TW202400773A

TW202400773A - 細胞層片製作方法

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Publication number: TW202400773A
Application number: TW112115521A
Authority: TW
Inventors: 草野仁; 宮內英征; 酒井秀人; 柳川聰秀; 岡崎道貴子; 田面喜之
Original assignee: 日商生物製藥股份有限公司
Priority date: 2022-04-27
Filing date: 2023-04-26
Publication date: 2024-01-01
Also published as: WO2023210609A1

Abstract

本發明的目的在於提供一種細胞層片的製作方法，其為簡便的細胞層片的製作方法，並且藉由該方法所製成的細胞層片容易處理。藉由本發明，能夠提供一種細胞層片的製作方法及以該方法製成的細胞層片，藉由該方法所製成的細胞層片容易處理，該製作方法包含：步驟(1)，將一種或複數種的源自哺乳動物的細胞進行調製；步驟(2)，將調製成的細胞播種於底面具有多孔性膜之第一細胞培養容器的前述多孔性膜上；及，步驟(3)，將前述第一細胞培養容器放入第二細胞培養容器中然後培養細胞。

Description

細胞層片製作方法

本發明關於一種由各式各樣的細胞構成的細胞層片的製作方法。特別是關於一種細胞層片的製作方法，該細胞層片是來自包含視網膜色素上皮細胞、間質幹細胞、纖維母細胞、iPS細胞(誘導性富潛能幹細胞)及iPS衍生分化細胞、ES細胞(胚胎幹細胞)及ES細胞衍生最後細胞這樣各式各樣的細胞。

為了治療各式各樣的疾病，已報導有細胞培養層片的移植療法。所謂細胞培養層片的移植療法是如下技術：將由人體採取或人工性地製作的幹細胞培養於盤(培養皿)中，然後將所獲得的層片狀的培養細胞配置於由外傷或患部等所造成的組織的缺損部，來將缺損部修復。

已嘗試有如下方法：以接近在生物體內的形態的細胞層片的狀態，將視網膜色素上皮細胞移植來治療視網膜退化疾病。例如，老年性黃斑部病變的治療，將視網膜色素上皮細胞或視網膜色素上皮移植到視網膜下的缺損部位的方法是一種有效的治療方法(專利文獻1：日本特表平9-501303號公報，專利文獻2：日本特開2008-173333號公報)。雖然已實行了將由老年性黃斑部病變患者的視網膜組織採集視網膜色素上皮細胞(作成伴隨脈絡膜之層)而成的細胞層片，移植至受到損傷的黃斑部分這樣的自體組織移植，但是該源自患者組織的細胞層片仍有下述問題：除了移植手術之外還增加了患者視網膜的切除手術所造成的侵入性風險，併發症的發病率高，並且移植後認定黃斑機能的改善和穩定維持的效果的比例低。

作為不倚賴患者視網膜的採取而利用在生物體外培養的視網膜色素上皮細胞和虹膜色素上皮細胞等色素上皮細胞的方法，已知有將在人工膜和羊膜上培養色素上皮細胞而製成的細胞層片用於移植中的方法。但是，人工膜的組成和性質、剛性等異於在生物體內的色素上皮細胞本身所生的基底膜，並且容易引發發炎和伴隨發炎的排斥反應，因此不適於移植用途。針對這點，已報導有一種簡易地製作細胞層片的方法，該細胞層片是以在生物體外培養的色素上皮細胞與該細胞本身所生的基底膜所構成者(例如，專利文獻3：WO2011/142364)。由該方法所獲得的細胞層片，在與用以培養的平面基材和細胞層片接觸之側的相反側處形成基底膜，因此不需要使用溫度響應性培養器材等特殊的培養器材或進行酵素處理，即能夠自平面基材剝離細胞層片，還能夠使基底膜接觸移植對象組織而不需將層片翻面，因此能夠簡化移植操作，並且伴隨與生物體相同成分的基底膜，所以容易植入，並具有剛性而處理性優異，因而適於移植治療用途。

然而，期望一種更簡便且效率佳的細胞層片的製作方法。此外，所製成的細胞層片要自培養皿剝離才能用於移植，但是剝離後的細胞層片會自支撐體(平面基材)分離，因此會有在醫療現場實行移植之前形狀容易變化而處理不易這樣的問題。

此外，以對移植後的色素上皮供給營養和氧氣為目的，已報導有一種細胞層片的製造方法，該細胞層片包含色素上皮細胞層及血管生成細胞層(專利文獻4：WO2014/030749)。

間質幹細胞(MSC：Mesenchymal stem cell)是具有多分化能力及自我複製能力之幹細胞，具有分化為骨母細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、肌肉細胞這樣的源自中胚層的細胞的能力，除此之外，還被報導有也能分化為源自外胚層的神經細胞和神經膠質細胞、源自內胚層的肝細胞的能力。MSC已知還具有歸巢效應、旁分泌效應及細胞黏著交互作用。認為MSC基於該等作用，能發揮目標組織和細胞的修復及再生能力以及抗發炎等免疫控制能力，其結果顯示了對各式各樣疾病的治療效果。

已報導有使用MSC的細胞移植療法，例如已報導有一種治療腎臟疾病的嘗試，其藉由將包含MSC之細胞層片組成物應用於腎臟(專利文獻5：日本特開2017-132744)。

雖然已報導有使用了各式各樣的細胞的細胞層片，但是仍尚未出現能夠應用於包含MSC和皮膚組織的細胞也就是纖維母細胞之各種種類的細胞的細胞層片的製作方法，而期望能夠確立一種能夠應用於範圍廣泛的細胞種類的細胞層片的製作方法。 [先前技術文獻] (專利文獻)

專利文獻1：日本特表平9-501303號公報。專利文獻2：日本特開2008-173333號公報。專利文獻3：WO2011/142364。專利文獻4：WO2014/030749。專利文獻5：日本特開2017-132744號公報。

[發明所欲解決的問題] 本發明的目的在於提供一種細胞層片的製作方法，其為簡便的細胞層片的製作方法，並且藉由該方法所製成的細胞層片容易處理。本發明的目的也在於提供一種簡便的細胞層片的製作方法，其能夠應用於各式各樣的細胞。 [解決問題的技術手段]

發明人致力於研究一種細胞層片的製作方法，其為簡便的細胞層片的製作方法，並且藉由該方法所製成的細胞層片容易處理，結果發現可利用底面具有多孔性膜之細胞培養容器來培養細胞，進而完成本發明。

本發明包含以下技術。 [1] 一種細胞層片的製作方法，其包含以下步驟：步驟(1)，將一種或複數種的源自哺乳動物的細胞進行調製；步驟(2)，將調製成的細胞播種於底面具有多孔性膜之第一細胞培養容器的前述多孔性膜上；及，步驟(3)，將前述第一細胞培養容器放入第二細胞培養容器中，然後培養細胞而將細胞層片製作於前述多孔性膜上。 [2] 如上述[1]所述之方法，其中，前述第一細胞培養容器中的培養液或前述第二細胞培養容器中的培養液中的至少一者，為包含血清及/或Rho激酶(ROCK)抑制劑之培養液。 [3] 如上述[1]或[2]所述之方法，其中，在步驟(1)中，源自哺乳動物的細胞為上皮細胞、內皮細胞、實質細胞或幹細胞。 [4] 如上述[3]所述之方法，其中，在步驟(1)中，源自哺乳動物的細胞是選自由色素上皮細胞(例如虹膜色素上皮細胞、視網膜色素上皮細胞)、纖維母細胞及間質幹細胞所組成之群組中的細胞。 [5] 如上述[1]～[4]中任一項所述之方法，其中，在步驟(2)中，細胞是以5000細胞數/mm ²(較佳是10000細胞數/mm ²)以上播種於底面上。 [6] 如上述[1]～[5]中任一項所述之方法，其中，在培養所獲得的細胞層片中，在細胞的與前述多孔性膜接觸之側的相反側形成有包含胞外基質之膜。 [7] 如上述[6]所述之方法，其中，培養所獲得的細胞層片進一步在細胞間形成有緊密連結(tight junction)。 [8] 如上述[6]或[7]所述之方法，其中，進一步包含以下的步驟(4)：步驟(4)，確認在細胞的與前述多孔性膜接觸之側的相反側是否形成包含胞外基質之膜。 [9] 如上述[1]～[8]中任一項所述之方法，其中，進一步包含以下的步驟(5)：步驟(5)，確認由步驟(3)所獲得的培養細胞中是否有分化標記的表現。前述分子標記如下：當前述源自哺乳動物的細胞是視網膜色素上皮細胞等或虹膜色素上皮細胞等上皮細胞時，較佳是選自由斑萎蛋白-1(Bestrophin-1)、RPE-65、泛細胞角蛋白及細胞角蛋白中的任一種次類型(subtype)、閉合蛋白(occludin)、ZO-1(封閉閉合-1)、彈性蛋白、肌動蛋白、1型膠原蛋白、2型膠原蛋白及4型膠原蛋白所組成之群組中的至少一種；當前述源自哺乳動物的細胞是上皮細胞時，較佳是選自由EpCAM及其任一種次類型、泛細胞角蛋白及細胞角蛋白中的任一種次類型所組成之群組中的至少一種；當前述源自哺乳動物的細胞是內皮細胞時，較佳是選自由CD31、CD34、CD45、ICAM-1/CD54、LYVE-1、Tie2/Tek、vWF(溫韋伯氏凝血因子，von Willebrand factor)、CD144、VCAM-1/CD106、VE鈣黏蛋白及VEGF-R2所組成之群組中的至少一種；當前述源自哺乳動物的細胞是纖維母細胞時，較佳是選自由HSP47、絲胺酸蛋白酶抑制劑(Serpin)H1、纖維母細胞特異性蛋白1、CD248(內皮唾液酸蛋白)、DDR-2、CD280 (Endo180)及波形蛋白所組成之群組中的至少一種；當前述源自哺乳動物的細胞是脂肪細胞時，較佳是PLN1及/或脂肪酸結合蛋白4；當前述源自哺乳動物的細胞是骨骼肌細胞時，較佳是肌鈣蛋白t型1及/或肌蛋白重鏈；當前述源自哺乳動物的細胞是平滑肌細胞時，較佳是選自由轉凝蛋白(Transgelin)、α-平滑肌肌動蛋白及鈣調蛋白所組成之群組中的至少一種；當前述源自哺乳動物的細胞是心肌細胞時，較佳是選自由脂肪酸結合蛋白3、心肌肌鈣蛋白T及Nkx2.5所組成之群組中的至少一種；當前述源自哺乳動物的細胞是肝臟幹細胞時，較佳是選自由EpCAM、E-鈣黏蛋白、CD133及CD29所組成之群組中的至少一種；當前述源自哺乳動物的細胞是神經細胞時，較佳是神經膠原纖維酸性蛋白、髓鞘鹼性蛋白及/或外周蛋白；當前述源自哺乳動物的細胞是間質幹細胞時，較佳是選自由CD73、CD90、CD105、CD11b、CD14、CD19、CD79α、CD34、CD45及HLA-DR所組成之群組中的至少一種；當前述源自哺乳動物的細胞是T細胞時，較佳是選自由CD3、CD4及CD8所組成之群組中的至少一種；當前述源自哺乳動物的細胞是B細胞時，較佳是選自由CD19、CD20、CD10、CD34、CD38、CD40及CD45R所組成之群組中的至少一種；當前述源自哺乳動物的細胞是自然殺手細胞時，較佳是選自由CD16、CD56及CD57所組成之群組中的至少一種；當前述源自哺乳動物的細胞是樹狀細胞時，較佳是選自由CD11c、HLA-DR、CD141、CD1c、CD11b、CD303、CD123及CD1a所組成之群組中的至少一種；當前述源自哺乳動物的細胞是造血幹細胞時，較佳是CD34及/或CD45；當前述源自哺乳動物的細胞是巨噬細胞時，較佳是選自由CD16、CD32、CD64、CD68、CD80及CD86所組成之群組中的至少一種。當前述源自哺乳動物的細胞是間質幹細胞時，特別更佳是CD73及/或CD90呈陽性且CD11b或CD14、CD19或CD79α、CD34、CD45及HLA-DR呈陰性。 [10] 如上述[1]～[9]中任一項所述之方法，其中，進一步包含以下的步驟(5’)：步驟(5’)，確認由步驟(3)所獲得的培養細胞是否分泌可溶性Flt-1(VEGF受體1)及/或TIMP-3。 [11] 如上述[1]～[10]中任一項所述之方法，其中，在步驟(1)中，前述源自哺乳動物的細胞是視網膜色素上皮細胞或虹膜色素上皮細胞等色素上皮細胞、間質幹細胞或纖維母細胞，並且細胞是以5000細胞數/mm ²(較佳是10000細胞數/mm ²)～40000細胞數/mm ²播種於底面上。 [12] 一種細胞層片，其是由上述[1]～[11]中任一項所述之方法所製成。 [13] 一種疾病治療用移植材料，其包含由上述[1]～[11]中任一項所述之方法所製成的細胞層片。 [14] 一種包含胞外基質之膜(例如，當使用上皮細胞時為基底膜，特別是使用視網膜色素上皮細胞時為布魯赫膜(Bruch's membrane))的製作方法，該製作方法中包含如下步驟：將形成於細胞層片的包含胞外基質之膜進行分離，該細胞層片是由上述[1]～[11]中任一項所述之方法所製成。 [15] 一種細胞層片，其是被配置於多孔性膜上者，在該細胞層片中，在細胞間存在有胞外基質，且在與前述多孔性膜接觸之側的相反側形成有包含胞外基質之膜(例如，當使用上皮細胞時為基底膜，特別是使用視網膜色素上皮細胞時為布魯赫膜)。 [16] 如上述[15]所述之細胞層片，其中，前述細胞層片進一步在細胞間形成有緊密連結。 [17] 如上述[15]或[16]所述之細胞層片，其中，前述細胞層片是藉由如下方式獲得：將1種或複數種的源自哺乳動物的細胞播種於底面具備前述多孔性膜之第一細胞培養容器的多孔性膜上，然後將該第一細胞培養容器放入第二細胞培養容器中進行培養。 [18] 如上述[17]所述之細胞層片，其中，前述第一細胞培養容器中的培養液或前述第二細胞培養容器中的培養液中的至少一者，為包含血清及/或Rho激酶(ROCK)抑制劑之培養液。 [19] 如上述[15]～[18]中任一項所述之細胞層片，其中，前述源自哺乳動物的細胞為上皮細胞、內皮細胞、實質細胞或幹細胞。 [20] 如上述[19]所述之細胞層片，其中，前述源自哺乳動物的細胞是選自由色素上皮細胞(例如：視網膜色素上皮細胞、虹膜色素上皮細胞)、纖維母細胞及間質幹細胞所組成之群組中的細胞。 [21] 如上述[20]所述之細胞層片，其中，前述源自哺乳動物的細胞是視網膜色素上皮細胞或虹膜色素上皮細胞。 [22] 如上述[15]～[21]中任一項所述之細胞層片，其中，前述細胞層片中所包含的細胞表現選自下述群組中的至少一種分子標記，該群組是由斑萎蛋白-1、RPE-65、泛細胞角蛋白及細胞角蛋白中的任一種次類型、閉合蛋白、ZO-1、彈性蛋白、肌動蛋白、1型膠原蛋白、2型膠原蛋白及4型膠原蛋白所組成。 [23] 如上述[15]～[22]中任一項所述之細胞層片，其中，前述細胞層片中所包含的細胞分泌可溶性Flt-1(VEGF受體1)及/或TIMP-3。 [24] 一種多層化細胞層片的製造方法，其包含下述步驟(1)～(4)：步驟(1)，將一種或複數種的源自哺乳動物的細胞進行調製；步驟(2)，將調製成的細胞播種於底面具有多孔性膜之第一細胞培養容器的前述多孔性膜上；步驟(3)，將前述第一細胞培養容器進一步放入第二細胞培養容器中，然後培養細胞而將細胞層片製作於前述多孔性膜上；及，步驟(4)，重複一次以上的下述步驟(a)及(b)，步驟(a)，將一種或複數種的源自哺乳動物的細胞播種於形成於第一細胞培養容器內的細胞層片上，步驟(b)，將前述第一細胞培養容器放入第二細胞培養容器中，然後培養細胞而在前述細胞層片上製作新的細胞層片。 [25] 一種多層細胞層片，其是由上述[24]所述之方法所製造。 [26] 一種多層細胞層片，其是被配置於多孔性膜上者，在多層細胞層片所包含的各細胞層片中，在細胞間存在有胞外基質，且在與前述多孔性膜接觸之側的相反側形成有包含胞外基質之膜。 [發明的效果]

藉由本發明，可提供一種細胞層片的製作方法，其為簡便的細胞層片的製作方法，並且藉由該方法所製成的細胞層片容易處理。以本發明的方法所獲得的細胞層片，能夠藉由賦予物理性的力，例如由移液產生的水流等而使細胞層片容易自細胞容器分離，並且也具備剛性，因此能夠藉由使用微細的軟管等進行抽吸或排出，在移植時使細胞層片到達目標的移植部位而不需實行大範圍的切開。

以下，以例示性的實施態樣為例，將本發明與本發明的實施時能夠使用的較佳態樣及材料一併進行說明，但是本發明不限於以下所記載的態樣。再者，若說明書中沒有特別說明，本說明書中使用的全部的技術用語及科學用語，與本發明所屬技術領域中具有通常知識者所一般性理解的意涵具備相同意涵。此外，與本說明書中所記載的態樣相同或者相同的任意材料及方法，能夠同樣地使用於本發明的實施中。此外，與本發明相關而被引用於本說明書中的全部的刊物及專利，例如能夠作為另外表示能夠用於本發明中的方法和材料的態樣，而成為被引用至本說明書中進而構成本說明書的一部分者。

本說明書中，顯示數值範圍的「A～B」的記載，意指包含端點也就是A及B之數值範圍。此外，針對「A乃至B」的記載亦同。此外，本說明書中，所謂「約」是使用來表示容許±10%的意義。

本發明的細胞層片的製作方法包含以下的步驟(1)～(3)。步驟(1)，將一種或複數種的源自哺乳動物的細胞進行調製；步驟(2)，將調製成的細胞播種於底面具有多孔性膜之第一細胞培養容器的前述多孔性膜上；及，步驟(3)，將前述第一細胞培養容器進一步放入第二細胞培養容器中，然後培養細胞而將細胞層片製作於前述多孔性膜上。

在本發明的方法中，利用步驟(1)來將一種或複數種的源自哺乳動物的細胞調製為典型的細胞懸浮液。在步驟(1)中所調製的源自哺乳動物的細胞，只要是源自哺乳動物的細胞即可，並無特別限定，能夠列舉例如源自人類、猴、小鼠、大鼠、狗、牛、馬、豬、綿羊、山羊、貓、兔子、倉鼠、豚鼠的細胞。較佳是源自人類的細胞。

作為進行調製的細胞的細胞種類，並無特別限定，能夠列舉例如：上皮細胞、內皮細胞、實質細胞或幹細胞。此外，作為細胞種類，可以是黏著性細胞，也可以是非黏著性細胞，但是較佳是黏著性細胞。具體而言，雖然不限於此，可列舉例如：肝臟的實質細胞也就是肝臟細胞；庫弗細胞、血管內皮細胞和角膜內皮細胞等內皮細胞；纖維母細胞、骨母細胞、破骨細胞、源自牙周膜的細胞、表皮基底細胞等表皮細胞；氣管上皮細胞、消化道上皮細胞、子宮頸上皮細胞、結膜上皮細胞、角膜上皮細胞、虹膜色素上皮細胞、視網膜色素上皮細胞等上皮細胞；乳腺細胞；外被細胞；平滑肌細胞和心肌細胞等肌肉細胞；腎臟細胞；胰臟蘭氏小島細胞；末梢神經細胞和視神經細胞等神經細胞；軟骨細胞；骨細胞；多能幹細胞、胚胎幹細胞(ES細胞)、誘導性富潛能幹細胞(iPS細胞)、間質幹細胞、造血幹細胞、神經幹細胞、心肌幹細胞、肝臟幹細胞、骨骼肌幹細胞、上皮幹細胞、表皮幹細胞、視網膜幹細胞、脂肪幹細胞等未分化的幹細胞及該等幹細胞衍生的細胞等。較佳可列舉角膜內皮細胞、氣管上皮細胞、消化道上皮細胞、子宮頸上皮細胞、角膜上皮細胞、視網膜色素上皮細胞、纖維母細胞、間質幹細胞；更佳可列舉角膜上皮細胞、角膜內皮細胞、視網膜色素上皮細胞、纖維母細胞、間質幹細胞、iPS細胞及iPS細胞衍生的分化細胞、ES細胞及ES細胞衍生的分化細胞；最佳可列舉視網膜色素上皮細胞、纖維母細胞、間質幹細胞。能夠使用該等細胞並藉由本發明的方法來製作細胞層片。

要調製的細胞，可以是由組織和器官直接採取的初代細胞，或者可以是將該等初代細胞進行數代的繼代培養而成的細胞。進一步，細胞可以是如下幹細胞，也可以是將該等幹細胞進行分化誘導所獲得的細胞，該等幹細胞包含：未分化細胞也就是胚胎幹細胞(ES細胞)、具有多分化潛能之間質幹細胞等多潛能幹細胞、由體細胞製成的人工多潛能幹細胞(iPS細胞)或者具有單分化潛能之血管內皮前驅細胞等單潛能幹細胞。ES細胞可以是自體細胞經細胞核重新編程(nuclear reprogramming)而生的ES細胞。iPS細胞能夠藉由將某一特定的重新編程化物質(核酸、蛋白質、低分子化合物等)導入體細胞來製造，並且為具有與ES細胞同等特性之體細胞衍生的人工幹細胞。此外，可藉由將人工多潛能幹細胞(iPS細胞)和ES細胞等幹細胞進行分化誘導來調製目標細胞。使前述幹細胞分化為目標的經分化的細胞的條件及培養基，能夠依據習知的條件及培養基來進行，本發明所屬技術領域中具有通常知識者可適當地設定。當將由本發明所製成的細胞層片用作移植用時，作為iPS細胞來源，能夠使用藉由使用基因體編輯等手法使組織相容性抗原刪除或改變而成的iPS細胞，或者將要進行移植的對象的體細胞。從由該等iPS細胞所獲得的細胞層片會成為相對於對象不具抗原性的細胞層片這點來看，較佳是使用iPS細胞。

當用於本發明的步驟(1)的源自哺乳動物的細胞為視網膜色素上皮細胞或虹膜色素上皮細胞等色素上皮細胞時，哺乳動物與前述相同，較佳是人類。此外，該視網膜色素上皮細胞是幹細胞衍生的分化細胞或源自眼球的細胞。源自眼球的視網膜色素上皮細胞，能夠藉由如下方式獲得：摘取屍體眼球後，迅速地在赤道部將眼球分割，去除玻璃體與視網膜後，藉由細胞刮勺進行刮取或以胰蛋白酶和EDTA溶液使細胞自布魯赫膜游離來進行回收後，藉由靜置於培養液中進行對培養皿的黏著、誘導增殖，由此使需要量的細胞增殖，並以胰蛋白酶處理等適當地繼代來確保細胞數量。當使幹細胞進行分化誘導時，利用添加有Dkk-1(Wnt拮抗劑)及Lefty A(Nodal拮抗劑)之ES細胞分化培養基培養人類ES細胞或iPS細胞。藉由培養規定期間會表現視網膜前驅細胞標記也就是Rx、Pax6、Mitf藉由光學顯微鏡觀察進行的形態觀察來確認多角形形態，藉此即能夠獲得人類視網膜色素上皮細胞。

當用於本發明的步驟(1)的源自哺乳動物的細胞為纖維母細胞時，哺乳動物與前述相同，較佳是人類。調製該纖維母細胞的方法並無特別限定，能夠使用習知的方法。例如，能夠利用酵素消化各種源自生物體的組織等進行分離而藉此進行調製，但是不限於此。該源自生物體的組織的非限定性的示例包含哺乳動物的真皮組織。

當用於本發明的步驟(1)的源自哺乳動物的細胞為間質幹細胞時，哺乳動物與前述相同，較佳是人類。此外，該間質幹細胞能夠由各種的組織獲得。並無限定於此，但能夠列舉例如：源自骨髓、源自臍帶、源自臍帶血、源自子宮內膜、源自胎盤、源自羊膜、源自絨毛膜、源自蛻膜、源自真皮、源自牙囊、源自牙周膜、源自牙髓、源自牙胚、源自脂肪組織、源自血管(周圍)、源自骨骼肌、源自滑膜等間質幹細胞。間質幹細胞的調製方法並無特別限定，能夠使用習知的方法。例如能夠利用酵素消化各種源自生物體的組織等進行分離而藉此進行調製，但是不限於此。該源自生物體的組織的非限定性的示例包含哺乳動物的骨髓、臍帶、脂肪。

作為用於本發明的步驟(1)的源自哺乳動物的細胞，能夠使用1種或複數種的細胞。當使用複數種的細胞時，其組合並無特別限定，能夠在本申請案發明的目的範圍內適當地選擇。例如，能夠組合源自相同或不同的組織的細胞、源自相同或不同的動物種類的細胞來使用。進行組合的細胞種類的數量並無特別限定。例如能夠使用組合2種以上、3種以上、4種以上、5種以上、6種以上、7種以上、8種以上、9種以上、10種以上的細胞種類來使用。

當將細胞調製成細胞懸浮液時，懸浮用液只要是具有一般將活細胞進行懸浮時所用的成分之液體即可，並無特別限定。細胞懸浮用液能夠使用該技術領域中使用的習知方法來調製。在一態樣中，該細胞懸浮用液可以是包含用以培養細胞的成分之細胞培養液。在一態樣中，可以在播種細胞後將包含用以培養細胞的成分之細胞培養液添加至第一細胞培養容器內。在另一態樣中，在播種細胞之前，可以預先將細胞培養液添加至第一細胞培養容器內。

步驟(2)中，將前述調製成的細胞播種於底面具有多孔性膜之第一細胞培養容器的多孔性膜上，然後添加培養液。當前述調製成的細胞為細胞以適於培養的濃度懸浮於培養基中而成的細胞懸浮液時，可不添加培養液。第一細胞培養容器的形狀，只要能夠保持經調製的細胞並且能夠將多孔性膜設置於底面即可，並無特別限制。多孔性膜的材料並無特別限制，可以是樹脂製、金屬製、玻璃製中的任一種。

作為形成多孔性膜的樹脂，可列舉：低密度聚乙烯、高密度聚乙烯、超高分子量聚乙烯等各種聚乙烯和聚萘二甲酸乙二醇酯；聚丙烯、聚甲基丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸甲酯-苯乙烯共聚物、聚苯乙烯；聚四氟乙烯和聚二氟乙烯等氟樹脂；乙烯-乙酸乙烯酯共聚物、聚醯胺、苯乙烯-丙烯腈共聚物、苯乙烯-丁二烯-丙烯腈三元共聚物、聚碳酸酯、聚氯乙烯等。該等之中，由聚四氟乙烯和聚二氟乙烯等氟樹脂所形成的多孔性樹脂薄膜，不僅保存液的吸收性優異，在顯微鏡觀察下細胞的能見度也優異，因而較佳。

作為形成多孔性膜的金屬，可列舉：銅、銅合金、鋁、鋁合金、金、金合金、銀、銀合金、錫、鋅、鉛、鈦、鎳、不銹鋼等。進一步，也能夠利用由二氧化矽、氧化鋁、鋯等金屬氧化物所構成之多孔性膜。此外，多孔性金屬及多孔性金屬氧化物膜，可以是分別含有2種以上的上述金屬及金屬氧化物之多孔性膜。

多孔性樹脂、多孔性金屬、多孔性金屬氧化物及多孔性玻璃製的多孔性膜的多孔體的孔徑，只要是所使用的細胞不會通過的程度的尺寸即可，並無特別限定。例如能夠使用具有小於10 μm、9 μm、8 μm、7 μm、6 μm、5 μm、4 μm、3 μm、2 μm、1 μm的孔徑之多孔性膜。一態樣中，較佳是具有小於3 μm的孔徑。

多孔性膜，以使與黏著性細胞的黏著性提升為目的，可以施有表面處理，但是為了使本發明的細胞層片容易進行自平面基材剝離的步驟，也可以不要進行處理。當要進行處理時，例如也可以藉由膠原蛋白、明膠、基質凝膠(Matrigel)、聚-L-離胺酸、聚-D-離胺酸、層連結蛋白、纖維連接蛋白等進行表面處理。

當要將細胞播種於多孔性膜上時，藉由以高密度播種細胞，能夠抑制層片的萎縮。本說明中所謂的「高密度」，意指在源自所調製的細胞的正常組織中所觀察到的細胞密度以上的密度。此外，其上限能夠由所屬技術領域中具有通常知識者適當地決定，例如是細胞彼此互相密合的密度且不會由於過度播種造成層片形成缺陷、細胞死亡程度的細胞密度。更具體而言，所謂「高密度」，較佳是設為一般培養時的建議播種密度的2.5倍以上，例如意指相對於在正常組織中所觀察到的細胞密度，例如1～100倍的細胞密度，較佳是1.2～50倍，更佳是2.5～30倍左右。作為在正常組織中所觀察到的細胞密度，會因組織的種類而異，例如能夠設為1000細胞數/mm ²以上、2000細胞數/mm ²以上、3000細胞數/mm ²以上、4000細胞數/mm ²以上、5000細胞數/mm ²以上。更具體而言，較佳是設為如下：針對角膜內皮為約3000細胞數/mm ²以上，針對視網膜色素上皮細胞為約4000細胞數/mm ²以上，針對間質幹細胞為約200細胞數/mm ²以上，針對纖維母細胞為約5000細胞數/mm ²以上。

當源自哺乳動物的細胞為視網膜色素上皮細胞時，所謂「高密度」意指「在正常的眼球中所觀察到的細胞密度以上的密度」。作為這樣的密度，具體而言至少為4000細胞數/mm ²以上。但是，即便是在正常的眼球中所觀察到的細胞密度以上的密度，以規定的密度以下播種於平面基材上時，有時所形成的細胞層片本身會受到收縮力作用，而無法維持播種時的面積。這被推測是由於如下原因而導致無法維持播種時的面積：為了使視網膜色素上皮的血清接觸面被包覆會有一定數量的細胞受到動員、細胞密度存在不均及細胞自身的生存率。但是，即便是這樣經收縮的層片，仍能夠利用於後述的用途而不會有特別的問題。從而，所謂「在正常的眼球中所觀察到的細胞密度以上的密度」，當容許所形成的細胞層片自播種時的面積收縮時，較佳是約5000細胞數/mm ²左右以上，更佳是約10000細胞數/mm ²左右以上，當使所形成的細胞層片維持播種時的面積時，較佳是約20000細胞數/mm ²左右以上。此外，作為其上限，為不會誘發由於過度地細胞播種造成層片形成缺陷、部分的細胞死亡的密度。當也考量這樣的上限時，所謂「在正常的眼球中所觀察到的細胞密度以上的密度」，較佳可以是約5000細胞數/mm ²～約200000細胞數/mm ²，更佳是約10000細胞數/mm ²～約120000細胞數/mm ²，特佳是約20000細胞數/mm ²～約40000細胞數/mm ²。

當源自哺乳動物的細胞為間質幹細胞時，所謂「高密度」意指「在一般的細胞培養時進行播種的密度以上的密度」。例如，當為間質幹細胞時，作為其密度，具體而言作為下限例如是約200細胞數/mm ²，較佳是約1000細胞數/mm ²，更佳是約1200細胞數/mm ²，進一步較佳是約5000細胞數/mm ²，作為其中一上限，例如可以是約200000細胞數/mm ²，較佳是約120000細胞數/mm ²，更佳是約60000細胞數/mm ²，進一步較佳是約40000細胞數/mm ²。較佳範圍可以是約1000細胞數/mm ²～約200000細胞數/mm ²，更佳是約3000細胞數/mm ²～約120000細胞數/mm ²，進一步較佳是約5000細胞數/mm ²～約60000細胞數/mm ²，特佳是約10000細胞數/mm ²～約40000細胞數/mm ²。當源自哺乳動物的細胞是iPS細胞和ES細胞等其他幹細胞時，所謂「高密度」與間質幹細胞中的「高密度」相同。

當源自哺乳動物的細胞為纖維母細胞時，所謂「高密度」意指「在一般的細胞培養時進行播種的密度以上的密度」。作為這樣的密度，具體而言可以是約5000細胞數/mm ²～約200000細胞數/mm ²，更佳是約10000細胞數/mm ²～約12000細胞數/mm ²，進一步較佳是約10000細胞數/mm ²～約60000細胞數/mm ²，特佳是約20000細胞數/mm ²～約40000細胞數/mm ²。

步驟(3)中，將第一細胞培養容器放入第二細胞培養容器。在該步驟中，細胞培養液的對第一細胞培養容器的添加與對第二細胞培養容器的添加能夠在各式各樣的時間點進行。例如，可以在將培養液添加至已播種有細胞的第一細胞培養容器後，將第一細胞培養容器放入已預先添加有培養液之第二培養容器。在另一態樣中，可以在將已播種有細胞的第一細胞培養容器放入已預先添加有培養液之第二培養容器後，對第一細胞培養容器添加培養液。之後，藉由將細胞進行培養，能夠形成單層或多層狀的細胞集團，並且能夠製作細胞層片。

作為培養液，只是要是該技術領域中一般所用的細胞培養用培養基即能夠使用，並無特別限制。例如，依據所用的細胞的種類，能夠使用朝倉書店所出版的「日本組織培養學會編撰組織培養的技術第三版」第581頁所記載的基礎培養基：F-10培養基、F12培養基、MEM、BME培養基、DMEM、αMEM、IMD培養基、ES培養基、DM-160培養基、Fisher培養基、WE培養基及RPMI1640培養基等。進一步，能夠在上述基礎培養基中添加血清(胎牛血清等)、各種增殖因子、抗生素、胺基酸等，較佳是使用添加有血清及/或Rho激酶(ROCK)抑制劑之培養液。藉由添加Rho激酶(ROCK)抑制劑，即便是高密度的培養仍可防止細胞凋亡，而能夠獲得品質良好的細胞層片。培養基的pH較佳是約6～約8。培養通常在約30～約40℃、約6～約168小時的條件實行。依據需要，可以進行培養基的交換及/或補充、通氣或攪拌。

Rho激酶(ROCK)抑制劑，是一種絲胺酸-蘇胺酸蛋白質磷酸化酵素，其被鑑別為低分子量GTP鍵結蛋白質Rho的目標蛋白質。其抑制劑也就是ROCK抑制劑已有市售，該等市售品能用於本發明中而無限制。作為用於本發明的ROCK抑制劑，不限於此，能夠列舉例如Y27632、HA1077，較佳是HA1077。用於本發明的Rho激酶抑制劑的濃度，能夠列舉例如1～50 μM，較佳是2～30 μM，更佳是5～20 μM。

第二細胞培養容器只要能夠倒入培養液且為一班的細胞培養用的培養容器即可，並無特別限定，能夠列舉例如：皿(dish)、培養皿、組織培養用皿、多皿(multidish)、微量盤(microplate)、微量多孔盤(microwell plate)、多盤(multiplate)、多孔盤(multiwall plate)、細胞培養玻片(Chamber Slides)、玻璃培養皿(Schale)、托盤等。作為培養容器的材質，能夠列舉例如：金屬、玻璃、陶瓷、矽膠等無機材料；由彈性體、塑膠(例如：聚酯樹脂、聚乙烯樹脂、聚丙烯樹脂、ABS樹脂、尼龍、丙烯酸樹脂、氟樹脂、聚碳酸酯樹脂、聚胺酯樹脂、甲基戊烯樹脂、酚醛樹脂、三聚氰胺樹脂、環氧樹脂、氯乙烯樹脂等)所代表的有機材料，但是不限於此。

作為能夠用於本發明的方法的底面具有多孔性膜之第一細胞培養容器及第二細胞培養容器之組合，例如也能夠使用市售品。作為第一及第二細胞培養容器，能夠列舉的細胞培養小杯(細胞培養小杯的底面由多孔性膜所構成)與可放入小杯的培養容器，該等容器是康寧股份有限公司(Corining International Inc.)、賽默飛世爾科技公司(Thermo Scientific Inc.)、格瑞納生技第一有限公司(Greiner Bio-One International)等所提供。作為第一細胞培養容器，例如有康寧股份有限公司製的Transwell(註冊商標)滲透性支持物、Snapwell(商標)小杯、Netwell(商標)小杯、Falcon細胞培養小杯等，並且能夠適用於本發明中。此外，作為第二細胞培養容器，例如有康寧股份有限公司製的Falcon細胞培養板、Falcon 多細胞培養板(康寧)等，並且能夠適用於本發明中。本發明的方法中，能夠黏著細胞的面設為多孔性膜的結構，雖然不限於此，但是認為從能夠自上下對細胞層片供給營養和供給氧氣的點來看有助於培養。此外，藉由培養所製成的細胞層片，被保持於第一細胞培養容器的底面的多孔性膜上，所以能夠與細胞培養小杯一起移動和運輸，而能夠以穩定地保持細胞的狀態進行移動和運輸。因此，用於移植時，在實行移植的醫療現場中能夠自細胞培養小杯的底面剝離細胞層片來使用，而容易操作。

由本發明的方法所獲得的細胞層片具有胞外基質，藉此，層片會變得強韌而容易維持形狀。因此，雖然不限於此，例如變得能夠使用微量吸管等的細管進行抽吸或排出，並且能夠進行對自個體表面難以到達之處的層片移植。

由本發明的方法所獲得的細胞層片也可在細胞的與多孔性膜接觸之側的相反側形成有包含胞外基質之膜。所謂與多孔性膜接觸之側的相反側，為細胞與培養液的接觸面側。因此，本發明的方法可以進一步包含以下的步驟(4)。步驟(4)，確認在細胞的與多孔性膜接觸之側的相反側是否形成有包含胞外基質之膜。當使用視網膜色素上皮細胞或虹膜色素上皮細胞等色素上皮細胞時，步驟(4)為確認布魯赫膜的形成的步驟。包含胞外基質之膜的形成，能夠藉由如下方式確認：利用免疫染色觀察彈性蛋白、1型膠原蛋白或4型膠原蛋白等在細胞表面的表現、和藉由西方墨點法觀察蛋白質的表現。

在由本發明的方法所獲得的細胞層片中，還可形成緊密連結。緊密連結形成能夠利用觀察六角形且互相密合的細胞形態與利用免疫染色觀察細胞間所特有的蛋白質等的表現來確認。會進行表現的特有的蛋白質等會因使用的細胞種類而異，能夠參照習知的資訊來適當選擇。例如，當使用上皮細胞時，藉由觀察閉合蛋白、ZO-1等的表現即能夠確認緊密連結的形成。

本發明的方法可進一步包含以下的步驟(5)。步驟(5)，確認由步驟(3)所獲得的培養細胞中是否有分化標記的表現。藉由在步驟(5)中確認由步驟(3)所獲得的培養細胞中是否有分化標記的表現，能夠判斷細胞薄片完成的情況。本說明書中，分化標記只要表現於細胞的任意之處(例如：細胞質、細胞膜、核膜等)即可。

作為本說明書中的「分化標記」，包含有基因的轉錄產物、轉譯產物或其分解產物，該等基因是在經分化的細胞中特異性地表現，或者與其他分化細胞或未分化細胞、前驅細胞相比表現會增加或減少者。分化標記例示如下。

當源自哺乳動物的細胞是使用視網膜色素上皮細胞或虹膜色素上皮細胞等色素上皮細胞時，較佳是選自由斑萎蛋白-1、RPE-65、泛細胞角蛋白及細胞角蛋白中的任一種次類型、閉合蛋白、ZO-1、彈性蛋白、肌動蛋白、1型膠原蛋白、2型膠原蛋白及4型膠原蛋白所組成之群組中的至少一種。

當源自哺乳動物的細胞是上皮細胞時，較佳是選自由EpCAM及其任一種次類型、泛細胞角蛋白及細胞角蛋白中的任一種次類型所組成之群組中的至少一種。

當源自哺乳動物的細胞是內皮細胞時，較佳是選自由CD31、CD34、CD45、ICAM-1/CD54、LYVE-1、Tie2/Tek、vWF(溫韋伯氏凝血因子)、CD144、VCAM-1/CD106、VE鈣黏蛋白及VEGF-R2所組成之群組中的至少一種，更佳是CD31及/或CD34

當源自哺乳動物的細胞是纖維母細胞時，較佳是選自由HSP47、SerpinH1、纖維母細胞特異性蛋白1、CD248(內皮唾液酸蛋白)、DDR-2、CD280 (Endo180)及波形蛋白所組成之群組中的至少一種。

當前述源自哺乳動物的細胞是脂肪細胞時，較佳是PLN1及/或脂肪酸結合蛋白4。

當源自哺乳動物的細胞是骨骼肌細胞時，較佳是肌鈣蛋白t型1及/或肌蛋白重鏈。

當源自哺乳動物的細胞是平滑肌細胞時，較佳是選自由轉凝蛋白、α-平滑肌肌動蛋白及鈣調蛋白所組成之群組中的至少一種。

當源自哺乳動物的細胞是心肌細胞時，較佳是選自由脂肪酸結合蛋白3、心肌肌鈣蛋白T及Nkx2.5所組成之群組中的至少一種。

當源自哺乳動物的細胞是肝臟幹細胞時，較佳是選自由EpCAM、E-鈣黏蛋白、CD133及CD29所組成之群組中的至少一種。

當源自哺乳動物的細胞是神經細胞時，較佳是神經膠原纖維酸性蛋白、髓鞘鹼性蛋白及/或外周蛋白。

當源自哺乳動物的細胞是T細胞時，較佳是選自由CD3、CD4及CD8所組成之群組中的至少一種。

當源自哺乳動物的細胞是B細胞時，較佳是選自由CD19、CD20、CD10、CD34、CD38、CD40及CD45R所組成之群組中的至少一種。

當源自哺乳動物的細胞是自然殺手細胞時，較佳是選自由CD16、CD56及CD57所組成之群組中的至少一種。

當源自哺乳動物的細胞是樹狀細胞時，較佳是選自由CD11c、HLA-DR、CD141、CD1c、CD11b、CD303、CD123及CD1a所組成之群組中的至少一種。

當源自哺乳動物的細胞是造血幹細胞時，較佳是CD34及/或CD45。

當源自哺乳動物的細胞是巨噬細胞時，較佳是選自由CD16、CD32、CD64、CD68、CD80及CD86所組成之群組中的至少一種。

當源自哺乳動物的細胞是間質幹細胞時，較佳是選自由CD73、CD90、CD105、CD11b、CD14、CD19、CD79α、CD34、CD45及HLA-DR所組成之群組中的至少一種。特別更佳是CD73及/或CD90呈陽性且CD11b或CD14、CD19或CD79α、CD34、CD45及HLA-DR呈陰性。

當源自哺乳動物的細胞是iPS細胞衍生的分化細胞或ES細胞衍生的分化細胞時，依據所製作的分化細胞的種類或細胞層片的利用目的，能夠適當選擇分化標記。

此外，作為神經細胞分化標記，可列舉：微管蛋白(特別是β-微管蛋白)、MAP2、神經絲、神經元特異性烯醇化酶；作為脂肪細胞分化標記，可列舉：aP2、甘油磷酸脫氫酶、降脂蛋白(adipsin)、瘦素；作為骨母細胞分化標記，如前膠原1α1、RUNX2、鹼性磷酸酶、骨橋蛋白、骨鈣蛋白等。

作為用於「確認是否有分化標記的表現」的樣品，是源自由步驟(3)所培養的細胞的樣品，只要含有分化標記(例如：RNA、蛋白質、其分解產物等)者即可，並無特別限制。

當上述樣品為細胞時，對由步驟(3)所培養的細胞實行免疫染色，即能夠利用例如流式細胞儀測定該分化標記的表現量。

當上述樣品為RNA時，從由步驟(3)所培養的細胞調製RNA(例如：總RNA、mRNA)部分，檢測該部分中所包含的該標記基因的轉錄產物，或者不從該細胞萃取RNA而直接檢測細胞中的標記基因產物，藉此即能夠調查分化標記基因的表現。從細胞進行RNA(例如：總RNA、mRNA)部分的調製，能夠依據一般方法來實行，例如能夠使用市售的RNA萃取用套組來實行。作為檢測RNA部分中的分化標記基因的轉錄產物的手段，可列舉使用雜交法(北方墨點法、點漬法、DNA晶片分析等)的方法、或使用PCR(RT-PCR、競爭性PCR、即時定量PCR等)的方法等，但是較佳是定量性PCR或DNA晶片分析。當不從細胞萃取RNA地檢測標記基因時，作為檢測手段，能夠使用in situ(原位)雜交，從在細胞的血清接觸面能夠直接確認分化標記的表現這點來看，適用於本發明中。

或者，分化標記基因的表現的確認，能夠藉由如下方式調查：從該細胞調製蛋白質部分，檢測該部分中所包含的該標記基因的轉譯產物(亦即，標記蛋白質)；或者由不從該細胞萃取蛋白質而直接檢測細胞中的標記基因的轉譯產物。標記蛋白質的檢測，能夠使用針對各蛋白質的抗體，藉由免疫學性側定法(例如：ELISA(酵素連結免疫吸附分析法)、FIA(免疫螢光分析法)、RIA(放射免疫分析法)、西法墨點法等)來實行，關於酵素等的可表現能測定的生理活性的蛋白質，也可以針對各標記蛋白質使用習知的手法來測定該生理活性來實行。或者，標記蛋白質的檢測也能夠使用MALDI-TOFMS(Matrix assisted laser desorption/ionization-Time of Flight Mass Spectrometry，基質輔助雷射脫附游離/飛行時間質譜法)等質量分析法來實行。

在較佳的一態樣中，藉由本發明的方法所製成的細胞層片中所包含的細胞，能夠分泌抑制新生血管產生的因子。例如，雖然不限於此，藉由本發明的方法由虹膜色素上皮細胞所製成的細胞層片，能夠分泌出抑制脈絡膜新生血管產生的因子也就是可溶性Flt-1(VEGF受體1)和TIMP-3。

在其他較佳的一態樣中，藉由本發明的方法所製成的細胞層片中所包含的細胞，不易引發細胞的遷移，而大致不會發現由於細胞的遷移所造成的來自細胞層片的細胞的脫落。

藉由本發明的方法所製成的細胞層片具備剛性，還不易引發來自細胞層片的細胞的遷移。本發明的細胞層片，能夠適用於截至目前仍使用藉由細胞的懸浮液進行的投予方法的生物體內的局部，而不易引發由懸浮液造成問題的細胞的遷移。因而，本發明的細胞層片能夠使用於較佳進行局部投予的對象疾病。

以下，針對使用視網膜色素上皮細胞或虹膜色素上皮細胞等色素上皮細胞並藉由本發明的方法來製作細胞層片的態樣進行說明，但是本發明不限於此。當使用視網膜色素上皮細胞並藉由本發明的方法來製作細胞層片時，上述步驟(4)中的包含胞外基質之膜，在一態樣中為布魯赫膜。所謂「布魯赫膜」，是位於視網膜色素上皮與脈絡膜之間的薄膜，並且是作為視網膜色素上皮的後盾之層。布魯赫膜是以膠原纖維為主體的無細胞性結構，脈絡膜與色素上皮細胞會進行黏著，並且可發揮自脈絡膜將物質輸送往不具血管之視網膜外層的流道的作用。本發明的方法中，藉由形成細胞本身產生的包含胞外基質之膜，例如基底膜和包含彈性纖維之布魯赫膜，可獲得能耐受移植操作的強度。此外，本發明的方法中，包含胞外基質之膜能夠被形成於細胞的與多孔性膜接觸之側的相反側，因此，以整個包含胞外基質之膜的方式將細胞層片自第一細胞培養容器分離是容易的。

本發明還提供一種包含胞外基質之膜的in vitro(體外)製作方法，該製作方法的特徵在於，在前述細胞層片的製作方法中，將所形成的包含胞外基質之膜自細胞層片分離。被形成於視網膜色素上皮上的包含胞外基質之膜，藉由進行EDTA處理，或者藉由利用未添加鎂、鉀之培養基在層片表面進行移液、抽吸操作，即能夠由層片剝離並回收。此外，藉由如下方法也能夠將膜進行剝離、回收：抽吸培養液而使其與空氣接觸和藉由稀釋醇的處理來對層片表面施加脫水作用。

本發明還關於一種依據前述細胞層片製作方法所獲得的細胞層片，較佳是關於視網膜色素上皮細胞層片或虹膜色素上皮細胞層片等色素上皮細胞層片。本發明的細胞層片，作為生物體的用途，例如能夠用於篩檢用途、毒性試驗用途與各式各樣的用途。此外，本發明的細胞層片能夠作為疾病治療用移植材料來適當地移植至需要組織移植的對象。特別是，本發明的視網膜色素上皮細胞層片，適於作為對眼部疾病患者的視網膜治療用移植材料。作為眼部疾病，可列舉例如：老年性黃斑部病變、色素性視網膜炎、類血管狀破裂症(angioid streaks)等。此外，本發明的視網膜色素上皮細胞層片，也能夠利用來用作針對前述眼部疾病的藥效篩檢和毒性評價等各種篩檢用途。例如，依據日本特表2007-517210中所記載的方法，能夠將本發明的細胞層片應用於毒性物質的篩檢。進一步，本發明的視網膜色素上皮細胞層片，也能夠利用來作為in vitro模型，其用以評價生物體內的視網膜色素上皮細胞所具備的各式各樣的機能，該等機能是視細胞外節的吞噬能力和神經保護作用等有關視細胞的維持的功能、泵送作用、藉由緊密連結產生的視網膜血管屏障功能等。

本發明也是一種細胞層片，較佳是視網膜色素上皮細胞層片，其依據前述細胞層片製作方法所獲得而呈被保持於多孔性膜上的狀態。所製成的細胞層片，呈被保持(固定)於膜上的狀態，而能夠防止萎縮、翻轉或捲起等形狀變化。此外，因為被保持於膜上，即便賦予移動和運輸等的物理性刺激，仍能夠防止前述的形狀變化，而可保持良好的狀態來實行移植。

本發明的疾病治療用移植材料，能夠用於用以治療人類、人類以外的哺乳動物(例如：猴、小鼠、大鼠、狗、牛、馬、豬、綿羊、山羊、貓、兔子、倉鼠、豚鼠等)的疾病。

本發明的疾病治療用移植材料能夠適用的疾病部位的範圍，可依據對象疾病、投予對象的動物種類、年齡、性別、體重、症狀等進行變化，例如，當應用於老年性黃斑部病變時，應進行移植的疾病部位的範圍一般是0.07 cm ²～0.28 cm ²的範圍。

本發明的疾病治療用移植材料能夠一次性或者分為數次地進行移植，移植的應用次數，依據疾病可由醫療人員依據治療指引來決定，例如當應用於老年性黃斑部病變時，能夠依據其嚴重程度將本發明的視網膜色素上皮細胞層片移植2次以上。此外，當實行複數次移植時，間隔時間並無特別限定，也可以設定為數日～數星期的期間。

本發明的疾病治療用移植材料可由醫療人員依據治療指引並依據適當的移植方法來移植。例如，針對胸腔或腹腔內的治療之處，能夠應用開胸、開腹手術，除此之外，也能採用內視鏡性的手法。此外，在視網膜下將視網膜色素上皮細胞層片作為本發明的疾病治療用移植材料來移植時，能夠實行順著來自注射針的水流進行的移植方法，該注射針被刺入眼球視網膜下的移植部位為止，除此之外也能夠藉由專用的搬運用治療器具來實行。

本發明進一步提供一種包含胞外基質之膜，其藉由前述包含胞外基質之膜的製作方法所獲得。這樣的膜的製作，除了使用本發明的方法製作細胞層片後自層片進行膜的剝離的方法以外，能夠藉由去除細胞的方法來獲得膜。細胞的去除，例如能夠使用凍乾和凍融等方法來實行。因而，本發明的包含胞外基質之膜的製作方法，在上述的本發明的細胞層片的製造方法中可進一步包含藉由凍乾步驟來去除細胞而獲得膜的步驟。本發明的包含胞外基質之膜為不含細胞之基底膜，由於移植膜的情況在規範上的制約少於移植細胞的情況，所以實用化的難度低。此外，也有助於用作機能分析等研究用途。

上述說明了使用視網膜色素上皮細胞並藉由本發明的方法製作細胞層片的態樣，當使用另外的細胞種類作為源自哺乳動物的細胞時，本發明所屬技術領域中具有通常知識者能夠瞭解，依據所使用的細胞，投予對象、對象疾病、移植方法等可參照治療指引等適當變更。當使用纖維母細胞作為源自哺乳動物的細胞時，作為對象疾病，雖然不限於此，能夠列舉皮膚相關疾病。此外，當使用間質幹細胞作為源自哺乳動物的細胞時，作為對象疾病雖然不限於此，能夠列舉視網膜上皮退化疾病、神經損傷疾病。

一態樣中，本發明提供一種多層細胞層片及其製造方法，該多層細胞層片包含複數片的細胞層片。藉由重複如下步驟能夠製造多層細胞層片：在藉由上述的製造細胞層片的方法而經層片化的細胞之上，再次將細胞進行播種來形成細胞層片。該多層細胞層片中所包含的各細胞層片，可以是包含單一細胞種類之細胞層片，也可以是包含複數種細胞種類之細胞層片。該多層細胞層片中所包含的各細胞層片，可以每一細胞層片包含不同的細胞種類，也可以是包含相同的細胞種類者。

組合由機能不同的細胞所構成之細胞層片、或將包含不同機能的細胞之細胞層片進行多層化，藉此能夠形成人工組織(日本過敏學會期刊，2013年，第62卷，第25～32頁)。例如藉由使用如下細胞懸浮液形成細胞層片或多層細胞層片，能夠製造人工淋巴組織或人工骨髓，該細胞懸浮液是混合有基質細胞或間質幹細胞與抗原呈現細胞、淋巴球等造血性細胞或者造血幹細胞而成。這樣的多層細胞層片，能夠應用於例如免疫不全、嚴重感染、惡性腫瘤等、造血不全的治療等。

藉由間質幹細胞的層片化，其標記也就是CD105的表現會減少或消失，而能夠誘導出免疫抑制性的性質較強的CD105陰性的間質的次類型。將如此的間質幹細胞層片進行多層化而成之多層細胞層片，例如能夠應用於臟器移植後的排斥反應的預防或抑制、間質幹細胞的同種異體移植時的排斥反應的預防或抑制、自體免疫性疾病的治療等。

從而，一態樣中，本發明提供一種多層化細胞層片的製造方法，其包含下述步驟(1)～(4)。步驟(1)，將一種或複數種的源自哺乳動物的細胞進行調製；步驟(2)，將調製成的細胞播種於底面具有多孔性膜之第一細胞培養容器的前述多孔性膜上；步驟(3)，將前述第一細胞培養容器進一步放入第二細胞培養容器中，然後培養細胞來將細胞層片製作於前述多孔性膜上；及，步驟(4)，重複一次以上的下述步驟(a)及(b)，步驟(a)，將一種或複數種的源自哺乳動物的細胞播種於形成於第一細胞培養容器內的細胞層片上，步驟(b)，將前述第一細胞培養容器放入第二細胞培養容器中，然後培養細胞而在前述細胞層片上製作新的細胞層片。

一態樣中，本發明提供一種由上述方法所製成之多層細胞層片及包含該多層細胞層片之疾病治療用移植材料。

一態樣中，本發明提供一種多層細胞層片，其是被配置於多孔性膜上者，在多層細胞層片所包含的各細胞層片中，在細胞間存在有胞外基質，且在與前述多孔性膜接觸之側的相反側形成有包含胞外基質之膜。再者，在多層細胞層片中，包含胞外基質之膜除了在細胞層片的與前述多孔性膜接觸之側的相反側以外，也可形成於各層之間。 [實施例]

以下，藉由實施例，具體性地說明本發明，但是本發明不限於以下實施例。

實施例1 源自人類脂肪組織的間質幹細胞層片的形成將由人類組織所獲得的源自人類脂肪組織的間質幹細胞(PromoCell GmbH Sickingenstr. 63/6569126 HeidelbergGermany)懸浮於間質幹細胞用培養液。將所製成的細胞懸浮液添加至細胞培養小杯底面的多孔性膜(具有0.4 μm孔洞聚酯膜之直徑6.5 mm的Transwell)上，以每一容器2.0×10 ⁵細胞或10×10 ⁵細胞將細胞進行播種。在細胞培養小杯的已預先填滿培養液的孔中一邊浸泡一邊培養，然後確認細胞層片的形成(第1圖)。確認了任意的細胞數皆能進行細胞層片的製作。2.0×10 ⁵細胞/一容器(底面的直徑6.5 mm)相當於約6000細胞/mm ²底面積。藉由以如此高的密度來播種細胞，觀察到可獲得不會萎縮的細胞層片。因此，在以下的實驗中，以每一容器2.0×10 ⁵細胞以上的細胞數將細胞進行播種來製作細胞層片。

當以顯微鏡觀察所獲得的細胞層片時，觀察到在與膜的相反側形成了包含胞外基質之膜，藉由對其賦予藉由物理性地移液產生的水流，能夠容易地自細胞容器分離細胞層片。在第2圖中顯示藉由移液產生的水流將被形成為膜狀的細胞層片自細胞容器分離的情況。

藉由移液將自細胞容器分離出的細胞層片移至裝有生理食鹽水的培養皿。使用微量吸管在培養皿中吸取細胞層片並繼而實行排出。確認到細胞層片可保持形狀而具備剛性，並且確認了在移植時容易進行細胞層片的移動。在第3圖中顯示移液的情況。

以10%三聚甲醛固定自細胞容器分離出的細胞層片，製成厚度14 μm的冷凍切片，然後以DAPI實行細胞核染色。其結果，確認了所獲得的細胞層片為具有20-40 μm的厚度之細胞層片(第4圖)。

將自細胞容器分離出的細胞層片保存於2-8℃中96小時後，在培養48小時之時以ELISA測定由細胞層片所分泌的有助於保護視細胞的PEDF及維持脈絡膜微血管不可或缺的VEGF。將結果顯示於以下的表1。

[表1]

藉由ELISA的分泌量測定
細胞激素	濃度(ng/mL)
血管內皮增殖因子(VEGF)	3.73～11.13
色素上皮衍生因子(PEDF)	275.5~641.5

此外，依照通常的方法，藉由免疫組織染色來確認各分子標記的表現。確認到以本發明的方法製成的間質幹細胞層片可表現彈性蛋白、IV型膠原蛋白、I型膠原蛋白、Zo-1(第5圖)。

進一步，將所製成的間質幹細胞層片移植到視網膜退化大鼠(Royal College Surgeon[RCS]大鼠)時，確認到可獲得視網膜保護效果。在移植後3星期後的觀察中，移植有以本發明的方法製成的間質幹細胞層片的大鼠仍可維持外顆粒層(視細胞的核所排列的層)的厚度(第6圖左側照片)。另一方面，未移植細胞層片之發病大鼠，外顆粒層呈現薄化(第6圖右側照片)。觀察比較處置眼(右)球與未處置眼(左)球並將外顆粒層的厚度(亦即視細胞保護的程度)進行評分時，在間質幹細胞層片移植組(n=10)與Sham組(n=5)之間發現具有統計學上顯著差異(p＜0.01，雙樣本中位數差異檢定(Wilcoxon rank sum test))。此外，如以下的表2所示，移植有以本發明的方法製成的間質幹細胞層片的大鼠，光感受器受到保護。確認了藉由將以本發明的方法製成的間質幹細胞層片進行移植，可抑制病變的進展並且保護視細胞的效果。

[表2]

試驗組	模擬(Sham安慰組)	間質幹細胞層片移植
發現等級	-	±	+	2+	3+	-	±	+	2+	3+
眼球
光感受器細胞的保護	5	0	0	0	0	2	5	3	0	0
等級：-無異常變化/±極度輕微/+輕微/2+中度/3+高度

作為以本發明的方法製成的間質幹細胞層片的安全性試驗，使用免疫不全大鼠來實行一般毒性試驗(GLP試驗)時，並未發現植入失敗和早期脫落，並且也未發現其他有害現象。

實施例2：進行播種的細胞數的探討與實施例1同樣地操作，使用源自人類脂肪組織的間質幹細胞製作細胞層片。在底面具有直徑6.5 mm的多孔性膜之容器中，以成為以下的細胞數的方式添加細胞懸浮液。細胞數每一容器以0.08×10 ⁵細胞、0.4×10 ⁵細胞、2.0×10 ⁵細胞、10×10 ⁵細胞、13×10 ⁵細胞、20×10 ⁵細胞來播種細胞。每一容器的底面積的細胞濃度分別相當於約240細胞/mm ²底面積、約1200細胞/mm ²底面積、約6000細胞/mm ²底面積、30000細胞/mm ²底面積、約40000細胞/mm ²底面積、約60000細胞/mm ²底面積。在全部的細胞濃度皆確認了細胞層片的形成。將結果顯示於第7圖。

實施例3 虹膜色素上皮細胞層片的形成使用從人類虹膜組織所得的虹膜色素上皮細胞，以與實施例1相同的方法製成細胞層片。基於體外試驗，顯示所獲得的虹膜色素上皮細胞層片表現出正常的視網膜色素上皮細胞所具有的(1)吞噬能力及(2)PEDF及VEGF的分泌，並且(3)具有與布魯赫膜同樣地可作為細胞再生的支架來發揮作用的含胞外基質之膜結構。將細胞層片保存於2-8℃中96小時後，在培養48小時之時以ELISA測定由細胞層片所分泌的有助於保護視細胞的PEDF及維持脈絡膜微血管不可或缺的VEGF，並將其測定結果顯示於以下的表3。

[表3]

藉由ELISA的分泌量測定
細胞激素	濃度(ng/mL)
血管內皮增殖因子(VEGF)	2.1～18.3
色素上皮衍生因子(PEDF)	1.4～58.4

在第8圖中顯示表示同樣地培養而成的細胞層片的吞噬能力的數據。再者，針對吞噬能力的試驗，使用Cayman chemical (US)公司製造的Phagocytosis assay kit(吞噬試驗套組)。試驗是混合細胞層片與經螢光標示的乳膠珠並進行培養後，以台盼藍洗滌，然後利用螢光顯微鏡觀察確認被吞噬的乳膠珠。使與未鍵結於珠體的螢光標示用二次抗體進行反應的層片作為陰性對照組。第8圖中，上方2張照片顯示陰性對照的數據，下方2張照片顯示以本發明的方法製成的細胞層片的數據。

依照通常的方法，確認各分子標記的表現。確認到以本發明的方法製成的視網膜色素上皮細胞層片可表現彈性蛋白、IV型膠原蛋白、I型膠原蛋白(第9圖)。

當將以本發明的方法製成的虹膜色素上皮細胞層片移植到視網膜退化大鼠(RCS大鼠)時，確認到可獲得視網膜保護效果(第10圖)。在移植後4星期後的時間點，移植有以本發明的方法製成的視網膜色素上皮細胞層片的大鼠仍可維持外顆粒層(視細胞的核所排列的層)的厚度(第10圖上方照片)。此外，移植有以本發明的方法製成的視網膜色素上皮細胞層片的大鼠，光感受器受到保護(第10圖下方圖表)。

作為以本發明的方法製成的虹膜色素上皮細胞層片的安全性試驗，使用免疫不全大鼠來實行一般毒性試驗(GLP試驗)時，並未發現植入失敗和早期脫落，並且也未發現其他有害現象。再者，針對在層片形態的製品中被視為最大問題的移植法，也不斷進行針對靈長類的測試而獲得確立。

實施例4 纖維母細胞層片的形成使用由人體組織所獲得的纖維母細胞，以與實施例1相同的方法製成細胞層片。基於體外試驗，顯示所獲得的纖維母細胞層片表現出正常的視網膜色素上皮細胞所具有的(1)吞噬能力及(2)PEDF及VEGF的分泌，並且(3)具有與布魯赫膜同樣地可作為細胞再生的支架來發揮作用的含胞外基質之膜結構。將細胞層片保存於2-8℃中96小時後，在培養48小時之時以ELISA測定由細胞層片所分泌的PEDF及VEGF，並將其測定結果顯示於以下的表4，並同樣地將顯示培養出的細胞層片具有吞噬能力的數據顯示於第11圖。

[表4]

藉由ELISA的分泌量測定
細胞激素	濃度(ng/mL)
血管內皮增殖因子(VEGF)	16.8～45.9
色素上皮衍生因子(PEDF)	45.1～213.3

依照通常的方法，藉由免疫組織染色確認各分子標記的表現。確認到以本發明的方法製成的纖維母細胞層片可表現I型膠原蛋白、IV型膠原蛋白、彈性蛋白、ZO-1(第12圖)。

當將以本發明的方法製成的纖維母細胞視網膜色素上皮細胞層片移植到視網膜退化大鼠(RCS大鼠)時，確認到可獲得視網膜保護效果(表5)。在移植後4星期後的時間點，確認到顯著的對外顆粒層(視細胞的核所排列的層)的薄化的保護(厚度的維持)(第13圖)。

[表5]

試驗組	模擬(Sham安慰組)	纖維母細胞層片
發現等級	-	±	+	2+	3+	-	±	+	2+	3+
眼球
光感受器細胞的保護	5	0	0	0	0	0	3	6	1	0	*
等級：-無異常變化/±極度輕微/+輕微/2+中度/3+高度

藉由確認CD90、波形蛋白及CK18的表現狀態來求出細胞層片的目標細胞純度。如下述表6所示，其結果確認了供以毒性試驗、藥效試驗的細胞層片中高純度地維持了目標細胞純度。此外，也確認了在運輸後的樣品中仍維持了較高的純度。

[表6]

同種抗體(Isotype)基準	CD90	波形蛋白	CK18
毒性試驗1樣品	98.04%	98.16%	0.00%
毒性試驗2樣品	97.72%	92.95%	0.14%
藥效試驗樣品	99.87%	98.60%	0.10%
運輸後樣品	88.29%	85.11%	11.71%

作為以本發明的方法製成的纖維母細胞層片的安全性試驗，使用免疫不全小鼠來實行一般毒性試驗(GLP試驗)時，並未發現植入失敗和早期脫落，並且也未發現其他有害現象。

實施例5 來自間質幹細胞層片的血管新生抑制因子的分泌的確認與實施例1同樣地操作，使用由人體組織所獲得的源自人類脂肪組織的間質幹細胞來製造細胞層片。作為比較例，使用由人體組織所獲得的源自人類脂肪組織的間質幹細胞來實行平面培養。平面培養是在樹脂性的細胞培養容器中，依據培養面積以最為適當的密度播種細胞而使細胞黏著於培養面地進行培養。

培養後藉由ELISA測定被分泌至培養基中的可溶性Flt-1(可溶性VEGF受體1)及TIMP-3。將結果顯示於第14圖。來自細胞層片的可溶性Flt-1的分泌量，比起平面培養，以本發明的方法培養的情況大幅地增加。進一步，在平面培養中並未檢測到TIMP-3的分泌，但是從藉由本發明的方法培養並製成的細胞層片檢測出TIMP-3的分泌。由此顯示，藉由本發明的方法所製成的細胞層片具有能夠抑制脈絡膜新生血管的產生的可能性。

實施例6 間質幹細胞的積層層片的製作與實施例1同樣地操作，在膜上製作間質幹細胞的細胞層片(單層)。進一步，以相同濃度將新的間質幹細胞播種於所製成的細胞層片上，實行培養來製作積層層片。將結果顯示於第15圖。由色調能夠確認：比起左側的單層細胞層片，積層細胞層片較厚。

實施例7 來自間質幹細胞層片的細胞的遷移的評價使用源自人類脂肪組織的間質幹細胞，針對將細胞懸浮而成的細胞懸浮液與藉由本發明並由細胞所製成的細胞層片，評價細胞的遷移性。細胞的遷移性，是使用細胞計數套組-8(Cell Counting Kit-8，Dojindo,Cat.CK04)及1%結晶紫溶液(SIGMA,Cat.V5265-250ML)來測定細胞培養小杯的內側的細胞是否通過膜而遷移至小杯外側的情況。膜的孔洞尺寸為8 μm。細胞引誘物質添加20%或40%的胎牛血清白蛋白。細胞懸浮液：在細胞培養盤(孔及細胞培養小杯)中添加細胞引誘物質(或對照組)及基礎培養基，繼而將細胞懸浮液播種於小杯。24小時後，去除小杯內的細胞然後評價孔內的細胞數。對照組不添加引誘物質。細胞層片：藉由本發明的方法所製成的細胞層片，以保持在第一培養容器(小杯)內的狀態來用於評價。將裝有細胞層片的小杯內的培養基及細胞培養盤(孔)內的培養基交換為基礎培養基來進行調節後，將小杯內的培養基交換為基礎培養基，將細胞培養盤(孔)內的培養基交換為包含細胞引誘物質(或對照組)之基礎培養基。在24小時後，去除小杯內的細胞然後評價孔內的細胞數。評價在分別的群組中以n=3來實行。細胞數的評價使用Cell Counting Kit-8(Dojindo)與1%結晶紫溶液 (SIGMA)來實行。將結果顯示於第16圖。在細胞懸浮液中發現細胞的遷移，相對於此，以本發明的方法製成的細胞層片中並未發現細胞的遷移。

上述詳細的記載僅用來說明本發明的目的及對象，而未用以限定以下的發明申請專利範圍。在不脫離以下的發明申請專利範圍的情況下，本發明所屬技術領域中具有通常知識者明瞭可基於本說明書所記載的教示，針對所記載的實施態樣進行各種變化和置換。

本申請案是以在日本國所申請的日本特願2022-73877(申請日：2022年4月27日)及日本特願2023-34995(申請日：2023年3月7日)為基礎，並在本說明書中包含該等申請案的全部內容。 [產業上的可利用性]

藉由本發明可提供一種細胞層片的製作方法，其為簡便的細胞層片的製作方法，並且藉由該方法所製成的細胞層片容易處理。本發明有助於製作細胞層片，該細胞層片能夠應用包含MSC和皮膚組織的細胞也就是纖維母細胞之各種細胞。且藉由本發明的方法所製成的細胞層片能夠用作治療用移植材料或利用於篩檢用途、毒性試驗用途等各式各樣的用途。

無

第1圖是藉由本發明的方法使用源自脂肪組織的間質幹細胞製作細胞層片的結果。圖中的1、2是將細胞以每一容器分別為2×10 ⁵細胞、10×10 ⁵細胞進行播種並培養而製作細胞層片後的結果的照片。第2圖是拍攝以移液產生的水流將形成為膜狀的細胞層片自細胞容器分離的情況的照片。第3圖是拍攝使用微量吸管將放入培養皿的生理食鹽水中的細胞層片進行抽吸並繼而排出的情況的照片。編號顯示操作的順序。第4圖是顯示由源自人類脂肪組織的間質幹細胞所形成的細胞層片的剖面的照片。顯示厚度的長條為39.0 μm。第5圖是藉由免疫組織染色確認使用源自脂肪組織的間質幹細胞所製作成的細胞層片中的各分子標誌的表現的結果。第6圖顯示試驗由源自人類脂肪組織的間質幹細胞所形成的細胞層片的保護效果的結果。圖左方的照片顯示了在移植後三週時的時間點，在移植有以本發明的方法所製成的間質幹細胞層片之大鼠中的外顆粒層(視細胞的核之層)的厚度仍受到維持的情況。圖右方的照片顯示了在未移植有間質幹細胞層片的目標群體中(安慰手術組)中的外顆粒層呈薄化的狀態。第7圖是藉由本發明的方法使用源自脂肪組織的間質幹細胞製作細胞層片的結果。圖中的A、B、C、D、E、F是將細胞以每一容器分別為0.08×10 ⁵細胞、0.4×10 ⁵細胞、2×10 ⁵細胞、10×10 ⁵細胞、13×10 ⁵細胞、20×10 ⁵細胞進行播種來製作細胞層片後的結果的照片。第8圖顯示試驗藉由本發明的方法由虹膜色素上皮細胞所形成的細胞層片的吞噬能力的結果。上半部顯示使用了陰性對照的結果的照片，下半部顯示使用了以本發明的方法所製成的細胞層片的結果的照片。第9圖顯示了藉由免疫組織染色確認藉由本發明的方法由虹膜色素上皮細胞所形成的細胞層片表現彈性蛋白、IV型膠原蛋白、I型膠原蛋白的情況的結果。第10圖顯示試驗由虹膜色素上皮細胞所形成的細胞層片的視網膜保護效果的結果。圖中的上半部的照片顯示了在移植後四週時的時間點，在移植有以本發明的方法所製成的虹膜色素上皮細胞層片之大鼠中的外顆粒層(視細胞的核之層)的厚度仍受到維持的情況。圖中下半部的圖表顯示了移植有虹膜色素上皮細胞層片之大鼠中的光感受器受到保護的情況。第11圖是顯示試驗由纖維母細胞所形成的細胞層片的吞噬能力的結果的圖。第12圖是顯示由纖維母細胞所形成的細胞層片表現出I型膠原蛋白、IV型膠原蛋白、彈性蛋白、ZO-1的情況的圖。第13圖顯示試驗由纖維母細胞所形成的細胞層片的視網膜保護效果的結果。左側是纖維母細胞層片移植組的結果，右側是安慰手術組(對照組)的結果。在移植後四週時的時間點，顯示了在移植有以本發明的方法所製成的纖維母細胞層片之大鼠中的外顆粒層(視細胞的核之層)的厚度仍受到維持的情況。第14圖是測定藉由由源自人類脂肪組織的間質幹細胞所形成的細胞層片所產生的可溶性Flt-1(VEGF受體1)及TIMP-3的分泌的結果。第15圖顯示藉由本發明的方法製作由源自人類脂肪組織的間質幹細胞所形成的積層層片的結果。第16圖顯示使用藉由本發明的方法使用間質幹細胞所製成的細胞層片來評價細胞的遷移的結果。在分別的圖中，左方的柱體為細胞懸浮液，右方的柱體為使用細胞層片的結果。

國內寄存資訊(請依寄存機構、日期、號碼順序註記) 無國外寄存資訊(請依寄存國家、機構、日期、號碼順序註記) 無

Claims

一種細胞層片的製作方法，其包含以下步驟：步驟(1)，將一種或複數種的源自哺乳動物的細胞進行調製；步驟(2)，將調製成的細胞播種於底面具有多孔性膜之第一細胞培養容器的前述多孔性膜上；及，步驟(3)，將前述第一細胞培養容器放入第二細胞培養容器中，然後培養細胞而將細胞層片製作於前述多孔性膜上。
如請求項1所述之方法，其中，前述第一細胞培養容器中的培養液或前述第二細胞培養容器中的培養液中的至少一者，為包含血清及/或Rho激酶(ROCK)抑制劑之培養液。
如請求項1所述之方法，其中，在步驟(1)中，源自哺乳動物的細胞為上皮細胞、內皮細胞、實質細胞或幹細胞。
如請求項3所述之方法，其中，前述源自哺乳動物的細胞是選自色素上皮細胞、纖維母細胞及間質幹細胞所組成之群組中的細胞。
如請求項4所述之方法，其中，在步驟(2)中，細胞是以5000細胞數/mm ²以上播種於底面上。
如請求項1～5中任一項所述之方法，其中，在培養所獲得的細胞層片中，在細胞的與前述多孔性膜接觸之側的相反側形成有包含胞外基質之膜。
如請求項6所述之方法，其中，培養所獲得的細胞層片進一步在細胞間形成有緊密連結。
如請求項6所述之方法，其中，進一步包含以下的步驟(4)：步驟(4)，確認在細胞的與前述多孔性膜接觸之側的相反側是否形成有包含胞外基質之膜。
如請求項1～5中任一項所述之方法，其中，進一步包含以下的步驟(5)：步驟(5)，確認由步驟(3)所獲得的培養細胞中是否有分化標記的表現。
如請求項1～5中任一項所述之方法，其中，進一步包含以下的步驟(5’)：步驟(5’)，確認由步驟(3)所獲得的培養細胞是否分泌可溶性Flt-1(VEGF受體1)及/或TIMP-3。
如請求項1～4中任一項所述之方法，其中，在步驟(1)中，源自哺乳動物的細胞是視網膜色素上皮細胞或虹膜色素上皮細胞這樣的色素上皮細胞、間質幹細胞或纖維母細胞，並且，在步驟(2)中，細胞是以5000細胞數/mm ²～40000細胞數/mm ²播種於底面上。
一種細胞層片，其是由請求項1～5中任一項所述之方法所製成。
一種疾病治療用移植材料，其包含由請求項1～5中任一項所述之方法所製成的細胞層片。
一種包含胞外基質之膜的製作方法，該製作方法中包含如下步驟：將形成於細胞層片的包含胞外基質之膜進行分離，該細胞層片是由請求項1～5中任一項所述之方法所製成。
一種細胞層片，其是被配置於多孔性膜上者，在該細胞層片中，在細胞間存在有胞外基質，且在與前述多孔性膜接觸之側的相反側形成有包含胞外基質之膜。
如請求項15所述之細胞層片，其中，前述細胞層片進一步在細胞間形成有緊密連結。
如請求項15所述之細胞層片，其中，前述細胞層片是藉由如下方式獲得：將1種或複數種的源自哺乳動物的細胞播種於第一細胞培養容器的底面的多孔性膜上，然後將該第一細胞培養容器放入第二細胞培養容器中進行培養。
如請求項17所述之細胞層片，其中，前述第一細胞培養容器中的培養液或前述第二細胞培養容器中的培養液中的至少一者，為包含血清及/或Rho激酶(ROCK)抑制劑之培養液。
如請求項17或18所述之細胞層片，其中，前述源自哺乳動物的細胞為上皮細胞、內皮細胞、實質細胞或幹細胞。
如請求項19所述之細胞層片，其中，前述源自哺乳動物的細胞是選自由色素上皮細胞、纖維母細胞及間質幹細胞所組成之群組中的細胞。
如請求項19所述之細胞層片，其中，前述源自哺乳動物的細胞是視網膜色素上皮細胞或虹膜色素上皮細胞。
如請求項19所述之細胞層片，其中，前述細胞層片中所包含的細胞表現選自由下述分子標記所組成之群組中的至少一種，該等分子標記是：斑萎蛋白-1、RPE-65、泛細胞角蛋白及細胞角蛋白中的任一種次類型、閉合蛋白、ZO-1、彈性蛋白、肌動蛋白、1型膠原蛋白、2型膠原蛋白及4型膠原蛋白。
如請求項19所述之細胞層片，其中，前述細胞層片中所包含的細胞分泌可溶性Flt-1(VEGF受體1)及/或TIMP-3。
一種多層化細胞層片的製造方法，其包含下述步驟(1)～(4)：步驟(1)，將一種或複數種的源自哺乳動物的細胞進行調製；步驟(2)，將調製成的細胞播種於底面具有多孔性膜之第一細胞培養容器的前述多孔性膜上；步驟(3)，將前述第一細胞培養容器進一步放入第二細胞培養容器中，然後培養細胞而將細胞層片製作於前述多孔性膜上；及，步驟(4)，重複一次以上的下述步驟(a)及(b)，步驟(a)，將一種或複數種的源自哺乳動物的細胞播種於形成於第一細胞培養容器內的細胞層片上，步驟(b)，將前述第一細胞培養容器放入第二細胞培養容器中，然後培養細胞而在前述細胞層片上製作新的細胞層片。
一種多層細胞層片，其是由請求項24所述之方法製造而成。
一種多層細胞層片，其是被配置於多孔性膜上者，在多層細胞層片所包含的各細胞層片中，在細胞間存在有胞外基質，且在與前述多孔性膜接觸之側的相反側形成有包含胞外基質之膜。