラーゲンなどが挙げられる。

「分化マーカーの発現の有無の確認」に用いられる試料としては、工程（２）で培養された細胞由来の分化マーカー（例、ＲＮＡ、蛋白質、その分解産物など）を含有するものであれば特に制限されない。

上記試料がＲＮＡの場合における分化マーカー遺伝子の発現は、工程（２）で培養された細胞からＲＮＡ（例：全ＲＮＡ、ｍＲＮＡ）画分を調製し、該画分中に含まれる該マーカー遺伝子の転写産物を検出するか、あるいは該細胞からＲＮＡを抽出せずに直接細胞中のマーカー遺伝子産物を検出することにより調べることができる。

細胞からＲＮＡ（例：全ＲＮＡ、ｍＲＮＡ）画分を調製する場合、ＲＮＡ画分の調製は、グアニジン−ＣｓＣｌ超遠心法、ＡＧＰＣ法など公知の手法を用いて行うことができるが、市販のＲＮＡ抽出用キット（例：ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ； ＱＩＡＧＥＮ製等）を用いて、微量試料から迅速且つ簡便に高純度の全ＲＮＡを調製することができる。ＲＮＡ画分中の分化マーカー遺伝子の転写産物を検出する手段としては、例えば、ハイブリダイゼーション（ノーザンブロット、ドットブロット、ＤＮＡチップ解析等）を用いる方法、あるいはＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ、競合ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ等）を用いる方法などが挙げられる。微量試料から迅速且つ簡便に定量性よく分化マーカー遺伝子の発現変動を検出できる点で競合ＰＣＲやリアルタイムＰＣＲなどの定量的ＰＣＲ法が、また、複数のマーカー遺伝子の発現変動を一括検出することができ、検出方法の選択によって定量性も向上させ得るなどの点でＤＮＡチップ解析が好ましい。

ノーザンブロットまたはドットブロットハイブリダイゼーションによる場合、分化マーカー遺伝子の検出は、該遺伝子の転写産物とハイブリダイズし得る核酸（プローブ）を用いて行うことができる。そのような核酸としては、分化マーカー遺伝子の転写産物とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る核酸が挙げられる。「ハイストリンジェントな条件」とは、例えば、６×ＳＳＣ（ｓｏｄｉｕｍ ｃｈｌｏｒｉｄｅ／ｓｏｄｉｕｍ ｃｉｔｒａｔｅ）中４５℃でのハイブリダイゼーション反応の後、０．２×ＳＳＣ／０．１％ ＳＤＳ中６５℃での一回以上の洗浄などが挙げられる。当業者は、ハイブリダイゼーション溶液の塩濃度、ハイブリダゼーション反応の温度、プローブ濃度、プローブの長さ、ミスマッチの数、ハイブリダイゼーション反応の時間、洗浄液の塩濃度、洗浄の温度等を適宜変更することにより、所望のストリンジェンシーに容易に調節することができる。該核酸はＤＮＡであってもＲＮＡであってもよく、あるいはＤＮＡ／ＲＮＡキメラであってもよい。好ましくはＤＮＡが挙げられる。

プローブとして用いられる核酸は、二本鎖であっても一本鎖であってもよい。二本鎖の場合は、二本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＲＮＡまたはＤＮＡ：ＲＮＡのハイブリッドでもよい。一本鎖の場合は、アンチセンス鎖を用いることができる。該核酸の長さは標的核酸と特異的にハイブリダイズし得る限り特に制限はなく、例えば約１５塩基以上、好ましくは約３０塩基以上である。該核酸は、標的核酸の検出・定量を可能とするために、標識剤により標識されていることが好ましい。標識剤としては、例えば、放射性同位元素、酵素、蛍光物質、発光物質などが用いられる。放射性同位元素としては、例えば、〔^３２Ｐ〕、〔^３Ｈ〕、〔^１４Ｃ〕などが用いられる。酵素としては、安定で比活性の大きなものが好ましく、例えば、β−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、アルカリホスファターゼ、パーオキシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素などが用いられる。蛍光物質としては、例えば、フルオレスカミン、フルオレッセンイソチオシアネートなどが用いられる。発光物質としては、例えば、ルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェリン、ルシゲニンなどが用いられる。さらに、プローブと標識剤との結合にビオチン−（ストレプト）アビジンを用いることもできる。

ノーザンハイブリダイゼーションによる場合は、上記のようにして調製したＲＮＡ画分をゲル電気泳動にて分離した後、ニトロセルロース、ナイロン、ポリビニリデンジフロリド等のメンブレンに転写し、上記のようにして調製された標識プローブを含むハイブリダイゼーション緩衝液中、上記「ハイストリンジェントな条件下で」ハイブリダイゼーションさせた後、適当な方法でメンブレンに結合した標識量をバンド毎に測定することにより、各分化マーカー遺伝子の発現量を測定することができる。ドットブロットの場合も、ＲＮＡ画分をスポットしたメンブレンを同様にハイブリダイゼーション反応に付し（各マーカー遺伝子についてそれぞれ行う）、スポットの標識量を測定することにより、各マーカー遺伝子の発現量を測定することができる。

ＤＮＡチップ解析による場合、例えば、上記のようにして調製したＲＮＡ画分から、逆転写反応によりＴ７プロモーター等の適当なプロモーターを導入したｃＤＮＡを合成し、さらにＲＮＡポリメラーゼを用いてｃＲＮＡを合成する（この時ビオチンなどで標識したモノヌクレオチドを基質として用いることにより、標識されたｃＲＮＡが得られる）。この標識ｃＲＮＡを、上記したプローブを固相化したチップと接触させてハイブリダイゼーション反応させ、固相上の各プローブに結合した標識量を測定することにより、各分化マーカー遺伝子の発現量を測定することができる。当該方法は、検出する分化マーカー遺伝子（従って、固相化されるプローブ）の数が多くなるほど、迅速性および簡便性の面で有利である。

一方、細胞からＲＮＡを抽出せずにマーカー遺伝子を検出する場合、その検出手段として、ｉｎ ｓｉｔｕ ハイブリダイゼーションを用いることができる。該方法では、細胞からＲＮＡを抽出する代わりに、細胞を固定剤、好ましくは沈殿固定剤、例えばアセトンで処理するか、又は緩衝ホルムアルデヒド溶液の中に短い時間インキュベーションすることによって細胞を固定する。固定化後、細胞をパラフィンの中に包埋してブロックを形成し、薄片を切り取ることで試料として用いることができる。良好に調製したパラフィン包埋サンプルは室温で何年も保存できる。プローブとして用いられる核酸は、上記したものと同様のものを用いることができる。ｉｎ ｓｉｔｕ ハイブリダイゼーションは、細胞の血清接触面に分化マーカーの発現を直接確認することができる点で、本発明において好適に用いられる。

あるいは、工程（２）における培養した細胞における分化マーカー遺伝子の発現の確認は、該細胞からタンパク質画分を調製し、該画分中に含まれる該マーカー遺伝子の翻訳産物（即ち、マーカータンパク質）を検出するか、あるいは該細胞からタンパク質を抽出することなく直接細胞中のマーカー遺伝子の翻訳産物を検出することにより調べることができる。マーカータンパク質の検出は、各タンパク質に対する抗体を用いて、免疫学的測定法（例：ＥＬＩＳＡ、ＦＩＡ、ＲＩＡ、ウェスタンブロット等）によって行うこともできるし、酵素などの測定可能な生理活性を示すタンパク質においては、該生理活性を、各マーカータンパク質について公知の手法を用いて測定することによっても行い得る。あるいはまた、マーカータンパク質の検出は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ等の質量分析法を用いても行うことができる。
尚、各マーカータンパク質に対する抗体は、該マーカータンパク質または該タンパク質、あるいはその部分ペプチドを感作抗原として、通常使用されるポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体作製技術に従って取得することができる。

個々の免疫学的測定法を本発明の検査方法に適用するにあたっては、特別の条件、操作等の設定は必要とされない。それぞれの方法における通常の条件、操作法に当業者の通常の技術的配慮を加えて分化マーカータンパク質の測定系を構築すればよい。これらの一般的な技術手段の詳細については、総説、成書などを参照することができる。例えば、入江寛編「ラジオイムノアッセイ」（講談社、昭和４９年発行）、入江寛編「続ラジオイムノアッセイ」（講談社、昭和５４年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（医学書院、昭和５３年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第２版）（医学書院、昭和５７年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第３版）（医学書院、昭和６２年発行）、「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ」 Ｖｏｌ． ７０（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ Ａ））、 同書 Ｖｏｌ． ７３（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ Ｂ））、 同書 Ｖｏｌ． ７４（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ Ｃ））、 同書 Ｖｏｌ． ８４（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ Ｄ ： Ｓｅｌｅｃｔｅｄ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ））、 同書 Ｖｏｌ． ９２（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ Ｅ ： Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ））、 同書 Ｖｏｌ． １２１（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ Ｉ ： Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ））（以上、アカデミックプレス社発行）などを参照することができる。

前記の細胞シートの作製方法であって、細胞が網膜色素上皮細胞である場合は、以下の工程（４）をさらに含んでもよい。
（４）細胞の平面基材の接触する側と反対側にブルッフ膜の形成を確認する工程

本明細書における「ブルッフ膜」とは、網膜色素上皮と脈絡膜の間にある薄い膜で、網膜色素上皮を裏打ちする層である。それは、膠原線維を主体とする無細胞性の構造で、脈絡膜と色素上皮細胞が接着し、脈絡膜から血管のない網膜外層へ物質を送る通路の役割を果たしている。単層上皮は移植操作などを行う際、非常に脆く破損しやすいため、従来は人工シートや羊膜など代用シート上で細胞を育てて用いていたが、細胞の分化が不十分になり、人工シートが移植部位の生物物理的現象の障害となる。それに対し、本発明では細胞自身が作る本来の基底膜や弾性線維を含むブルッフ膜が形成されることにより移植操作に耐えうる強度が得られる。また、本発明のブルッフ膜は血清に接する側に形成されるため、シートをブルッフ膜ごと培養皿から剥離することが容易である。

本発明はまた、前記網膜色素上皮細胞シートの作製方法において、形成されたブルッフ膜を網膜色素上皮細胞シートから分離することを特徴とする、ブルッフ膜のｉｎ ｖｉｔｒｏ作成方法を提供する。網膜色素上皮上に形成されたブルッフ膜はＥＤＴＡ処理することにより、またはマグネシウム、カルシウム無添加培地にて、シート表面でピペッティング、吸引操作によりシートからブルッフ膜を剥離、回収することが可能である。また、培養液を吸引して空気に接触させることや、希釈アルコール処理によってシート表面に脱水作用を加えることによっても剥離、回収が可能である。

本発明は、また前記細胞シート作製方法に従って、得られる細胞シート、好ましくは、網膜色素上皮細胞シートに関する。本発明の細胞シートは、生体の用途としては、例えば、スクリーニング用途、毒性試験用途と様々な用途に用いることができる。また、本発明の細胞シートは疾患治療用移植材料として組織移植が必要な対象に好適に移植することができる。特に本発明の網膜色素上皮細胞シートは、眼疾患患者への網膜治療用移植材料として好適である。眼疾患としては、例えば、加齢黄斑変性疾患、網膜色素変性症等が挙げられる。また、本発明の網膜色素上皮細胞シートは、前記眼疾患に対する薬効スクリーニングや毒性評価などの各種スクリーニング用途としても利用できる。例えば、特表２００７−５１７２１０に記載の方法に従って、毒性物質のスクリーニングに本発明の細胞シートを適用することができる。さらに、本発明の網膜色素上皮細胞シートは、視細胞外節の貪食能や神経保護作用などの視細胞の維持に関わる機能、ポンプ作用、タイトジャンクションによる網膜血管バリア機能などの、生体内における網膜色素上皮細胞が備える種々の様々な機能を評価するためのｖｉｔｒｏモデルとして利用することも可能である。

本発明の疾患治療用移植材料は、ヒト、ヒト以外の哺乳動物（例：サル、マウス、ラット、イヌ、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ネコ、ウサギ、ハムスター、モルモット等）における上記疾患を治療するために用いることができる。

本発明の疾患治療用移植材料の適用可能な疾患部位の範囲は、対象疾患、投与対象の動物種、年齢、性別、体重、症状などに依存して変化し得るが、例えば、加齢黄斑変性疾患に適用する場合は、移植すべき疾患部位の範囲が通常、０．０７ｃｍ^２〜０．２８ｃｍ^２の範囲である。

本発明の疾患治療用移植材料は、一度にもしくは数回に分けて移植してもよい。移植の適用回数は疾患に応じて医療従事者、ガイドラインに従って決定されるが、例えば疾患が加齢黄斑変性疾患であった場合には、本発明の網膜色素上皮細胞シートを、その重篤度によって２回以上移植してもよい。また複数回移植を行う場合、インターバルは特に限定されないが、数日〜数週間の期間を置いても良い。

本発明の疾患治療用移植材料は、医療従事者、ガイドラインに沿った適切な移植方法に従って移植される。例えば、胸部または腹腔内の治療箇所に対しては、開胸、開腹手術を適用できるほか、内視鏡的手法を採用することもできる。また、網膜下に本発明の疾患治療用移植材料として網膜色素上皮細胞シートを移植する場合、眼球網膜下の移植部位まで刺入した注射針からの水流に乗せる移植方法のほか、専用の運搬用治療器具によっても行うことができる。

本発明はさらに、前記ブルッフ膜作製方法によって得られるブルッフ膜を提供する。本発明のブルッフ膜は、細胞を含まない基底膜であるため、細胞を移植するよりブルッフ膜を移殖するほうが規制上の制約が少なく、実用化のハードルが低い。また、機能解析などの研究用途としても有用である。

以下に実施例を示して、本発明をより詳細に説明するが、これらは単なる例示であって、本発明の範囲を何ら限定するものではない。

眼球由来ヒト網膜色素上皮細胞の調製
ヒト網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞（ｈＲＰＥＣｓ）を死後４８時間以内の数名のドナーから採取した。該細胞をＨａｍ Ｆ−１０培地（１０％ウシ胎児血清、診断用培地（Ｇｌｕｔａｍａｘ ＩＩ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）ペニシリンＧ（１００ＩＵ／ｍＬ）、ストレプトマイシン（０．１ｍｇ／ｍＬ）、およびアムホテリシンＢ（０．２５ｍｇ／Ｌ））中に懸濁し、１０ｃｍディッシュ上に播種した。培養は、９５％空気／５％ＣＯ_２雰囲気下、３７℃で行った。

播種細胞数の検討
細胞を播種する前に、播種細胞数を検討した。網膜色素上皮細胞の１細胞の直径は１０〜２０μｍである。本実施例においては１０μｍと仮定し、１細胞の面積は５×５×３．１４＝７８．５μｍ^２と見積もった。従って、１ｍｍ^２中を細胞で占める場合、播かなければならない細胞数は、１，０００×１，０００／７８．５＝約１２，７４０細胞である。本実施例では、平面基材として４ウェルチャンバースライド（Ｌａｂ−Ｔｅｋ）を用い（１ウェルあたり２ｃｍ^２）、１ウェルを細胞で占めるためには、１２，７４０×２×１０×１０＝２，５４８，０００、即ち、約２５０万個の細胞数が必要であると見積もることができた。通常の細胞培養では、７５ｃｍ^２培養皿にコンフルエントの状態まで育てた網膜色素上皮細胞の数が約１００〜２５０万個であり、２５０万個として細胞密度は、２５０万個／７５ｃｍ^２＝約３３３細胞／ｍｍ^２であり、生体における細胞密度（４，０００細胞／ｍｍ^２程度）や本培養法で用いる細胞密度（例えば４００万個、細胞密度２０，０００細胞／ｍｍ^２）よりかなり少ないものである。

実施例１
ヒト網膜色素上皮シートの形成
眼球から採取した網膜色素上皮細胞を培養後、０．１％トリプシンおよび０．０２％ＥＤＴＡで５分間処理し、ピペットで集めた。集めたＲＰＥ細胞を遠心し、数を計測し、上記検討結果に従い、４ウェルチャンバースライド（Ｌａｂ−Ｔｅｋ）に１００万個、２００万個ずつ播種した（それぞれ５，０００細胞／ｍｍ^２、１０，０００細胞／ｍｍ^２）。その結果、シートは形成されたものの、ウェル面積の１／４、１／２にそれぞれ収縮した（図１）。そこで、収縮しない細胞数は２，０００，０００細胞／ｃｍ^２であると見積もり、新たに４ウェルチャンバースライドに播種した。その結果、細胞シートの収縮は観察されなかった（図２）。
また、細胞シートに対して免疫染色を行った。免疫染色はシートを４％パラフォルムアルデヒドにて固定後、ホールマウントによるか冷凍またはパラフィン切片を作成して、エラスチン、コラーゲンＩＶ、コラーゲンＩ、アクチン、サイトケラチン、オクルディン、ＺＯ−１など目的とするタンパク質に対する一次抗体を用いて、酵素抗体法または蛍光抗体法にて染色を行い、光学顕微鏡または蛍光顕微鏡で観察を行った。アクチンに関しては、蛍光標識したファロイジンによっても染色し観察可能である。かかる免疫染色の結果、細胞間接着および平滑筋アクチンの発現が、播種１日後に確認された（図３）。その後、ブルッフ膜のコンポーネントであるエラスチンおよびコラーゲンＩＶの発現がＲＰＥ細胞の血清接触表面に確認された（図４）。網膜色素上皮細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ培養系で、エラスチンの発現を確認することができたことは、これまで報告がない。

また、前記の免疫染色は、別途下記の通りに行うことでも同様の結果が得られた。
作成したヒト網膜色素上皮シートを１Ｍリン酸バッファー生理食塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄し、４％パラフォルムアルデヒドを含有する０．２ＭＰＢＳ中で１５分間固定を行った。固定後、網膜色素上皮シートをＴｗｅｅｎ２０含有Ｔｒｉｓ−バッファー生理食塩水（ＴＢＳ−Ｔ）で細胞シートを５回洗浄した。次いで、細胞シートをタンパク質ブロッキングバッファーでブロッキングの後、細胞シートを１次抗体で４℃、一晩培養した。用いた１次抗体としては、抗オクルディンヤギポリクローナル抗体（１：１００；Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、抗エラスチンウサギポリクローナル抗体（１：１００；Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）を用いた。細胞シートをＴＢＳ−Ｔで３回洗浄した後、二次抗体で３０分間、室温にて培養した。次いで、細胞シートをＴＢＳ−Ｔで３回洗浄し、乾燥後、ＤＡＰＩと共にｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄで封入した。各切片は、光学顕微鏡および蛍光顕微鏡（ＡＸ−７０； Ｏｌｙｍｐｕｓ ｏｐｔｉｃａｌ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．， Ｔｏｋｙｏ， Ｊａｐａｎ）で観察した。

実施例２
ヒトｉＰＳ細胞由来ヒト網膜色素上皮シートの形成
ヒト網膜色素上皮細胞として、iＰＳ細胞由来ＲＰＥ細胞を用いた点以外は、実施例１と同様の方法でヒト網膜色素上皮シートを形成した。iＰＳ細胞由来ＲＰＥ細胞として、Neuroscience Letters 458 (2009) 126-131に記載の方法で得たヒトｉＰＳ細胞を、国際公開ＷＯ０１／０８８１００号公報に記載の方法に準じた方法で分化誘導して得たＲＰＥ細胞を用いた。

実施例３
ヒト網膜色素上皮シート由来タンパク質に対するウエスタンブロッティング
実施例１で作成したヒト網膜色素上皮シートの抽出物をプロテアーゼ阻害剤を含有するライシスバッファーで溶解した。得られたタンパク質を等量ずつＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１０％）で分離し、二フッ化ポリビニリデンメンブレン（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ； Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ， Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ， ＭＡ）に転写したのち、ＴＢＳ−Ｔに溶解させた１０％スキムミルクで一時間ブロッキングを行った。次いで、抗ＲＰＥ−６５マウスモノクローナル抗体（１：５０００）、抗オクルディンウサギポリクローナル抗体（１：２５０）、抗サイトケラチン１８マウスモノクローナル抗体（１：１０００）、抗ＺＯ−１ウサギポリクローナル抗体（１：５０）、抗４型コラーゲンマウスモノクローナル抗体（１：１０００）、抗エラスチンマウスモノクローナル抗体（１：１０００）を１％スキムミルク含有ＴＢＳ−Ｔにそれぞれ溶解させた一次抗体で４℃一晩、メンブレンを培養した。ＴＢＳ−Ｔで６回洗浄した後、メンブレンをアルカリホスファターゼがコンジュゲートされた二次抗体（５０ｎｇ／ｍｌ）で１時間培養を行った。メンブレンを洗浄バッファーで６回洗浄して抗体を除去し、化学蛍光バッファーで染色を行った（図５）。標準化のために、メンブレンは抗ＧＡＰＤＨウサギモノクローナル抗体または抗アクチンウサギモノクローナル抗体でリプローブを行った。ヒト網膜色素上皮シート由来のタンパク質からは上記各抗体に対するタンパク質の発現が認められた。

実施例４
ヒト網膜色素上皮シートの電子顕微鏡像解析
実施例１で作成したヒト網膜色素上皮シートを回収し、２．５％グルタルアルデヒドを含有する０．１Ｍリン酸バッファー（ＰＢ）中で６０分間固定を行った。０．１ＭＰＢＳで洗浄後、網膜色素上皮シートを１％ＯｓＯ_４を含有する０．１ＭＰＢＳ中に２時間静置した。固定後、エタノールおよびt−ブチルアルコールで脱水し、乾燥させた。次いで、網膜色素上皮シートをパラジウムでスパッタ被覆（標的試料と５０ｍｍの距離、５×１０^−２ミリバールで３０ｍＡ、４０秒間）を行い、走査型電子顕微鏡で観察した（図６）。電子顕微鏡像からは、コラーゲン線維および弾性線維（図６、矢印）の形成が認められた。

本発明の方法によって、加齢黄斑変性患者に移植適用する網膜色素上皮細胞シートを比較的簡便に調製することができる。特に、培養に用いる細胞をｉＰＳ細胞由来の網膜色素上皮細胞とした場合、患者自身の細胞を利用可能となるため、移植の際の拒絶反応を回避することができる。
本出願は、日本で出願された特願２０１０−１０８６７４（出願日：平成２２年５月１０日）を基礎としており、その内容はすべて本明細書に包含されるものとする。

Claims (5)

1. 以下の工程を含む、細胞シートの作製方法。
   （１）哺乳動物由来網膜色素上皮細胞を調製する工程；
   （２）調製した細胞を平面基材上に２０，０００細胞数／ｍｍ^２〜４０，０００細胞数／ｍｍ^２で播種し、培養する工程
   （３）細胞の平面基材の接触する側と反対側にブルッフ膜の形成を確認する工程
2. 得られる細胞シートが、細胞間にタイトジャンクションが形成され、且つ平面基材の接触する側と反対側に基底膜が形成されている、請求項１に記載の方法。
3. 以下の工程（４）をさらに含む、請求項１または２に記載の方法。
   （４）工程（２）で得られた培養細胞における分化マーカーの発現の有無を確認する工程
4. 工程（４）において、分化マーカーが、ベストロフィン−１、ＲＰＥ−６５、サイトケラチン、オクルディン、ＺＯ−１、エラスチン、アクチン、１型コラーゲンおよび４型コラーゲンからなる群より選択される少なくとも１種である、請求項３に記載の方法。
5. 請求項１〜４に記載の方法で形成されたブルッフ膜を分離する工程を含む、ブルッフ膜の作製方法。