WO2011142364A1 - 細胞シート作製方法 - Google Patents

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WO2011142364A1
WO2011142364A1 PCT/JP2011/060778 JP2011060778W WO2011142364A1 WO 2011142364 A1 WO2011142364 A1 WO 2011142364A1 JP 2011060778 W JP2011060778 W JP 2011060778W WO 2011142364 A1 WO2011142364 A1 WO 2011142364A1
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cells
cell
retinal pigment
sheet
pigment epithelial
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政代 高橋
力 安川
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独立行政法人理化学研究所
公立大学法人名古屋市立大学
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    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
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    • A61L27/38—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells
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    • A61P27/02—Ophthalmic agents
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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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    • A61L2430/00—Materials or treatment for tissue regeneration
    • A61L2430/16—Materials or treatment for tissue regeneration for reconstruction of eye parts, e.g. intraocular lens, cornea

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing a cell sheet using a flat substrate, and particularly to a method for producing a retinal pigment epithelial sheet.
  • the present invention also relates to a method for producing a Bruch film using a planar substrate.
  • Age-related macular degeneration is currently one of the leading causes of legal blindness in developed countries and is mainly found in elderly people over 50 years of age.
  • Age-related macular degeneration is a disease caused by age-related changes in the macula, and is roughly divided into exudative type and atrophic type.
  • Exudative age-related macular degeneration is a disease in which neovascularization occurs in the macular of the elderly from the choroid, causing bleeding or exudative lesions in the subretinal or subretinal area of the retina, and finally forming scar tissue.
  • Atrophic age-related macular degeneration is a disease accompanied by macular atrophy and drusen accumulation.
  • precursor lesions that lead to exudative and atrophic age-related macular degeneration are sometimes referred to as early age-related macular degeneration, and this lesion is also considered to be a pathological condition of age-related macular degeneration.
  • Treatment of age-related macular degeneration is, in the case of mild exudation, surgical treatment such as photodynamic therapy, laser photocoagulation, neovascularization, or vascular endothelial growth factor (angular neovascular growth factor). It is possible to select a treatment method for the purpose of regression / removal of new blood vessels by pharmacotherapy such as administration of an inhibitor against factor (VEGF).
  • VEGF inhibitor against factor
  • RPE retinal pigment epithelium
  • transplanting retinal pigment epithelial cells or retinal pigment epithelium into a defect site under the retina is an effective treatment method (Patent Documents 1 and 2).
  • retinal pigment epithelial cells When cells are used for transplantation, examples of retinal pigment epithelial cells include retinal pigment epithelial cells isolated and cultured from donor fetal eyeballs, iris pigmented epithelial cells isolated and cultured from the patient's own eyeballs, and scratches during surgery. Examples include collected retinal pigment epithelial cells.
  • retinal pigment epithelial cells When another person's cells are used as a donor, there is a concern about rejection to the patient, and even if the patient's own cells are used, it is not therapeutically preferable to use different cell types for transplantation.
  • transplantation of separated and cultured cells has a problem in engraftment rate and cannot function sufficiently as an epithelium.
  • Non-patent Document 1 a retinal pigment epithelium sheet cultured on a tissue or an artificial sheet composed of retinal pigment epithelium-Bruch's membrane-choroid as a retinal pigment epithelium for transplantation.
  • the sheet becomes an epithelial engraftment and a functional maintenance disorder in the living body.
  • transplantation of retinal pigment epithelial cells (Non-patent Document 1) or artificial sheets using iPS cells has also been studied and attempts have been made to solve antigenic problems.
  • the problem of obstacles to maintaining functions in the living body still remains, and the creation of a retinal pigment epithelium that is therapeutically effective and easy to prepare for age-related macular degeneration has become a problem.
  • An object of the present invention is to develop a new method for easily producing a cell sheet derived from a mammal without using an artificial sheet, and to provide it to an object requiring tissue transplantation.
  • it is to provide an epithelium for transplantation having a high engraftment rate and excellent functionality in age-related macular degeneration accompanied by a defect of the retinal pigment epithelium.
  • the base of the cells is formed on the contact surface side with the dish.
  • the inventors of the present invention have cultivated retinal pigment epithelial cells separated and cultured from human eyeballs in a three-dimensional aggregation rather than on a flat substrate, that is, when spheroids are cultured, It was discovered that cells existing inside die by apoptosis, and Bruch's membrane is formed on the surface of the cell mass in contact with serum (data not shown). It was also found that the cell surface was differentiated as a retinal pigment epithelium.
  • the inventors have differentiated into epithelium without inducing cell dedifferentiation in an environment where intercellular adhesion occurs preferentially over extracellular matrix even in normal planar culture, and The possibility of forming a Bruch's membrane on the serum contact surface is examined, and a Bruch's membrane is formed on the opposite side of the normal surface, that is, on the contact surface with serum, by culturing the retinal pigment epithelial cells in a high density state. I found out. Further, it has been found that in such culture, retinal pigment epithelial cells do not dedifferentiate but differentiate as epithelium. As a result of intensive studies, the present inventors have completed the present invention from these findings.
  • the present invention [1] A method for producing a cell sheet, comprising the following steps; (1) a step of preparing a mammal-derived cell; (2) The method of the above-mentioned [1], wherein the prepared cells are seeded at a high density on a flat substrate and cultured [2]
  • the mammal-derived cells are epithelial cells or endothelial cells.
  • the mammal-derived cells are selected from the group consisting of corneal endothelial cells, tracheal epithelial cells, gastrointestinal epithelial cells, cervical epithelial cells, corneal epithelial cells, and retinal pigment epithelial cells.
  • step (1) the mammal-derived cell is a retinal pigment epithelial cell
  • step (2) the high density is a density equal to or higher than the cell density observed in a normal eyeball
  • step (3) The method according to [6] above, wherein the density equal to or higher than the cell density observed in a normal eyeball is at least 4,000 cells / mm 2 ;
  • step (3) Step of confirming the presence or absence of expression of a differentiation marker in the cultured cells obtained in step (2)
  • step (3) the differentiation markers are bestrophin-1, RPE-65,
  • a cell sheet having a structure in which the basement membrane is exposed in which the layer structure is reversed from that obtained by a normal culture method.
  • the cell sheet of the present invention can be brought into contact with the tissue to be transplanted without turning the sheet upside down, so that the transplanting operation can be simplified and the engraftment rate is excellent.
  • a retinal pigment epithelial cell sheet can be easily prepared by planar culture, and can be transplanted to an age-related macular degeneration patient.
  • the cells used for culturing are retinal pigment epithelial cells derived from iPS cells, the rejection reaction during transplantation can be avoided by using the patient's own cells.
  • the photographic image and the stained image when human retinal pigment epithelial cells are seeded at 20,000 cells / mm 2 are shown.
  • A Cytophotographic image on day 0 after seeding
  • B Hard drusen photographic image on day 1 after seeding
  • C Cellular photographic image on day 1 after seeding
  • D Bruch membrane photographic image on day 1 after seeding
  • E Cell nucleus staining image 1 day after seeding
  • F Bruch membrane actin staining image 1 day after seeding
  • the figure of the Western blotting which confirmed the expression of each marker protein of RPE-65, occludin, cytokeratin-18, ZO-1, type 4 collagen, and elastin about the protein extracted from the human retinal pigment epithelial sheet
  • seat is shown.
  • the scanning electron microscope image of a human retinal pigment epithelial sheet is shown. Arrows are collagen fibers and elastic fibers.
  • the lower right of the figure is an exposed basal indentation (basal microvilli) diagram.
  • the present invention provides a method for producing a cell sheet including the following steps. (1) a step of preparing a mammal-derived cell; (2) A step of seeding and culturing the prepared cells on a flat substrate at a high density
  • the mammal-derived cells prepared include mammals (eg, human, monkey, mouse, rat, dog, cow, horse, pig, sheep, goat, cat, rabbit, hamster, guinea pig, etc.) As long as it is a cell derived from any mammal, it may be a cell derived from any mammal, but is preferably a cell derived from a human.
  • mammals eg, human, monkey, mouse, rat, dog, cow, horse, pig, sheep, goat, cat, rabbit, hamster, guinea pig, etc.
  • cells having either epithelial or endothelial adhesive properties are preferably used.
  • liver cells that are liver parenchymal cells, Kupffer cells, endothelial cells such as vascular endothelial cells and corneal endothelial cells, fibroblasts, osteoblasts, osteoclasts, periodontal ligament-derived cells, Epidermal cells such as epidermal basal cells, tracheal epithelial cells, gastrointestinal epithelial cells, cervical epithelial cells, conjunctival epithelial cells, corneal epithelial cells, iris pigment epithelial cells, epithelial cells such as retinal pigment epithelial cells, breast cells, pericytes , Muscle cells such as smooth muscle cells and cardiomyocytes, kidney cells, pancreatic Langerhans islet cells, nerve cells such as peripheral nerve cells and optic nerve cells, chondrocytes, bone cells, etc., preferably corneal endothelial cells
  • the cells to be prepared may be primary cells collected directly from tissues or organs, or may be passaged from one or more generations. Furthermore, these cells are pluripotent stem cells such as embryonic stem cells (ES cells) which are undifferentiated cells, mesenchymal stem cells having multipotency, or vascular endothelial progenitor cells having unipotency. It may be a cell obtained by inducing differentiation of a stem cell containing The ES cell may be an ES cell produced by nuclear reprogramming from a somatic cell. In addition, target cells may be prepared by inducing differentiation of recently reported induced pluripotent stem cells (iPS cells).
  • iPS cells induced pluripotent stem cells
  • An iPS cell can be prepared by introducing a specific nuclear reprogramming substance (nucleic acid, protein, low molecular weight compound, etc.) into a somatic cell, and is an artificial cell derived from a somatic cell having characteristics equivalent to those of an ES cell.
  • a specific nuclear reprogramming substance nucleic acid, protein, low molecular weight compound, etc.
  • Stem cells [Takahashi, K. And Yamanaka, S. , Cell, 126: 663-676 (2006); Takahashi, K .; Et al. , Cell, 131: 861-872 (2007)].
  • Conditions / medium for differentiating the stem cells into target differentiated cells may be according to conventionally known conditions / medium, or may be appropriately set by those skilled in the art.
  • the somatic cell to be transplanted is used as a source of iPS cells, whereby the resulting cell sheet becomes a cell sheet having no antigenicity to the subject.
  • iPS cells is preferred.
  • the mammal-derived cell prepared by the present invention is a retinal pigment epithelial cell
  • the mammal is the same as described above, but is preferably a human.
  • the retinal pigment epithelial cells are stem cell-derived differentiated cells or eyeball-derived cells. Eye-derived retinal pigment epithelial cells, after cadaveric enucleation, quickly split the eyeball at the equator, remove the vitreous and retina, and then release the cells from the Bruch's membrane by scraping with a cell scraper or with trypsin or EDTA solution.
  • the cells After being collected, the cells are allowed to stand in the culture medium to induce the adhesion and proliferation to the culture dish, thereby proliferating a necessary amount of cells and appropriately subcultured by trypsin treatment or the like to secure the number of cells.
  • stem cells When stem cells are induced to differentiate, human ES cells or iPS cells are cultured in an ES cell differentiation medium supplemented with Dkk-1 (Wnt antagonist) and Lefty A (Nodal antagonist).
  • Dkk-1 Wnt antagonist
  • Lefty A Nodal antagonist
  • step (2) the prepared cells are seeded at a high density on a flat substrate and cultured, whereby a cell sheet can be prepared.
  • the planar substrate in the present specification is not particularly limited as long as it is for cell culture.
  • a flask, a flask for tissue culture, a dish, a petri dish, a tissue culture dish, a multi-dish, a microplate, a microwell plate, Multiplate, multiwell plate, chamber slide, petri dish, tube, tray, culture bag, and roller bottle are mentioned.
  • planar substrate examples include inorganic materials such as metal, glass, ceramic, and silicon, elastomers, and plastics (for example, polyester resins, polyethylene resins, polypropylene resins, ABS resins, nylons, acrylic resins, fluorines). Resin, polycarbonate resin, polyurethane resin, methylpentene resin, phenol resin, melamine resin, epoxy resin, and vinyl chloride resin) can be given, but not limited thereto.
  • the planar substrate may be subjected to a surface treatment for the purpose of improving adhesion with adhesive cells, but in order to facilitate the process of peeling the cell sheet of the present invention from the planar substrate, It does not have to be processed at all. When it has been treated, it may be surface treated with, for example, collagen, gelatin, matrigel, poly-L-lysine, poly-D-lysine, laminin, fibronectin and the like.
  • high density refers to a density equal to or higher than the cell density observed in normal tissue from which the prepared cells are derived.
  • the upper limit can be appropriately determined by those skilled in the art.
  • the upper limit is a density at which cells can be brought into close contact with each other, and is a cell density that does not cause sheet formation due to excessive seeding or cell death.
  • “high density” means, for example, about 1 to 100 times, preferably about 1.2 to 50 times, more preferably about 2.5 to 30 times the cell density observed in normal tissue.
  • the cell density is particularly preferably about 5 to 10 times.
  • the cell density observed in normal tissues but depends on the type of tissue, for example, in the corneal endothelium, 3,000 cells number / mm 2, the retinal pigment epithelial cells, is approximately 4,000 cells number / mm 2 .
  • “high density” means “a density higher than the cell density observed in a normal eyeball”. Specifically, such density is at least 4,000 cells / mm 2 or more.
  • the contraction force is exerted on the formed cell sheet itself.
  • the cell density is uneven, and the viability of the cells themselves cannot maintain the seeding area. This is probably because of this.
  • the “density higher than the cell density observed in a normal eyeball” is preferably about 5,000 cells / mm 2 when the formed cell sheet is allowed to shrink from the area at the time of seeding. As mentioned above, More preferably, it is about 10,000 cells / mm ⁇ 2 > or more, and when maintaining the area at the time of seeding in the formed cell sheet, Preferably it is about 20,000 cells / mm ⁇ 2 > or more.
  • the upper limit is a density that does not induce sheet formation failure due to excessive cell seeding, and does not induce some cell death.
  • the “density higher than the cell density observed in a normal eyeball” is preferably 5,000 cells / mm 2 to 200,000 cells / mm 2 , more preferably The number is 10,000 cells / mm 2 to 120,000 cells / mm 2 , particularly preferably 20,000 cells / mm 2 to 40,000 cells / mm 2 .
  • a single-layer cell population can be formed by culturing the cells seeded at a high density in a culture solution.
  • Any culture medium can be used without particular limitation as long as it is a cell culture medium usually used in the art.
  • F-10 medium, F12 medium, MEM, BME medium, DMEM, ⁇ MEM, IMD medium, ES medium, DM-160 medium, Fisher medium, WE medium and RPMI 1640 medium, etc. Asakura Shoten A basal medium as described in page 581 of “Tissue Culture Technology 3rd Edition” published by the Japanese Society for Tissue Culture can be used.
  • serum such as fetal bovine serum
  • various growth factors such as fetal bovine serum
  • antibiotics such as antibiotics, amino acids and the like
  • the pH of the medium is preferably about 6 to about 8.
  • the culture is usually performed at about 30 to about 40 ° C. for about 15 to about 60 hours. You may perform ventilation
  • a tight junction is formed between cells, and a basement membrane is formed on the side opposite to the side in contact with the planar substrate.
  • the side opposite to the side in contact with the planar substrate is the contact surface side between the cells and the serum.
  • Tight junction formation can be confirmed by observing the expression of hexagonal closely contacting cells and expression of occludin, ZO-1, etc. between cells by immunostaining.
  • Formation of the Bruch's membrane including the basement membrane can be confirmed by observing the expression on the cell surface of elastin, type 1 collagen, type 4 collagen or the like by immunostaining, or by observation with a scanning electron microscope.
  • the mammal-derived cell prepared by the present invention is a retinal pigment epithelial cell, it may further include the following step (3).
  • step (3) A step of confirming the presence or absence of expression of a differentiation marker in the cultured cells obtained in step (2)
  • step (3) it can be determined that the cell sheet has been completed by confirming the presence or absence of expression of the differentiation marker in the cultured cells obtained in step (2).
  • the differentiation marker may be expressed in any part of the cell (for example, cytoplasm, cell membrane, nuclear membrane, etc.), but is preferably expressed on the contact surface side of the seeded cell and serum. Target marker.
  • differentiation marker refers to a transcription product of a gene that is specifically expressed in differentiated cells or whose expression is amplified or attenuated compared to other differentiated cells, undifferentiated cells, or progenitor cells. , Translation products or degradation products thereof.
  • genes include tubulin (particularly ⁇ -tubulin), MAP2, neurofilament, neuron-specific enolase as a neuronal differentiation marker, aP2, glycerophosphate dehydrogenase as an adipocyte differentiation marker, Adipsin, leptin, osteoblast differentiation markers include procollagen 1 ⁇ 1, RUNX2, alkaline phosphatase, osteopontin, osteocalcin, retinal pigment epithelial cell differentiation markers include bestrophin-1 (VMD2), RPE-65, cytokeratin, occludin ZO-1, elastin, actin, type 1 collagen or type 4 collagen.
  • VMD2 bestrophin-1
  • RPE-65 cytokeratin
  • occludin ZO-1 elastin
  • actin type 1 collagen or type 4 collagen.
  • a sample used for “confirmation of the presence or absence of expression of a differentiation marker” a sample containing a differentiation marker (eg, RNA, protein, degradation product thereof, etc.) derived from the cells cultured in the step (2) is particularly useful. Not limited.
  • a differentiation marker eg, RNA, protein, degradation product thereof, etc.
  • the expression of the differentiation marker gene is prepared by preparing an RNA (eg, total RNA, mRNA) fraction from the cells cultured in step (2), and the marker gene contained in the fraction. It can be examined by detecting the transcription product or directly detecting the marker gene product in the cell without extracting RNA from the cell.
  • RNA eg, total RNA, mRNA
  • the RNA fraction can be prepared using a known method such as guanidine-CsCl ultracentrifugation or AGPC.
  • an extraction kit eg, RNeasy Mini Kit; manufactured by QIAGEN, etc.
  • high-purity total RNA can be prepared quickly and easily from a small amount of sample.
  • a means for detecting the transcription product of the differentiation marker gene in the RNA fraction for example, a method using hybridization (Northern blot, dot blot, DNA chip analysis, etc.) or PCR (RT-PCR, competitive PCR, real-time PCR). Etc.).
  • Quantitative PCR methods such as competitive PCR and real-time PCR, can detect changes in the expression of multiple marker genes in a batch because they can quickly and easily detect changes in the expression of differentiation marker genes from a small amount of sample.
  • DNA chip analysis is preferable in that the quantitativeness can be improved by selecting a detection method.
  • a differentiation marker gene can be detected using a nucleic acid (probe) that can hybridize with a transcription product of the gene.
  • a nucleic acid include a nucleic acid that can hybridize with a transcription product of a differentiation marker gene under highly stringent conditions. “High stringent conditions” means, for example, a hybridization reaction at 45 ° C. in 6 ⁇ SSC (sodium chloride / sodium citrate), followed by one at 65 ° C. in 0.2 ⁇ SSC / 0.1% SDS. Cleaning more than once.
  • the nucleic acid may be DNA or RNA, or may be a DNA / RNA chimera.
  • DNA is used.
  • the nucleic acid used as the probe may be double-stranded or single-stranded. In the case of a double strand, it may be a double-stranded DNA, a double-stranded RNA or a DNA: RNA hybrid. In the case of a single strand, an antisense strand can be used.
  • the length of the nucleic acid is not particularly limited as long as it can specifically hybridize with the target nucleic acid, and is, for example, about 15 bases or more, preferably about 30 bases or more.
  • the nucleic acid is preferably labeled with a labeling agent in order to enable detection and quantification of the target nucleic acid.
  • a radioisotope for example, an enzyme, a fluorescent substance, a luminescent substance, or the like is used.
  • the radioisotope for example, [ 32 P], [ 3 H], [ 14 C] and the like are used.
  • the enzyme a stable enzyme having a large specific activity is preferable.
  • ⁇ -galactosidase, ⁇ -glucosidase, alkaline phosphatase, peroxidase, malate dehydrogenase and the like are used.
  • the fluorescent substance for example, fluorescamine, fluorescein isothiocyanate and the like are used.
  • luminescent substance for example, luminol, luminol derivatives, luciferin, lucigenin and the like are used.
  • biotin- (strept) avidin can also be used for binding between the probe and the labeling agent.
  • RNA fraction prepared as described above is separated by gel electrophoresis, then transferred to a membrane such as nitrocellulose, nylon, polyvinylidene difluoride, and prepared as described above.
  • a membrane such as nitrocellulose, nylon, polyvinylidene difluoride, and prepared as described above.
  • Each hybridization marker was measured by measuring the amount of label bound to the membrane by an appropriate method after hybridization in the above-mentioned “hyperstringent conditions” in a hybridization buffer containing the labeled probe.
  • the expression level of the gene can be measured.
  • dot blots the expression level of each marker gene is measured by subjecting the membrane on which the RNA fraction is spotted to the hybridization reaction in the same manner (respectively for each marker gene), and measuring the amount of label on the spot. be able to.
  • cDNA in which an appropriate promoter such as T7 promoter is introduced is synthesized from the RNA fraction prepared as described above by reverse transcription, and further cRNA is synthesized using RNA polymerase (this)
  • a labeled cRNA is obtained by using a mononucleotide labeled with biotin or the like as a substrate).
  • the labeled cRNA is brought into contact with the above-described probe on which the probe is immobilized and subjected to a hybridization reaction, and the expression level of each differentiation marker gene is measured by measuring the amount of label bound to each probe on the solid phase. be able to.
  • This method is more advantageous in terms of rapidity and simplicity as the number of differentiation marker genes to be detected (and hence immobilized probes) increases.
  • in situ hybridization can be used as the detection means.
  • the cells instead of extracting RNA from the cells, the cells are fixed by treating the cells with a fixative, preferably a precipitation fixative such as acetone, or by incubating in a buffered formaldehyde solution for a short time. After fixation, the cells are embedded in paraffin to form a block, and a slice can be cut off and used as a sample. Well-prepared paraffin-embedded samples can be stored for many years at room temperature.
  • the nucleic acid used as the probe the same nucleic acid as described above can be used.
  • In situ hybridization is preferably used in the present invention in that the expression of the differentiation marker can be directly confirmed on the serum contact surface of the cell.
  • the expression of the differentiation marker gene in the cultured cells in the step (2) is confirmed by preparing a protein fraction from the cell and obtaining the translation product of the marker gene (ie, marker protein) contained in the fraction.
  • the detection can be carried out by detecting the translation product of the marker gene directly in the cell without extracting the protein from the cell.
  • Marker protein can be detected by immunoassay (eg, ELISA, FIA, RIA, Western blot, etc.) using antibodies against each protein, or a protein exhibiting measurable physiological activity such as an enzyme. In, the physiological activity can also be measured by measuring each marker protein using a known method.
  • the marker protein can be detected using a mass spectrometry method such as MALDI-TOFMS.
  • the antibody with respect to each marker protein can be acquired according to the polyclonal antibody or monoclonal antibody preparation technique normally used by making this marker protein or this protein, or its partial peptide into a sensitizing antigen.
  • the cell sheet is a retinal pigment epithelial cell as described above, it may further include the following step (4).
  • step (4) A step of confirming the formation of Bruch's film on the side opposite to the side in contact with the planar substrate of the cell
  • the “Bruch's membrane” is a thin membrane between the retinal pigment epithelium and the choroid and is a layer that lines the retinal pigment epithelium. It is an acellular structure mainly composed of collagen fibers, and the choroid and pigment epithelial cells adhere to each other and play a role of a path for sending substances from the choroid to the outer retina without blood vessels.
  • Single-layer epithelium is very fragile and easily damaged during transplantation, and so far, cells were grown and used on substitute sheets such as artificial sheets and amniotic membranes. Is an obstacle to the biophysical phenomenon at the transplantation site.
  • the strength that can withstand the transplantation operation can be obtained by forming the original basement membrane made by the cell itself or the Bruch's membrane containing elastic fibers. Moreover, since the Bruch membrane of the present invention is formed on the side in contact with serum, it is easy to peel the sheet from the culture dish together with the Bruch membrane.
  • the present invention also provides a method for producing Bruch's membrane in vitro, characterized in that, in the method for producing a retinal pigment epithelial cell sheet, the formed Bruch's membrane is separated from the retinal pigment epithelial cell sheet.
  • the Bruch membrane formed on the retinal pigment epithelium can be peeled off and collected from the sheet by EDTA treatment or pipetting on the sheet surface with magnesium or calcium-free medium and suction operation. .
  • recovery are also possible by attracting
  • the present invention also relates to a cell sheet obtained according to the cell sheet preparation method, preferably a retinal pigment epithelial cell sheet.
  • the cell sheet of the present invention can be used for various uses such as screening use and toxicity test use as living body use.
  • the cell sheet of the present invention can be suitably transplanted to a subject requiring tissue transplantation as a transplant material for disease treatment.
  • the retinal pigment epithelial cell sheet of the present invention is suitable as a transplant material for retinal treatment to an eye disease patient.
  • eye diseases include age-related macular degeneration disease, retinitis pigmentosa, and the like.
  • the retinal pigment epithelial cell sheet of the present invention can also be used for various screening applications such as drug efficacy screening and toxicity evaluation for the eye diseases.
  • the cell sheet of the present invention can be applied to screening of toxic substances according to the method described in JP-T-2007-517210.
  • the retinal pigment epithelial cell sheet of the present invention is a retina in vivo such as functions relating to maintenance of photoreceptor cells such as phagocytic ability and neuroprotective action of photoreceptor outer segments, retinal vascular barrier function by tight junction, etc. It can also be used as a vitro model for evaluating various functions of pigment epithelial cells.
  • the transplant material for disease treatment of the present invention is the above-mentioned disease in humans, mammals other than humans (eg, monkeys, mice, rats, dogs, cows, horses, pigs, sheep, goats, cats, rabbits, hamsters, guinea pigs, etc.) Can be used to treat.
  • mammals other than humans eg, monkeys, mice, rats, dogs, cows, horses, pigs, sheep, goats, cats, rabbits, hamsters, guinea pigs, etc.
  • the range of applicable disease sites of the transplant material for disease treatment of the present invention can vary depending on the target disease, the animal species to be administered, age, sex, weight, symptoms, etc., for example, age-related macular degeneration
  • the range of the disease site to be transplanted is usually in the range of 0.07 cm 2 to 0.28 cm 2 .
  • the transplant material for disease treatment of the present invention may be transplanted at once or divided into several times.
  • the number of times of transplantation is determined according to medical personnel and guidelines according to the disease. For example, when the disease is age-related macular degenerative disease, the retinal pigment epithelial cell sheet of the present invention is determined according to its severity. You may transplant more than once. In the case of performing transplantation multiple times, the interval is not particularly limited, but a period of several days to several weeks may be set.
  • the transplant material for disease treatment of the present invention is transplanted according to an appropriate transplantation method in accordance with medical staff and guidelines.
  • thoracotomy or abdominal surgery can be applied to a treatment site in the chest or abdominal cavity, and an endoscopic technique can also be employed.
  • an endoscopic technique can also be employed.
  • transplanting a retinal pigment epithelial cell sheet as a transplant material for disease treatment of the present invention under the retina in addition to a transplantation method of placing on a water flow from an injection needle inserted into the transplantation site under the eyeball retina, dedicated transport It can also be done with a therapeutic instrument.
  • the present invention further provides a Bruch film obtained by the Bruch film production method. Since the Bruch's membrane of the present invention is a basement membrane that does not contain cells, it is less restrictive to transfer the Bruch's membrane than to transplant cells, and the practical hurdle is low. It is also useful for research purposes such as functional analysis.
  • RPE cells Human retinal pigment epithelial (RPE) cells (hRPECs) were collected from several donors within 48 hours after death. The cells were treated with Ham F-10 medium (10% fetal bovine serum, diagnostic medium (Glutamax II; Invitrogen) penicillin G (100 IU / mL), streptomycin (0.1 mg / mL), and amphotericin B (0.25 mg / L). )) And seeded on a 10 cm dish. Culturing was performed at 37 ° C. in a 95% air / 5% CO 2 atmosphere.
  • the diameter of one retinal pigment epithelial cell is 10 to 20 ⁇ m.
  • Cells / mm 2 which is considerably less than the cell density in the living body (about 4,000 cells / mm 2 ) and the cell density used in the main culture method (eg, 4 million cells, cell density 20,000 cells / mm 2 ). is there.
  • Example 1 Formation of human retinal pigment epithelial sheet
  • Retinal pigment epithelial cells collected from the eyeball were cultured, treated with 0.1% trypsin and 0.02% EDTA for 5 minutes, and collected with a pipette.
  • the collected RPE cells were centrifuged, the number was counted, and 1 million and 2 million cells were seeded on 4-well chamber slides (Lab-Tek) according to the above examination results (5,000 cells / mm 2 , 10, respectively). 000 cells / mm 2 ).
  • the sheet was formed, it contracted to 1/4 and 1/2 of the well area (FIG. 1). Therefore, the number of cells that did not contract was estimated to be 2,000,000 cells / cm 2 and newly seeded on 4-well chamber slides.
  • FIG. 2 As a result, no contraction of the cell sheet was observed (FIG. 2).
  • immunostaining was performed on the cell sheet.
  • the sheet is fixed with 4% paraformaldehyde, and then mounted by whole mount or frozen or paraffin sections are prepared for elastin, collagen IV, collagen I, actin, cytokeratin, occludin, ZO-1, etc.
  • staining was performed by an enzyme antibody method or a fluorescent antibody method, and observation was performed using an optical microscope or a fluorescent microscope. Actin can also be stained and observed with fluorescently labeled phalloidin.
  • the prepared human retinal pigment epithelium sheet was washed twice with 1M phosphate buffer saline (PBS) and fixed in 0.2M PBS containing 4% paraformaldehyde for 15 minutes. After fixation, the retinal pigment epithelium sheet was washed 5 times with Tween20-containing Tris-buffer saline (TBS-T). Subsequently, after blocking the cell sheet with a protein blocking buffer, the cell sheet was cultured overnight at 4 ° C. with a primary antibody.
  • PBS phosphate buffer saline
  • TBS-T Tris-buffer saline
  • an anti-occludine goat polyclonal antibody (1: 100; Santa Cruz Biotechnology) and an anti-elastin rabbit polyclonal antibody (1: 100; Calbiochem) were used.
  • the cell sheet was washed 3 times with TBS-T and then incubated with the secondary antibody for 30 minutes at room temperature. Next, the cell sheet was washed 3 times with TBS-T, dried, and sealed with vectorshield together with DAPI. Each section was observed with a light microscope and a fluorescence microscope (AX-70; Olympus optical Co., Ltd., Tokyo, Japan).
  • Example 2 Formation of human iPS cell-derived human retinal pigment epithelial sheet A human retinal pigment epithelial sheet was formed in the same manner as in Example 1 except that iPS cell-derived RPE cells were used as human retinal pigment epithelial cells.
  • iPS cell-derived RPE cells human iPS cells obtained by the method described in Neuroscience Letters 458 (2009) 126-131 were obtained by inducing differentiation by a method according to the method described in International Publication WO01 / 088100. RPE cells were used.
  • Example 3 Western blotting for human retinal pigment epithelial sheet-derived protein
  • the human retinal pigment epithelial sheet extract prepared in Example 1 was dissolved in a lysis buffer containing a protease inhibitor.
  • the obtained protein was separated by SDS-PAGE (10%) in equal amounts, transferred to a polyvinylidene difluoride membrane (Immobilon-P; Millipore, Billerica, MA), and then dissolved in TBS-T. Blocking was performed with skim milk for 1 hour.
  • anti-RPE-65 mouse monoclonal antibody (1: 5000), anti-occludin rabbit polyclonal antibody (1: 250), anti-cytokeratin 18 mouse monoclonal antibody (1: 1000), anti-ZO-1 rabbit polyclonal antibody (1:50)
  • the membrane was cultured overnight at 4 ° C. with primary antibodies in which anti-type 4 collagen mouse monoclonal antibody (1: 1000) and anti-elastin mouse monoclonal antibody (1: 1000) were dissolved in TBS-T containing 1% skim milk, respectively. . After washing 6 times with TBS-T, the membrane was cultured with a secondary antibody (50 ng / ml) conjugated with alkaline phosphatase for 1 hour.
  • the membrane was washed 6 times with a washing buffer to remove the antibody, and stained with a chemical fluorescence buffer (FIG. 5).
  • the membrane was reprobed with anti-GAPDH rabbit monoclonal antibody or anti-actin rabbit monoclonal antibody. From the protein derived from the human retinal pigment epithelium sheet, the expression of the protein for each of the above antibodies was observed.
  • Example 4 Electron microscopic image analysis of human retinal pigment epithelium sheet
  • the human retinal pigment epithelium sheet prepared in Example 1 was collected and fixed in 0.1 M phosphate buffer (PB) containing 2.5% glutaraldehyde for 60 minutes. It was. After washing with 0.1 M PBS, the retinal pigment epithelial sheet was allowed to stand in 0.1 M PBS containing 1% OsO 4 for 2 hours. After fixation, it was dehydrated with ethanol and t-butyl alcohol and dried.
  • PB phosphate buffer
  • the retinal pigment epithelium sheet was sputter coated with palladium (distance of 50 mm from the target sample, 30 mA at 5 ⁇ 10 ⁇ 2 mbar, 40 seconds) and observed with a scanning electron microscope (FIG. 6). From the electron microscopic images, formation of collagen fibers and elastic fibers (FIG. 6, arrows) was observed.
  • a retinal pigment epithelial cell sheet to be transplanted and applied to an age-related macular degeneration patient can be prepared relatively easily.
  • the cells used for the culture are iPS cell-derived retinal pigment epithelial cells
  • the patient's own cells can be used, so that rejection during transplantation can be avoided.

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Abstract

　本発明は、 （１）哺乳動物由来細胞を調製する工程； （２）調製した細胞を平面基材上に高密度に播種し、培養する工程； を含む細胞シートの作製方法、該方法によって作製された細胞シート、移植用材料、ブルッフ膜などを提供する。

Description

細胞シート作製方法
　本発明は、平面基材を用いた細胞シート作製方法、特に網膜色素上皮シートの作製方法に関する。本発明はまた、平面基材を用いたブルッフ膜の作製方法に関する。
　加齢黄斑変性（ａｇｅ‐ｒｅｌａｔｅｄ　ｍａｃｕｌａｒ　ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ： ＡＭＤ）は、現在、先進国における法的失明の主要原因疾患の一つであり、主に５０歳以上の高齢者に見られる。加齢黄斑変性は黄斑の加齢に伴う変化によっておこる疾患であり、滲出型と萎縮型に大別される。滲出型加齢黄斑変性は高齢者の黄斑に脈絡膜から新生血管が発生し、網膜色素上皮下又は網膜下に出血や滲出性病変を生じ、ついには瘢痕組織を形成する疾患である。萎縮型加齢黄斑変性は黄斑部の萎縮やドルーゼンの蓄積を伴う疾患である。また、滲出型及び萎縮型加齢黄斑変性に到る前駆病変を、特に早期加齢黄斑変性と呼ぶことがあり、本病変も加齢黄斑変性の一病態と考えられている。
　加齢黄斑変性の治療は、軽度の滲出型の場合には、光線力学的療法、レーザー光凝固術、新生血管抜去術などの外科的療法、または血管新生に関わる血管内皮増殖因子（ｖａｓｃｕｌａｒ　ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ：ＶＥＧＦ）に対する阻害剤の投与などの薬物療法による新生血管の退縮・除去を目的とした治療方法を選択することができる。しかし、網膜色素上皮（ｒｅｔｉｎａｌ　ｐｉｇｍｅｎｔ　ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ：ＲＰＥ）の高度の萎縮や欠損に至るまで進行した滲出型や萎縮型の場合、前記手段で有効性を得ることができない。かかる場合は、網膜色素上皮細胞または網膜色素上皮を網膜下の欠損部位に移植することが有効な治療方法となる（特許文献１、２）。
　移植に細胞を用いる場合、網膜色素上皮細胞としては、例えば、ドナーとなる胎児の眼球から分離・培養した網膜色素上皮細胞、患者自身の眼球から分離・培養した虹彩色素上皮細胞、手術中に擦過採取した網膜色素上皮細胞などが挙げられる。しかし、ドナーとして他人の細胞を用いた場合、患者側への拒絶反応が懸念され、また患者自身の細胞であっても、異なる細胞種を移植に用いることは治療上好適ではない。さらに、分離・培養した細胞の移植は生着率に課題があり、上皮として十分な機能を発揮できない。そこで、移植用網膜色素上皮として網膜色素上皮－ブルッフ膜－脈絡膜からなる組織あるいは人工シート上に培養した網膜色素上皮シートも提案されている（特許文献１、３）が、切除された脈絡膜や人工シートが上皮の生着および生体における機能維持障害となることが懸念される。また近年、ｉＰＳ細胞を用いた網膜色素上皮細胞（非特許文献１）または人工シートの移植についても検討されており、抗原性の問題の解決が図られているが、細胞の生着やシートの生体における機能維持に対する障害の問題は依然として残されており、加齢黄斑変性に対する治療上有効かつ調製が簡便な網膜色素上皮の作成が課題となっている。
特表平９－５０１３０３号公報 特開２００８－１７３３３３号公報 特表２００７－５０９６４３号公報
Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ　Ｌｅｔｔｅｒｓ，　４５８，　２００９，　１２６－１３１
　本発明の課題は、人工シートを用いることなく、簡便に哺乳類由来の細胞シートを作成する新たな方法を開発し、以って組織移植の必要な対象に提供することである。特に、網膜色素上皮の欠損を伴う加齢黄斑変性において生着率の高い、機能性に優れた移植用上皮を提供することである。
　通常、網膜色素上皮細胞を含む上皮細胞を疎な密度で平面ディッシュ上で培養した場合、細胞の基底部はディッシュとの接触面側に形成される。本発明者らは、ヒト眼球から分離・培養した網膜色素上皮細胞を平面基材上ではなく３次元的に凝集させて培養、即ち、球状（ｓｐｈｅｒｏｉｄ）培養した場合、球状になった細胞塊の内部に存在する細胞はアポトーシスによって死滅し、血清と接触する細胞塊表面にブルッフ膜が形成されることを発見した（データ未公開）。また、細胞表面は網膜色素上皮として分化していることが分かった。このことから、発明者らは、通常の平面培養であっても、細胞外基質より優先的に細胞間接着が生じる環境下では、細胞の脱分化を誘発せず、上皮に分化すること、ならびに血清接触面にブルッフ膜を形成させることの可能性を検討し、網膜色素上皮細胞を高密度な状態で平面培養することで、通常と逆側、即ち血清との接触面側にブルッフ膜が生じることを見出した。また、かかる培養では、網膜色素上皮細胞は脱分化せず、上皮として分化することを見出した。本発明者らは、鋭意検討の結果、これらの発見から本発明を完成させるに至った。すなわち、本発明は、
［１］以下の工程を含む、細胞シートの作製方法；
（１）哺乳動物由来細胞を調製する工程；
（２）調製した細胞を平面基材上に高密度に播種し、培養する工程
［２］工程（１）において、哺乳動物由来細胞が、上皮細胞又は内皮細胞である、上記［１］の方法；
［３］工程（１）において、哺乳動物由来細胞が、角膜内皮細胞、気管上皮細胞、消化管上皮細胞、子宮頚部上皮細胞、角膜上皮細胞、及び網膜色素上皮細胞からなる群から選択される、上記［１］の方法；
［４］得られる細胞シートが、細胞間にタイトジャンクションが形成され、且つ平面基材の接触する側と反対側に基底膜が形成されている、上記［１］の方法；
［５］工程（１）において、哺乳動物由来細胞が、網膜色素上皮細胞である、上記［１］の方法；
［６］工程（２）において、高密度が、正常な眼球において観察される細胞密度以上の密度である、上記［５］の方法；
［７］正常な眼球において観察される細胞密度以上の密度が、少なくとも４，０００細胞数／ｍｍ２である、上記［６］の方法；
［８］以下の工程（３）をさらに含む、上記［５］～［７］のいずれか１つの方法；
（３）工程（２）で得られた培養細胞における分化マーカーの発現の有無を確認する工程
［９］工程（３）において、分化マーカーが、ベストロフィン－１、ＲＰＥ－６５、サイトケラチン、オクルディン、ＺＯ－１、エラスチン、アクチン、１型コラーゲンおよび４型コラーゲンからなる群より選択される少なくとも１種である、上記［８］の方法；
［１０］以下の工程（４）をさらに含む、上記［５］～［９］のいずれか１つの方法；
（４）細胞の平面基材の接触する側と反対側にブルッフ膜の形成を確認する工程
［１１］上記［１０］の方法で形成されたブルッフ膜を分離する工程を含む、ブルッフ膜の作製方法；
［１２］上記［１］～［１０］のいずれか１つの方法で作製された細胞シート；
［１３］上記［１］～［１０］のいずれか１つの方法で作製された細胞シートを含む疾患治療用移植材料；
［１４］上記［１１］の方法で作製されたブルッフ膜；
を提供する。
　本発明により、通常の培養方法で得られる細胞シートと層構造が逆さとなった、基底膜が表出した構成を有する細胞シートを、簡易に調製することができる。本発明の細胞シートは、シートを裏返すことなく基底膜を移植対象組織に接触させることができるため、移植操作を簡略化でき、しかも生着率に優れるため、移殖用途として極めて有用である。例えば、平面培養によって容易に網膜色素上皮細胞シートを作成することができ、加齢黄斑変性患者に移植適用することができる。特に、培養に用いる細胞をｉＰＳ細胞由来の網膜色素上皮細胞とした場合、患者自身の細胞を利用することで、移植の際の拒絶反応を回避することができる。
４ウェルチャンバースライド（Ｌａｂ－Ｔｅｋ）にヒト網膜色素上皮細胞を５，０００細胞／ｍｍ２で播種した場合に観察されたシートの写真像を示す。矢印は収縮した細胞シートを示す。 ４ウェルチャンバースライド（Ｌａｂ－Ｔｅｋ）にヒト網膜色素上皮細胞を２０，０００細胞／ｍｍ２で播種した場合に観察されたシートの写真像を示す。細胞シートに収縮は観察されなかった。 ヒト網膜色素上皮細胞を２０，０００細胞／ｍｍ２で播種した場合の細胞写真像および染色像を示す。（Ａ）播種後０日における細胞写真像、（Ｂ）播種後１日における硬性ドルーゼン写真像、（Ｃ）播種後１日における細胞写真像、（Ｄ）播種後１日におけるブルッフ膜写真像、（Ｅ）播種後１日における細胞核染色像、（Ｆ）播種後１日におけるブルッフ膜中アクチン染色像 ヒト網膜色素上皮細胞の平面培養２週間における、網状の弾性線維を形成したエラスチンの染色像。 ヒト網膜色素上皮シートから抽出したタンパク質に関して、ＲＰＥ－６５、オクルディン、サイトケラチン－１８、ＺＯ－１、４型コラーゲン、エラスチンの各マーカータンパク質の発現を確認したウエスタンブロッティングの図を示す。 ヒト網膜色素上皮シートの走査型電子顕微鏡像を示す。矢印はコラーゲン線維や弾性線維である。図右下は、露出した基底陥入（基底部の微絨毛）図である。
　以下に、本発明を詳細に説明する。
　本発明は以下の工程を含む、細胞シートの作製方法を提供する。
（１）哺乳動物由来細胞を調製する工程；
（２）調製した細胞を平面基材上に高密度に播種し、培養する工程
　工程（１）において、調製される哺乳動物由来細胞としては、哺乳動物（例：ヒト、サル、マウス、ラット、イヌ、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ネコ、ウサギ、ハムスター、モルモット等）由来の細胞であれば、いずれの哺乳動物由来の細胞であってもよいが、好ましくはヒト由来の細胞である。
　また、調製する細胞の細胞種としては、上皮系および内皮系いずれかの接着性を有する細胞が好適に使用される。そのような細胞としては、例えば、肝臓の実質細胞である肝細胞、クッパー細胞、血管内皮細胞や角膜内皮細胞などの内皮細胞、線維芽細胞、骨芽細胞、砕骨細胞、歯根膜由来細胞、表皮基底細胞などの表皮細胞、気管上皮細胞、消化管上皮細胞、子宮頸部上皮細胞、結膜上皮細胞、角膜上皮細胞、虹彩色素上皮細胞、網膜色素上皮細胞などの上皮細胞、乳腺細胞、ペリサイト、平滑筋細胞や心筋細胞などの筋細胞、腎細胞、膵ランゲルハンス島細胞、末梢神経細胞や視神経細胞などの神経細胞、軟骨細胞、骨細胞などが挙げられるが、好ましくは角膜内皮細胞、気管上皮細胞、消化管上皮細胞、子宮頚部上皮細胞、角膜上皮細胞、網膜色素上皮細胞が挙げられ、さらに好ましくは角膜上皮細胞、角膜内皮細胞、網膜色素上皮細胞、最も好ましくは網膜色素上皮細胞が挙げられる。
　調製する細胞は、組織や器官から直接採取した初代細胞でもよく、あるいは、それらを何代か継代させたものでもよい。さらにこれら細胞は、未分化細胞である胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、多分化能を有する間葉系幹細胞などの多能性幹細胞、または単分化能を有する血管内皮前駆細胞などの単能性幹細胞を含む幹細胞を分化誘導することによって得られる細胞であっても良い。ＥＳ細胞は体細胞から核初期化されて生じたＥＳ細胞であってもよい。また、近年報告された人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）を分化誘導することにより、目的の細胞を調製してもよい。ｉＰＳ細胞は、ある特定の核初期化物質（核酸、タンパク質、低分子化合物等）を、体細胞に導入することにより作製することができる、ＥＳ細胞と同等の特性を有する体細胞由来の人工の幹細胞である［Ｔａｋａｈａｓｈｉ，　Ｋ．　ａｎｄ　Ｙａｍａｎａｋａ，　Ｓ．，　Ｃｅｌｌ，　１２６：　６６３－６７６　（２００６）；Ｔａｋａｈａｓｈｉ，　Ｋ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｃｅｌｌ，　１３１：　８６１－８７２　（２００７）］。前記幹細胞を目的の分化細胞に分化させる条件・培地は従来公知の条件・培地に従ってもよいし、当業者が適宜設定してもよい。本発明によって作成される細胞シートを移植用とする場合、移植する対象の体細胞をｉＰＳ細胞のソースとして用いることによって、得られる細胞シートは対象に対して抗原性を持たない細胞シートとなる点でｉＰＳ細胞の使用は好ましい。
　本発明の調製する哺乳動物由来細胞が、網膜色素上皮細胞である場合には、哺乳動物は前記と同様であるが、好ましくはヒトである。また、該網膜色素上皮細胞は、幹細胞由来の分化細胞または眼球由来の細胞である。眼球由来の網膜色素上皮細胞は死体眼球摘出後、速やかに赤道部で眼球を分割し、硝子体と網膜を除去した後、セルスクレーパーによる擦過またはトリプシンやＥＤＴＡ溶液にて細胞をブルッフ膜より遊離させて回収した後、培養液の中で静置することにより培養皿への接着、増殖を誘導することにより必要量の細胞を増殖させ、トリプシン処理などで適宜継代し細胞数を確保する。幹細胞を分化誘導させる場合は、ヒトＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞を、Ｄｋｋ－１（Ｗｎｔアンタゴニスト）およびＬｅｆｔｙ　Ａ（Ｎｏｄａｌアンタゴニスト）を添加したＥＳ細胞分化培地で培養を行う。一定期間培養することで網膜前駆細胞マーカーであるＲｘ、Ｐａｘ６、Ｍｉｔｆが発現し、光学顕微鏡観察による形態観察から多角性形態を確認することで、ヒト網膜色素上皮細胞を得ることができる。
　工程（２）において、前記調製した細胞を平面基材上に高密度に播種し、培養することによって細胞シートを作成することができる。本明細書における平面基材としては、細胞培養用であれば特に限定されないが、例えば、フラスコ、組織培養用フラスコ、ディッシュ、ペトリディッシュ、組織培養用ディッシュ、マルチディッシュ、マイクロプレート、マイクロウエルプレート、マルチプレート、マルチウエルプレート、チャンバースライド、シャーレ、チューブ、トレイ、培養バック、ローラーボトルが挙げられる。本明細書における平面基材の材質としては、例えば、金属、ガラス、セラミック、シリコン等の無機材料、エラストマー、プラスチック（例えば、ポリエステル樹脂、ポリエチレン樹脂、ポリプロピレン樹脂、ＡＢＳ樹脂、ナイロン、アクリル樹脂、フッ素樹脂、ポリカーボネート樹脂、ポリウレタン樹脂、メチルペンテン樹脂、フェノール樹脂、メラミン樹脂、エポキシ樹脂、塩化ビニル樹脂）で代表される有機材料を挙げることができるが、それらに限定されない。また、平面基材は、接着性細胞との接着性を向上させる目的で、表面処理が施されていてもよいが、本発明の細胞シートを平面基材から剥がす工程を容易にするために、なんら処理されていなくてもよい。処理されている場合は、例えば、コラーゲン、ゼラチン、マトリゲル、ポリ－Ｌ－リジン、ポリ－Ｄ－リジン、ラミニン、フィブロネクチンなどによって表面処理されていてもよい。
　本明細書における「高密度」とは、調製した細胞が由来する正常組織において観察される細胞密度以上の密度をいう。またその上限は、当業者であれば適宜決定することができるが、例えば、細胞同士が密着し合える密度でかつ過剰な播種によるシート形成不備、細胞死滅しない程度の細胞密度である。より具体的には、「高密度」とは、正常組織において観察される細胞密度に対して、例えば１～１００倍、好ましくは１．２～５０倍、より好ましくは２．５～３０倍程度であり、特に好ましくは５～１０倍程度の細胞密度をいう。正常組織において観察される細胞密度としては、組織の種類によって異なるが、例えば、角膜内皮では、３，０００細胞数／ｍｍ２、網膜色素上皮細胞では、４，０００細胞数／ｍｍ２程度である。
　本発明の調製する哺乳動物由来細胞が、網膜色素上皮細胞である場合には、「高密度」とは、「正常な眼球において観察される細胞密度以上の密度」をいう。そのような密度としては、具体的には、少なくとも４，０００細胞数／ｍｍ２以上である。しかし、下記実施例においても示されるように、正常眼球において観察される細胞密度以上の密度であっても、一定密度以下で平面基材上に播種した場合、形成された細胞シート自身に収縮力が働き、播種時の面積を維持することが出来ない。これは、網膜色素上皮の血清接触面を被覆するために一定数の細胞が動員されていること、細胞密度にムラが存在すること、および細胞自身の生存率から、播種時の面積を維持できないためと推察される。但し、この収縮したシートであっても、特段の不都合なく後述する用途に利用することが可能である。従って、「正常な眼球において観察される細胞密度以上の密度」とは、形成された細胞シートが播種時の面積から収縮することを許容する場合、好ましくは、５，０００細胞数／ｍｍ２程度以上、より好ましくは、１０，０００細胞数／ｍｍ２程度以上であり、形成された細胞シートに播種時の面積を維持させる場合、好ましくは、２０，０００細胞数／ｍｍ２程度以上である。また、その上限としては、過剰に細胞播種することによるシート形成不全、一部細胞の死滅を誘発しない密度である。そのような上限も考慮した場合、「正常な眼球において観察される細胞密度以上の密度」とは、好ましくは、５，０００細胞数／ｍｍ２～２００，０００細胞数／ｍｍ２、より好ましくは、１０，０００細胞数／ｍｍ２～１２０，０００細胞数／ｍｍ２、特に好ましくは、２０，０００細胞数／ｍｍ２～４０，０００細胞数／ｍｍ２である。
　前記高密度で播種した細胞を培養液中で培養することにより、単層状の細胞集団を形成することができる。培養液としては、当技術分野で通常用いられる細胞培養用培地であれば特に制限なく用いることができる。例えば、用いる細胞の種類に応じて、Ｆ－１０培地、Ｆ１２培地、ＭＥＭ、ＢＭＥ培地、ＤＭＥＭ、αＭＥＭ、ＩＭＤ培地、ＥＳ培地、ＤＭ－１６０培地、Ｆｉｓｈｅｒ培地、ＷＥ培地およびＲＰＭＩ１６４０培地等、朝倉書店発行「日本組織培養学会編　組織培養の技術第三版」５８１頁に記載されているような基礎培地を用いることができる。さらに、基礎培地に血清（ウシ胎児血清等）、各種増殖因子、抗生物質、アミノ酸などを加えてもよい。培地のｐＨは、好ましくは約６～約８である。培養は、通常約３０～約４０℃で、約１５～約６０時間行なわれる。必要に応じて通気や撹拌を行ってもよい。
　本発明の方法で得られる細胞シートは、細胞間にタイトジャンクションが形成され、且つ平面基材の接触する側と反対側に基底膜が形成される。平面基材の接触する側と反対側とは、細胞と血清との接触面側である。タイトジャンクション形成は、６角形状の密着しあう細胞形態と、免疫染色により細胞間のオクルディンやＺＯ－１等の発現を観察することで確認できる。基底膜を含むブルッフ膜の形成は、免疫染色によりエラスチン、１型コラーゲンまたは４型コラーゲン等の細胞表面での発現を観察することや、走査型電子顕微鏡による観察により確認することができる。
　本発明の調製する哺乳動物由来細胞が、網膜色素上皮細胞である場合には、以下の工程（３）をさらに含んでもよい。
（３）工程（２）で得られた培養細胞における分化マーカーの発現の有無を確認する工程
　工程（３）において、工程（２）で得られた培養細胞における分化マーカーの発現の有無を確認することによって、細胞シートが完成したことを判定することができる。本明細書において、分化マーカーは細胞の任意の箇所（例えば、細胞質、細胞膜、核膜など）で発現していてもよいが、好ましくは、播種した細胞と血清との接触面側で発現しているマーカーを対象とする。
　本明細書における「分化マーカー」としては、分化した細胞において特異的に発現しているか、他の分化細胞または未分化細胞、前駆細胞と比較して発現が増幅あるいは減衰している遺伝子の転写産物、翻訳産物またはその分解産物が含まれる。そのような遺伝子としては、例えば、神経細胞分化マーカーとしては、チューブリン（特にβチューブリン）、ＭＡＰ２、ニューロフィラメント、ニューロン特異的エノラーゼ、脂肪細胞分化マーカーとしては、ａＰ２、グリセロリン酸脱水素酵素、アディプシン、レプチン、骨芽細胞分化マーカーとしては、プロコラーゲン１α１、ＲＵＮＸ２、アルカリホスファターゼ、オステオポンチン、オステオカルシン、網膜色素上皮細胞分化マーカーとしては、ベストロフィン－１（ＶＭＤ２）、ＲＰＥ－６５、サイトケラチン、オクルディン、ＺＯ－１、エラスチン、アクチン、１型コラーゲンまたは４型コラーゲンなどが挙げられる。
　「分化マーカーの発現の有無の確認」に用いられる試料としては、工程（２）で培養された細胞由来の分化マーカー（例、ＲＮＡ、蛋白質、その分解産物など）を含有するものであれば特に制限されない。
　上記試料がＲＮＡの場合における分化マーカー遺伝子の発現は、工程（２）で培養された細胞からＲＮＡ（例：全ＲＮＡ、ｍＲＮＡ）画分を調製し、該画分中に含まれる該マーカー遺伝子の転写産物を検出するか、あるいは該細胞からＲＮＡを抽出せずに直接細胞中のマーカー遺伝子産物を検出することにより調べることができる。
　細胞からＲＮＡ（例：全ＲＮＡ、ｍＲＮＡ）画分を調製する場合、ＲＮＡ画分の調製は、グアニジン－ＣｓＣｌ超遠心法、ＡＧＰＣ法など公知の手法を用いて行うことができるが、市販のＲＮＡ抽出用キット（例：ＲＮｅａｓｙ　Ｍｉｎｉ　Ｋｉｔ；　ＱＩＡＧＥＮ製等）を用いて、微量試料から迅速且つ簡便に高純度の全ＲＮＡを調製することができる。ＲＮＡ画分中の分化マーカー遺伝子の転写産物を検出する手段としては、例えば、ハイブリダイゼーション（ノーザンブロット、ドットブロット、ＤＮＡチップ解析等）を用いる方法、あるいはＰＣＲ（ＲＴ－ＰＣＲ、競合ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ等）を用いる方法などが挙げられる。微量試料から迅速且つ簡便に定量性よく分化マーカー遺伝子の発現変動を検出できる点で競合ＰＣＲやリアルタイムＰＣＲなどの定量的ＰＣＲ法が、また、複数のマーカー遺伝子の発現変動を一括検出することができ、検出方法の選択によって定量性も向上させ得るなどの点でＤＮＡチップ解析が好ましい。
　ノーザンブロットまたはドットブロットハイブリダイゼーションによる場合、分化マーカー遺伝子の検出は、該遺伝子の転写産物とハイブリダイズし得る核酸（プローブ）を用いて行うことができる。そのような核酸としては、分化マーカー遺伝子の転写産物とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る核酸が挙げられる。「ハイストリンジェントな条件」とは、例えば、６×ＳＳＣ（ｓｏｄｉｕｍ　ｃｈｌｏｒｉｄｅ／ｓｏｄｉｕｍ　ｃｉｔｒａｔｅ）中４５℃でのハイブリダイゼーション反応の後、０．２×ＳＳＣ／０．１％　ＳＤＳ中６５℃での一回以上の洗浄などが挙げられる。当業者は、ハイブリダイゼーション溶液の塩濃度、ハイブリダゼーション反応の温度、プローブ濃度、プローブの長さ、ミスマッチの数、ハイブリダイゼーション反応の時間、洗浄液の塩濃度、洗浄の温度等を適宜変更することにより、所望のストリンジェンシーに容易に調節することができる。該核酸はＤＮＡであってもＲＮＡであってもよく、あるいはＤＮＡ／ＲＮＡキメラであってもよい。好ましくはＤＮＡが挙げられる。
　プローブとして用いられる核酸は、二本鎖であっても一本鎖であってもよい。二本鎖の場合は、二本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＲＮＡまたはＤＮＡ：ＲＮＡのハイブリッドでもよい。一本鎖の場合は、アンチセンス鎖を用いることができる。該核酸の長さは標的核酸と特異的にハイブリダイズし得る限り特に制限はなく、例えば約１５塩基以上、好ましくは約３０塩基以上である。該核酸は、標的核酸の検出・定量を可能とするために、標識剤により標識されていることが好ましい。標識剤としては、例えば、放射性同位元素、酵素、蛍光物質、発光物質などが用いられる。放射性同位元素としては、例えば、〔３２Ｐ〕、〔３Ｈ〕、〔１４Ｃ〕などが用いられる。酵素としては、安定で比活性の大きなものが好ましく、例えば、β－ガラクトシダーゼ、β－グルコシダーゼ、アルカリホスファターゼ、パーオキシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素などが用いられる。蛍光物質としては、例えば、フルオレスカミン、フルオレッセンイソチオシアネートなどが用いられる。発光物質としては、例えば、ルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェリン、ルシゲニンなどが用いられる。さらに、プローブと標識剤との結合にビオチン－（ストレプト）アビジンを用いることもできる。
　ノーザンハイブリダイゼーションによる場合は、上記のようにして調製したＲＮＡ画分をゲル電気泳動にて分離した後、ニトロセルロース、ナイロン、ポリビニリデンジフロリド等のメンブレンに転写し、上記のようにして調製された標識プローブを含むハイブリダイゼーション緩衝液中、上記「ハイストリンジェントな条件下で」ハイブリダイゼーションさせた後、適当な方法でメンブレンに結合した標識量をバンド毎に測定することにより、各分化マーカー遺伝子の発現量を測定することができる。ドットブロットの場合も、ＲＮＡ画分をスポットしたメンブレンを同様にハイブリダイゼーション反応に付し（各マーカー遺伝子についてそれぞれ行う）、スポットの標識量を測定することにより、各マーカー遺伝子の発現量を測定することができる。
　ＤＮＡチップ解析による場合、例えば、上記のようにして調製したＲＮＡ画分から、逆転写反応によりＴ７プロモーター等の適当なプロモーターを導入したｃＤＮＡを合成し、さらにＲＮＡポリメラーゼを用いてｃＲＮＡを合成する（この時ビオチンなどで標識したモノヌクレオチドを基質として用いることにより、標識されたｃＲＮＡが得られる）。この標識ｃＲＮＡを、上記したプローブを固相化したチップと接触させてハイブリダイゼーション反応させ、固相上の各プローブに結合した標識量を測定することにより、各分化マーカー遺伝子の発現量を測定することができる。当該方法は、検出する分化マーカー遺伝子（従って、固相化されるプローブ）の数が多くなるほど、迅速性および簡便性の面で有利である。
　一方、細胞からＲＮＡを抽出せずにマーカー遺伝子を検出する場合、その検出手段として、ｉｎ　ｓｉｔｕ　ハイブリダイゼーションを用いることができる。該方法では、細胞からＲＮＡを抽出する代わりに、細胞を固定剤、好ましくは沈殿固定剤、例えばアセトンで処理するか、又は緩衝ホルムアルデヒド溶液の中に短い時間インキュベーションすることによって細胞を固定する。固定化後、細胞をパラフィンの中に包埋してブロックを形成し、薄片を切り取ることで試料として用いることができる。良好に調製したパラフィン包埋サンプルは室温で何年も保存できる。プローブとして用いられる核酸は、上記したものと同様のものを用いることができる。ｉｎ　ｓｉｔｕ　ハイブリダイゼーションは、細胞の血清接触面に分化マーカーの発現を直接確認することができる点で、本発明において好適に用いられる。
　あるいは、工程（２）における培養した細胞における分化マーカー遺伝子の発現の確認は、該細胞からタンパク質画分を調製し、該画分中に含まれる該マーカー遺伝子の翻訳産物（即ち、マーカータンパク質）を検出するか、あるいは該細胞からタンパク質を抽出することなく直接細胞中のマーカー遺伝子の翻訳産物を検出することにより調べることができる。マーカータンパク質の検出は、各タンパク質に対する抗体を用いて、免疫学的測定法（例：ＥＬＩＳＡ、ＦＩＡ、ＲＩＡ、ウェスタンブロット等）によって行うこともできるし、酵素などの測定可能な生理活性を示すタンパク質においては、該生理活性を、各マーカータンパク質について公知の手法を用いて測定することによっても行い得る。あるいはまた、マーカータンパク質の検出は、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦＭＳ等の質量分析法を用いても行うことができる。
　尚、各マーカータンパク質に対する抗体は、該マーカータンパク質または該タンパク質、あるいはその部分ペプチドを感作抗原として、通常使用されるポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体作製技術に従って取得することができる。
　個々の免疫学的測定法を本発明の検査方法に適用するにあたっては、特別の条件、操作等の設定は必要とされない。それぞれの方法における通常の条件、操作法に当業者の通常の技術的配慮を加えて分化マーカータンパク質の測定系を構築すればよい。これらの一般的な技術手段の詳細については、総説、成書などを参照することができる。例えば、入江寛編「ラジオイムノアッセイ」（講談社、昭和４９年発行）、入江寛編「続ラジオイムノアッセイ」（講談社、昭和５４年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（医学書院、昭和５３年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第２版）（医学書院、昭和５７年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第３版）（医学書院、昭和６２年発行）、「Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ」　Ｖｏｌ．　７０（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ　Ａ））、　同書　Ｖｏｌ．　７３（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ　Ｂ））、　同書　Ｖｏｌ．　７４（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ　Ｃ））、　同書　Ｖｏｌ．　８４（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ　Ｄ　：　Ｓｅｌｅｃｔｅｄ　Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ））、　同書　Ｖｏｌ．　９２（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ　Ｅ　：　Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　ａｎｄ　Ｇｅｎｅｒａｌ　Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ　Ｍｅｔｈｏｄｓ））、　同書　Ｖｏｌ．　１２１（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ　Ｉ　：　Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ））（以上、アカデミックプレス社発行）などを参照することができる。
　前記の細胞シートの作製方法であって、細胞が網膜色素上皮細胞である場合は、以下の工程（４）をさらに含んでもよい。
（４）細胞の平面基材の接触する側と反対側にブルッフ膜の形成を確認する工程
　本明細書における「ブルッフ膜」とは、網膜色素上皮と脈絡膜の間にある薄い膜で、網膜色素上皮を裏打ちする層である。それは、膠原線維を主体とする無細胞性の構造で、脈絡膜と色素上皮細胞が接着し、脈絡膜から血管のない網膜外層へ物質を送る通路の役割を果たしている。単層上皮は移植操作などを行う際、非常に脆く破損しやすいため、従来は人工シートや羊膜など代用シート上で細胞を育てて用いていたが、細胞の分化が不十分になり、人工シートが移植部位の生物物理的現象の障害となる。それに対し、本発明では細胞自身が作る本来の基底膜や弾性線維を含むブルッフ膜が形成されることにより移植操作に耐えうる強度が得られる。また、本発明のブルッフ膜は血清に接する側に形成されるため、シートをブルッフ膜ごと培養皿から剥離することが容易である。
　本発明はまた、前記網膜色素上皮細胞シートの作製方法において、形成されたブルッフ膜を網膜色素上皮細胞シートから分離することを特徴とする、ブルッフ膜のｉｎ　ｖｉｔｒｏ作成方法を提供する。網膜色素上皮上に形成されたブルッフ膜はＥＤＴＡ処理することにより、またはマグネシウム、カルシウム無添加培地にて、シート表面でピペッティング、吸引操作によりシートからブルッフ膜を剥離、回収することが可能である。また、培養液を吸引して空気に接触させることや、希釈アルコール処理によってシート表面に脱水作用を加えることによっても剥離、回収が可能である。
　本発明は、また前記細胞シート作製方法に従って、得られる細胞シート、好ましくは、網膜色素上皮細胞シートに関する。本発明の細胞シートは、生体の用途としては、例えば、スクリーニング用途、毒性試験用途と様々な用途に用いることができる。また、本発明の細胞シートは疾患治療用移植材料として組織移植が必要な対象に好適に移植することができる。特に本発明の網膜色素上皮細胞シートは、眼疾患患者への網膜治療用移植材料として好適である。眼疾患としては、例えば、加齢黄斑変性疾患、網膜色素変性症等が挙げられる。また、本発明の網膜色素上皮細胞シートは、前記眼疾患に対する薬効スクリーニングや毒性評価などの各種スクリーニング用途としても利用できる。例えば、特表２００７－５１７２１０に記載の方法に従って、毒性物質のスクリーニングに本発明の細胞シートを適用することができる。さらに、本発明の網膜色素上皮細胞シートは、視細胞外節の貪食能や神経保護作用などの視細胞の維持に関わる機能、ポンプ作用、タイトジャンクションによる網膜血管バリア機能などの、生体内における網膜色素上皮細胞が備える種々の様々な機能を評価するためのｖｉｔｒｏモデルとして利用することも可能である。
　本発明の疾患治療用移植材料は、ヒト、ヒト以外の哺乳動物（例：サル、マウス、ラット、イヌ、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ネコ、ウサギ、ハムスター、モルモット等）における上記疾患を治療するために用いることができる。
　本発明の疾患治療用移植材料の適用可能な疾患部位の範囲は、対象疾患、投与対象の動物種、年齢、性別、体重、症状などに依存して変化し得るが、例えば、加齢黄斑変性疾患に適用する場合は、移植すべき疾患部位の範囲が通常、０．０７ｃｍ２～０．２８ｃｍ２の範囲である。
　本発明の疾患治療用移植材料は、一度にもしくは数回に分けて移植してもよい。移植の適用回数は疾患に応じて医療従事者、ガイドラインに従って決定されるが、例えば疾患が加齢黄斑変性疾患であった場合には、本発明の網膜色素上皮細胞シートを、その重篤度によって２回以上移植してもよい。また複数回移植を行う場合、インターバルは特に限定されないが、数日～数週間の期間を置いても良い。
　本発明の疾患治療用移植材料は、医療従事者、ガイドラインに沿った適切な移植方法に従って移植される。例えば、胸部または腹腔内の治療箇所に対しては、開胸、開腹手術を適用できるほか、内視鏡的手法を採用することもできる。また、網膜下に本発明の疾患治療用移植材料として網膜色素上皮細胞シートを移植する場合、眼球網膜下の移植部位まで刺入した注射針からの水流に乗せる移植方法のほか、専用の運搬用治療器具によっても行うことができる。
　本発明はさらに、前記ブルッフ膜作製方法によって得られるブルッフ膜を提供する。本発明のブルッフ膜は、細胞を含まない基底膜であるため、細胞を移植するよりブルッフ膜を移殖するほうが規制上の制約が少なく、実用化のハードルが低い。また、機能解析などの研究用途としても有用である。
　以下に実施例を示して、本発明をより詳細に説明するが、これらは単なる例示であって、本発明の範囲を何ら限定するものではない。
　眼球由来ヒト網膜色素上皮細胞の調製
　ヒト網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞（ｈＲＰＥＣｓ）を死後４８時間以内の数名のドナーから採取した。該細胞をＨａｍ　Ｆ－１０培地（１０％ウシ胎児血清、診断用培地（Ｇｌｕｔａｍａｘ　ＩＩ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）ペニシリンＧ（１００ＩＵ／ｍＬ）、ストレプトマイシン（０．１ｍｇ／ｍＬ）、およびアムホテリシンＢ（０．２５ｍｇ／Ｌ））中に懸濁し、１０ｃｍディッシュ上に播種した。培養は、９５％空気／５％ＣＯ２雰囲気下、３７℃で行った。
　播種細胞数の検討
　細胞を播種する前に、播種細胞数を検討した。網膜色素上皮細胞の１細胞の直径は１０～２０μｍである。本実施例においては１０μｍと仮定し、１細胞の面積は５×５×３．１４＝７８．５μｍ２と見積もった。従って、１ｍｍ２中を細胞で占める場合、播かなければならない細胞数は、１，０００×１，０００／７８．５＝約１２，７４０細胞である。本実施例では、平面基材として４ウェルチャンバースライド（Ｌａｂ－Ｔｅｋ）を用い（１ウェルあたり２ｃｍ２）、１ウェルを細胞で占めるためには、１２，７４０×２×１０×１０＝２，５４８，０００、即ち、約２５０万個の細胞数が必要であると見積もることができた。通常の細胞培養では、７５ｃｍ２培養皿にコンフルエントの状態まで育てた網膜色素上皮細胞の数が約１００～２５０万個であり、２５０万個として細胞密度は、２５０万個／７５ｃｍ２＝約３３３細胞／ｍｍ２であり、生体における細胞密度（４，０００細胞／ｍｍ２程度）や本培養法で用いる細胞密度（例えば４００万個、細胞密度２０，０００細胞／ｍｍ２）よりかなり少ないものである。
　実施例１
　ヒト網膜色素上皮シートの形成
　眼球から採取した網膜色素上皮細胞を培養後、０．１％トリプシンおよび０．０２％ＥＤＴＡで５分間処理し、ピペットで集めた。集めたＲＰＥ細胞を遠心し、数を計測し、上記検討結果に従い、４ウェルチャンバースライド（Ｌａｂ－Ｔｅｋ）に１００万個、２００万個ずつ播種した（それぞれ５，０００細胞／ｍｍ２、１０，０００細胞／ｍｍ２）。その結果、シートは形成されたものの、ウェル面積の１／４、１／２にそれぞれ収縮した（図１）。そこで、収縮しない細胞数は２，０００，０００細胞／ｃｍ２であると見積もり、新たに４ウェルチャンバースライドに播種した。その結果、細胞シートの収縮は観察されなかった（図２）。
　また、細胞シートに対して免疫染色を行った。免疫染色はシートを４％パラフォルムアルデヒドにて固定後、ホールマウントによるか冷凍またはパラフィン切片を作成して、エラスチン、コラーゲンＩＶ、コラーゲンＩ、アクチン、サイトケラチン、オクルディン、ＺＯ－１など目的とするタンパク質に対する一次抗体を用いて、酵素抗体法または蛍光抗体法にて染色を行い、光学顕微鏡または蛍光顕微鏡で観察を行った。アクチンに関しては、蛍光標識したファロイジンによっても染色し観察可能である。かかる免疫染色の結果、細胞間接着および平滑筋アクチンの発現が、播種１日後に確認された（図３）。その後、ブルッフ膜のコンポーネントであるエラスチンおよびコラーゲンＩＶの発現がＲＰＥ細胞の血清接触表面に確認された（図４）。網膜色素上皮細胞のｉｎ　ｖｉｔｒｏ培養系で、エラスチンの発現を確認することができたことは、これまで報告がない。
　また、前記の免疫染色は、別途下記の通りに行うことでも同様の結果が得られた。
　作成したヒト網膜色素上皮シートを１Ｍリン酸バッファー生理食塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄し、４％パラフォルムアルデヒドを含有する０．２ＭＰＢＳ中で１５分間固定を行った。固定後、網膜色素上皮シートをＴｗｅｅｎ２０含有Ｔｒｉｓ－バッファー生理食塩水（ＴＢＳ－Ｔ）で細胞シートを５回洗浄した。次いで、細胞シートをタンパク質ブロッキングバッファーでブロッキングの後、細胞シートを１次抗体で４℃、一晩培養した。用いた１次抗体としては、抗オクルディンヤギポリクローナル抗体（１：１００；Ｓａｎｔａ　Ｃｒｕｚ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、抗エラスチンウサギポリクローナル抗体（１：１００；Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）を用いた。細胞シートをＴＢＳ－Ｔで３回洗浄した後、二次抗体で３０分間、室温にて培養した。次いで、細胞シートをＴＢＳ－Ｔで３回洗浄し、乾燥後、ＤＡＰＩと共にｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄで封入した。各切片は、光学顕微鏡および蛍光顕微鏡（ＡＸ－７０；　Ｏｌｙｍｐｕｓ　ｏｐｔｉｃａｌ　Ｃｏ．，　Ｌｔｄ．，　Ｔｏｋｙｏ，　Ｊａｐａｎ）で観察した。
　実施例２
　ヒトｉＰＳ細胞由来ヒト網膜色素上皮シートの形成
　ヒト網膜色素上皮細胞として、iＰＳ細胞由来ＲＰＥ細胞を用いた点以外は、実施例１と同様の方法でヒト網膜色素上皮シートを形成した。iＰＳ細胞由来ＲＰＥ細胞として、Neuroscience Letters 458 (2009) 126-131に記載の方法で得たヒトｉＰＳ細胞を、国際公開ＷＯ０１／０８８１００号公報に記載の方法に準じた方法で分化誘導して得たＲＰＥ細胞を用いた。
　実施例３
　ヒト網膜色素上皮シート由来タンパク質に対するウエスタンブロッティング
　実施例１で作成したヒト網膜色素上皮シートの抽出物をプロテアーゼ阻害剤を含有するライシスバッファーで溶解した。得られたタンパク質を等量ずつＳＤＳ－ＰＡＧＥ（１０％）で分離し、二フッ化ポリビニリデンメンブレン（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ－Ｐ；　Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，　Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，　ＭＡ）に転写したのち、ＴＢＳ－Ｔに溶解させた１０％スキムミルクで一時間ブロッキングを行った。次いで、抗ＲＰＥ－６５マウスモノクローナル抗体（１：５０００）、抗オクルディンウサギポリクローナル抗体（１：２５０）、抗サイトケラチン１８マウスモノクローナル抗体（１：１０００）、抗ＺＯ－１ウサギポリクローナル抗体（１：５０）、抗４型コラーゲンマウスモノクローナル抗体（１：１０００）、抗エラスチンマウスモノクローナル抗体（１：１０００）を１％スキムミルク含有ＴＢＳ－Ｔにそれぞれ溶解させた一次抗体で４℃一晩、メンブレンを培養した。ＴＢＳ－Ｔで６回洗浄した後、メンブレンをアルカリホスファターゼがコンジュゲートされた二次抗体（５０ｎｇ／ｍｌ）で１時間培養を行った。メンブレンを洗浄バッファーで６回洗浄して抗体を除去し、化学蛍光バッファーで染色を行った（図５）。標準化のために、メンブレンは抗ＧＡＰＤＨウサギモノクローナル抗体または抗アクチンウサギモノクローナル抗体でリプローブを行った。ヒト網膜色素上皮シート由来のタンパク質からは上記各抗体に対するタンパク質の発現が認められた。
　実施例４
　ヒト網膜色素上皮シートの電子顕微鏡像解析
　実施例１で作成したヒト網膜色素上皮シートを回収し、２．５％グルタルアルデヒドを含有する０．１Ｍリン酸バッファー（ＰＢ）中で６０分間固定を行った。０．１ＭＰＢＳで洗浄後、網膜色素上皮シートを１％ＯｓＯ４を含有する０．１ＭＰＢＳ中に２時間静置した。固定後、エタノールおよびt－ブチルアルコールで脱水し、乾燥させた。次いで、網膜色素上皮シートをパラジウムでスパッタ被覆（標的試料と５０ｍｍの距離、５×１０－２ミリバールで３０ｍＡ、４０秒間）を行い、走査型電子顕微鏡で観察した（図６）。電子顕微鏡像からは、コラーゲン線維および弾性線維（図６、矢印）の形成が認められた。
　本発明の方法によって、加齢黄斑変性患者に移植適用する網膜色素上皮細胞シートを比較的簡便に調製することができる。特に、培養に用いる細胞をｉＰＳ細胞由来の網膜色素上皮細胞とした場合、患者自身の細胞を利用可能となるため、移植の際の拒絶反応を回避することができる。
　本出願は、日本で出願された特願２０１０－１０８６７４（出願日：平成２２年５月１０日）を基礎としており、その内容はすべて本明細書に包含されるものとする。

Claims (14)

  1. 以下の工程を含む、細胞シートの作製方法。
    （１）哺乳動物由来細胞を調製する工程；
    （２）調製した細胞を平面基材上に高密度に播種し、培養する工程
  2. 工程（１）において、哺乳動物由来細胞が、上皮細胞又は内皮細胞である、請求項１に記載の方法。
  3. 工程（１）において、哺乳動物由来細胞が、角膜内皮細胞、気管上皮細胞、消化管上皮細胞、子宮頚部上皮細胞、角膜上皮細胞、及び網膜色素上皮細胞からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
  4. 得られる細胞シートが、細胞間にタイトジャンクションが形成され、且つ平面基材の接触する側と反対側に基底膜が形成されている、請求項１に記載の方法。
  5. 工程（１）において、哺乳動物由来細胞が、網膜色素上皮細胞である、請求項１に記載の方法。
  6. 工程（２）において、高密度が、正常な眼球において観察される細胞密度以上の密度である、請求項５に記載の方法。
  7. 正常な眼球において観察される細胞密度以上の密度が、少なくとも４，０００細胞数／ｍｍ２である、請求項６に記載の方法。
  8. 以下の工程（３）をさらに含む、請求項５～７のいずれか１項に記載の方法。
    （３）工程（２）で得られた培養細胞における分化マーカーの発現の有無を確認する工程
  9. 工程（３）において、分化マーカーが、ベストロフィン－１、ＲＰＥ－６５、サイトケラチン、オクルディン、ＺＯ－１、エラスチン、アクチン、１型コラーゲンおよび４型コラーゲンからなる群より選択される少なくとも１種である、請求項８に記載の方法。
  10. 以下の工程（４）をさらに含む、請求項５～９のいずれか１項に記載の方法。
    （４）細胞の平面基材の接触する側と反対側にブルッフ膜の形成を確認する工程
  11. 請求項１０に記載の方法で形成されたブルッフ膜を分離する工程を含む、ブルッフ膜の作製方法。
  12. 請求項１～１０のいずれか１項に記載の方法で作製された細胞シート。
  13. 請求項１～１０のいずれか１項に記載の方法で作製された細胞シートを含む疾患治療用移植材料。
  14. 請求項１１に記載の方法で作製されたブルッフ膜。
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