JPH09501303A

JPH09501303A - 網膜色素上皮移植

Info

Publication number: JPH09501303A
Application number: JP6524207A
Authority: JP
Inventors: マーチンエスシルヴァーマン
Original assignee: フォトジェネシスインコーポレイテッド
Priority date: 1993-04-30
Filing date: 1993-04-30
Publication date: 1997-02-10
Anticipated expiration: 2019-01-26
Also published as: ATE196923T1; EP0700429A4; JP3490447B2; EP0700429B1; DE69329556D1; IL107498A0; EP0700429A1; IL107498A; WO1994025569A1

Abstract

(57)【要約】網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞の単層のラミネート及び、予め決めた条件に曝す際に普通の眼組織の機能を妨げない非毒性で柔軟性のある支持体を含む移植片が、宿主の眼の網膜下の領域への移植用に提供される。宿主の眼の網膜下領域へ移植するＲＰＥ細胞の集団の生産方法もまた提供される。該方法は、ＲＰＥ細胞を含むドナー組織を提供し、該組織からＲＰＥ細胞を収集し、収集されたＲＰＥ細胞を非毒性で柔軟性のある支持体の単層として並べることを含む。このとき該支持体は、網膜下領域へ移植して予め決めた条件に曝す際に、宿主の眼及び移植された細胞集団の普通の眼組織の機能を妨げないものである。上記移植片の移植方法もまた提供されており、該方法は、移植片を提供し、宿主の眼を貫く切り口を作り、少なくとも網膜下の領域に接触するように網膜をある程度引き離し、そして接触させる領域に移植片を配置することを含んでいる。

Description

【発明の詳細な説明】網膜色素上皮移植発明の背景この出願は、１９８９年８月１４日出願の米国特許出願第０７／３９４,３７７号の一部継続出願である、１９９０年８月１３日出願の米国特許出願第０７／５６６，９９６号の一部継続出願である。本発明は一般に、細胞および組織移植技術に関する。さらに詳細には、本発明は、網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞集団を単層として眼の網膜下領域に移植する技術、および移植用のＲＰＥ細胞の単層を含む移植組織の製造方法に関する。網膜は、眼の後面に並び、水晶体により形成された像を受入れ、この像を神経刺激に変換し、この情報を視神経により脳に伝達する知覚上皮表面である。網膜は多数の層、すなわち、神経節細胞層、内網状層、内顆粒層、外網状層、外顆粒層、光受容体内セグメントおよび光受容体外セグメントを含んでいる。外顆粒層は、光受容体細胞の細胞体を含み、その内セグメントと外セグメントは細胞体の延長部分である。脈絡膜は、大きな分岐色素細胞を含む脈管膜であり、脊椎動物の眼の掌膜と網膜の間に存在する。脈絡膜の上に、ブルックの膜（Bruck's memb rane）として知られる基本的にコラーゲンからなる厚さ１〜５ミクロンの膜がある。ブルック膜と網膜の間に、網膜色素上皮があり、これが、光受容体細胞と緊密な構造的および機能的関係を形成している。ＲＰＥ細胞が果たす機能には、光受容体が産生する外セグメントデブリス（debris）の食作用がある。ＲＰＥ細胞が外セグメントデブリスの消化等の機能を果たせなくなると光受容体細胞の最終的な変性および損失が起こると考えられている。老年性斑変性（ＡＭＤ）のような西欧先進国における視力障害の主な原因として、光受容体と下層のＲＰＥの両者が傷害を受け、変性していることが挙げられる。ＡＭＤのもう一つの特徴は、ブルック膜とＲＰＥを通して成長し、出血して網膜下空間に液を漏出する傾向をもつ、網膜下新血管膜の頻繁な出現である。従来回復不能な傷害を受けた網膜であると考えられていたものを回復させる努力の中で、研究者達が様々な形態の移植組織や移植技術を提案してきているが、これらはいずれもジストロフィー網膜を復元する有効な方法にはなっていない。眼に網膜細胞を移植することは、Royoらの報告[Growth 23: 313-336(1959)]に従って行うことができる。この方法では、胚網膜を、母眼の前室に移植している。光受容体をはじめとする種々の細胞が生育することが報告された。次いで、del Cerro らはこれらの実験を繰り返し、進展させることができた（del Cerro ら， Invest．Ophthalmol．Vis．Sci．26: 1182-1185，1985）。その後間もなく、Tur nerらは、新生児の網膜組織を網膜の傷に移植することができることを報告した( Turner ら，Dev．Brain Res．26:91-104(1986))。 LiとTurner［Exp．Eye Res．47: 911 (1988)］は、ＲＣＳジストロフィーラットにおける治療アプローチにおいて、網膜色素上皮（ＲＰＥ）を網膜下空間に移植して、欠陥のある変異体ＲＰＥ細胞を健康な野性型の対応細胞で置き換えることを提案した。彼等のアプローチによれば、６〜８日齢の虹彩の黒い眼を持つラットからＲＰＥを単離し、掌膜と脈絡膜を通って浸透する障害パラダイムを用いて網膜下空間に移植した。ＲＰＥ（40,000〜60,000細胞）の１mlの注射液を、30 ゲージの注射針を取り付けた１０mlのシリンジで網膜下空間の切開部位に注射した。しかしこの方法は、未成熟ＲＰＥ細胞については多少適切ではあるが、成熟細胞についてはこれらの細胞の活性化および変質を起こし、眼や網膜組織を損傷する。 Lopez ら[Invest．Ophthalmol．Vis．Sci．30: 586-589,(1989)]も、分離したＲＰＥ細胞の移植方法を報告している。この方法では、ＲＰＥ細胞を、正常な、コンジェニック（congenic）な、色素ラットの眼からトリプシン消化により得ている。これらの新たに取り出した、分離ＲＰＥ細胞を、鞏膜、脈絡膜および神経網膜の切開部位からジストロフィーＲＣＳラットの眼の網膜下領域に注射した。上記LiとTurnerのアプローチと同様に、この方法も、健康な眼でコンフルエントな単層の形態をとっている、移植されたＲＰＥ細胞の有機的な生来の構造を破壊する。さらにこの方法は、成熟ＲＰＥ細胞の移植については疑問である。成熟ＲＰＥ細胞を、分離した形態で移植すると、活性化し、網膜下空間に移動し、 Laneら[Eye（1989）3，27-32]が指摘したように、網膜と硝子体を侵す傾向があることを、実験結果は示している。移植した成熟ＲＰＥ細胞のこの活性化は、網膜の皺、大量の網膜下繊維症、網膜ロゼット形成、網膜剥離、および増殖性硝子体網膜病のような病状をもたらす。成熟ＲＰＥ細胞の移植に関連する上記困難性は、未熟ヒトＲＰＥドナー組織の利用できる供与量が非常に限定されているので、ヒト移植にとって問題である。更に、成熟細胞を使用できないので、自己のＲＰＥ組織を使用する移植が効果的に阻害される。自己ＲＰＥを使用する移植は、非自己移植片によって生じる潜在的な免疫応答を含む合併症を避けるのに望ましい。ＡＭＤの患者は、主として高齢者であり、殆どの場合、移植片に自己組織を利用すると、必然的に成熟ヒトＲＰＥ細胞を使用する。成人ヒトＲＰＥ細胞の移植を成功させるとともに、ＲＰＥ細胞の活性化に関連する問題を避けるためには、その細胞を実質的に単層に維持することが必要であると考えられる。特定の理論に限定されることを望むものではないが、基質への接着によって補完される、無傷の単層による細胞対細胞接触の阻害は、ＲＰＥ細胞活性を軽減するものと考えられる。更に、ＲＰＥに対する単層構造は、組織化された外核層構造における光受容体細胞の維持のための並びに内側及び外側セグメントの適切な成長及び配列のための適切な基礎を提供し、合理的な程度の視力を回復するのに有利であると信じられる。光受容体を組織化された構造中に維持する要件は、光受容体の周知の光学的特性（外側セグメントは、光ガイドとして作用する）及び網膜幾何における折り畳み又は類似の若しくは小さい変動が視力を酷く低下させ得ることを示す臨床的証拠に基づくものである。更に、ＲＰＥ移植の前に、網膜下新生血管膜が現れるＡＭＤの場合には、かかる膜は、網膜下水腫及びその出血を防止するために除去する必要があろう。実際には、新生血管膜を除去すると、本来のＲＰＥ並びにブルック膜(Bruch's membr ane)も除去される。単層としてのＲＰＥ細胞の移植に対する重要な障害は、網膜下領域への移植の間の操作の激しさに対して、ＲＰＥの細胞間構造が脆弱であることである。更に、この操作の間にＲＰＥ細胞を充分に支持することは、脈絡膜とその上の網膜との間の代謝交換を調整するのを避けるために、その支持を移植の後に除去するか、又は進行する生理学的活性と調和させなければならないために、複雑化する。従って、ＲＰＥ細胞の単層を含む移植片を調製し、移植し、その際、ＲＰＥ細胞の単層を支持する部材が、網膜下領域に移植されかつ所定の条件に曝された時に、通常の眼組織の機能を阻害しない方法が必要である。更に、血管新生が起こり、本来のブルック膜が除去される場合には、移植されたＲＰＥ細胞の接着のためのブルック様膜が必要となろう。発明の要約本発明の目的の内、ジストロフィーＲＰＥの再構成に使用される単層のＲＰＥ細胞群を調製する方法の提供；ジストロフィーＲＰＥの再構成において、成熟、特に自己の成熟細胞を、ドナー組織として使用できる方法の提供；ジストロフィー網膜の再構成において使用する移植片の提供；移植後に通常の眼組織の機能に抵触せず、光受容体の本来の機構を維持できるようにすることによって、光受容体及びその内側及び外側セグメントを維持する、移植片の提供；特に本来のブルック膜を除去した時にＲＰＥ細胞群の接着のための膜を提供する移植片の提供；並びにかかる移植片を眼の網膜下領域に移植する方法の提供を明記することができる。簡潔に述べれば、本発明は、宿主眼の網膜下領域へ移植するためのＲＰＥ細胞群の調製方法に関する。この方法は、ＲＰＥ細胞を含むドナー組織を提供する工程、かかる組織からＲＰＥ細胞を収穫する工程、そして、網膜下領域へ移植し、所定の条件に暴露した時に、宿主眼の通常の眼の組織の機能及び移植された細胞群に害を与えない、非毒性の可撓性支持体に、収穫されたＲＰＥ細胞を添える工程を含有する。本発明は、更に、宿主の眼の網膜下領域へ移植するための移植片に関する。移植片は、ＲＰＥ細胞の単層と、網膜下領域へ移植し、所定の条件に暴露した時に、通常の眼組織の機能を妨げない非毒性の可撓性支持体との積層体を含有する。また、本発明は、宿主眼の網膜下領域に、ＲＰＥ細胞の単層を含有する移植片を移植する方法に関する。この方法は、ＲＰＥ細胞の単層と、網膜下領域へ移植し、所定の条件に暴露した時に、通常の眼組織の機能を妨げない非毒性の可撓性支持体との積層体を準備する工程、宿主の眼に切開を形成する工程、少なくとも部分的に網膜を分離して、網膜下領域に接近できるようにする工程、そして移植片を接近した網膜下領域に位置させる工程を含有する。図面の簡単な説明図１は、正常なラットの網膜および網膜下部の低温部の写真（２００倍）である。図２（ａ、ｂ、ｃ、ｄおよびｅ）は、支持体に積層したＲＰＥ細胞の単層を含む移植組織の好ましい実施態様の準備および移植を図で示したものである。図３は、支持体に積層したＲＰＥ細胞の単層を含む移植組織の適する実施態様を図で示したものである。図４は、脈絡膜および鞏膜を通した外科的アプローチを示す、目の断面図である。図５は、角膜を通した外科的アプローチを示す、目の断面図である。図６は、実施例１で述べる、齧歯類の角膜、瞳孔およびレンズを取り除いた網膜の下に移植したヒト成熟ＲＰＥ細胞の無傷の単層の移植組織の、移植２週間後の状態を示した写真である。図７は、実施例１で述べる、ラットの網膜および網膜下部の写真（４０倍）であり、ヒト成熟ＲＰＥ細胞集団の無傷の単層の移植組織の移植１４日後を示している。図８は、実施例１で述べる、ラットの網膜および網膜下部の高倍率写真(４００倍)であり、ヒト成熟ＲＰＥ細胞集団の無傷の単層の移植組織の移植１４日後を示している。図９は、実施例２で述べる、分離したヒト成熟ＲＰＥ細胞の移植１４日後のラットの網膜および網膜下部の写真（１００倍）である。図１０は、実施例２で述べる、分離したヒト成熟ＲＰＥ細胞の移植１４日後のラットの網膜および網膜下部の高倍率写真（３００倍）である。詳細な説明ここで使用する用語“ドナー”は宿主に関する、同じまたは異なる生物を意味する。また“ドナー組織”は宿主に関する、同じまたは異なる生物から得た組織またはこれを培養したものを意味する。同原の組織も宿主生物から得た組織またはこれを培養したものを意味する。成熟ＰＲＥ細胞は、胎児ではない生物から派生した分化したＲＰＥ細胞を意味する。年齢に関係した黄斑変性（ＡＭＤ）において、光受容体の下にあり、かつ構造的および代謝的に近い支持体を形成するＲＰＥ細胞の変性または弱体化は、成育しうる光受容体の破壊または障害を引き起こすと考えられている。しかし、細胞と細胞の接触を阻止するように細胞体部の二次元配列であることが必要である、単層のＲＰＥ細胞集団の移植により、ＲＰＥ細胞に、自然の健康な網膜の色素上皮の正常な性質を大部分保持させ、光受容体に構造的および機能的支持を与えることができることが見出された。さらに、以下の実施例２に示すように、そのような細胞の活性化を阻止するためには、成熟ＲＰＥ細胞を単層で移植することが必要であると考えられている。活性化は、ＲＰＥ細胞を遊走性マクロファージ、繊維芽細胞様細胞および他の細胞型に分化転換させ、これは、目および網膜における様々なジストロフィー効果を与える。図１は、正常ラット網膜および網膜下部の低温部の写真である。図１および他の図において、神経節細胞層（“Ｇ”）、内部網状層（“ＩＰＬ”）、内顆粒層（“ＩＮＬ”）、外部網状層（“ＯＰＬ”）、外顆粒層（“ＯＮＬ”）、内部領域（“ＩＳ”）、外部領域（“ＯＳ”）、および網膜色素上皮（“ＲＰＥ”）などの網膜またはその層をそれぞれ、上部から下部に示している。図２および３には、ＲＰＥ細胞の単層を含む移植組織を、一般に、ＲＰＥ細胞をドナー組織から採取し、採取した無傷の単層のＲＰＥ細胞を無毒で柔軟な組成物に積層させるか、またはそのような組成物を分離したＲＰＥ細胞の単層に摂取してそれらを融合層に成育させることにより、準備することが示されている。移植組織の成分は、ＲＰＥ細胞の単層と、約１００〜５００ミクロンの厚さ、好ましくは１５０〜２５０ミクロンの厚さの支持組成物との積層体からなる。移植組織の表面積は、約１平方ミリメートルより大きいものであり、２平方ミリメートルより大きいものが好ましく、４平方ミリメートルより大きいものが最も好ましく、または実際に操作が行えるような大きさである。このように構築して、移植組織は網膜下部に明確な境界を作る。ＲＰＥ細胞を採取するためのドナー組織を選択する際には、今まではＲＰＥ細胞の移植は完全に未成熟細胞に限られていたことに注意が必要である。従来の方法により移植された成熟ＲＰＥ細胞は活性化を受け、その結果、網膜の縮み、網膜下部の繊維症、および増殖硝子体網膜症を起こした。しかし、本発明のＲＰＥ細胞の単層を移植する方法を使用することにより、移植された成熟ＲＰＥ細胞は本質的に正常な構造および機能を完全に維持した。このように、本発明は、成熟ＲＰＥ細胞を移植に用い、未成熟ヒトドナー組織の非常に限られている供給以上に、使用可能なドナー組織の供給を大きく増加させた。ＲＰＥは、血液−網膜障壁の一部を形成し、その結果、リンパ球の攻撃にさらされることにも留意すべきである。従って、成熟ＲＰＥ細胞についてさえ現在では可能であるが、自己由来のＲＰＥ細胞の使用が好ましく、これにより臨床への適用における免疫学的な合併症を避けることができるであろう。非−自己由来組織を利用すると、移植による拒絶を避けるのに、組織型及び／又は免疫抑制養生の使用が、一般的に必要であろう。アイバンクから、非−自己由来ヒトＲＰＥ組織について、ドナー組織を提供することができ、これにより、角膜移植の実施に関して該ＲＰＥ組織が利用可能になる。非−自己由来ＲＰＥ組織を含有するドナー組織の収穫は、好適な方法により行うことができる。一般的に、ＲＰＥ細胞の収穫は、オスボーン及びチャダー編(Osborn，N．and Chader J.)フェッファー(Pfeffer，B.A.):第１０章、“Impr oved Methodology for Cell Culture of Human and Monkey Retinal Pigent Epi thelium”Progress in Retinal Research第１０巻（１９９１）又は、メイヤーソンら(Mayerson，P.L．et al.)“An Improved Method for Isolation and Cult ure of Rat Retinal Pigent Epithelial Cells” Investigative Ophthalmology & Visual Science １９８５年１１月、２６巻：１５９９−１６０９に記載の方法により行うことができる。これらの文献に記載の内容は、本明細書の記載に含まれるものとする。具体的には、非−自己由来ＲＰＥ組織を収穫するために、眼のケージ内に、ドナーの眼の光学神経断端をピンで止め、角膜除去後直ちに眼用のビン(eye jar)の中に入れる。次いで、該ビンにその容量まで、牛胎児血清を５％補填した冷ダルベッコの変成必須培地（ＤＭＥＭ）を浸す。ゆるく結合した組織と筋肉とを眼から注意深く切取った後、殺菌プレート上に真っすぐに立てて置き、接着性硝子体液を有する前方部分をアイカップから取り上げる。神経網膜を光学ディスク上に分離し、除去する。次いで、外皮を、Ｃａ⁺⁺及びＭｇ⁺⁺を含まないハンクの緩衝塩溶液で洗浄し、０.２５％トリプシンで３７℃、３０分間処理する。このトリプシン溶液を外皮から吸引し、ＤＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ）を加える。外皮に培地をピペットで温和な条件で加えることにより、ブルック(Bruch)の膜からＲＰＥ細胞が放出される。自己由来の組織を含む移植組織について、生検を行い、次いでレインら(Lane, C.，et al.)、Eye(1989)3，27-32に記載の操作により、ＲＰＥ細胞を収穫することができる。この移植組織は、又、ＲＰＥ細胞についての支持体(support)を含むので、ＲＰＥ細胞の単層はほとんど損傷せず、移植操作の間一層容易に操作できる。基体、被覆層又はその両方からなる支持体は、ＲＰＥ細胞の少し損傷した単層に機械的強度と安定性とを付与するのに選ばれた非毒性で柔軟な組成物の１枚以上のシートを含む。支持体組成物は、目の中にＲＰＥ細胞の単層とのラミネートとして挿入されるので、網膜下の領域に移植され、ここで述べた一連の所定の条件にさらされた時に支持体はそのようなものとして構成され、支持体組成物は宿主の眼又は移植したＲＰＥ細胞の集団の正常な眼組織機能を妨害しないであろう。もしも収穫したＲＰＥ細胞を移植の前に培養すべきであるならば、移植の間にＲＰＥ細胞の単層に対して支持体を提供する組成物は、培養の間ＲＰＥ細胞の付着基質として作用する能力を有するものであってもよい。ＲＰＥ細胞の集団のための支持体として、移植後に組成物がさらされるであろう特定の条件に依存して、種々の組成物を用いることができる。結局、移植後約１週間以上の間網膜下の領域に残存している部分が、網膜下領域内で体液にさらされ場合に、正常な眼組織の機能に適合するように、又は所定の条件にさらされた時に除去に対して感受性があるように、該組成物を選択する。ＲＰＥ細胞の単層の支持体のための組成物の調製を決定する場合に考慮すべきもう１つの因子は、ＲＰＥ細胞の単層の移植の前に、ブルック(Bruch)の膜が宿主の眼から既に除去されているか又は除去される予定であるかである。ブルックの膜は健康な眼にＲＰＥ細胞を固定する作用をする。ブルックの膜の除去は、網膜下のネオ血管膜が形成されているＡＭＤの場合に生じるかも知れず、新生血管膜の除去の結果としてブルックの膜の除去が生じる。ブルックの膜が除去される場合、支持体組成物は、厚みが１００ミクロン未満、好ましくは１〜１０ミクロンのコラーゲンの膜から構成されるであろう。ＲＰＥ細胞の底部表面は、容易にコラーゲン膜にくっつき、除去されたブルックの膜の代わりに、脈絡膜に対してＲＰＥ細胞を止める作用をする。又、コラーゲンの層は、移植したＲＰＥの周り及び移植したＲＰＥを通して網膜下のネオバスクラリゼーション(neovascularization)の発生及び再発生を防止するように作用する。このようなコラーゲン層は網膜下領域に無期限に保持される。しかしながら、ブルックの膜は、本質的にコラーゲンから構成され、コラーゲンのこのような極薄(microthin)層は、脈絡膜と網膜との間の代謝交換のような正常な眼の組織機能の妨げを避けるのに十分透過性である。しかしながら、この極薄層のコラーゲン組成物は移植の間のＲＰＥ細胞の単層の座屈やねじれを防止するほど強いものではない。従って、この極薄コラーゲン材料は、仮に移植したＲＰＥ細胞の支持体の一部を形成するのであれば、移植後に除去されるであろう他の支持体材料と組み合わせて使用する必要がある。移植が、生来のブルック（Bruch）膜を傷つけないで行われると、ＲＰＥ細胞の移植を受けるその領域をカバーする宿主ＲＰＥ細胞は、物理的に及び／又は化学的にブルック膜から、例えば、宿主ＲＰＥ細胞を除去するために、コラゲナーゼを天然のブルック膜に適用し、宿主ＲＰＥ細胞をゆるめることにより、鮮創する(debride)ことができる。移植されたＲＰＥ細胞は、その後それ自身をブルック膜に直接つなぎ留めることができる。上記のように、コラーゲンの層を補うためか、又は、コラーゲン・アンカーを含むことが必要ではない場合に、例えば、十分量の熱、選択された酵素、又は体液に暴露させることにより、放散する（dissipate）支持体組成物を選択することができる。ゼラチンは、可撓性で、神経組織に対して毒性がなく、体温で溶解する能力を有する、好ましい支持体材料の一例である。支持体組成物は、活性化した低ゲル化温度アガロース（タイプVII、#A4018 シグマ化学会社(Sigma Chem ical Co.，St．Louis)）又はフィブリンのような材料を含有することもできる。これらは、他の成分を攻撃しないであろう選択性の酵素に暴露されたとき、放散するものと知られている。例えば、アガラーゼ（agarase）は、アガロースを特異的に攻撃すると知られている酵素であり、ウロキナーゼはフィブリン特異性の酵素である。他の代替物は、エチレン−酢酸ビニル共重合体（Elvax 40W、デュポン化学会社(DuPont Chemical Co.，Delaware)）；ポリ（グリコール酸）、ポリ（L-ラクチド−コ−グリコリド）(poly(L-lactide-co-glycolide)(70:30比)又はポリ(DL-乳酸)(低分子量)(ポリサイエンス（Polyscience，Inc.，Warrinton， PA.，Data Sheet #365，1990））のような生分解性ポリマーを用いることであり、これらは、移植及び体液に暴露した際にゆっくり放散する、可撓性で、毒性がない材料である。パウエル（Powell，E．M．）のBrain Research、515巻（1990 年）、309-311頁及びポリサイエンス社のデータ・シート#365（Polyscience，In c．Data Sheet #365）を参照のこと。ゼラチン又は他の支持体組成物は、さらに、サイクロスポリンＡのような免疫抑制薬、デキサメタザンのような抗炎症薬、抗血管由来因子（anti-angiogenic factor）、抗グリア剤（anti-glial agent）、及び抗有糸分裂因子を含む薬理剤のような多くの栄養因子のいずれかのためのキャリアとして働くことができる。支持体組成物の溶解において、因子又は薬剤は、その周囲の組織に所望の効果を付与するのに役にたつことになる。投与量は、確立した実験技術により決定することができる。プファー（Pfeffer，B.A.）、Progress in Retinal Reseach、10巻(1991年)、 264頁、第10章”Improved Methodology for Cell Culture of Human and Monkey Retinal Pigment Epithelium”により開示された技術を用いて、適当な酵素的消化で、ＲＰＥ細胞をブルック膜から、分離した細胞としてよりはむしろ傷のないシートとして除去する。ＲＰＥ細胞のそのような採取したばかりの傷のない単層を即座に、傷のない単層として薄いコラーゲン・シートのような支持体であって、上層又はゼラチンの基質で補われた支持体に併置し、移植する前に接着のために数時間経過させる。この工程は、バイオプシーで得られたＲＰＥ細胞の移植に有用であり、提供される、十分なＲＰＥ組織は、傷のない単層としてバイオプシーから得られる。しかし、多くの場合、単層のＲＰＥ細胞を調製することができるように、採取したＲＰＥ細胞を付着基質上で培養するのが好ましい。採取する前に、ＲＰＥ細胞を培養することは、少量の採取した組織から大量のＲＰＥ細胞集団を製造することができ、かつ、移植すべきＲＰＥ細胞が健全かつ機能しうることを保証する観察の時間を可能にすること、の双方の点で好ましい。適切な培養として、内包する採取したＲＰＥ細胞を基質に併置し、そこに細胞が付着し、成長し、ＲＰＥ細胞が有効に成長するのに適切な培養条件で基質を維持することができる。ＲＰＥ細胞を併置することは、ＲＰＥ細胞の群を含む溶液を基質上にピペットで移すことによって達成することができる。生理溶液中の採取したＲＰＥ細胞の傷のないシートは、大口径のピペットで基質上に物理的に剥離することができ、もし必要であれば、細かいキャメル−ヘアー・ブラシで操作してもよい。ＲＰＥ細胞培養は、３７℃付近で最もよく成長し、最適な基質はこの温度での固体物である。ＲＰＥ細胞培養の成長に好適な付着基質には、細胞付着のためのコラーゲン、ラミニン（laminin）、又はフィブロネクチン（fibrone ctin）でコートしたプラスチック培養容器又はガラス培養チャンバースライドが挙げられる。コラーゲンのようなコーティングは、フィブリン又は活性化アガロースのような下部基質（substratum）に適用することができる。ＲＰＥ細胞を培養することは、融合性の単層のＲＰＥ細胞を得るためのいかなる好適な方法によっても達成することができる。適当な培養技術は、プファー（ Pfeffer，B.A．）、Progress in Retinal Reseach 、10巻（1991年）、第10章『 “Improved Methodology for Cell Culture of Human and Monkey Retinal Pigm ent Epithelium”』(オズボーン(Osborn，N.)及びチャダー(Chader，J.)編)、又はメイヤーソン(Mayerson，P.L.)らのInvestigative Ophthalmology & Visual S cience 、11月号（1985年）26巻、1599-1609頁、“An Improved Method for Isol ation and Culture of Rat Retinal Pigment Epithelial Cells”に記載されている。図２は、本発明による移植片の好ましい態様の調製及び移植の概略を示す。移植ラミネート１は、図２ａ及び図２ｂに示すように形成した。ゼラチン３は、可撓性があり、神経組織に対して毒性がなく、かつ体温（３７℃）に暴露後に溶解してなくなるので、移植の際に単層支持体を提供するために用いるのが好ましい。しかし、ＲＰＥ細胞は、３７℃以下の温度で成長するのがあまりにも遅いので、ゼラチンは、ＲＰＥ細胞を培養するのに用いる適当な基質ではない。よって、ＲＰＥ細胞５の単層を、まず成長に好適な基質上で培養する。ＲＰＥ細胞はプラスチック培養容器Ａ上で成長するであろう。しかし、培養容器ＡからＲＰＥ細胞の単層を除去するのを援助するために、培養容器Ａをアガロース又はフィブリンのような、ＲＰＥ細胞のための基質９でコートするのがよい。図２ｂを参照のこと。基質９を、次にコラーゲン７の薄い（２〜４ミクロン）層でコートし、それにＲＰＥ細胞５の単層をすぐに付着させ、移植後の期間（post-transplantation period）でＲＰＥ細胞のアンカーとして働く。基質９としてアガロースが用いられると、アクセン（Axen，R）らのNature（1967年）214巻、1302-1304頁に開示されるような臭化シアン、又はウィルチェック（Wilchek，M）及びマイロン（ Miron，T）のBiochemistry International（1982年）４巻、629-635頁に開示されるようなp-ニトロフェニル・クロロフォルメートのような活性化剤でアガロースの表面を処理することにより、コラーゲン７がそれに付着するように、アガロースは活性化される。ＲＰＥ細胞の十分なカルチャーが成長した後に、溶融ゼラチンの５〜３０％溶液をカルチャー中のＲＰＥ細胞の単層の頂芽表面（apical surface）５に加える。次いで、ＲＰＥ細胞及びゼラチン溶液の入ったカルチャー容器を冷却し、ゼラチン３を固化して、ＲＰＥ細胞の頂芽表面５に付着した好ましくは厚さ約150〜2 50mmのシートにする。次に、図２ａに示すように、カルチャー容器Ａの表面とコラーゲン７との間を剃刀Ｃでスライスして、コラーゲンアンカー７に付着したＲＰＥ細胞の単層５及びゼラチンの上層３を含む移植ラミネート１をカルチャー容器Ａから物理的に剥離してよい。あるいは、図２ｂに示すように、移植ラミネート１をカルチャー容器及び基質９から酵素的に剥離してもよい。基質９を含む物質に対し特異的な酵素を添加して、下層の基質９を移植ラミネート１から剥離してよい。基質がアガロースである場合、アガロースに対し特異的な酵素であるアガラーゼを使用してアガロースを分解してよい。アガロース基質を分解するには、５mlのカルチャー培地に対し１mgのアガラーゼ濃度で十分であると考えられる。基質がフィブリンコーティングからなる場合、ウロキナーゼ（１mlのカルチャー培地に対し２活性単位のウロキナーゼ）等の酵素を用いてフィブリンを分解してよい。基質９の分解を補助するため、カルチャー容器Ａは、多孔質の底部を有する内側膜Ａ−１及び外側の固形膜Ａ−２を含む細胞カルチャー挿入膜を有していてよい。そのような挿入膜の多孔質（例えば孔径.45mm）の内側膜Ａ−１に基質９を塗布する。この孔は、酵素を含有する溶液Ｂの基質９への浸透を容易にし、それにより基質が分解され、移植ラミネート１をカルチャー容器Ａから剥離することが可能となる。図２ｃに示すように、移植ラミネート１を切り出し、移植作業の間移植片１ａを保護するためのキャリア溝を有する外科手術用器具２０に適合し得る寸法にする。以下に更に詳細に記載する外科的手法により、図２ｄに示すように、網膜を剥離した後に、宿主の眼の後極７６における網膜下部領域に移植片１ａを移植する。ゼラチン上層は、移植片１ａを宿主の眼に移植した後１時間以内に溶解する。移植の後に、網膜を再度取付け、コラーゲンの層に固定したＲＰＥ細胞の単層を脈絡膜と網膜との間に挟み込む。図２ｅ参照。図３に、本発明による移植片の他の態様を図示する。上記図２との関係で上に記載したように、基質９を塗布したカルチャー容器上でＲＰＥ細胞の単層５を成長させる。但し、本態様においては、基質９は移植の間ラミネートされたままであって移植片１ａの一部を含む。移植に使用する基質９はアガロースを含んでいてよく、これは生物的に不活性であって、前記のようにアガロースを選択的に攻撃する酵素であるアガラーゼに曝すことにより分解してよい。本態様においては、活性化したアガロースに強固に結合する、厚さ約２〜４ミクロンのコラーゲンの薄層７に、活性化したアガロースを塗布する。次いでＲＰＥ細胞の単層５をコラーゲン７に並べ、簡単に取り付けて、移植用の移植片１ａとして使用するＲＰＥ細胞と支持組成物（コラーゲン７及び基質９）のラミネートを形成する。図２に関して記載したようにゼラチン上層を追加する代わりに、剃刀を用いて基質９を含む材料のシートを厚さ約150〜250mmにスライスし、移植の間のＲＰＥ細胞の単層５及びコラーゲン７の固定用支持体として使用する。移植を完了しＲＰＥ細胞の単層を適切な位置に固定したら、酵素（例えばアガロース基質を使用する場合にはアガラーゼ（５mlの容積のガラス容器（vitreal chamber）あたり１mg））の眼内注射を行って基質を分解してよい。あるいは、エチレン−酢酸ビニルコポリマー（デラウェア州デュポンケミカル社製Elvax 40 W）等の徐放剤１１に酵素を導入し、移植に先立ってこれを基質９に添加してもよい。酵素用の徐放性マトリクスとしての生分解性ポリマーの使用法は当業界で公知であり、例えばE.M.パウエルのBrain Research，515, 309-311（1990）；ワイズらの第１２章，“Lactic/Glycolic Acid Polymers”，Drug Carriers in Bi ology and Medicine，（Gregoriades編）（1979）；J.キッチェル及びD.ワイズの“Poly(lactic/glycolic acid)Biodegradable Drug - Polymer Matrix System s”Method in Enzymology，112, 436-448（1985）等に開示されている。酵素を徐放することにより、基質支持体を徐々に分解することになる。基質９が分解した後に残存するコラーゲン７は、生理学的に透過性であって正常な細胞機能を阻害するものではなく、ＲＰＥ細胞の単層５を固定する役割を果たすと同時に、宿主の眼の網膜下部領域における血管新生（neovascularization）を防止する。図２に関連して論じたフィブリンは、図３に描かれた実施態様において、基質９として使用することができる。フィブリンは、血液クロットの構造部材を形成する繊維状の不溶性タンパクである。フィブリンは、プレスして引張強さを高めることができ、また、ＲＰＥ細胞が付着し、単層として成長するであろう柔軟な無毒性支持体を提供する材料である。フィブリンを製造するためには、基質使用に適したフィブリンクロットを、トロンビンの添加によりフィブリンへのフィブリノーゲンの重合を触媒することにより製造する。移植後、フィブリンは、血液クロットを溶解する天然生産酵素への暴露により散逸(dissipate)するであろう。フィブリンサポート組成物の散逸を促進したい場合は、組織プラスミノーゲンアクチベーター（ＴＰＡ）、ウロキナーゼ又はストレプトキナーゼ等のフィブリンに特異的な酵素を、上記で論じた酵素の適用法の１つを用いて投与する。移植片を移植するために、宿主アイは、出血及び外科的外傷を減少させるように製造する。網膜下空間のトランス鞏膜(transcleral)／トランス脈絡膜(transc horoidal)外科的アプローチは、適切なアプローチの例であり、トランス角膜(tr anscorneal)アプローチ等の他の外科的アプローチも利用することができると理解されるであろう。ヒトにおける好ましい外科的アプローチ、図４は、鞏膜及び脈絡膜７８における十分なサイズの横径切開(tranverse incision)７０を作りだして、外科的器具２０の挿入を可能にすることを含む。器具２０は、図４に図示したように、鞏膜及び脈絡膜７８を通して鋸状縁７４に前進させる。器具は、網膜下から、網膜下空間中に眼球後極７６まで前進する際、網膜を剥離する。好ましくは、移植片を、鞏膜又は脈絡膜における適切なサイズの切開を通して輸送する際には、平らな広い横断面を有するエロンゲートチューブを含む器具を使用して、該移植片を保護用のエロンゲートチューブに取り込ませることができる。器具を、宿主アイの鋸状縁７４に前進させ、また、器具がルーメンを含む場合、網膜は、該ルーメンから出た(eject)生理食塩水類似流体、カルボキシメチルセルロース、又は１〜２％ハイルロニックアシッド(hyluronic acid)等の灌流液の穏やかな力により剥離される。有利には、流体は、付加的に、酸化防止剤、炎症抑制剤、麻酔剤、又は宿主網膜の代謝要求を遅延させる薬剤を含んでいてもよい。器具がルーメンを含まない場合、網膜は、網膜下イリゲーション(irrigation) により、又は該器具の壁体により、外科的器具が、網膜下から、網膜下空間中に眼球後極７６まで前進する際に剥離される。移植片は、その後、該移植片を含むチューブを眼から後退(retract)させ、同時に該移植片を該チューブから穏やかに出す(eject)ことにより移植する。器具を、その後、眼から慎重に取り出す。網膜再結合(reattachment)が直ちに起こり、単層ＲＰＥ細胞が、網膜と脈絡膜間のサンドイッチ様配置における部分に保持される。切開は、縫合を必要としてもよい。図５は、上述したトランス鞏膜及び脈絡膜アプローチに代わる方法として、トランス角膜外科的アプローチを描いたものである。入口の位置を除いては、外科的技術は、トランス鞏膜又は脈絡膜アプローチの略述されたものと本質的に同一である。図５に図示したように、横径切開７０を角膜７２に作り、移植片を含む器具２０を、虹彩下から、該角膜７２を通して鋸状縁７４に前進させる。虹彩は、例えば、局所性アトロピンにより拡大されるべきである。角膜切開の先端は、ヒーリング(healing)を可能にすることが必要とされるのなら、アバット(abut) 及び縫合する。齧歯動物についてのトランス角膜アプローチが好ましく、なぜなら、それは、出血及び外科的外傷を減少させることが知られているからである。さもなければ、視力を害し得る角膜の悪影響を避けるために、ヒトについてのトランス鞏膜又は脈絡膜アプローチが好ましい。更なる外科的アプローチは、パーズプラナ(pars planna)領域においてジアテルミーで治療して、出血を除去する。鞏膜を、その後、切開し、脈絡膜及び全ての天然上皮組織をジアテルミーで治療する。外科的器具を、その後、切開を通して挿入し、網膜を鋸状縁でインターセプトし、移植片を、本明細書の他の部分に略述されたような他の方法で網膜下領域に堆積させる。また更なる外科的アプローチにおいて、上記に略述したようにパーズプラナ領域を通して入口を設け、切開を、網膜斑(retinal macula)付近の網膜に作る。外科的器具を、その後、レティノトミー(retinotomy)により、斑領域に挿入する。本発明に使用する支持体組成物の製造に関連して先に論じたように、移植後、移植片を、所定の条件への暴露（熱、選択された酵素又は体液への暴露等）する。適切な程度の暴露により、サポート組成物が散逸され、又は宿主の眼の通常眼組織の機能及びＲＰＥ細胞の移植集団(population)を他の方法で妨害する。以下の実施例により、本発明を説明する。実施例１実験動物及び材料ＲＰＥ細胞を、提供されたヒトの眼（ミズーリライアン(Missouri Lions)及びセントルイスアイバンク(St．Luois Eye Banks)から入手した）の角膜の除去に次いで、網膜下の領域から採取した。宿主は、シクロスポリンＡで免疫抑制した（10mg/kg/日腹膜内注射）成熟白子症（albino）ラットであった。ＲＰＥ細胞の収集角膜除去の直後に、眼を視神経幹によりアイケージの中へ留め、アイジャーの中に置いた。該ジャーは、５％胎児牛血清を補充した冷ダルベッコ改良基礎培地 (Delbecco's modified essential medium(DMEM))で最大限に満たした。眼を滅菌状態で処理した。ゆるく結合した組織及び筋肉を注意深く眼から切取った後、滅菌プレート上に垂直に置き、付着した硝子体を伴った先の断片をアイカップから持ち上げた。ペトリ皿中で、眼が置かれたフラットを持つオプティクディスクに向けて、放射状に４つのスリットを切った。神経網膜をその後、オプティクディスクで分離して除去した。そのシェルをCa⁺⁺及びMg⁺⁺を含まないハンクの平衡塩溶液(Hanks' balanced salt solution)で洗浄して、３7℃で３０分間0.25%トリプシンで処理した。該トリプシン溶液を該シェルから吸引して、DMEM(GIBCO)を加えた。パスツールピペットの磨かれたチップでＲＰＥ細胞の表面を穏やかにブラッシングし、シェル中の培養培地をピペットで取ることによってブルック膜(B ruch's membrane)から細胞を離した。ＲＰＥ細胞の培養ガラス培養チャンバースライドをシグマ社（セントルイス）から得た液状コラーゲンでコーティングすることによって用意した。該コラーゲンは約150ミクロンの厚さで固まることが可能であった。３×10⁵のＲＰＥ細胞を、用意したスライドの上へパスツールピペットを使用して置いた。その後、該ＲＰＥ細胞を20% 胎児牛血清（シグマ社、セントルイス）を補充したDMEM + F12（1:1，GIBCO）の中でインキュベートした。ＲＰＥ細胞のコンフルエントな単層が培養されるまで、その培養培地を３〜４日毎に交換した。コラーゲンに積層されたＲＰＥ細胞の単層を含む移植組織を培養チャンバースライドから除去し、移植のために約２mm ×４mmのシートに切り取った。外科的手順高さ0.5mmの内腔を持つ幅が2.5mmの手術用器具の挿入が可能となるのに十分な横筋の切開を角膜に行った。該器具は、虹彩（局所アトロピンで拡大している）の下で鋸状縁へ前進させ、網膜を引き離した。そのキャリヤーをその後、網膜の下で網膜下の空間内へ入れて眼の後極まで進めた。その器具は、150mmのコラーゲン基体(2.5×4mmまで)に並列したＲＰＥ細胞の単層を含む移植組織を、その手術用器具の撤回と同時のプランジャーの前進によって該網膜空間へ導くことができた。該器具を次いで除去した。器具の除去の後、角膜切開した縁を迅速で縫い目のない治癒のために寄せた。回復する間、眼を隠し、ペニシリンの予防薬量を投与した。パッチの除去とともに、獣医学的な眼病用の抗生物質軟膏を適用した。移植受容体を５０ルクスの平均光強度で１２時間／１２時間の明／暗サイクルに維持した。適当な救命時間に次いで、該動物にペントバルビタールを過投薬した。図６は、除かれた角膜、瞳孔及び水晶体とともに、移植後２週間の網膜の下に位置する移植したＲＰＥ細胞の単層の外観を示す。矢印は移植組織の端を示す。組織学的調製組織学的評価のため、ＲＰＥ細胞移植組織を持つラットの眼を５時間、ボウイン溶液（Bouin's solution）に浸漬固定し、その後、勾配をつけたエタノールのシリーズで脱水した。移植網膜の移植領域を含むように、その眼をかみそり刃で切取り、その後、キシレンで処理しパラフィンに包埋した。８mmの切片に切り、ヘマトキシリン及びエオジンで染色した。結果経角膜的な手法(transcorneal approach)を使用することによって、宿主の網膜と、隣接する眼の繊毛膜様組織層の間のＲＰＥ細胞の単層の位置付けが、血管へのダメージ及び続く眼の中への出血を最小限にしながら達成され得たことが見出された。加えて、この手法が網膜の一体性を破壊することがないようであり、網膜と繊毛膜の間にはさまれている移植されたＲＰＥ細胞で、眼の後方へ再付着することが見出された。この挿入方法を使用して、網膜（図７）の後極の真下にＲＰＥ細胞を位置させることが可能であった。移植されたＲＰＥ細胞の生体適合性を評価するために、パラフィン切片(8mm) を、ＲＰＥ細胞移植を受けた移植後２週間、４週間及び３ヶ月の眼から作成した。試験されたすべての時期で（１２移植体のうち１０）、ＲＰＥ細胞単層が移植されて生存することが見出された。免疫抑制により、これまで試験したすべての生存時間において（２週間〜３ヵ月）、移植の成功が見られ、図７に示すように、ＲＰＥの宿主の眼との外観上物理的な一体化を示し、その形態的特徴を維持していた。図７は、成人ドナーからのヒトＲＰＥ細胞の単層の成熟ラット宿主への移植を示している。（Ｔ、トランス移植）。４０倍。移植してから２週間後に作成したパラフィン切片を、図７および８に示す。図７は、宿主の眼の後極の矢尻間のＲＰＥ単層移植組織（Ｔ）の位置を示す低出力顕微鏡写真である。光受容体細胞の外セグメントと脈絡膜の間に実質的に単層で保持された、ＲＰＥ細胞の正常な外観と正常な網膜配置が維持されていることに注目されたい。図８は、移植組織と隣接する網膜の間の界面を詳細に示す高出力顕微鏡写真である。図８に示すように、光受容体外セグメントは、移植されたＲＰＥ細胞の先端の微絨毛突起（Ａ）に対して正しく並んでいることがわかる。移植されたＲＰＥ細胞と再構築された網膜の機能を、光受容体の維持、並びに移植されたＲＰＥ細胞の先端突起に対して正しく配置された内および外セグメントの存在により確認した。ＲＰＥ細胞の単層を移植するこれらの操作の成功は図７および８に反映されている。実施例２比較として、成熟したヒトＲＰＥ細胞を、Exp．Eye Res.,47:911(1988)のリー (Li)とターナー(Turner)により述べられているような薬剤導入方法を使用して分離形態で移植した。実施例１で実施した移植片に使用したものと同じドナー組織から得たＲＰＥ細胞を収集し、実施例１で述べたように培養した。培養後、リーとターナーの薬剤導入法の移植用分離ＲＰＥ細胞を形成するために、ＲＰＥ細胞をトリプシン処理した。宿主は、実施例１で述べたシクロスポリンＡ（10mg/kg/ day IP導入）で免疫抑制した成人白皮症ラットであった。移植の宿主は、平均光強度50ルックスで、12時間／12時間の明／暗のサイクルに維持した。適当な生存時間の後、該動物にペントバルビタールを過剰投与した。次にＲＰＥ細胞移植片の入った眼のパラフィン切片を切断（８mm）した。移植２週間後に作ったパラフィン切片を図９及び図10に示す。図９は、宿主の眼の後極における分離ＲＰＥ細胞の導入位置を表す、低解像(low-power)の顕微鏡写真である。網膜剥離(RD)、網膜襞(retinal pucker)(RP)、網膜下繊維症(sub retinal fibrosis)(SF)、及び網膜斑紋(retinal rosette)(RR)の形成を含む病理学的な形状が注目される。図10は、隣接する網膜、網膜下繊維症及び網膜襞中へのＲＰＥ細胞の病理学的侵入(pathological invasion)を詳細に表す高解像(high er-power)の顕微鏡写真である。前述の記載から、当該技術分野で技能を有する者は、本発明の全ての局面が実現されることを理解するであろう。本発明は、ＲＰＥ細胞移植の際の細胞組織の提供に適する、改良された外科的移植片を提供する。本発明の移植片とともに、ＲＰＥの移植中及び移植後にわたって細胞組織は維持される。上述のように、本発明の幾つかの目的が達成され、他の利点が得られるとわかるであろう。本発明の範囲から逸脱することなく前述の構成及び方法で様々な変更が行われるので、前述中に含まれ又は添付図面で示される全ての態様は、実施例と解され、制限する意味に解すべきではない。

Claims

【特許請求の範囲】１．宿主の眼の網膜下領域への移植の為のＲＰＥ細胞集団の調製方法であって、 (a) ＲＰＥ細胞を含むドナー組織を用意し、 (b) 該ドナー組織からＲＰＥ細胞を採取し、そして (c) 採取したＲＰＥ細胞を、単層として、非毒性の、可撓性支持体に付着させる工程を含み、該支持体が、網膜下領域への移植並びに一組の予め決められた条件への曝露で、宿主及び移植した集団の眼の正常な眼組織機能を妨害しないものであることを特徴とする方法。２．採取したＲＰＥ細胞を培養する工程を更に含む、請求の範囲１項記載の調製方法。３．ドナー組織が、成熟ＲＰＥ細胞を含む、請求の範囲１項記載の調製方法。４．ドナー組織が、宿主に対して自己由来である、請求の範囲１項記載の調製方法。５．支持体が、厚さ約100 μより薄いコラーゲン層を含む、請求の範囲１項記載の調製方法。６．採取したＲＰＥ細胞が、頂端及び基底面を有し、支持体が、更にコラーゲンの基体とゼラチンの被覆層を含み、採取したＲＰＥ細胞の基底面がコラーゲンに付着し、採取したＲＰＥ細胞の頂端面がゼラチンに付着する、請求の範囲１項記載の調製方法。７．採取したＲＰＥ細胞が頂端面を有し、支持体へのＲＰＥ細胞の付着が、ＲＰＥ細胞の頂端面を支持体へ接触させる事を更に含む、請求の範囲１項記載の調製方法。８．該支持体が、熱、体液又は酵素作用への曝露で劣化する物質を含む、請求の範囲１項記載の調製方法。９．該支持体が、網膜下領域での移植組織片の位置決め後に、該支持体の少なくとも一部を破壊するのに使われる酵素を更に含む、請求の範囲１項記載の調製方法。 10．酵素が、徐放剤に混入されている、請求の範囲９項記載の調製方法。 11．該徐放剤が、生分解性重合体である、請求の範囲10項記載の調製方法。 12．該徐放剤が、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリラクチド−コ−グリコライド及びエチレン−酢酸ビニル共重合体から成る群から選ばれる、請求の範囲10項記載の調製方法。 13．該支持体が、厚さ約１μ〜約100 μのコラーゲン層で被覆したアガロースのシートを含み、採取したＲＰＥ細胞を、移植前にコラーゲンに付着させる、請求の範囲１項記載の調製方法。 14．該支持体が、徐放剤に混入されたアガロースを更に含む、請求の範囲13項記載の調製方法。 15．該支持体が、フィブリンを含む、請求の範囲１項記載の調製方法。 16．該支持体が、組織プラスミノーゲン活性化因子、ウロキナーゼ又はストレプトキナーゼから成る群から選ばれる、請求の範囲15項記載の調製方法。 17．該支持体が、栄養因子、免疫抑制剤、抗炎症剤、抗血管形成因子、抗グリア剤又は抗有糸分裂因子の１つ以上を含む、請求の範囲１項記載の調製方法。 18．宿主の眼の網膜下領域への移植の為のＲＰＥ細胞集団の調製方法であって、 (a) ＲＰＥ細胞を含むドナー組織を用意し、 (b) 該ドナー組織からＲＰＥ細胞を採取し、 (c) 採取したＲＰＥ細胞を、ＲＰＥ細胞の単層の付着と成長の為に適した基体上で培養し、 (d) 培養したＲＰＥ細胞の単層を、基体から除去し、そして (e) 培養したＲＰＥ細胞の単層を、非毒性の、可撓性支持体に付着させる工程を含み、該支持体が、網膜下領域への移植並びに一組の予め決められた条件への曝露で、宿主及び移植した集団の眼の形状な眼組織機能を妨害しないものであることを特徴とする方法。 19．基体がアガロースを含み、該基体から前記単層を除去する工程が、アガロースをアガラーゼに接触させることを含み、前記支持体がゼラチンを含み、かつ支持体に対し単層を並置する工程が、該単層をゼラチンの溶融溶液と接触させること、及び該ゼラチンを冷却して硬化させることを含む、請求の範囲18項記載の方法。 20．ＲＰＥ細胞の単層と、網膜下領域に移植し、かつ前もって決めた条件に暴露した場合に、正常な眼組織機能を妨げない、非毒性可撓性支持体との積層を含む、宿主の眼に移植するための移植組織。 21．前記ＲＰＥ細胞が、さらに成熟ＲＰＥ細胞を含む、請求の範囲16項記載の移植組織。 22．前記ＲＰＥ細胞が宿主に対して自己由来である、請求の範囲16項記載の移植組織。 23．前もって決めた条件が、熱、体液又は酵素作用に暴露し、該組成物の少なくとも一部を分解するものである、請求の範囲20項記載の移植組織。 24．前記支持体が、熱、体液又は酵素作用への暴露により分解し得る材料を含む、請求の範囲20項記載の移植組織。 25．さらに前記支持体が、網膜下領域に移植組織を植えた後、支持体の少なくとも一部を分解するのに適した酵素を含む、請求の範囲20項記載の移植組織。 26．酵素が徐放剤と組み合わされている、請求の範囲25項記載の移植組織。 27．前記徐放剤が、生分解性ポリマーである請求の範囲26項記載の移植組織。 28．前記徐放剤が、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリラクチド−共−グリコリド及びエチレン−ビニルアセテート共重合体からなる群より選ばれる、請求の範囲26項記載の移植組織。 29．前記支持体が、厚さ約100 ミクロン未満のコラーゲンの層である、請求の範囲20項記載の移植組織。 30．ＲＰＥ細胞の単層が、舌尖かつ基底の表面を有し、前記支持体がさらに、コラーゲンの基体及びゼラチンのオーバー層を含み、かつＲＰＥ細胞の単層の基底表面が、前記コラーゲンに積層しており、かつＲＰＥ細胞の単層の舌尖表面が前記ゼラチンに積層している、請求の範囲20項記載の移植組織。 31．前記支持体が、厚さ約１〜約100 ミクロンのコラーゲンの層で被覆されているアガロースのシートを含む、請求の範囲20項記載の移植組織。 32．前記支持体が、さらに徐放剤に組み込まれたアガラーゼを含む、請求の範囲 31項記載の移植組織。 33．前記支持体が、フィブリンを含む、請求の範囲20項記載の移植組織。 34．前記支持体が、組織プラスミノーゲンアクチベータ、ウロキナーゼ、及びストレプトキナーゼからなる群より選ばれる酵素を含む、請求の範囲33項記載の移植組織。 35．前記支持体が、栄養因子、免疫抑制剤、抗炎症剤、抗アンジオゲニック（an ti-angiogenic）ファクター、抗膠剤又は抗有糸分裂因子の１種以上を含む、請求の範囲20項記載の移植組織。 36．下記の工程を含む、宿主の眼の網膜下領域にＲＰＥ細胞の単層を移植する方法： (a) ＲＰＥ細胞の単層と、網膜下領域に移植し、かつ前もって決めた条件に暴露した場合に、正常な眼組織機能を妨げない、非毒性可撓性支持体との積層を含む移植組織を調製する工程、 (b) 宿主の眼に切開部をつくる工程、及び (c) 網膜を少なくとも部分的に剥離して、網膜下領域に近づくことを可能にする工程 (d) 接近した網膜下領域に、前記移植組織を移植する工程。 37．前もって決めた条件が、支持体を、熱、体液又は酵素作用に暴露することを含む、請求の範囲36項記載の方法。 38．宿主の眼の網膜下領域に、支持体の少なくとも一部を分解する酵素を入れる、請求の範囲36項記載の移植方法。