KR101970125B1 - 신축 가능한 피부 칩 - Google Patents

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Abstract

과제: 정적인 상태에서 배양되는 피부 세포는 실제 피부에 주어지는 스트레칭 환경을 모사하지 못하는 문제점이 있다.
해결수단: 본 발명은 피부 칩 (skin-on-a-chip)에 관한 것으로서, 피부 칩에 영구자석을 내장하여 피부 세포 스트레칭에 의한 수축과 이완의 반복을 모사하여 좀 더 실제 피부에 가까운 피부 칩을 제공할 수 있다.

Description

신축 가능한 피부 칩 {Stretchable skin-on-a-chips}
본 발명은 피부 칩 (skin-on-a-chip)에 관한 것으로서, 외부 선형 운동 구동장치에 대응하여 칩의 피부 세포에 선형 운동을 일으키는 연결부를 내장하여 피부 세포 스트레칭에 의한 수축과 이완의 반복을 모사하여 좀 더 실제 피부에 가까운 인공피부를 배양할 수 있는 피부 칩을 제공한다.
장기 칩(Organ-on-a-chip)은 전자회로가 놓인 칩 위에 살아있는 특정 장기를 구성하는 세포를 배양함으로써, 해당 장기의 기능과 특성뿐만 아니라 역학적, 생리적 세포반응을 모방하는 기술이다. 특정 장기의 세포운동이나 물리 화학적 반응의 메커니즘을 상세하게 연구할 수 있고, 또 신약개발이나, 독성평가에 대한 모델로서 이용될 것으로 기대받고 있는 소재이다.
전자회로는 장기 칩의 종류에 따라 역할이 다르지만, 공통적으로 장기 내부의 미세환경을 모방하는 역할과 생리적 반응을 감지하여 데이터로 표출하는 역할을 수행한다. 폐 칩에서는 배양액 시스템으로 체액과 공기의 흐름을 전자회로를 이용하여 체내를 모방하였고, 눈 칩에서는 세포 종류별로 구획화하면서 눈물을 정기적으로 공급하는데 전자회로가 이용된다.
최초의 장기 칩은 2010년 허동은 펜실베니아대 바이오공학과 교수의 주관으로 미국 하버드 위스연구소 (Wyss Institute)에서 개발한 약 3cm 정도의 작은 플라스틱 칩 위에 전자회로와 함께 폐 세포를 배양한 폐 칩이다. 마이크로칩 제조 방법으로 전자회로가 깔린 칩 위에 미세 세포 배양 환경을 구축하여 관류 챔버 속에 살아있는 폐 세포와 혈관 세포를 배양함으로써 실제 폐처럼 허파꽈리와 모세혈관을 갖추고 산소와 이산화탄소를 교환하는 기능을 수행한다. 이 폐 칩은 폐 관련 질환에 감염되어 질환의 진행상황을 그대로 모사하며 실시간 관찰 가능하다. 심지어 단일 질환이 아닌, 화학요법의 부작용으로 유발된 합병증까지 모사할 수 있는 것으로 알려졌다.
폐 칩 이후 장기 칩은 심장, 눈, 동맥, 신장, 피부 등 여러 장기 모델이 개발되고 있으며, 장기의 세포운동이나 물리 화학적 반응의 메커니즘을 상세하게 연구할 수 있고, 또 신약개발이나 독성평가에 대한 모델로 이용될 것으로 기대되고 있다 (인터넷 위키백과 참조).
사람 피부는 화장품, 세제, 자외선, 병원균, 환경오염물질 및 미생물 등과 같은 다양한 화학물질 및 생물학적 제제에 노출되어 있기 때문에 피부의 주요 기능은 생리적 장벽을 제공하여 기관을 보호하는 것이다. 피부에 이러한 화학물질 및 생물학적 제제가 증가하면 피부 염증, 가려움, 알러지, 심지어는 종양과 같은 다양한 반응을 유발할 수 있다. 따라서, 이와 같은 외부 물질의 독성을 걸러주어야 하며, 피부에 사용하는 약제의 효과를 높여야 할 필요가 있다. 이와 같은 목적을 위해 세계적으로 마우스를 비롯하여 수백만 마리의 동물이 실험에 이용되고 있다. 그러나 동물 실험은 두 가지 결정적인 한계가 있다. 첫째는 윤리적인 문제이고, 둘째는 두께, 털의 밀도 및 부속기관 (appendages)과 같은 것에서 마우스와 사람 피부에는 상당한 차이가 있다. 나아가, 마우스는 발바닥을 제외하고는 피부에 땀샘이 없다. Humane Society International에 따르면, 동물 실험에서 안전하고 효과적이라고 나타난 열 개의 약제 후보 중 아홉은 사람에게 처방되었을 때 실패하며, 동물 실험은 종종 실제 사람에게 사용되었을 때의 결과를 제대로 예측하지 못한다. 이와 같은 이유로 인하여 가능하면 사람 피부에 가깝게 모방하는 대용 체외 (in vitro) 시스템을 구축할 필요가 제기되었다. 1980년대 초반 최초의 사람 피부 유사 구조체가 보고된 이후로 다양한 체외 피부 모델이 개발되고 상업화되어 왔다. 그렇지만, 이 모델들 대부분은 섬유아세포 및 각질세포에 기반을 두고 사람 상피만을 모방한 정적인 배양 시스템을 체용한다. 피부의 복잡한 구조는 이러한 세포들만으로는 모방할 수 없다. 왜냐하면 피부는 모공, 면역세포, 멜라닌 세포, 메르켈 세포 복합체 (Merkel cell complexes), 혈관, 신경 섬유 및 다중층 구조를 포함하기 때문이다. 그리하여, 산업계, 임상 및 학계의 다양한 연구자들은 피부 및 피부 질환을 모방할 수 있는 체외 피부 모델 개발에 참여하고 있다.
그동안 연구되었던 대부분의 3D 기반의 세포배양은 정적인 환경에서 이루어져 왔다 [Y. G. Anissimov et al., Advanced drug delivery reviews, 65, 169-190 (2013)]. 그러나 실제 인체 내부, 외부에서는 끊임없는 자극이 주어지고 있다. 또한, 인체에서 피부는 일상생활 중에 외부 접촉과 마찰, 근육의 이완과 수축 등이 항상 일어나고 있다. 현재 보고된 연구 내용으로는 스트레칭 환경 하에서 각질층 분화의 증가 [Nobuhito Mori et al., IEEE MEMS 24-28 January 2016], 후각 덮개세포의 발현 저해 [Kamble Harshad et al., Biomed microdevice. 19. May (2016)] 등이 있다. 그러므로 종래의 정적인 상태의 피부 칩으로는 피부의 이완, 수축 등에 따른 피부의 변화를 관찰할 수 없다.
대한민국 공개특허공보 10-2016-0057050 "면역자기장분리용 바이오 칩 및 이의 제조방법" 대한민국 공개특허공보 10-2011-0044226 "마이크로채널을 갖는 기관 모방 장치 및 그 사용 및 제조 방법" 대한민국 공개특허공보 10-2015-0063077 "개선된 수명 시간 및 항상성을 갖는 다기관 칩 장치" 대한민국 공개특허공보 10-2015-0048958 "미세유체칩과 이를 이용한 허혈 및 재관류에 따른 세포손상 재현방법 및 세포손상 분석시스템"
Maierdanjiang Wufer et al., Scientific Reports Vol 6 (2016) 37471
따라서, 본 발명은 종래 정적인 피부 칩의 한계를 극복하고, 실제로 사람피부 조건에 좀 더 유사한 상태, 즉 수축과 이완이 반복적으로 일어나는 상태를 모방한 피부 칩을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명에서는 피부에 주어지는 외부 자극을 모사하기 위하여 외부의 선형 직선운동 구동장치에 대응하여 칩의 피부 세포에 선형 운동을 일으키는 연결부를 포함하는 피부 칩 (Skin on a chip)을 제작하였으며, 외부 구동장치를 이용하여 세포배양시 간헐적으로 또는 주기적으로 칩에 기계적 자극을 가하여 세포배양 거동을 관찰하였다. 본 발명에서는 PDMS (Polydimethylsiloxane) 배합비 (즉, PDMS와 경화제의 배합비)를 달리하여 이에 따른 탄성의 변화에 의해 일어나는 수축률을 확인하여 약 10%의 수축에 상응하도록 설계하였고 이를 알루미늄 몰드를 사용해 규격화하였다. 또, 항상 일정한 자극이 가해지도록 사각 디쉬 크기의 플레이트에 고정해주는 플레이트를 디자인하였다.
실험시 조건은 일상에서 인체는 수면과 휴식시간을 고려하여 하루에 12시간씩 10% 수축 자극을 0.01Hz 주기로 가하는 방식을 채택하였다. 기존의 정적인 환경에서 배양한 조직과 스트레칭을 가해주었을 때 나타나는 조직을 H/E 염색으로 광학 현미경을 통해 비교 분석하였다.
피부 칩에 스트레칭을 가해주었을 때와 정적인 상태를 유지하였을 때 H/E 염색을 통해 조직의 단면을 확인한 결과, 섬유아세포와 각질세포의 분화는 큰 차이를 보였다. 영구자석이 내장된 피부 칩에 스트레칭을 수행한 경우, 시간이 경과한 후에도 콜라겐 절편에 각질세포가 잘 붙어서 자라는 것을 확인할 수 있었고, 스트레칭을 가해 주었을 때 시간 경과에 따라 스트레스에 의해 각질세포가 콜라겐 섬유아세포층으로 점차 파고드는 것을 확인할 수 있었다. 이러한 결과를 통해 3차원 피부 세포를 배양하는 피부 칩에 있어서, 간헐적 스트레칭이 피부 세포를 좀 더 실제의 피부와 가까운 상태가 되도록 하여 세포독성 등을 시험함에 있어서 유용할 것으로 기대된다.
본 발명의 설명 및 청구범위의 "피부 등가물"은 본 발명의 신축 가능한 피부 칩(stretchable skin-on-a-chip)에서 배양된 피부 세포를 의미한다.
섬유아세포의 모양과 ECM 단백질 및 β- 액틴 발현량 변화
본 발명자들은 돼지 피부 콜라겐과 쥐 꼬리 콜라겐을 사용한 시료에서 조직을 관찰하여 섬유아세포에서의 발현량과 모양의 변화를 확인하였고, 유전자 분석을 통하여 정량적으로 β-액틴 발현량 변화를 확인하였다. β-액틴은 살아있는 세포에서는 반드시 필요한 단백질로 세포 골격에 관여하는 단백질이다. 이는 대체로 실험에서 하우스키핑 유전자로서 대조군으로 사용되지만 세포의 노화가 일어나는 경우에는 이를 대조군으로 사용하기에 부적합하다. 따라서 이러한 세포골격의 변화는 스트레칭으로 자극을 준 피부 등가물에서 노화가 일어났다는 증거로 볼 수 있다. 이뿐만 아니라, H/E 조직염색 결과를 보면, 정적인 조건의 시료에서 관찰되는 길쭉한 모양의 섬유아세포가 스트레칭에 의해 노화되어 둥글고 작은 타원형 형태로 변하였다.
섬유아세포는 세포외 기질(Extracellular matrix, ECM)을 담당하는 단백질, 대표적으로 콜라겐, 피브로넥틴 등을 생성하는데 주된 역할을 한다. 그러나 노화된 섬유아세포에서는 세포외기질 발현능력이 낮아지고 연약한 피부, 주름진 피부를 형성하게 된다. 본 발명에서는 7일간 스트레칭을 가한 피부 등가물 시료에서 세포외 기질의 발현능력이 현저하게 감소함을 확인하였다. 또한, 돼지 피부 콜라겐을 사용한 실험군에서는 자극의 주기가 짧을수록 섬유아세포의 수가 감소하는 것으로 보아 스트레칭 자극이 빠른 주기로 주어지면(5.3mm/s, 0.05Hz) 세포가 살기 어려운 환경이 되어 세포의 죽음을 초래한다고 볼 수 있으며, 자극에 따라 콜라겐, 피브로넥틴의 발현도 영향을 받는다. 쥐 꼬리 콜라겐을 사용한 실험에서는 스트레칭을 가한 실험군에서 섬유아세포 크기에서 큰 변화가 나타남을 확인하였다. 도 6 (d)와 같이 정적인 조건에서는 섬유아세포 모양이 길쭉하게 뻗어있는 모양이었으며, 도 6 (h)에서와 같이 스트레칭 조건에서는 섬유아세포의 모양이 둥근 타원형으로 나타났다. 이 두 조건에서 섬유아세포의 길이는 정적인 조건 49.8±12㎛, 스트레칭 11.8±6.8㎛로 약 5배가량 차이가 났다. 이는 스트레칭 자극이 세포 골격 자체에 큰 변화를 주었다고 볼 수 있으며 이와 관련하여 β-액틴의 정량결과 스트레칭이 가해질수록 점차 값이 줄어드는 것을 확인하였다[도 10 (a)]. 면역조직화학염색 결과에서도 피브로넥틴, 콜라겐의 생성에서 큰 차이가 남을 확인하였다[도 9]. 스트레칭 조건에서는 새로 생성된 콜라겐이 섬유모양으로 뻗어나가지 못하고 둥근 고리 모양의 연약한 골격으로 생성되게 된다. 우리는 이를 통해 스트레칭 조건이 섬유아세포의 세포 골격에 영향을 미치고 이에 따라 세포외 기질 단백질 발현이 저하되는 것을 확인하였고, 노화된 피부에서와 마찬가지로 연약한 피부가 됨을 확인하였으며, 따라서 물리적 자극에 의해 섬유아세포의 노화가 촉진됨을 알 수 있었다.
스트레칭 조건에서 각질층의 노화 현상
본 발명에서 스트레칭 장치를 이용하여 피부 등가물에 빠른 자극을 주었을 때(5.3mm/s) 각질층에서도 정적인 환경에서의 배양과 큰 차이가 나타났다. H/E 염색 결과, 돼지 피부 콜라겐을 이용한 피부 등가물에서 자극이 빨라질수록 더 얇고 연약한 각질층이 되어 진피층과 떨어지는 현상이 나타났으며, 자극 7일차 시료에서 각질세포가 진피층 안으로 확산되며 주름진 피부가 형성되는 모습을 확인하였다[도 4]. 이후 케라틴 10 발현을 비교하였을 때 7일차에 걸쳐 정적인 환경에서보다 0.01Hz 자극의 경우 케라틴 10 발현이 저하되었고 특히 0.05Hz에서는 발현량이 현저히 저하됨을 확인하였다. 우리는 위의 결과를 토대로 지지체를 3D 세포배양에 더 적합한 결과가 나타난 쥐 꼬리 콜라겐(0.85wt%)으로 바꾸어 정적인 환경과 0.01Hz의 스트레칭 환경에서 비교하였고 H/E 염색 결과로 확인하였을 때 각질층의 두께가 정적인 조건에서 86.4±26㎛, 스트레칭 조건에서 49.8±12㎛ 두께로, 스트레칭시 대략 37㎛ 만큼 각질층이 얇아진 것을 실험으로 확인하였으며 스트레칭 7일차 때 역시 진피 안으로 각질세포가 스트레스에 의해 확산되는 현상을 확인하였다[도 6]. 이는 세포에 가해지는 스트레스에 의해 세포가 안전한 곳으로 가기 위함이며 이 과정 중 피부에서 주름이 형성되는 것으로 사료된다. 또, 이전 실험에서와 마찬가지로 스트레칭 조건에서 케라틴 10 발현량이 현저하게 저하되는 결과를 확인하였다. 이는 각질세포의 발현량이 감소함을 의미한다.
스트레칭 조건에서 각질층이 약하게 부착되고 주름진 피부가 형성되는 현상을 증명하기 위해 각질층에서 중요한 단백질인 필라그린(Filaggrin), 라미닌(Laminin) α5, 인볼루크린(Involucrin)을 qPCR을 통해 정량, 비교하였다. 피부의 보호, 보습을 담당하는 필라그린의 경우 스트레칭을 하루 가했을 때부터 발현이 매우 떨어지는 것을 확인하였으며 점차 정상 수준으로 발현량이 증가하는 경향을 보였는데 스트레칭에 의해 줄어든 발현량이 각질화의 속도에 영향을 미쳤다고 사료되며 각질층이 완전히 생성된 7일차에 정적인 환경과 비슷한 수준으로 발현되었다고 여겨진다. 기저층에서 중요한 역할을 하여 지지를 담당하는 라미닌 α5는 노화가 일어날 때 발현이 감소하고 주름을 형성하는데 기여하게 되는데 1일, 3일간 스트레칭 조건에서 라미닌 α5 발현수준이 정적인 환경과 비슷한 수준으로 나타났으나 7일차에 라미닌 α5 발현수준이 저하되었다. 이는 세포에서 노화가 시작되었음을 시사하며 조직염색으로 확인한 결과, 7일차에 각질세포가 진피층으로 확산하며 주름진 피부 모양을 형성하는 설명을 뒷받침하며 세포의 노화가 시작되었다고 여겨진다. 인볼루크린은 피부 보호 기능을 담당하는데 스트레칭이 주어졌을 때 발현량이 매우 저하되며 스트레칭이 지속되면서 계속하여 발현이 저하된다. 이러한 현상은 각질층의 두께가 점차 얇아지고 연약해지는 현상을 설명해준다.
노화된 피부에서 P53 발현량 증가
돌연변이 세포 또는 암세포화된 세포를 수리하거나 세포자멸을 유도하는 유전자인 P53은 노화된 피부에서 증가하는 경향을 보인다. 따라서 우리는 스트레칭 장치를 통하여 피부 등가물에 자극을 주었을 때 P53의 증가를 통해 피부가 노화되었음을 확인하였다. 최초 1일, 3일간에는 P53이 정상수치보다 더 떨어져 있었는데, 이는 세포의 활성이 스트레스에 의해 떨어졌기 때문에 나타나는 현상이라고 여겨진다. 그러나, 자극 7일차에 접어들었을 때 P53이 3일차에 비해 2.5배 증가하였으며 정상수치보다 올라가 있었다. 이를 통해 돌연변이 세포, 암세포화된 세포들이 생겨 P53의 발현이 증가하게 되었다고 볼 수 있고 스트레스에 의해 세포활성이 저하되었다는 것을 감안하면 발현량이 매우 크게 증가하였음을 시사한다. 따라서 7일차에 접어들었을 때 노화된 세포에서 나타나는 대표적인 현상인 P53의 증가를 확인하였으므로 스트레칭 장치를 통한 기계적 자극에 의하여 피부 노화가 초래되었음을 알 수 있다.
노화된 피부 등가물
우리는 스트레칭 자극을 준 시료에서 피부 노화 현상을 확인하였고, 3일, 5일, 7일 스트레칭 자극을 준 시료를 비교하여 노화된 피부 등가물이 형성된 날짜를 확인하였다. 3일차 스트레칭을 주었을 때 피부 등가물은 ECM 발현이 감소하는 경향을 보였으나 각질층이 완전히 형성되지 않았고 라미닌 α5의 발현이 감소하지 않았으며 P53의 발현이 증가하지 않았다. 또한, 5일차 스트레칭 자극 조건에서도 각질세포가 진피층으로 확산하지 않았으며 주름진 피부가 형성되지 않았다. 그러나 7일차 스트레칭 자극 조건에서는 각질세포가 연약한 각질층과 진피층으로 확산되며 주름진 피부형성, ECM 단백질 발현 감소, P53의 증가 등을 확인하였고, 이를 통해 스트레칭 7일차 조건에서 순간적인 스트레스가 아닌 피부 노화 현상으로 연결되었다고 사료된다. 따라서 빠른 자극조건(5.3 mm/s)에서 7일간의 자극이 주어졌을 때 피부 노화를 촉진한다고 여겨진다[도 11].
앞서 스트레칭 장치를 통한 피부 등가물을 연구한 Takeuchi 그룹에서 혈관세포와 같이 배양한 피부 등가물에서 각질층이 더 두껍게 나타난 결과를 보였다. 그러나 우리가 제작한 스트레칭 장치를 통해 피부 등가물에 자극을 가해주었을 때는 상이한 결과가 나타났다. 이와 같이 스트레칭 조건에서 정반대의 결과가 나타난 이유는 Takeuchi 그룹에서는 클램프를 이용하여 서서히 변형을 주었기 때문에 세포 활성에 영향을 미쳐 세포 증식이 활성화되었다고 여겨진다. 반면, 본 발명에서 제작한 스트레칭 장치는 매우 빠른 속도(5.3 mm/s)로 스트레칭 자극을 주었기 때문에 세포가 느끼는 스트레스에서 큰 차이가 났을 것이라고 생각되며, 따라서 빠른 속도의 스트레칭은 세포에 스트레스로 작용하여 활성의 차이가 나타나며 세포의 모양, 기능에 노화를 촉진하는 영향을 초래하는 것을 알 수 있다. 스트레칭 자극이 7일 이상 지속될 경우 주름진 피부의 형성, 피부 보호, 지지에 관한 단백질의 발현능력 저하가 일어나게 되어 노화된 피부와 같은 피부 등가물을 형성하게 되는 것을 실험적으로 확인하였다.
우리는 노화된 사람의 피부를 모방하기 위하여 영구자석과 전자석을 이용하여 5.3mm/s의 빠른 속도로 작동하는 스트레칭 장치를 제작하였고 이를 통해 피부등가물을 0.01Hz의 주기로 수축-이완시켜 주었다. 인체 피부 세포들로 제작된 3차원 피부 등가물을 스트레칭 했을 때 노화된 피부에서 나타나는 현상인 주름진 피부, 연약한 각질층, 보습·지지에 관련된 단백질의 발현량 감소, P53의 발현 증가 등의 현상을 다음과 같이 설명할 수 있었다.
첫 번째로 진피층에서의 변화는 스트레칭 장치를 통한 자극에 의해 섬유아세포의 모양이 길쭉하게 뻗은 모양에서 둥근 모양으로 약 1/5만큼 길이가 줄어들었으며 이에 따라 세포외 기질 단백질인 콜라겐, 피브로넥틴의 발현이 현저히 감소하였으며 qPCR 분석을 통해 자극이 계속되면서 세포 골격을 담당하는 β-액틴의 발현량이 점차 감소하는 것을 확인하였다. 이와 같은 결과를 통해 섬유아세포의 발현 능력은 스트레칭 자극에 의해 감소한다고 여겨진다.
두 번째로 각질층에서는 각질층의 두께, 각질세포의 거동, 단백질 발현량의 감소를 보였다. 각질층의 두께는 정적인 환경에 비해 약 1/2만큼 감소하는 경향을 보였으며 각질세포의 거동은 스트레칭 장치를 통한 자극 7일차에서 진피층 안으로 확산하는 현상을 보였다. 이는 라미닌 α5가 7일차에 감소하는 경향을 보이는 현상과 같이 주름진 피부가 형성되었음을 시사한다. 케라틴 10의 발현은 자극의 세기가 강해질수록 감소하는 경향을 보였으며 정적인 환경과 0.01Hz 주기의 자극 환경을 비교했을 때 발현에서 큰 차이를 보였다. 또 그 밖에 qPCR 결과로 피부 보호, 보습에 관여하는 필라그린의 발현량은 감소하다 점차 증가하는 추세를 보였는데 이는 각질층의 형성이 늦어지는 것에 기여한다고 여겨지며, 인볼루크린은 자극이 주어짐에 따라 지속적으로 발현량이 줄어드는 경향을 보이며, 스트레칭 자극에 의하여 연약하고 얇은 각질층이 형성되었다고 사료된다.
세 번째로 P53의 발현인데, P53은 돌연변이 세포 또는 암세포화된 세포를 회복시키거나 세포자멸을 유도하며 노화시 발현량이 증가하는 중요한 노화 마커이다. 스트레칭 조건에서 스트레스에 의하여 진피와 각질층의 활성이 매우 떨어지는데 이에 따라 1일차, 3일차에서 P53이 정적인 환경에서보다 발현이 대략 1/2만큼 떨어져 있음을 확인하였다. 그러나 7일차에서는 3일차에 비해 약 2.5배 높아진 수치가 나타났다. 이와 같은 결과는 활성이 낮아진 세포라는 것을 감안하면 p53 발현이 매우 큰 폭으로 증가하였다고 볼 수 있다. 이는 스트레칭 장치에 의하여 연약한 각질층과 진피층으로 확산해가는 각질세포의 결과와 마찬가지로 스트레칭 자극 7일차 때 피부의 노화가 이루어졌음을 보여주는 중요한 결과이다.
우리는 실험을 통하여 7일간 5.3mm/s의 속도로 0.01Hz 주기에서 25V, 영구자석-전자석간의 거리 6mm의 조건으로 피부 등가물을 약 10% 신축시켰을 때 노화된 피부에서 나타나는 현상을 확인하였다. 본 발명의 신축 가능한 피부 칩을 통해 화장품 개발, 약물테스트 등에서 생체내 실험에 앞서 작은 칩 안에서 시험할 수 있으며, 더욱 연구가 진행된다면 생체내 실험을 대체하여 테스트를 진행할 수 있는 강력한 도구가 될 것이라고 전망한다.
본 발명은 칩 상의 3차원으로 배열된 피부 세포에 배양액을 공급하여 피부 세포를 배양하는 피부 칩에 있어서, 직선으로 전진, 후퇴 운동을 제공하는 칩 외부의 선형 구동장치에 대응하여 칩의 피부 세포에 선형 운동을 일으키는 연결부가 포함되어 피부 세포를 스트레칭함으로써 피부의 수축과 이완 현상을 모사하는 것을 특징으로 하는 피부 칩 (skin on a chip)을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 연결부가 기계적, 전기적 또는 자기적으로 칩 외부의 선형 구동장치와 연결되는 것임을 특징으로 하는 피부 칩을 제공한다.
또한, 본 발명은
기저층;
상기 기저층 상에 배열되며, 미세 유체채널과 멤브레인이 형성된 하부층; 및
상기 하부층 상에 배열되며, 배양액 챔버, 피부 세포가 3차원으로 배양되는 피부 세포 배양 챔버 및 직선으로 전진, 후퇴 운동을 제공하는 칩 외부의 직선 선형운동 구동장치에 연결할 수 있는 연결부를 포함하는 상부층;을 포함하는 피부 칩 (skin on a chip)을 제공한다. 상기 연결부는 기계적, 전기적 또는 자기적으로 칩 외부의 선형운동 구동장치와 연결되는 것임을 특징으로 한다.
그뿐만 아니라, 본 발명은 선형 구동장치와 연결부를 자석 또는 자기장, 자성물체를 이용하는 방식 외에도 연결고리 간의 기계적 연결방식, 연결고리를 통공에 통과시키는 방식 등 다양한 연결방식을 이용하여 구현할 수 있으며, 피부 세포에 직선 선형운동을 가하여 수축, 이완이 일어나도록 하는 데 방해가 되지 않는다면 연결방식에 특별한 제한은 없다.
또한, 본 발명은 상기 기저층이 유리 또는 투명한 합성 중합체를 포함하거나 이로 구성되는 재료로 제조되는 것을 특징으로 하는 피부 칩에 관한 것이다. 기저층으로는 유리 및/또는 폴리스티롤, 폴리카보네이트, 폴리실록산, 폴리디메틸실록산 등 광학적으로 투명한 합성 중합체와 같은 재질을 이용한다.
또한, 본 발명은 상기 하부층의 미세 유체채널이 상기 상부층의 배양액 챔버와 피부 세포 배양 챔버를 연결하여 배양액을 피부 세포로 공급하는 것임을 특징으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 하부층의 멤브레인이 상기 상부층의 피부 세포 배양 챔버 아래에 위치함을 특징으로 하는 피부 칩을 제공한다.
또한, 본 발명의 피부 칩은 상기 연결부가 피부 세포 배양 챔버의 주위에 위치함을 특징으로 한다.
또한, 본 발명의 피부 칩은 상기 연결부를 하나 이상 포함하는 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명의 피부 칩은 상기 하부층 및 상부층 중 하나 이상이 PDMS (Polydimethylsiloxane) 또는 PDMS를 포함하는 조성물로 이루어진 것임을 특징으로 한다.
또한, 본 발명의 피부 칩은 상기 피부 세포가 섬유아세포 또는 각질세포 중 하나 이상임을 특징으로 한다.
또한, 본 발명의 피부 칩은 상기 피부 세포에 3차원 세포배양을 위한 지지체를 부가함을 특징으로 한다.
또한. 본 발명의 피부 칩은 상기 지지체가 콜라겐, 젤라틴, 푸코이단, 알지네이트, 키토산, 히알루론산, 실크, 폴리이미드(polyimides), 폴리아믹스 산(polyamix acid), 폴리카프롤락톤(polycarprolactone), 폴리에테르이미드(polyetherimide), 나일론(nylon), 폴리아라미드(polyaramid), 폴리비닐알콜(polyvinyl alcohol), 폴리비닐피롤리돈(polyvinylpyrrolidone), 폴리벤질글루타메이트(poly-benzyl-glutamate), 폴리페닐렌테레프탈아마이드(polyphenyleneterephthalamide), 폴리아닐린(polyaniline), 폴리아크릴로나이트릴(polyacrylonitrile), 폴리에틸렌옥사이드(polyethylene oxide), 폴리스티렌(polystyrene), 셀룰로오스(cellulose), 폴리아크릴레이트(polyacrylate), 폴리메틸메타크릴레이트(polymethylmethacrylate), 폴리락산(polylactic acid; PLA), 폴리글리콜산(polyglycolic acid; PGA), 폴리락산과 폴리글리콜산의 공중합체(PLGA), 폴리{폴리(에틸렌옥사이드)테레프탈레이트-co-부틸렌테레프탈레이트}(PEOT/PBT), 폴리포스포에스터(polyphosphoester; PPE), 폴리포스파젠(PPA), 폴리안하이드라이드(Polyanhydride; PA), 폴리오르쏘에스터{poly(ortho ester; POE}, 폴리(프로필렌푸마레이트)-디아크릴레이트{poly(propylene fumarate)-diacrylate; PPF-DA} 및 폴리에틸렌글라이콜디아크릴레이트{poly(ethylene glycol) diacrylate; PEG-DA}로 이루어진 그룹 중에서 선택된 1종 이상의 생체적합성 지지체임을 특징으로 한다.
또한, 본 발명의 피부 칩은 상기 피부 세포가 내피 세포, 진피 세포 및 상피 세포를 포함함을 특징으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 피부 칩 외부 선형 구동장치에 간헐적으로 한 방향 선형 운동을 인가하여 피부 세포에 이완과 수축을 일으킴으로써 피부 세포를 모사하고 피부 외용 조성물의 효능을 평가하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 피부 외용 조성물이 화장료 조성물, 피부 외용 약제 또는 독성 시험물질임을 특징으로 하는 피부 외용 조성물의 효능을 평가하는 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 영구자석이 내장된 피부 칩에 스트레칭을 수행한 경우, 시간이 경과한 후에도 콜라겐 절편에 각질세포가 잘 붙어서 자라는 것을 확인할 수 있었고, 스트레칭을 가해 주었을 때 시간 경과에 따라 스트레스에 의해 각질세포가 콜라겐 섬유아세포층으로 점차 파고드는 것을 확인할 수 있었다.
또한, 본 발명에 따르면, 정적인 배양조건에서 자라는 피부 세포에 비하여 실제로 스트레칭에 의하여 노화된 피부를 모사할 수 있으므로 좀 더 실제 피부에 가까운 상태를 나타내어 본 발명의 피부 칩은 화장품, 피부 외용 약품, 독성 물질 등의 시험에 유용하다.
도 1은 스트레칭 가능한 피부 칩 모식도이다. 상부층은 배양액 챔버, 배양 챔버, 영구자석을 포함하여 구성되어 있고, 하부층은 피부 세포 배양 챔버에 배양액을 공급하는 미세 유체채널과, 피부 세포가 배양액에 잠겨있지 않게 하고 피부 세포 배양 챔버 아래에서부터 배양액이 공급되도록 하는 멤브레인을 포함한다.
도 2 (a)는 30V에서 PDMS 주제 : 경화제의 혼합비율과 영구자석-전자석 간 거리에 따른 변형률 비교 그래프. (b) 25V에서 PDMS 주제 : 경화제 혼합비율과 영구자석-전자석 간 거리에 따른 변형률. 비교 그래프 *-실험에서 실제 사용된 조건( PDMS 주제 : 경화제 = 35:1, 25V, 약 10% 변형률).
도 3은 돼지 피부 콜라겐을 이용한 피부 등가물의 H/E(Hematoxylin and eosin stain) 염색 결과 사진이다. (a),(b),(c) 정적인 조건에서 3일, 5일, 7일간 공기 노출하여 배양한 시료, (d),(e),(f) 25V, 1A, 10% 변형률로 12h/Day, 0.01Hz 반복 주기 조건에서 각각 3일, 5일, 7일간 공기 노출하여 배양한 시료, (g),(h),(i) 25V, 1A, 10% 변형률로 12h/Day, 0.05Hz 반복 주기 조건에서 3일, 5일, 7일간 공기 노출.
도 4는 돼지 피부 콜라겐을 이용한 피부 등가물의 특수염색 결과 사진이다. (a),(b),(c) 정적인 환경 조건에서 3일간 공기 노출하여 배양한 시료, (d),(e),(f) 25V, 1A, 10% 변형률로 12h/Day, 0.01Hz 반복 주기 조건에서 3일간 공기 노출하여 배양한 시료, (g),(h),(i). 25V, 1A, 10% 변형률로 12h/Day, 0.05Hz 반복 주기 조건에서 7일간 공기 노출하여 배양한 시료, 각(a),(d),(g) - H/E 염색, (b),(e),(h) - 메이슨 트리크롬 염색, (c),(f),(i) - 시리우스 염색(광학현미경, 각 200배).
도 5. 돼지 피부 콜라겐을 이용한 피부 등가물의 면역조직화학 결과 사진. (a),(b),(c) 정적인 환경 조건에서 3일간 공기 노출하여 배양한 시료, (d),(e),(f) 25V, 1A, 10% 변형률로 12h/Day, 0.01Hz 반복 주기 조건에서 3일간 공기 노출하여 배양한 시료, (g),(h),(i). 25V, 1A, 10% 변형률로 12h/Day, 0.05Hz 반복 주기 조건에서 7일간 공기 노출하여 배양한 시료, 각 (a),(d),(g) - 피브로넥틴 염색, (b),(e),(h) - 콜라겐 Ⅳ염색, (c),(f),(i) - 케라틴 10 염색(광학현미경, 각 200배).
도 6. 쥐 꼬리 콜라겐을 사용한 피부 등가물에서의 H/E 염색 분석 결과. (a),(b),(c) - 정적인 환경에서 공기 노출하여 각 3일, 5일, 7일간 배양한 시료(광학현미경 200배). (d) - (b)의 상자를 확대한 섬유아세포의 모양(광학현미경 800배). (e),(f),(g) - 25V, 1A, 10% 변형률로 12h/Day, 0.01Hz 반복 주기 조건에서 공기 노출하여 각 3일, 5일, 7일간 배양한 시료(광학현미경 200배). (h) - (f)의 상자를 확대한 섬유아세포의 모양(광학현미경 800배).
도 7. 쥐 꼬리 콜라겐을 사용한 피부 등가물에서의 특수염색 분석 결과. (a),(b),(c) - 정적인 환경에서 공기 노출하여 각 7일간 배양한 시료. (d),(e),(f) - 25V, 1A, 10% 변형률로 12h/Day, 0.01Hz 반복 주기 조건에서 공기 노출하여 각 7일간 배양한 시료. (a),(d)- H/E 염색 사진, (b),(e) - 메이슨 트리좀 염색 사진, (c),(f) - 시리우스 염색 사진(광학현미경, 각 200배).
도 8. 쥐 꼬리 콜라겐을 사용한 피부 등가물에서의 면역조직화학염색 분석 결과. (a),(b),(c) - 정적인 환경에서 공기 노출하여 7일간 배양한 시료. (d),(e),(f) - 25V, 1A, 10% 변형률로 12h/Day, 0.01Hz 반복 주기 조건에서 공기 노출하여 7일간 배양한 시료. (a),(d) - 섬유아세포 염색 사진, (b),(e) - 콜라겐 Ⅳ 염색 사진, (c),(f) - 케라틴 10 염색 사진(광학현미경, 각 200배).
도 9. 25V, 1A, 10% 변형률로 12h/Day, 0.01Hz 반복 주기 조건에서 피부 등가물 비교. (a),(d),(g). 각각 3일, 5일, 7일간 스트레칭 자극이 가해진 시료의 H/E 염색 비교. (b),(e),(h) 각각 3일, 5일, 7일간 스트레칭 자극이 가해진 시료의 피브로넥틴 염색 비교. (c)(f)(i) 각각 3일, 5일, 7일간 스트레칭 자극이 가해진 시료의 콜라겐 Ⅳ염색 비교(광학현미경 200배).
도 10. qPCR 정량 비교 그래프. (a) 정적인 환경에서의 배양과 0.01Hz, 10% Strain의 신축 가능한 피부 칩에서 시간에 따른 β-액틴 발현 비교(공기 노출 0일, 1일, 3일, 7일).(b) 정적인 환경에서의 배양과 0.01Hz, 10% Strain의 스트레처블 스킨-온-어-칩에서 필라그린 발현의 시간에 따른 비교(공기노출 0일, 1일, 3일, 7일). (c) 정적인 환경에서의 배양과 0.01Hz, 10% Strain의 신축 가능한 피부 칩에서 라미닌 α5 발현의 시간에 따른 비교(공기노출 0일, 1일, 3일, 7일). (d) 정적인 환경에서의 배양과 0.01Hz, 10% Strain의 신축 가능한 피부 칩에서 인볼루크린 발현의 시간에 따른 비교(공기 노출 0일, 1일, 3일, 7일). (e) 정적인 환경에서의 배양과 0.01Hz, 10% Strain의 신축 가능한 피부 칩에서 P53 발현의 시간에 따른 비교(공기 노출 0일, 1일, 3일, 7일).
도 11. 피부 노화와 관련된 단백질, 유전자 인자와 각각 3일, 7일간의 스트레칭 환경에서 나타난 변화 경향.
아래에서는 구체적인 실시예를 들어 본 발명의 구성을 좀 더 자세히 설명한다. 그러나, 본 발명의 범위가 실시예의 기재에만 한정되는 것이 아님은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 자명하다.
세포 배양
인체 섬유아세포는 DMEM 배양액 (10%(v/v) 우태혈청, 1% 페니실린/스트렙토마이신 함유)을 사용하여 배양하였고, 실험에서는 인체 섬유아세포와 돼지 피부 타입 1 콜라겐 (SK Bioland) 또는 쥐 꼬리에서 추출한 타입 1 콜라겐 졸을 혼합하여 CO2 배양기에서 한 시간 굳힌 후 4일간 매일 배양액을 교체하면서 배양하였다. 섬유아세포의 농도는 2.0 x 104 cell/ml로 하였다.
인체 각질세포는 KGM (Lonza) 배양액을 사용하여 계대배양하였고, 각질층 형성은 4일간 섬유아세포를 배양한 콜라겐 젤 표면에 인체 각질세포 (Biosolution Co., Ltd.)를 뿌려주고 1시간 동안 CO2 배양기에서 부착한 후 KGM 배양액을 공급하였다. 이때 인체 각질세포의 농도는 6 x 106 cell/ml로 하였고, 4일간 매일 배양액을 교체하면서 배양하였다.
인체 섬유아세포를 넣어주는 콜라겐 젤을 배양할 때는 DMEM 배양액을 사용하였고, 섬유아세포와 각질세포를 함께 배양할 때는 미세유체관을 따라 DMEM을 아래층으로 공급하고 배양챔버의 콜라겐 젤 위로는 KGM을 공급하였다.
공기 노출을 통하여 각질세포의 분화를 유도하기 위하여 DMEM/Ham's F12 (EGF-1 10 ng/ml, 하이드로코르티손 (Hydrocortisone) 0.4 ㎍/ml, 인슐린 5 ㎍/ml, 트랜스페린 5 ㎍/ml, 3,3,5-TriiodoL-thyonine sodium salt 2 x 10-11 M, 콜레라 독소 10-10 M, 10%(v/v) 우태혈청, 1% 페니실린/스트렙토마이신)를 사용하여 배양하였다.
스트레칭 피부 칩 제작
본 발명에서는 미세 유체채널을 통하여 배양액의 공급이 되도록 하며 이를 통해 인체 유사 피부조직을 3차원에서 배양하도록 하였다. 또 배양액의 공급은 방해하지 않고 물리적 자극을 주는 스트레칭 피부 칩을 구현하기 위해 영구자석이 칩에 삽입된 구조를 설계하였다. 이를 위해 피부 칩을 상부층과 하부층으로 나누어 제작하였다.
우선 상부층 제작을 위해 배양공간과 영구자석의 위치를 고려하여 알루미늄 몰드 (CSI Tech)에 PDMS (Polydimethylsiloxane) 주제 (base) : 경화제 (curing agent)의 비율을 35:1로 혼합하여 부어주고 80℃ 오븐에서 1시간 굳힌 후 몰드를 제거했다. 이후 영구자석을 삽입하여 다시 PDMS 혼합액을 부어 80℃ 오븐에서 한 시간 굳혔다. 그 다음 하부층은 포토리소그래피를 이용하여 폭 150㎛ 높이 50㎛의 채널로 패터닝된 마스터 패턴 웨이퍼 상에 PDMS 주제:경화제를 10:1의 비율로 혼합하여 부어준 후 80℃ 오븐에서 한 시간 굳혀주어 미세패턴이 형성된 하부층을 제작하였다. 기저층: 하부층: 상부층 접착 공정은 O2 플라즈마 (FEMTO science)를 이용하여 접합하였다. 삽입된 영구자석으로는 직경 10mm, 두께 1mm의 원반형 네오듐 자석을 사용하였다 (JL magnet). 전자석으로는 직경 40mm의 원형 전자석 (JL magnet)을 사용하였으며, Magnetic plate 산화막 처리된 알루미늄 몰드(CSI Tech)를 사용하였다.
스트레칭 실험
스트레칭 실험에서는 전자석에 1A, 25V의 교류전압을 이용하여 0.01 Hz 주기로 10% 수축-이완을 12시간 동안 반복하고, 12시간 동안 정지한 상태를 유지하였다 (도 2). 이 장치는 PC 제어를 통해 구동하였으며 편리하고 정밀한 측정이 되도록 하는 점이 장점이다.
조직학, IHC 염색, 특수염색
피부 등가물을 4% 파라포름알데하이드로 고정하고 파라핀으로 포매하였다. 재수화 이후, 조직 절편 (5mm)은 조직실험을 위해 H/E(Hematoxylin and eosin) 염색하거나 특정 단백질 발현 연구를 위해 면역조직화학을 수행하였다.
피브로넥틴, 사이토케라틴 10, CD34 및 콜라겐 IV에 대한 일차 항체는 ab2413(abcam), ab6318(abcam), ab81289(abcam) 및 ab6586(abcam)을 사용하였고, 이체항체로는 토끼 특이적 HRP/DAB(ABC) 탐지 킷트(ab64261, abcam)를 사용하였다.
특이적 염색을 위해 MT(Massan Trichrome stain kit Procedure, K7228, IMEB INC)와 Sirius red/Fast Green 염색을 이용하였고, 형광 슬라이드는 OLYMPUS IX173으로 시각화 및 기록하였다.
qPCR 정량분석
qPCR 분석은 우선 mRNA를 추출하기 위해 트리졸 시약 1㎖를 시료에 처리하여 RNA를 세포에서 분리하고 RNA 침전, RNA 세척, RNA 재현탁 과정을 거쳐 추출하였으며, Nanodrop 2000C(Thermo)를 통하여 mRNA를 정량하였다. 그 후 amfiRivert cDNA synthesis Platinum Master Mix(GenDEPOT)를 이용하여 cDNA를 합성하였다. 정제된 cENA는 AccuPower® 2X GreenStar™ 볘CR Master Mix(Bioneer)를 사용하여 Exicycler™ 96(Bioneer) 장치를 통해 qPCR 정량하였다. 각 프라이머는 표 1에 나타내었다.
결과 1: 신축 가능한 피부 칩의 변형률 비교
우리는 신축 가능한 피부 칩의 챔버 변형률을 조절하기 위하여 PDMS 제작시 부피비율과 영구자석과 전자석 간의 거리, 전자석 인가 전압을 변화시켰다. PDMS 주제:경화제 혼합비율을 각각 25:1, 30:1, 35:1로 제작하였고, 영구자석과 전자석과의 거리는 5, 6, 8, 10mm로, 전자석 인가 전압을 25V와 30V로 하였다(도 2)
도 2에서 보는 바와 같이 전자석 인가전압 25V, PDMS 주제:경화제 혼합비율 35:1, 영구자석-전자석간 거리가 5mm일 때 변형률이 약 10%로 비교적 많은 변형률을 보여주었고 25:1 비율에서는 거리가 가까워짐에도 변형률의 변화가 거의 없었다. 30V에서는 PDMS 주제:경화제 비율 35:1에서 가장 큰 변형률을 보여주었고, 거리가 8mm일 때에도 약 11% 변형률을 보여주었다. 이밖에 30:1, 25:1 비율에서도 25V에 비하여 30V에서 변형률이 큰 폭으로 증가함을 볼 수 있었다. 우리는 약 10% 변형률을 채택하기 위하여 25V에서 PDMS 주제:경화제가 35:1 비율로 제작된 신축 가능한 피부 칩에 영구자석과 전자석과의 거리가 6mm 떨어진 조건을 실험에 이용하였다.
결과 2: 돼지 피부 콜라겐을 이용한 피부 등가물에서 정적 조건 및 스트레칭 조건에서 조직 분석 결과
스트레칭을 가해준 비교군에서는 25V, 1A, 10% 변형률로 12h/Day의 조건에서 각각 0.01Hz, 0.05Hz의 반복 주기에서 3일, 5일, 7일에 걸쳐 공기노출(Air-exposure)을 시켜 배양하였고 정적인 배양에서는 스트레칭을 주지 않고 3일, 5일, 7일에 걸쳐 공기 노출을 시켜 배양하였다. 조직단면분석을 위해 파라핀으로 고정하고 H/E 염색을 통하여 단면을 분석하였다(도 3).
도 3에서 보는 바와 같이 스트레칭을 주어 배양한 시료와 정적인 상태에서 배양한 시료를 H/E 염색하고 조직의 단면을 확인한 결과, 섬유아세포와 각질세포가 각 조건에 따라 상이한 결과를 확인할 수 있었다. 0.01Hz, 0.05Hz의 반복 주기로 스트레칭을 가해 주었을 때 각 7일째에 스트레스에 의해 각질세포가 콜라겐 젤로 점차 파고들어가는 현상이 유사하게 나타났음을 확인할 수 있었고 반복 주기를 짧게 하여 더 자주 자극을 주었을 때 섬유아세포의 수가 감소하였으며 연한 각질층이 형성되어 있었다.
결과 3: 정적 조건 및 스트레칭 조건에서 배양된 돼지 피부 콜라겐을 이용한 피부 등가물의 메이슨 트리크롬, 시리우스 염색 결과
섬유아세포는 여러 가지 콜라겐과 피브로넥틴 등 세포외기질을 생성하는 기능을 하고 있다. 따라서 섬유아세포의 기능은 탄력 있는 피부 형성에 중요한 역할을 맡는다. 이러한 자극을 주었을 때 섬유아세포가 제대로 기능을 하는지 알아보기 위해서 특수 염색을 통하여 총 콜라겐을 분석하였다. 특수염색으로 메이슨 트리크롬(Masson's trichrome), 시리우스(Sirius) 염색을 하였고 이 둘의 결과가 서로 일치했을 때 총 콜라겐에 대한 증거가 타당해진다.
메이슨 트리크롬(Masson's trichrome) 염색법에서는 진한 청색으로 염색된 부분은 세포의 핵을 나타내고 각질층은 핑크로 염색된다. 또 콜라겐은 담청색으로 염색된다. 시리우스 염색법에서는 진한 핑크로 염색된 부분이 세포의 핵을 나타내고 각질층은 청색으로 염색되며 콜라겐은 핑크로 염색된다. 도 4에서 보는 바와 같이 각 시료에서 나타난 메이슨 트리크롬, 시리우스 염색의 결과가 일치하였으며, 정적인 조건에서는 상피층 주변부에 콜라겐 발현이 높았으며 0.01Hz 자극 조건에서는 진피층에 전반적으로 콜라겐 발현이 높았고 0.05Hz 자극조건에서는 대체로 발현량이 적었다 (도 4).
결과 4: 돼지 피부 콜라겐을 이용한 피부 등가물에서 정적 조건 및 스트레칭 조건에서 면역조직화학염색
인체 내에서 진피층에서는 피부는 콜라겐을 생성하고 여러 가지 단백질을 발현하며 수분을 보호하고 탄력성을 늘려주며, 각질층에서는 세포가 사멸하여 각질화되고 이는 신체 내로 들어오는 곰팡이, 세균 및 외부 물질로부터 인체를 보호하며 수분 소실을 막는 기능을 한다. 이러한 이유로 본 발명에서 섬유아세포의 콜라겐 생성, 피브로넥틴 생성을 알아보기 위해 콜라겐 Ⅳ와 피브로넥틴 10을 조사하고 각질세포의 정상적 기능을 알아보기 위해 케라틴 10을 확인하였다.
도 5와 같이, 피브로넥틴과 콜라겐 Ⅳ의 경우 진한 갈색으로 염색된 부분은 세포의 핵이며 옅은 갈색으로 나타난 부분이 피브로넥틴, 콜라겐 Ⅳ의 발현 부분이다. 참고로, 푸른색으로 염색된 부분이 각질층이다. 정적인 환경의 배양 결과는 메이슨 트리크롬, 시리우스 염색 결과와 마찬가지로 상피층이 있는 주변부쪽으로 발현이 나타남을 확인하였다. 그러나 0.01Hz 스트레칭 환경에서 배양된 시료에서는 상피층 주변부분에 옅게 발현되어 있었다. 또 0.05Hz에서는 발현된 피브로넥틴과 콜라겐 Ⅳ가 실선 모양이 아닌 둥근 고리 모양으로 매우 적은 발현률을 보였다. 그리고 케라틴 10은 각질층에서 각질은 진한 갈색으로 염색되며 세포는 푸른색으로 염색된다. 정적인 환경에서 배양된 시료에서는 공기와 노출된 바깥쪽 부분에 케라틴 10이 잘 발현되어 있었다. 그러나 스트레칭 환경에서 배양한 시료는 0.01Hz 조건의 경우 콜라겐층 상부에 약간 발현되어 있었고 0.05Hz 조건의 경우 거의 발현되지 않았다(도 5).
결과 5: 쥐 꼬리 콜라겐을 이용한 피부 등가물에서 정적 조건 및 스트레칭 조건에서 조직 분석 결과
우리는 앞서 연구한 실험 결과에서 돼지 피부 콜라겐을 사용한 피부 등가물보다 쥐 꼬리 콜라겐을 사용한 피부 등가물에서 세포에 더 적합한 조건임을 확인하였다. 따라서 3D 세포배양에 더 적합한 조건인 쥐 꼬리 콜라겐을 사용한 피부 등가물에서 스트레칭 자극을 주었을 때 세포의 변화를 비교하기 위해 쥐 꼬리 콜라겐 0.85중량% 피부 등가물을 사용하였다.
조직 분석 결과를 위해 돼지 피부 콜라겐 결과와 동등한 배양조건에서 실험하였으며 지지체로 쥐 꼬리 콜라겐 (0.85중량%)을 사용하여 정적인 조건의 피부 칩과 0.01Hz, 10% Strain을 시킨 신축 가능한 피부 칩에서 배양한 시료를 H/E 염색을 통해 비교하였다. 도 6의 (a),(b),(c)는 정적인 조건에서 각각 3일, 5일, 7일에 거쳐 배양한 피부 등가물의 단면이며 도 6 (d)는 도 6 (b)의 사각형 부분을 확대한 사진이다. 도 6 (e),(f),(g)는 스트레칭 조건에서 각각 3일, 5일, 7일에 거쳐 배양한 피부 등가물의 단면이며 도 6 (h)는 도 6 (f)의 사각형 부분을 확대한 사진이다. 5일차 공기노출을 통한 배양에서 정적인 조건에서 스트레칭 조건보다 각질층의 두께가 두꺼우며 진피층과 잘 붙어있음을 확인하였고, 수치상으로 비교하였을 때 정적인 조건에서 86.4±26㎛이었으며 스트레칭 조건에서 49.8±12㎛ 두께로 약 37㎛ 얇은 각질층이 생성된 것을 확인하였다. 또 흥미롭게도 섬유아세포의 모양에서 큰 변화를 확인하였는데, 각 5일차 공기노출을 통한 배양에서 정적인 조건의 피부 칩의 섬유아세포는 길쭉하고 별모양의 모양으로 신장되어 길이는 약 50±24㎛로 나타났으며 신축 가능한 피부 칩은 섬유아세포가 둥글고 작은 타원형 모양을 띠고 있으며 길이는 11.8±6.8㎛로 나타났다.
결과 6: 정적 조건 및 스트레칭 조건에서 배양된 쥐 꼬리 콜라겐을 이용한 피부 등가물의 메이슨 트리크롬, 시리우스 염색 결과
정적 조건 및 스트레칭 조건에서 배양된 공기노출 7일차 시료를 사용하여 메이슨 트리크롬 염색 및 시리우스 염색을 통해 비교하였다.
도 7에서 보는 바와 같이 메이슨 트리크롬 염색 및 시리우스 염색 결과는 각 조건에 따라 동일한 양상을 보였다. 정적인 조건에서는 전체적인 진피층 부분에 실 모양으로 새롭게 발현된 콜라겐이 매우 많이 나타났음을 확인할 수 있었고 각질층 부분에 더 짙게 염색되어 있었다. 그러나 스트레칭 조건에서는 정적인 조건에 비해 실 모양으로 나타난 콜라겐 발현량이 적었으며 세포 주변부에 짙게 염색된 부분을 제외하고는 기존의 지지체로 사용한 쥐 꼬리 콜라겐과 구별하기 어려웠다. 이를 통해 섬유아세포의 콜라겐 발현 능력은 스트레스가 가해지면 현저히 감소함을 확인할 수 있었다.
결과 7: 정적 조건 및 스트레칭 조건에서 배양된 쥐 꼬리 콜라겐을 이용한 피부 등가물의 면역염색 결과
면역 염색 결과를 비교하기 위해 마찬가지로 위 조직염색 결과에 사용된 공기노출 7일차 시료를 사용하였으며 두 세포의 정상적 기능을 알아보기 위해 섬유아세포의 대표적 단백질 합성 지표로 피브로넥틴의 발현과 콜레긴 Ⅳ의 발현을 비교하였으며 각질세포의 단백질 발현을 알아보기 위해 케라틴 10 발현을 비교하였다.
도 8 (g), (h), (i)는 정적인 조건에서 배양한 시료의 피브로넥틴, 콜라겐 Ⅳ, 케라틴 10 발현을 각각 나타내는 사진이다. 진피층 전체적으로 피브로넥틴과 콜라겐 Ⅳ가 실 모양으로 매우 잘 발현되어있음을 보여주고 이는 특수염색의 결과와 비교하였을 때 일치하는 결과를 보여준다. 또 케라틴 10의 발현에서도 표피세포 위 각질층 부근에 잘 형성되어 있는 것을 확인하였다. 그리고 도 8 (j), (k), (l)은 스트레칭 조건에서 배양한 시료의 피브로넥틴, 콜라겐 Ⅳ, 케라틴 10의 발현을 나타내는 사진이다. 여기서는 정적인 조건에서 배양된 조직과 같이 실 모양의 피브로넥틴이나 콜라겐 Ⅳ가 발현되지 않았고 돼지 피부 콜라겐을 사용했을 때와 마찬가지로 둥근 고리 모양으로 나타났으며 정적인 조건에서와 비교했을 때 훨씬 적은 양이 염색되었다. 특히 콜라겐 Ⅳ는 스트레칭 환경에서 거의 나타나지 않음을 확인하였다. 이는 메이슨 트리크롬, 시리우스 염색 결과에서 거의 발현되지 않고 기존의 쥐 꼬리 콜라겐에 의해 발현된 것임을 시사한다. 또 케라틴 10의 발현량은 정적인 조건에 비교했을 때 매우 적게 나타났음을 확인하였다.
결과 8: 스트레칭 시간에 따른 쥐 꼬리 콜라겐을 이용한 피부 등가물의 조직사진 비교
우리는 시간이 지남에 따라 각질층의 두께가 얇아지고 세포의 수도 감소하는 현상을 조직 사진을 통해 확인하였다. 따라서 시간이 지남에 따라 단백질의 발현량에서도 어떤 변화가 일어나는지 알아보기 위해 각각 3일, 5일, 7일에 거쳐 배양된 샘플을 H/E 염색과 면역조직화학 염색을 통해 피브로넥틴, 콜라겐 Ⅳ를 비교하였다. 도 9 (a), (b), (c)는 스트레칭 조건 하에서 3일간 배양한 시료이며 도 9 (d), (e), (f)는 5일, 도 9 (g), (h), (i)는 7일간 배양한 시료의 조직사진이다. 스트레칭을 가한 조건에서 피브로넥틴 발현이 둥근 고리 모양으로 나타남을 확인하였으며 3일차 시료에서 낮은 발현, 5일차에는 그보다 높은 발현, 7일차에는 다시 낮은 발현을 확인하였다. 또한, 스트레칭 조건 7일차에 각질세포가 확산되어가는 현상을 면역조직화학염색을 통해서 확인하였다.
결과 9: 정적 조건 및 스트레칭 조건에서 배양된 쥐 꼬리 콜라겐을 이용한 피부 등가물 유래 단백질 발현 유전자 분석
조직분석을 통해 나타난 노화 현상을 정량적으로 분석하기 위해 qPCR을 통해 노화 관련 인자를 비교하였다. 그 중 필라그린(Filaggrin)은 주로 각질세포에서 발현하는 단백질로 피부 보호, 보습에 관여하는 단백질이고 노화시 감소하는 경향을 보인다. 라미닌(Laminin) α5은 진피-각질층 접합부에 존재하는 기저막에서 주로 발현되는 단백질로 피부 지지를 담당하며 노화시 감소하고 주름진 피부의 원인이 된다. 인볼루크린(Involucrin)은 각질층 부분의 피부 보호에 관여하고 노화된 피부에서 감소하는 경향이 나타났으며[32], P53 유전자는 돌연변이가 일어났을 때 이를 수리하고 노화된 세포나 암세포화된 세포 등을 자기사멸(Apoptosis)시키는 유전자로, 노화된 피부에서는 P53 유전자 발현량이 증가하는 경향이 나타난다. 마지막으로 β-액틴은 세포 골격을 담당하며 일반적인 실험에서 대조군으로 사용되지만, 노화시 β-액틴 발현량의 감소가 보고되어 노화를 유발하는 조건이 주어졌을 때 β-액틴은 적절한 대조군으로 사용될 수 없다. 도 10 (a)에서 보는 바와 같이 우리는 β-액틴 발현이 시간이 증가함에 따라 점차 감소하는 경향을 확인하였고, 도 10 (b)와 (c)에서 필라그린은 스트레칭 초기에 급격히 감소했다가 서서히 증가하였고, 라미닌 α5는 정적인 조건과 유사하게 발현하지만 7일차에 감소함을 확인하였다. 또, 도 10 (d)에서 보는 바와 같이 인볼루크린은 스트레칭 초기에 대폭 감소하며 시간이 지남에 따라 점점 더 발현이 감소하였으며, 도 10 (e)에서 보는 바와 같이 P53의 경우 스트레칭 1일차, 3일차에 지나며 점차 감소하는 추세에서 7일차에서 스트레칭 3일차 조건보다 약 2.5배 가량 급격하게 증가하는 경향을 확인하였다.
Figure 112017129651141-pat00001

Claims (17)

  1. 기저층;
    상기 기저층 상에 배열되며, 멤브레인과 미세 유체채널이 형성된 하부층; 및
    상기 하부층 상에 배열되며, 배양액 챔버, 피부 세포 배양 챔버 및 수평 방향으로 전진, 후퇴 운동을 제공하는 칩 외부의 선형 구동장치에 대응하여 칩의 피부 세포에 선형 운동을 일으키는 하나 이상의 연결부를 포함하는 상부층;을 포함하며,
    상기 피부 세포 배양 챔버에는 피부 세포 및 피부 세포의 3차원 세포배양을 위한 지지체가 들어 있어 피부 세포가 3차원으로 배양되며,
    상기 피부 세포 배양 챔버는 신축 가능한 탄성 재질로 제조되며,
    상기 연결부는 피부 세포 배양 챔버의 측면에 위치하며,
    상기 멤브레인은 상부층의 피부 세포 배양 챔버 아래에 위치하며, 피부 세포가 배양액에 잠겨있지 않도록 하고, 미세 유체채널과 연결되며,
    상기 미세 유체채널은 별도의 동력장치 없이 피부 세포 배양 챔버 아래의 멤브레인과 배양액 챔버를 연결하여 배양액과 산소를 피부 세포로 공급하고, 노폐물과 이산화탄소를 피부 세포로부터 회수하는 것을 특징으로 하는 피부 칩 (skin-on-a-chip).
  2. 청구항 1에 있어서,
    상기 연결부는 기계적, 전기적 또는 자기적으로 칩 외부의 선형 구동장치와 연결되는 것임을 특징으로 하는 피부 칩.
  3. 청구항 1에 있어서,
    상기 기저층은 유리 또는 투명한 합성 중합체를 포함하거나 이로 구성되는 재료로 제조되는 것을 특징으로 하는 피부 칩.
  4. 청구항 1에 있어서,
    상기 피부 세포 배양 챔버는 탄성 PDMS (Polydimethylsiloxane) 또는 탄성 PDMS를 포함하는 조성물로 이루어진 것임을 특징으로 하는 피부 칩.
  5. 청구항 1에 있어서,
    상기 지지체는 콜라겐, 젤라틴, 푸코이단, 알지네이트, 키토산, 히알루론산, 실크, 폴리이미드(polyimides), 폴리아믹스 산(polyamix acid), 폴리카프롤락톤(polycarprolactone), 폴리에테르이미드(polyetherimide), 나일론(nylon), 폴리아라미드(polyaramid), 폴리비닐알콜(polyvinyl alcohol), 폴리비닐피롤리돈(polyvinylpyrrolidone), 폴리벤질글루타메이트(poly-benzyl-glutamate), 폴리페닐렌테레프탈아마이드(polyphenyleneterephthalamide), 폴리아닐린(polyaniline), 폴리아크릴로나이트릴(polyacrylonitrile), 폴리에틸렌옥사이드(polyethylene oxide), 폴리스티렌(polystyrene), 셀룰로오스(cellulose), 폴리아크릴레이트(polyacrylate), 폴리메틸메타크릴레이트(polymethylmethacrylate), 폴리락산(polylactic acid; PLA), 폴리글리콜산(polyglycolic acid; PGA), 폴리락산과 폴리글리콜산의 공중합체(PLGA), 폴리{폴리(에틸렌옥사이드)테레프탈레이트-co-부틸렌테레프탈레이트}(PEOT/PBT), 폴리포스포에스터(polyphosphoester; PPE), 폴리포스파젠(PPA), 폴리안하이드라이드(Polyanhydride; PA), 폴리오르쏘에스터{poly(ortho ester; POE}, 폴리(프로필렌푸마레이트)-디아크릴레이트{poly(propylene fumarate)-diacrylate; PPF-DA} 및 폴리에틸렌글라이콜디아크릴레이트{poly(ethylene glycol) diacrylate; PEG-DA}로 이루어진 그룹 중에서 선택된 1종 이상임을 특징으로 하는 피부 칩.
  6. 청구항 1의 피부 칩을 이용하여 칩 외부 선형 구동장치에 간헐적으로 한 방향 선형 운동을 인가하여 피부 세포에 이완과 수축을 일으킴으로써 피부 세포를 모사하고 피부 외용 조성물의 효능을 평가하는 방법.
  7. 청구항 6에 있어서,
    상기 피부 외용 조성물은 화장료 조성물, 피부 외용 약제 또는 독성 시험물질임을 특징으로 하는 피부 외용 조성물의 효능을 평가하는 방법.
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