KR20230015682A - 노화 피부 모델 및 그 제작 방법 - Google Patents

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Abstract

외부 환경으로부터 신체를 보호하는 피부는 인간 몸에서 일어나는 대사 과정으로 인한 내인성 노화와 자외선과 같은 환경적 요인에 장기간 노출되어 나타나는 외인성 노화에 의해 노화된다. 내인성 노화의 경우 인간이 성장한 이후 죽음에 이를 때까지 긴 시간 동안 진행되므로 인 비트로 실험에 큰 걸림돌이 되고 있다. 우리는 28일간 일주성 리듬을 고려한 주기적인 기계적 자극에 의해 완전한 두께 피부 등가물의 노화가 가속된다는 것을 발견하였다. 우리는 신축성 피부 칩에 인간 섬유아세포와 케라티노사이트로 완전한 두께 3D 피부 등가물을 배양할 때 기계적 자극 구동 시스템을 적용하여 노화 피부 모델을 제작하였다. 주기적인 압축 스트레스에 의한 노화 가속화는 표피층의 두께 감소, 완전한 두께의 피부 등가물의 수축율 저하, β-갈락토시데이즈 유전자의 발현 증가, 활성산소종과 TGF-β1의 분비 증가, Myb의 분비 감소 등의 결과들로 입증하였다. 신축성 피부 칩과 기계적 자극 구동 시스템을 적용한 인 비트로 노화 피부 모델은 동물 실험이 금지된 화장품 산업과 피부질환용 신약개발 기간을 앞당기는데 크게 기여할 수 있을 것으로 전망된다.

Description

노화 피부 모델 및 그 제작 방법 {Aging skin model of full thickness and a producing method thereof}
본 발명은 노화 피부 모델 및 일주성 기계적 자극을 이용한 노화 피부 모델 제작 방법에 관한 것이다.
외부 환경으로부터 신체를 보호하는 피부는 내인성 노화 (Intrinsic aging)와 외인성 노화 (extrinsic aging)에 의해 노화가 유도된다. 내인성 노화는 인간의 몸에서 일어나는 대사 과정으로 인해 노화되는 것이고, 외인성 노화는 자외선과 같은 환경적 요인에 장기간 노출되어 나타나는 변화이다.1,2 대표적인 노화의 원인으로는 활성산소종 (reaction oxygen species; "ROS")과 자외선이 있다. 내인성 노화에서는 우리 몸의 대사과정에서 활성산소종이 만들어져 손상이 누적되고, 외인성 노화에서는 유해한 활성산소종이 자외선에 의하여 만들어진다.3-5 일반적인 조건에서 피부 세포 표면의 RTK (receptor tyrosine kinase)의 활성이 RPTP (receptor protein tyrosine kinase)에 의해 억제된다. 그러나 자외선을 쬐었을 때는 피부에서 활성산소종을 생성해서 RPTP와 결합하게 된다. 그 결과, RTK가 인산화되어 NF-kB (nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells)와 AP-1 (activator protein-1) 전사 인자들이 유발된다. 이 전사 인자들은 TGF-β 수용체를 감소시켜서 콜라겐 생성을 억제하고 MMP (matrix metalloproteinases) 유전자 전사를 증가시켜 콜라겐 함량을 감소시킨다.3,6,7 이렇게 피부 노화가 진행되며, 노화된 피부는 표피 두께가 얇아지고 장벽 기능이 저하되며 복제 능력이 감소한다.8 또한 각질 세포의 각질화 주기 속도가 감소하여 상처 회복이 지연된다. 진피에서는 섬유아세포의 수가 감소하고 콜라겐과 탄성 섬유가 손실되어 탄력이 떨어지며 진피 두께가 감소한다. 진피-표피 접합부에서는 그 경계 부분이 평평해지며 표피와 진피 사이의 결합이 느슨해지기 때문에 작은 자극에도 표피와 진피가 서로 분리되고 손상을 입는다.8 인간의 수명이 연장되고 젊고 건강한 삶을 영위하려는 욕구를 충족시키기 위해 많은 사람들이 피부 노화를 막거나 되돌리려는 화장품과 약품들을 많이 사용하고 있고 이를 위한 피부 노화와 치료에 대한 연구가 지속적으로 진행되고 있다.8-10
피부는 몸의 가장 바깥에서 체온 조절, 면역 기능을 수행할 뿐만 아니라 체내의 수분, 전해질, 단백질이 소실되는 것을 막아주는 역할을 하고, 그 구조는 표피 (epidermis), 진피 (dermis), 지방층 (fat layer)으로 구성된다. 표피층은 각질층 (stratum corneum), 투명층 (stratum lucidum), 과립층 (stratum granulosum), 가시층 (stratum spinosum), 기저층 (stratum basale)으로 구성되어 있고, 진피층은 유두층 (papillary layer)과 망상층 (reticular layer)으로 구성되어 있다.11 케라틴 (Keratin)과 필라그린 (Filaggrin)은 피부의 가장 바깥쪽 층인 표피층 단백질 대부분을 이루고 있다. 표피 분화의 마지막 단계에 해당하는 각질층 (stratum corneum)에서 필라그린은 케라틴으로 이루어진 섬유조직이 서로 뭉쳐질 수 있도록 도와주고12 피부 장벽 기능을 강화시킨다. 표피의 투명층 (stratum lucidum)은 2~3개 층의 상피 세포로 구성되어 있고 이 상피 세포의 세포 골격 구성 성분 중의 하나인 케라틴 10은 기계적 스트레스가 외부에서 가해질 때 상피 세포의 안정성을 유지시켜주는 역할을 한다.13 인볼루크린 (Involucrin)은 각질세포 막을 구성하는 성분 중 하나로 다른 구조 단백질보다 비교적 일찍 합성되어 과립층 (stratum granulosum)과 가시층 (stratum spinosum)에서부터 나타나기 시작한다. 과립층은 각질화 과정이 일어나는 층으로 각질세포 분화가 시작되면서 나오는 세포막 안쪽 층이 피부 장벽 기능에 가장 중요한 역할을 하기 때문에 피부 장벽에 문제가 생기면 정상 분화가 일어나지 않으므로 인볼루크린의 발현 수준도 낮아진다.14 망상층은 진피의 대부분을 차지하는 부분으로 주로 콜라겐, 엘라스틴, 당단백질 등으로 이루어져 있다. 콜라겐은 피부를 견고하게 지탱하는 역할을 해주고 엘라스틴은 피부 탄력에 중요한 역할을 한다. 당단백질은 세포 사이 접착력이나 섬유질 사이의 접착에 영향을 주고 이런 접착 단백질로는 피브로넥틴이 가장 대표적이다.15 이러한 다양한 피부 단백질들은 노화에 따라 발현 양상이 변화될 것으로 생각된다.
노화를 확인할 수 있는 대표적인 바이오마커는 β-갈락토시데이즈이다. β-갈락토시데이즈는 갈락토스와 유기 부분 사이의 β-글라이코사이드 결합을 가수분해하는 효소이며 증식 세포가 없는 배양세포에서 pH 6.0에서 검출할 수 있다. 배양 세포에서 라이소좀의 수와 크기는 후기 계대로 갈수록 증가하는데 이에 따라 라이소좀 β-갈락토시데이즈 단백질도 증가하지만, 활성세포와 사멸세포에서는 발현되지 않는다.16,17 β-갈락토시데이즈는 노인과 동물에게서 검출된 것이 확인되었고, 이를 통해서 세포의 노화에서 나타나는 β-갈락토시데이즈의 발현이 유기체 노화의 특징임이 보고된 바가 있다.18,19 이와 관련된 실험에서 노화된 세포가 포함되어 있는 대식세포를 쥐에 이식했을 때 시간이 지날수록 β-갈락토시데이즈가 더 많이 발현되었다는 결과를 확인하였다.20 따라서 노화된 세포일수록 β-갈락토시데이즈 발현이 많아진다는 것을 입증할 수 있었고21 노화된 세포에 대한 명백한 특이성 때문에 β-갈락토시데이즈는 가장 흔하게 사용되는 노화 마커라고 할 수 있다. 또 다른 노화 바이오마커로는 PSMD8 (Proteasome 26S Subunit, Non-ATPase 8)이 있다. 피부 노화가 진행되면 세포에서 손상되거나 잘못 접혀있는 단백질을 제거하는 프로테아좀 (proteasome)이 감소하게 된다. 프로테아좀의 활성이 저하되면 세포 및 조직 기능을 방해하는 비정상 단백질이 축적된다. 피부가 노화되면 감소하는 프로테아좀은 많은 서브유닛이 있는데 그 중에서도 표피에서의 PSMD8의 부분적인 손실이 프로테아좀 기능을 손상시키고 표피 조직을 얇아지게 한다는 것을 확인했다.22 노화된 각질 세포에서의 PSMD8 발현량을 실험한 연구결과에서 신생아 피부에서보다 노화된 각질 세포에서 PSMD8 단백질 발현이 30% 감소했다는 결과가 보고되었다.23 이를 통해 PSMD8을 노화의 바이오마커로 사용할 수 있다는 것을 알 수 있다. 또한 노화된 피부에서 표피층과 진피층이 변화를 보이기 때문에 앞서 언급했던 표피층의 두께와 필라그린, 케라틴 10, 인볼루크린, 피브로넥틴 등의 발현 거동도 노화의 증거로 고려할 수 있다.
지축을 중심으로 한 지구의 24시간의 자전은 주간 및 야간 기능의 주기적 패턴을 중심으로 하는 유기체 발달에 영향을 미친다. 일주성 시스템 (Circadian system)은 중심 시계 (central clock)와 보조 시계 (peripheral clock)로 구성된다. 보조 시계라 불리는 생체 리듬 조절 수단은 다양한 종류의 조직과 세포 내에 있고 마스터 조절 유전자인 Clock과 Bmal1의 전사를 포함하는 자동 조절 피드백 루프에 의해 유지된다. 이 자동 조절 피드백 루프는 Per1, Per2, Per3, Cry1, Cry2 단백질이 세포질에 축적될 때 형성된다.24,25 한 연구에서 섬유아세포, 각질 세포, 멜라닌 세포를 배양하고 qRT-PCR을 이용하여 clock 유전자가 발현된 것을 관찰하였다.26 이 결과는 생명체에서 일어나는 생체 내 과정의 주기와 배양된 세포에서 일어나는 활동 주기가 유사하다는 것을 알 수 있다. 일주성 시스템은 시계의 리듬을 동반하는 환경적 차이트게버 (Zeitgeber; 체내 시계의 주기에 영향을 주는 외적 인자)들에 의해 결정된다. 차이트게버에는 빛, 온도, 대기 조건, 운동 등이 있다.27 그래서 우리는 생체 내에서 이루어지고 있는 화학적 반응과 유사한 환경을 만들기 위해 일주성 리듬을 고려하여 12시간 동안 인장 자극를 일정한 주기로 인가하고, 12시간 동안 무자극 상태를 유지하는 실험 조건을 적용하여 주름진 피부모델을 보고한 바 있다.28 신축 가능한 피부 칩 (한국특허 제1970125호)은 자력을 이용하여 피부 칩에 12시간 주기로 기계적 인장응력을 가하여 인체의 피부와 유사한 피부 칩을 제공하려는 시도였다. 그러나, 일반적인 인간 피부 재생 주기인 28일까지 인장응력을 가한 결과, 3~14일까지는 표피층이 점차 얇아지고, 21일 또는 28일까지 12시간 주기로 인장응력을 가하며 피부 칩의 피부 세포를 배양한 결과, 각질층 구조가 지나치게 약화되어 분리되고 찢어지는 결과가 나타났다. 따라서, 인장 자극을 주는 피부칩의 경우 배양 14일차 이후 점차 표피층이 진피층과 분리되고, 각질층이 터지거나 찢어지는 파괴 현상이 일어나 28일간 안정적인 피부 노화모델 구현이 불가능하다.
약물과 화장품의 출시에 필수적인 전임상시험은 동물 실험을 통해서 이루어지고 있다. 특히 화장품의 독성 시험을 위해 사용되던 동물 실험은 비용과 시간, 윤리적인 문제들에 의해 EC에서 2013년부터 금지되었고 전세계적으로 금지국가가 늘어나고 있다. 동물 실험을 대체하기 위해 피부 칩 (Skin-on-a-Chip)을 이용하여 인간의 생리학적 환경과 유사한 3D 배양과 체외에서 인간 피부 등가물 (Human skin equivalents)을 접목시킨 모델을 제작하는 연구들이 보고되었다.29 이러한 연구들에서는 일반적으로 세포들이 정적인 3차원 환경에서 미세유체 채널을 통해 공급되는 배양액으로 배양되어 실험이 진행된다. 하지만 실제 인간에게는 외부와 내부에서 많은 자극들이 주어지고 있기 때문에 정적인 실험 조건은 생체 내에서 이루어지고 있는 생리화학적인 반응들과 유사하다고 보기 어렵다.30 우리는 트랜스웰 (transwell)과 미세유체 칩 (microfluidic chip)에서 3D 피부 등가물을 배양하여 중력 흐름 시스템 (gravity flow system)이 적용된, 펌프가 없는 피부 칩 (pumpless skin-on-a-chip)에 배지의 관류 (perfusion)를 가하는 것이 트랜스웰에서와 비교하였을 때 스킨 등가물이 증식하고 분화하는데 충분한 영양분을 제공한다는 것을 확인하였다.29 또한 펌프 없이 유체 흐름을 가능하게 하는 중력 흐름 시스템을29,31-35 적용한 피부 칩을 사용하여 인간 피부 등가물 모델을 제작하고 이런 모델들을 사용하여 약물의 효능을 평가할 수 있는 약물 테스트 모델들이 소개되었다. 한 연구에서는 기계적인 스트레칭으로 인하여 표피층의 두께가 두꺼워지는 것을 확인하였다.36 하지만 이는 세포에 자극을 전달하긴 했지만 직접적인 영향을 줄 수는 없었다. 압전적으로 (piezoelectrically) 및 전자기적으로 (electromagnetically) 작동하는 스트레칭 기구 등으로 다양한 작동 모드를 가진 장치로 직접적으로 기계적 자극을 인가하는 연구들이 보고되었으나 2D 배양 모델에서 적용하였을 뿐이며, 3D 모델에 적용된 예는 아직 보고된 바 없다.28,37-40
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따라서, 본 발명은 종래 인장응력을 가하는 피부 칩의 한계를 극복하고, 실제로 사람피부 조건에 좀 더 유사하게 수축과 이완이 반복적으로 일어나는 상태를 모방한 노화 피부 모델 및 그 제조방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명에서는 신축성 피부 칩과 기계 자극 작동 시스템을 이용하여 3차원 피부 등가물에 일주성 리듬을 고려한 기계적 압축자극을 주어 28일간의 비교 배양실험을 통해 노화 피부 모델을 제작하고 노화 마커들을 조사하여 진피층과 표피층에서 일어나는 노화 진행 여부를 입증하였다. 이러한 노화피부모델이 피부 칩에서 구현된다면 아직까지 밝혀지지 않은 새로운 노화 기전을 밝힐 수 있을 뿐만 아니라, 새로운 항노화물질의 스크리닝과 효능 시험에도 활용될 수 있어서 항노화 화장품 개발과 피부질환 신약개발에 대한 파급효과가 매우 클 것으로 기대된다.
본 발명자들은 인 비트로 완전한 두께의 피부 등가물 실험에서 큰 걸림돌이 되는 수축 문제를 광가교제를 이용하여 해결하고, 일주성 리듬을 고려한 기계적 자극 환경을 만들어주는 신축성 피부 칩 (flexible skin-on-a-chip; FSOC)과 기계적 자극 구동 시스템 (Mechanical stimulus actuating system; MSAS)을 제작하여 28일만에 노화된 완전한 두께의 피부 등가물을 만들었다. 우리는 기계적 자극에 의한 피부 등가물의 수축율 감소, 표피층 두께의 감소와 노화 마커로 알려진 β-갈락토시데이즈 유전자 발현의 증가로 노화가 진행되었음을 입증하였다. 진피층의 콜라겐 IV와 피브로넥틴의 발현량은 기계적 자극으로 노화된 시료들에서 감소하였고, 표피층의 필라그린, 케라틴 10, 인볼루크린, 인테그린 β-1의 유전자 발현 경향이 단백질 발현 경향과 유사하게 1주일 정도 먼저 진행되는 것이 관찰되었다. 기계적 자극에 의한 노화 기전을 설명하기 위하여, 배양 배지에 대한 사이토카인 분석을 수행하였다. 기계적 자극에 의해 활성산소종, TGF-β1이 증가하였고 Myb가 감소하는 결과를 얻어서 도 11과 같은 노화 기전을 제안하고자 한다. 기계적 자극에 의해 세포 내 활성이 촉진되어 활성산소종이 증가하고, 이 활성산소종은 세포 표면의 RPTP와 결합하여 RTK 인산화를 일으켜 NF-κ와 AP-1 전사 인자들을 유발한다. 이 전사들은 TGF-β 수용체를 감소시켜서 콜라겐 생성을 억제하고 MMP 유전자 전사를 증가시켜 콜라겐 함량을 감소시킨다. 그렇게 진피층의 콜라겐 I이 결핍되면 각질세포의 Myb 분비가 감소한다. 따라서 주기적인 기계적 자극에 의해 활성산소종이 증가하고 TGF-β1 수용체가 감소하여 진피층 내의 콜라겐 I을 결핍시켰고, 이에 따라 Myb 분비가 감소하게 된다. 이 기전을 통해 노화가 진행되어 우리가 관찰한 완전한 두께의 피부 등가물의 수축율 감소, 표피층 두께의 감소와 노화 마커인 β-갈락토시데이즈 유전자 발현 증가 등의 노화 증거들이 나타난 것으로 생각된다.
이때 본 발명에서는 신축성 피부 칩에 기계적 자극으로 인장응력이 아닌 압축응력을 인가함으로써 실제 피부의 상태와 유사한 정도로 노화된 피부 칩을 얻을 수 있었다.
도 12는 본 발명자들의 특허인 한국특허 제1970125호 신축 가능한 피부 칩에 영구 자석과 전자석을 이용하여 0.01 Hz 주기로 5%의 일축 인장 변형을 12시간 인가하고, 12시간 중지하는 기계적 자극 조건으로 3, 5, 7, 14, 21, 28일간 배양하여 관찰한 것이다. 대조군은 인장 변형을 가하지 않은 것이다. 그 결과, 3~14일까지는 표피층이 얇게 분화되고, 21일, 28일 배양 결과는 각질층의 구조가 약화되어 분리되어 찢어지는 현상이 관찰되었다. 따라서, 이 기술은 14일차 이후 표피층이 진피층과 분리되고, 각질층의 파괴가 일어나 28일간 안정적인 노화모델 구현이 어렵다.
우리는 일주성 리듬을 반영한 기계적 자극 환경을 제공하는 방법으로 노화된 완전한 두께의 피부 등가물 모델을 제작하여, 인 비트로 약물효능 평가를 수행함으로써 동물실험이 금지된 화장품 산업의 신제품 개발과 피부질환 치료제 개발 기간을 획기적으로 앞당길 수 있는 길을 열게 되었다.
본 발명은
기저층;
상기 기저층 상에 배열되며, 미세 유체채널과 멤브레인을 포함하는 하부층; 및
상기 하부층 상에 배열되며, 배양액 챔버, 피부 세포가 3차원으로 배양되며, 신축 가능한 탄성 재질로 제조되는 피부 세포 배양 챔버를 포함하는 상부층;을 포함하며,
상기 피부 세포 배양 챔버에는 피부 세포의 3차원 세포배양을 위한 지지체 및 피부 세포가 들어 있고, 피부 세포의 위쪽 표면은 공기에 노출된 상태로 피부 세포가 3차원으로 배양되며,
상기 하부층의 멤브레인은 미세 유체채널과 연결되며, 상부층의 피부 세포 배양 챔버 아래에 위치하며, 피부 세포가 배양액에 잠겨있지 않도록 하고,
상기 미세 유체채널은 피부 세포 배양 챔버 아래의 멤브레인과 배양액 챔버를 연결하여 배양액과 산소를 피부 세포 배양 챔버 내의 피부 세포로 공급하고, 노폐물과 이산화탄소를 피부 세포로부터 회수하며,
매일 일정 시간 동안 압축응력을 피부 세포 배양 챔버에 가하여 피부 세포에 압축 및 이완을 인가하여 피부의 수축과 이완 현상을 모사하는 것을 특징으로 하는 노화 피부 모델에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 기저층이 유리 또는 투명한 합성 중합체를 포함하거나 이로 구성되는 재료로 제조되는 것을 특징으로 하는 노화 피부 모델에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 하부층 및 상부층 중 하나 이상이 PDMS (Polydimethylsiloxane) 또는 PDMS를 포함하는 조성물로 이루어진 것임을 특징으로 하는 노화 피부 모델에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 피부 세포 배양 챔버가 신축성 폴리머로 이루어진 것임을 특징으로 하는 노화 피부 모델에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 피부 세포가 진피층 및 표피층을 포함하는 것을 특징으로 하는 노화 피부 모델에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 지지체가 콜라겐, 젤라틴, 푸코이단, 알지네이트, 키토산, 히알루론산, 실크, 폴리이미드(polyimides), 폴리아믹스 산(polyamix acid), 폴리카프롤락톤(polycarprolactone), 폴리에테르이미드(polyetherimide), 나일론(nylon), 폴리아라미드(polyaramid), 폴리비닐알콜(polyvinyl alcohol), 폴리비닐피롤리돈(polyvinylpyrrolidone), 폴리벤질글루타메이트(poly-benzyl-glutamate), 폴리페닐렌테레프탈아마이드(polyphenyleneterephthalamide), 폴리아닐린(polyaniline), 폴리아크릴로나이트릴(polyacrylonitrile), 폴리에틸렌옥사이드(polyethylene oxide), 폴리스티렌(polystyrene), 셀룰로오스(cellulose), 폴리아크릴레이트(polyacrylate), 폴리메틸메타크릴레이트(polymethylmethacrylate), 폴리락산(polylactic acid; PLA), 폴리글리콜산(polyglycolic acid; PGA), 폴리락산과 폴리글리콜산의 공중합체(PLGA), 폴리{폴리(에틸렌옥사이드)테레프탈레이트-co-부틸렌테레프탈레이트}(PEOT/PBT), 폴리포스포에스터(polyphosphoester; PPE), 폴리포스파젠(PPA), 폴리안하이드라이드(Polyanhydride; PA), 폴리오르쏘에스터{poly(ortho ester; POE}, 폴리(프로필렌푸마레이트)-디아크릴레이트{poly(propylene fumarate)-diacrylate; PPF-DA} 및 폴리에틸렌글라이콜디아크릴레이트{poly(ethylene glycol) diacrylate; PEG-DA}로 이루어진 그룹 중에서 선택된 1종 이상임을 특징으로 하는 노화 피부 모델에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 피부 세포 배양 챔버는 신축 가능한 탄성 PDMS로 형성하고, 상기 피부 세포 배양 챔버의 PDMS 내측 표면에 광반응으로 설포-SANPHA를 부착하고, 그 위에 피브로넥틴을 공유결합시킨 후, 그 위에 피부 세포를 가하여 피부 세포가 피부 세포 배양 챔버에 단단하게 결합한 것을 특징으로 하는 노화 피부 모델에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 매일 일정 시간이 매일 6~18시간, 바람직하게는 매일 8~16시간, 더욱 바람직하게는 매일 10~14시간임을 특징으로 하는 노화 피부 모델에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 압축 응력을 0.01~0.10 Hz, 바람직하게는 0.02~0.07 Hz, 더욱 바람직하게는 0.03~0.06 Hz 주기로 인가하는 것을 특징으로 하는 노화 피부 모델에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 압축 응력을 압축 변형률이 1~10%, 바람직하게는 2~7%, 더욱 바람직하게는 3~6%가 되도록 인가하는 것을 특징으로 하는 노화 피부 모델에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 압축 응력을 0.1~0.7 MPa, 바람직하게는 0.1~0.6 MPa, 더욱 바람직하게는 0.2~0.5 MPa 강도로 인가하는 것을 특징으로 하는 노화 피부 모델에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 피부 세포를 20~30일 동안, 바람직하게는 24~28일 동안 배양함을 특징으로 하는 노화 피부 모델에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 배양액과 산소를 피부 세포 배양 챔버 내의 피부 세포로 공급하는 과정을 별도의 동력 없이 중력 흐름을 이용하는 것을 특징으로 하는 노화 피부 모델에 관한 것이다.
또한, 본 발명은
(가) 기저층; 상기 기저층 상에 배열되며, 미세 유체채널과 멤브레인을 포함하는 하부층; 및 상기 하부층 상에 배열되며, 배양액 챔버, 피부 세포가 3차원으로 배양되며, 신축 가능한 탄성 재질로 제조되는 피부 세포 배양 챔버를 포함하는 상부층;을 포함하고, 상기 피부 세포 배양 챔버에는 피부 세포의 3차원 세포배양을 위한 지지체 및 피부 세포가 들어 있고, 피부 세포의 위쪽 표면은 공기에 노출된 상태로 피부 세포가 3차원으로 배양되며, 상기 하부층의 멤브레인은 미세 유체채널과 연결되며, 상부층의 피부 세포 배양 챔버 아래에 위치하며, 피부 세포가 배양액에 잠겨있지 않고, 상기 미세 유체채널은 피부 세포 배양 챔버 아래의 멤브레인과 배양액 챔버를 연결하여 배양액과 산소를 피부 세포 배양 챔버 내의 피부 세포로 공급하고, 노폐물과 이산화탄소를 피부 세포로부터 회수하는 피부 칩을 준비하는 단계;
(나) 배양액 챔버에 배양액을 가하는 단계;
(다) 피부 세포 배양 챔버 내측 표면에 설포-SANPAH 등의 교차 링커를 이용하여 피브로넥틴을 공유결합 등으로 단단하게 결합시키는 단계;
(라) 피브로넥틴이 결합된 피부 세포 배양 챔버에 피부 세포의 3차원 세포배양을 위한 지지체 및 진피층을 형성하는 단계;
(마) 진피층 위에 표피층을 형성하여 3D 피부 세포를 제조하는 단계;
(바) 3D 피부 세포를 공기에 노출하여 3~28일 동안 배양하는 단계; 및
(사) 3D 피부 세포를 배양한 피부 칩에 압축 응력을 매일 일정 시간 동안 인가하여 피부 세포에 이완과 수축을 반복하는 단계;를 포함하는 노화 피부 모델 제조방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 (바) 단계에서 중력 흐름을 이용하여 3D 피부 세포를 배양하는 것을 특징으로 하는 노화 피부 모델 제조방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 (사) 단계의 일정 시간이 매일 6~18시간임을 특징으로 하는 노화 피부 모델 제조방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 (사) 단계의 압축 응력을 0.01~0.1 Hz, 바람직하게는 0.02~0.07 Hz, 더욱 바람직하게는 0.03~0.06 Hz 주기로 가하는 것을 특징으로 하는 노화 피부 모델 제조방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 (사) 단계에서 압축 변형률 1~10%, 바람직하게는 1~7%, 더욱 바람직하게는 3~6%로 압축 응력을 가하는 것을 특징으로 하는 노화 피부 모델 제조방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 (사) 단계에서 압축 응력을 0.1~0.7 MPa, 바람직하게는 0.1~0.6 MPa, 더욱 바람직하게는 0.2~0.5 MPa 강도로 인가하는 것을 특징으로 하는 노화 피부 모델 제조방법에 관한 것이다.
위와 같은 주기 범위, 압축 변형률 범위 및/또는 압축 응력 강도 범위에서 실제 노화 피부와 유사한 노화 상태를 구현할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 노화 피부 모델을 이용하여 피부 외용 조성물의 효능을 평가하는 방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 피부 외용 조성물이 화장료 조성물, 피부 외용 약제 또는 독성 시험물질임을 특징으로 하는 피부 외용 조성물의 효능을 평가하는 방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은
1) 하나 이상의 피부 칩을 장착할 수 있는 랙,
2) 피부 칩을 랙에 안정적으로 고정하기 위한 서스펜션,
3) 피부 칩을 올려 두기 위한 바닥판,
4) 랙과 서스펜션을 조립할 수 있는 고정된 윗판,
5) 모터의 직선 왕복운동을 피부 칩에 전달하는 이동형 윗판,
6) 모터와 이동형 윗판을 연결시켜주는 브릿지 판,
7) 이동형 윗판과 브릿지 판을 연결시켜주는 브릿지; 및
8) 랙에 장착된 피부 칩에 압축응력을 가하는 모터;를 포함하며, 피부 칩에 압축응력을 인가하는 기계적 자극 구동 시스템에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 7)의 브릿지가 열전도도가 낮은 경량성 폴리머 재질, 예컨대 폴리카보네이트, 폴리에스터, 폴리스티렌, 폴리프로필렌, 폴리에틸렌, 폴리테트라플루오로에틸렌, 폴리옥시메틸렌 아세탈 중 선택된 1종 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 기계적 자극 구동 시스템에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 피부 칩이 기저층; 상기 기저층 상에 배열되며, 미세 유체채널과 멤브레인을 포함하는 하부층; 및 상기 하부층 상에 배열되며, 배양액 챔버, 피부 세포가 3차원으로 배양되며, 신축 가능한 탄성 재질로 제조되는 피부 세포 배양 챔버를 포함하는 상부층;을 포함하고, 상기 피부 세포 배양 챔버에는 피부 세포의 3차원 세포배양을 위한 지지체 및 피부 세포가 들어 있고, 피부 세포의 위쪽 표면은 공기에 노출된 상태로 피부 세포가 3차원으로 배양되며, 상기 하부층의 멤브레인은 미세 유체채널과 연결되며, 상부층의 피부 세포 배양 챔버 아래에 위치하며, 피부 세포가 배양액에 잠겨있지 않고, 상기 미세 유체채널은 피부 세포 배양 챔버 아래의 멤브레인과 배양액 챔버를 연결하여 배양액과 산소를 피부 세포 배양 챔버 내의 피부 세포로 공급하고, 노폐물과 이산화탄소를 피부 세포로부터 회수하는 것을 특징으로 하는 기계적 자극 구동 시스템에 관한 것이다.
본 발명에 따르면, 교차 링커를 이용하여 3차원 피부 세포를 피부 칩의 내측 표면에 강하게 결합시켜 실제 피부와 유사한 피부 모델을 제공할 수 있다.
또한, 본 발명에 따르면 3차원 피부 세포에 압축 응력을 주기적으로 가함으로써 실제 피부가 받는 것과 유사한 스트레스를 가하여 이상적인 노화 피부 모델을 제공할 수 있다.
이뿐만 아니라, 본 발명에 따르면 압축응력을 주기적으로 가한 3차원 피부 세포가 표피층이 얇아지고, 피부 세포 내 노화 바이오마커의 확인을 통하여 적절한 노화 피부 모델임을 확인할 수 있었다. 이 노화 피부 모델은 화장료 조성물, 피부 외용 약제 또는 독성 시험물질과 같은 피부 외용 조성물의 효능 평가에 유용하다.
도 1은 신축 가능한 피부 칩 (Flexible skin-on-a-chip; FSOC) 모식도와 실제 사진이다.
도 2는 설포-SANPAH, 피브로넥틴과 PDMS의 결합 과정을 나타내는 모식도이다.
도 3. (a) 중력 흐름 시스템을 이용한 FSOC 3D 배양 과정의 모식도. (b) 기계적 자극 구동 시스템 (Mechanical stimulus actuating system; MSAS)을 이용하여 12시간 동안 주기적 압축 자극을 인가하고 12시간 동안 무자극 상태를 유지하는 3D 배양 과정의 모식도.
도 4는 기계적 자극 구동 시스템의 모식도와 실제 사진이다. (a) ① 랙 (Rack), ② 서스펜션 (Suspension), ③ 바닥판 (Bottom plate), ④ 고정된 윗판 (Fixed top plate), ⑤ 이동형 윗판 (Moving top plate), ⑥ 브릿지 판 (Bridge plate), ⑦ 브릿지 (Bridge), (b) 4개의 FSOC (신축 가능한 피부 칩)가 탑재된 기계적 자극 구동 시스템의 모식도와 실제사진.
도 5는 공기에 노출시켜 28일 간 배양하는 동안 배양 조직 수축률 변화 그래프이다.
도 6은 배양 기간에 따른 H&E 조직 염색 이미지와 표피층 두께 변화 그래프이다.
도 7은 압축 자극 인가 유무와 배양 기간에 따른 qPCR 분석 그래프이다. (a) 필라그린 (Filaggrin), (b) 피브로넥틴 (Fibronectin), (c) 인볼루크린 (Involucrin), (d) 케라틴 10 (Keratin10), (e) β-갈락토시데이즈, (f) PSMD8.
도 8 (a)는 공기 노출 기간 동안 압축 자극을 인가하지 않은 면역조직화학 염색 이미지, (b)는 공기 노출 기간 동안 압축 자극을 인가한 면역조직화학 염색 이미지이다.
도 9는 압축 자극 인가 유무와 배양 기간에 따른 면역조직화학 분석 결과이다. (a) 콜라겐 Ⅳ, (b) 피브로넥틴, (c) 필라그린, (d) 케라틴 10, (e) 인볼루크린, (f) 인테그린-β1.
도 10은 압축 자극 유무에 따른 사이토카인 분비 비교 그래프이다. (a) 활성산소종, (b) TGF-β1, (c) Myb.
도 11은 피부 내 섬유아세포와 케라티노사이트 (keratinocyte)의 상호작용을 나타낸다.
도 12는 한국특허 제1970125호 신축 가능한 피부 칩에 영구 자석과 전자석을 이용하여 0.01 Hz 주기로 5%의 일축 인장 변형을 12시간 인가하고, 12시간 중지하는 기계적 자극 조건으로 3, 5, 7, 14, 21, 28일간 배양하여 관찰한 것이다. 대조군은 인장 변형을 가하지 않은 것이다.
아래에서는 구체적인 실험예와 실시예를 들어 본 발명의 구성을 좀 더 자세히 설명한다. 그러나, 본 발명의 범위가 실험예 및/또는 실시예 범위 내로 한정되는 것이 아님은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 자명하다.
1. 신축성 피부 칩 제작
PDMS (Polydimethylsiloxane)가 유연한 물리적 특성을 갖도록 프리폴리머: 경화제를 30:1의 비율로 혼합하여 제조한 후 80℃ 오븐에서 2시간 동안 경화시켜 상부 PDMS 칩을 제작하였다. 하부 PDMS 칩은 포토리소그래피 (photolithography) 방법으로 폭 200 μm 와 높이 150 μm의 미세 유체채널이 패턴화된 마스터 몰드를 이용하여 프리폴리머: 경화제 비율이 10:1인 PDMS를 제조한 후 80 ℃ 오븐에서 1시간 동안 경화시켜 제작하였다. 도 1에서 보는 바와 같이 신축성 피부 칩 (FSOC)은 상부 PDMS 칩과 하부 PDMS 칩으로 이루어져 있고 다공성 막 (공극 크기 0.4 μm) (Corning Inc., New York, U.S.)이 그 사이에 위치하고 있다. FSOC의 중앙에는 8 mm 정사각형 배양챔버가 있고 바닥의 막을 통해서 양쪽 배지 챔버로부터 공급되는 배지로 세포를 배양한다. 양쪽 배지 챔버에 채워진 배지가 하부채널을 통해 순환하도록 했다.28,31-35
2. 교차 링커 처리
시료의 수축을 최소화하기 위하여 광가교 교차 링커 (cross-linker)를 활용하였다.41,42 도 2에 나타낸 바와 같이, 10 mM SS(Sulfo-SANPAH, (ProteoChem, Hurricane, U.S.))를 FSOC의 세포 챔버에 가득 채운 후 고출력 UV 경화 장치(JHCI-051BS-V2, (Jueun UV Teq Anyang, Korea)를 이용하여 PDMS 표면과 약 15 cm의 거리에서 400 W의 고출력 UV (파장 365 nm) 조건으로 45분간 노광하였다. 이 과정 중에 나이트로페닐 아자이드 (Nitrophenyl azide) 반응이 일어나 PDMS 표면과 결합하면서 SS 분자들이 표면과 수직을 이루었다. 그 후 PBS로 세척하고 0.66 mg/ml의 피브로넥틴 (Corning Inc., New York, U.S.) 용액을 제조하여 챔버에 채워준 후 최소 3시간 동안 4℃에서 코팅 처리를 하고 세포 배양하였다. 이 과정 동안 PDMS 표면에 결합한 SS 끝부분의 아민기에 피브로넥틴이 결합된다. 결합된 피브로넥틴은 3차원 배양 지지체인 콜라겐과 강하게 결합하여 배양시 수축을 저지하게 된다.
3. 세포 배양
도 3에 간략히 도시된 바와 같이 진피층은 쥐꼬리 추출 타입 I 콜라겐 (Corning Inc., New York, U.S.) 용액과 섬유아세포 (Biosolution Co., Ltd. Seoul, Korea)를 혼합하여 인큐베이터에서 1시간 동안 젤화시킨 후 DMEM (Gibco, New York, USA) 배양액을 사용하여 5일간 배양하였다. 그 후에 케라티노사이트 (Biosolution Co., Ltd. Seoul, Korea)를 진피층 위에 부착시킨 후 KGM (Lonza, Basel, Switzerland) 배양액을 사용하여 3일의 공배양 기간 동안 표피층 형성이 이루어졌다. 그 후 공기에 세포를 직접적으로 노출시켜 분화를 유도하는 공기 노출 단계에서 기계적 자극 시료들은 일주성 리듬을 고려하여 12시간 동안 0.01 Hz 주기로 반복하여 5% 압축 응력 (compressive strain)을 가해준 후, 12시간 동안은 압축응력을 가하지 않고 배양하는 패턴으로 최대 28일간 수행하였다. 압축응력을 가하지 않은 시료들은 30초, 각도 15°로 기울이는 것을 반복하여 최대 28일간 수행하였다. 이 기간 동안 E-media를 사용하여 배양을 진행하였다 (E-media 조성: DMEM/Ham's F12 (gibco, New York, USA), EGF-1 10 ng/mL, 하이드로코르티손 0.4 ㎍/mL, 인슐린 5 ㎍/mL, 트랜스페린 5 ㎍/mL, 3,3,5-Triiodo-L-thyonine sodium salt 2 x 10-11 M, 콜레라 톡신 10-10 M, 10% (v/v) FBS, 1% 페니실린/스트렙토마이신).
4. 중력 흐름 시스템
3D 세포 배양은 생체 내의 환경과 유사하게 모방하기 위하여 중력 흐름 시스템을 이용하였다.29,43 배양액이 중력이 작용하는 방향으로 흐름이 생겨 효율적으로 배양액을 공급할 수 있다. 중력 흐름 시스템은 컴퓨터, 모터, 스테이지로 이루어져 있고 시간과 각도를 제어할 수 있다. 이 연구에서는 30초, 15°로 설정하여 작동시켰다.
5. 기계적 자극 구동 시스템
FSOC에 압축자극을 인가하는 구동 시스템은 도 4에서 보는 바와 같이, 총 7개의 부품으로 구성하였다. 4개의 칩을 걸 수 있는 랙, 칩이 뜨거나 끌려가는 것을 고정하기 위한 서스펜션, 칩을 올려 두기 위한 바닥판, 랙과 서스펜션을 조립할 수 있는 고정된 윗판, 선형 모터의 직선 왕복운동을 전달하는 이동형 윗판, 모터와 이동형 윗판을 연결시켜주는 브릿지 판, 이동형 윗판과 브릿지 판을 연결시켜주는 브릿지 등으로 구성하였다. 선형 모터의 발열에 의한 열전도를 최대한 차단하여야 하는 부품들은 열전도도가 0.31 W/mK으로 매우 낮은 폴리옥시메틸렌아세탈 (polyoxymethylene acetal) 재질을 사용하였고, 그 외의 부품들은 경량합금인 Al6061 (열전전도: 180 W/mK)을 사용하였다.
구동 모터는 선형 모터 (ZABER, British Columbia, Canada)를 사용했으며, 실험에 필요한 압축자극을 인가하기 위해 제조사에서 제공하는 Zaber Console Program을 이용했다. 일주성 시스템은 시계의 리듬을 동반하는 빛, 온도, 대기 조건 등 환경적 요인에 의해서 결정되는데 그 중에서도 우리는 운동 요소를 고려하였다. 그래서 우리는 생명체에서 일어나는 화학적 반응과 같은 생체 내 과정과 일주성 리듬을 고려하여 12시간 동안 5% 압축응력 (compressive strain), 0.01 Hz 조건으로 4개의 칩을 동시에 구동시키고 12시간 동안 무자극 상태를 유지하는 조건으로 28일간 수행하였다.
6. H&E (Hematoxylin and Eosin) 염색
피부 칩에서 배양된 피부 등가물을 4% 포름알데하이드로 고정시킨 후, 파라핀 처리하였다. 고정된 조직을 12시간 동안 세척 과정을 거친 후 Automatic Tissue processor (Leica)에서 탈수와 제거 (clearing) 과정을 진행했다. 이 과정을 통해 파라핀이 조직 내로 침투하게 되며 24시간 동안 유지하였다. 파라핀이 침투된 샘플 조직을 파라핀 블록으로 제작해 냉장실에 1시간 동안 보관한 후, 박절기를 이용하여 4~6 μm로 절단하였다. 절단한 조직을 온수에 닿도록 하여 주름을 펴고 슬라이드로 만들어 슬라이드 보온기구에서 물기를 제거하고 파라핀 슬라이드에 완전 밀착시켰다. 60 ℃ 오븐에서 1~2시간 동안 파라핀을 녹인 후 염색을 진행하여 자일렌 (Xylene)을 이용하여 파라핀을 제거하였다. H&E (hematoxylin and eosin)를 이용하여 샘플 조직을 염색하고 광학현미경 (OLYMPUS IX73)을 통해 확인하였다.
7. 면역조직화학 (Immunohistochemistry)
H&E 준비과정과 동일하게 준비한 샘플 슬라이드에 1차 항체를 처리한 후 자동면역염색을 진행하여 슬라이드를 스캔하였다. 현미경으로 샘플을 5장씩 촬영한 후 Image J FIJI 프로그램을 이용해 분석하였다.
8. 실시간 정량 PCR
qRT-PCR 분석은 신뢰도를 높이기 위해 각 배양일별로 5개의 완전한 두께의 피부 등가물 시료를 사용하였고, TRIzol 반응을 이용하여 샘플의 조직 단위에서 mRNA를 추출했다. 추출된 mRNA는 SpectraMax M2 Microplate Readers (Molecular Devices Inc.)에서 정량화되었으며, 추출된 mRNA는 amfiRivert cDNA Synthesis Platinum Master Mix (GenDEPOT, Barker, TX, USA)로 처리하여 cDNA를 합성했다. qPCR은 LightCycler®480 Instrument II (Roche, Basel, Switzerland)에서 LightCycler®480 SYBR Green I Master (Roche, Basel, Switzerland)를 사용하여 실행되었다. qRT-PCR에 사용된 프라이머 쌍은 표 1과 같다.
Figure pat00002
위 표 1의 서열은 순서대로 서열번호 1~14이다.
9. 배양 배지 분석
대조군과 기계적 자극 시료들의 배양 배지 챔버에서 24시간마다 교체되는 배양배지를 한 조건당 3개의 칩에서 수집하여 deep freezer에 보관하였다가 한 번에 분석을 진행했다. TGFβ-1 ELISA Kit (BioVision, san francisco bay area, USA), Myb ELISA Kit (LSBio, Seattle, USA), Fluorometric Intracellular ROS Kit (Sigma-aldrich, St. Louis, USA)를 사용하여, 제조사의 메뉴얼에 따라 TGFβ-1, Myb, 활성산소종 등을 측정하였다.
결과 1: 수축률과 표피층의 두께 변화
표피와 진피가 공배양된 완전한 두께 피부 등가물 배양시 가장 큰 걸림돌 중 하나인 수축문제를 해결하기 위하여, 배양 챔버 벽에 콜라겐 세포외 매트릭스를 단단하게 부착시키는 교차 링커로 설포-SANPAH를 처리하였고 이에 따라 수축률이 많이 제어되는 것을 확인했다 (데이터 나타내지 않음). 도 5에서 보는 바와 같이 설포-SANPAH 처리에 의해 공기 노출 배양기간인 28일 동안 40%의 수축율 감소 효과가 유지되었고, 설포-SANPAH 처리된 FSOC에 기계적 압축자극을 인가한 경우 수축율은 10%의 추가적인 감소를 보였다 (데이터 나타내지 않음). 기계적 압축자극에 의해 수축율이 감소한 것은 섬유아세포와 케라티노사이트 간의 측분비 신호전달 (paracrine signaling)이 저하된 것으로 보이며44,45, 이는 기계적 자극에 의해 세포들의 노화가 가속된 것으로 생각할 수 있다.
도 6은 대조군과 기계적 압축 자극군 시료에 대한 H&E 염색된 조직학적 이미지와 표피층 두께 변화를 측정한 결과이다. 두 군 모두 표피층 두께는 14일차까지 증가하다가 그 이후에 감소하는 유사한 경향을 나타내었으나, 압축 자극에 의해 표피층 두께가 현저히 감소한 것을 관찰하였다. 나이가 들면서 피부의 두께가 감소한다는 보고에 따라 이것은 압축 자극에 의해 시료들에 노화가 일어난 것이라 생각된다.46
결과 2: 유전자 발현
qPCR을 통해 대조군과 압축 자극군의 배양기간에 따른 유전자 발현량을 비교하여 도 7에 도시하였다. 필라그린은 대조군의 경우 배양기간이 늘어날수록 유전자 발현량이 감소하였고, 기계적 자극에 의해 7일차까지 유전자 발현량이 증가하다가 감소하고 28일차에 다시 증가하였다 (도 7(a)). 피브로넥틴은 대조군의 경우 7일차에서 대폭 증가했지만 전체적으로 발현량이 적었다. 기계적 자극에 의해 5일차에서 피브로넥틴 유전자 발현량이 대폭 증가하고 배양기간이 길어짐에 따라 점차 감소하는 경향을 보였다 (도 7(b)). 기계적 자극에 의해 최대 발현일이 당겨졌고 이후의 발현량 감소 경향은 대조군과 유사하였다. 인볼루크린은 대조군에서 5일차에 감소하였다가 14일차까지 증가하고 그 후에 감소하는 경향을 보였고, 기계적 자극 시료에 비해 전반적으로 발현량이 적었다. 기계적 자극을 준 시료의 경우, 7일차까지 인볼루크린 발현량이 급격하게 증가하다가 14일차부터는 감소된 발현량이 일정하게 유지되었다 (도 7(c)). 케라틴 10은 대조군에서 5일차에 발현량이 소폭 감소하였다가 7일과 14일차에 증가하였고 그 후에 발현량이 크게 감소하였다. 기계적 자극을 준 경우, 케라틴 10은 7일차까지 증가하였다가 14일차부터 배양기간에 따라 감소하는 것으로 나타났고, 전체적으로 대조군에 비해 발현량이 대폭 증가하였다 (도 7(d)). β-갈락토시데이즈는 5일차 이후 28일차까지 기계적 자극에 의해 발현량이 크게 증가하였다 (도 7(e)). β-갈락토시데이즈는 계대가 내려갈수록 세포에서 라이소좀의 수와 크기가 점차 증가함에 따라 라이소좀 β-갈락토시데이즈 단백질도 증가하고, 이를 통해 노화된 세포일수록 β-갈락토시데이즈가 많이 검출되어 노화의 바이오마커로 알려져있다.8,9,47 따라서, 우리는 기계적 자극으로 노화마커로 알려진 β-갈락토시데이즈 유전자가 과다 발현된 결과로부터 노화가 가속된 것을 확인하였다. 세포에서 손상되거나 잘못 접힌 단백질을 제거하는 프로테아좀은 나이가 들면서 감소하고, 이는 특정 프로테아좀 서브유닛 중 PSMD8 발현 감소에 의해 유발된다고 알려져 있다.22 표피에서 PSMD8이 표피 노화와 함께 감소하고, 노화된 각질 세포 전구체는 더 낮은 속도로 복제된다고 보고된 바 있다.23 PSMD8 유전자 발현량이 압축 자극에 의해 7일차까지 급격히 증가하다가 이후부터 크게 감소되었고, 대조군의 꾸준한 감소와는 다른 경향을 나타내고 있다 (도 7(f)).
결과 3: 단백질 발현
면역조직화학 사진으로부터 기계적 자극에 의한 진피층과 표피층의 단백질 발현량을 비교하였다 (도 8). 도 9와 같이 콜라겐 Ⅳ(COL Ⅳ)는 대조군에서 7일차와 14일차에 발현량이 높고 점차 감소하다가 28일차에 다시 단백질 발현량이 증가하였다. 피브로넥틴은 대조군 14일차에 단백질 발현량이 대폭 증가하였다가 점차 감소하였다. 우리는 기계적 자극에 의해 진피층에서 발현되는 두 단백질 모두 배양 기간 동안 전반적으로 발현이 억제된 결과로 미루어 노화에 기인한 것으로 생각한다.
표피층에서 발현되는 필라그린, 케라틴 10, 인볼루크린, 인테그린 β-1 등은 대조군에서 배양 기간에 따른 단백질 발현량 변화가 크게 보이지 않았고, 인볼루크린은 5, 14일차에서 발현량이 비교적 많이 줄어들기는 했지만 전체적으로 감소하는 경향을 보였다. 인테그린 β-1은 5일차에서 감소했다가 다시 증가하였으며 21일차에 감소했다. 기계적 자극에 의한　위 4종의 표피층 단백질들은 모두 14일차까지 증가하다가 21일차에 소폭 감소하고 28일차에 대폭 감소하는 경향을 보였다. 케라틴 10과 인볼루크린의 qPCR 결과를 보면 7일차까지 유전자 발현량이 증가하다가 그 후로 감소하는 경향이 나타나는데, 유전자 발현과 단백질 발현 경향이 일주일 정도 차이가 남을 감안하면 이는 유전자에 의해 단백질이 발현되는 기간이 반영되어 나타난 결과로 생각된다. 또한, 기계적 자극에 의한 표피층의 두께 변화와 4종의 표피층 단백질 발현량 변화가 동일한 경향을 보이는 것으로 미루어, 기계적 자극 기간이 길어질수록 노화가 가속화되고 14일 이후 급격한 노화가 진행되는 것으로 생각된다.
결과 4: 사이토카인 분비
대조군과 기계적 자극 시료의 배양기간에 따라 배양액에서 활성산소종 분비량을 측정하여 도 10(a)에 나타내었다. 기계적 자극에 의해 활성산소종이 증가하는 것을 확인할 수 있다. 활성산소종은 정상적인 세포 내 활성작용 과정에서 생성되며 이를 제거하는 항산화 반응과 불균형으로 인해 세포 내 활성산소종이 증가하고, 이는 DNA, 단백질, 지질과 반응하여 손상시키고 노화를 유도하는 것으로 알려져 있다.48,49 활성산소종은 28일째에서 특히 분비량이 큰 것을 볼 수 있는데 이는 오랜 기간 동안 주기적인 기계적 자극을 받았을 때 활성산소를 제거하는 항산화 방어 기능이 감소하여 활성산소종 분비량이 급격히 증가한 것으로 보인다. 따라서 기계적 자극이 노화 진행을 촉진시킨다고 할 수 있다.
활성산소종이 세포 내에서 생성되면 세포 표면에 RTK의 활성화를 억제하던 RPTP와 결합하고 이는 NF-kB와 AP-1의 활성을 유발한다. NF-kB는 MMP 유전자 전사를 증가시켜 콜라겐 생성을 억제하고 AP-1은 TGF-β 수용체를 감소시켜서 콜라겐 후속 생성을 억제한다.3,6 도 10(b)에서 보는 바와 같이 기계적 자극에 의해 TGF-β1의 농도가 증가하였고, 28일차에 증가가 두드러졌는데, 이는 활성산소종 증가로 감소된 TGF-β 수용체와 결합하지 못한 TGF-β1이 배지에서 많이 검출된 것으로 보이고 결국 콜라겐 생성을 억제하여 노화를 가속화한다고 볼 수 있다.
대조군과 기계적 자극 시료의 배양기간에 따른 배양액의 Myb 농도를 측정한 도 10(c)에서 보는바와 같이 기계적 자극에 의해 Myb 분비량이 감소한 것으로 측정되었다. 케라티노사이트에서 분비되는 Myb는 섬유아세포의 TGF-β1을 포함하는 파라크린 인자의 세포-세포 상호작용을 통해 서로 통신한다.45 TGF-β1의 분비 감소로 인해 케라티노사이트의 Myb 결핍이 유도되고 감소된 Myb는 콜라겐 I 결핍을 유도함을 보인 연구가 있다.50 이를 통해 기계적 자극에 의해 케라티노사이트에서 Myb 분비가 감소되어 섬유아세포에서의 콜라겐 I 생성이 감소되어 수축율이 저하된 것으로 유추해 볼 수 있다.
<110> Industry Academic Cooperation Foundation, Hallym University <120> Aging skin model of full thickness and a producing method thereof <130> HallymU_GYSUNG_AgingSkinModel <160> 14 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer of GAPDH <400> 1 ctcctctgac ttcaacagcg 20 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer of GAPDH <400> 2 gccaaattcg ttgtcatacc ag 22 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for Fliaggrin <400> 3 ggagtcacgt ggcagtcctc a 21 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for Fliaggrin <400> 4 ggtgtctaaa cccggattca c 21 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for PSMD8 <400> 5 atgtacgagc aactcaaggg 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for PSMD8 <400> 6 ctgtggttgg caagaagttg 20 <210> 7 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for Involucrin <400> 7 ccgccaaatg aaacagccaa ctcc 24 <210> 8 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for Involucrin <400> 8 ggattcctca tgctgttccc ag 22 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for Fibronectin <400> 9 ctgagggcag aagagacaac 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for Fibronectin <400> 10 tcatgctgct tatcccactg 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for beta-galactosidase <400> 11 aatcaagacc gaagcagtgg 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for beta-galactosidase <400> 12 ggcatcatag tcgtagctgg 20 <210> 13 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for Keratin 10 <400> 13 ccggagatgg tggccttctc tct 23 <210> 14 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for Keratin 10 <400> 14 ggcctgatgt gagttgccat gct 23

Claims (20)

  1. 기저층;
    상기 기저층 상에 배열되며, 미세 유체채널과 멤브레인을 포함하는 하부층; 및
    상기 하부층 상에 배열되며, 배양액 챔버, 피부 세포가 3차원으로 배양되며, 신축 가능한 탄성 재질로 제조되는 피부 세포 배양 챔버를 포함하는 상부층;을 포함하며,
    상기 피부 세포 배양 챔버에는 피부 세포의 3차원 세포배양을 위한 지지체 및 피부 세포가 들어 있고, 피부 세포의 위쪽 표면은 공기에 노출된 상태로 피부 세포가 3차원으로 배양되며,
    상기 하부층의 멤브레인은 미세 유체채널과 연결되며, 상부층의 피부 세포 배양 챔버 아래에 위치하며, 피부 세포가 배양액에 잠겨있지 않도록 하고,
    상기 미세 유체채널은 피부 세포 배양 챔버 아래의 멤브레인과 배양액 챔버를 연결하여 배양액과 산소를 피부 세포 배양 챔버 내의 피부 세포로 공급하고, 노폐물과 이산화탄소를 피부 세포로부터 회수하며,
    매일 일정 시간 동안 압축응력을 피부 세포 배양 챔버에 가하여 피부 세포에 압축 및 이완을 인가하여 피부의 수축과 이완 현상을 모사하는 것을 특징으로 하는 노화 피부 모델.
  2. 청구항 1에 있어서,
    상기 기저층은 유리 또는 투명한 합성 중합체를 포함하거나 이로 구성되는 재료로 제조되는 것을 특징으로 하는 노화 피부 모델.
  3. 청구항 1에 있어서,
    상기 하부층 및 상부층 중 하나 이상은 PDMS (Polydimethylsiloxane) 또는 PDMS를 포함하는 조성물로 이루어진 것임을 특징으로 하는 노화 피부 모델.
  4. 청구항 1에 있어서,
    상기 피부 세포 배양 챔버는 신축성 폴리머로 이루어진 것임을 특징으로 하는 노화 피부 모델.
  5. 청구항 1에 있어서,
    상기 피부 세포는 진피층 및 표피층을 포함하는 것을 특징으로 하는 노화 피부 모델.
  6. 청구항 1에 있어서,
    상기 지지체는 콜라겐, 젤라틴, 푸코이단, 알지네이트, 키토산, 히알루론산, 실크, 폴리이미드(polyimides), 폴리아믹스 산(polyamix acid), 폴리카프롤락톤(polycarprolactone), 폴리에테르이미드(polyetherimide), 나일론(nylon), 폴리아라미드(polyaramid), 폴리비닐알콜(polyvinyl alcohol), 폴리비닐피롤리돈(polyvinylpyrrolidone), 폴리벤질글루타메이트(poly-benzyl-glutamate), 폴리페닐렌테레프탈아마이드(polyphenyleneterephthalamide), 폴리아닐린(polyaniline), 폴리아크릴로나이트릴(polyacrylonitrile), 폴리에틸렌옥사이드(polyethylene oxide), 폴리스티렌(polystyrene), 셀룰로오스(cellulose), 폴리아크릴레이트(polyacrylate), 폴리메틸메타크릴레이트(polymethylmethacrylate), 폴리락산(polylactic acid; PLA), 폴리글리콜산(polyglycolic acid; PGA), 폴리락산과 폴리글리콜산의 공중합체(PLGA), 폴리{폴리(에틸렌옥사이드)테레프탈레이트-co-부틸렌테레프탈레이트}(PEOT/PBT), 폴리포스포에스터(polyphosphoester; PPE), 폴리포스파젠(PPA), 폴리안하이드라이드(Polyanhydride; PA), 폴리오르쏘에스터{poly(ortho ester; POE}, 폴리(프로필렌푸마레이트)-디아크릴레이트{poly(propylene fumarate)-diacrylate; PPF-DA} 및 폴리에틸렌글라이콜디아크릴레이트{poly(ethylene glycol) diacrylate; PEG-DA}로 이루어진 그룹 중에서 선택된 1종 이상임을 특징으로 하는 노화 피부 모델.
  7. 청구항 1에 있어서,
    상기 피부 세포 배양 챔버는 신축 가능한 탄성 PDMS로 형성하고,
    상기 피부 세포 배양 챔버의 내측 표면에 교차 링커를 부착하고, 그 위에 피브로넥틴을 공유결합시킨 후, 그 위에 지지체 및 피부 세포를 가하여 피부 세포가 피부 세포 배양 챔버에 결합한 것을 특징으로 하는 노화 피부 모델.
  8. 청구항 1에 있어서,
    상기 매일 일정 시간은 매일 6~18시간임을 특징으로 하는 노화 피부 모델.
  9. 청구항 1에 있어서,
    상기 압축응력은
    (a) 0.01~0.10 Hz 주기;
    (b) 1~10% 압축 변형률; 및
    (c) 0.1~0.7 MPa 강도; 중 하나 이상의 조건을 만족하도록 인가하는 것을 특징으로 하는 노화 피부 모델.
  10. 청구항 1에 있어서,
    상기 피부 세포는 20~30일 동안 배양함을 특징으로 하는 노화 피부 모델.
  11. 청구항 1에 있어서,
    상기 배양액과 산소를 피부 세포 배양 챔버 내의 피부 세포로 공급하는 과정은 별도의 동력 없이 중력 흐름을 이용하는 것을 특징으로 하는 노화 피부 모델.
  12. (가) 기저층; 상기 기저층 상에 배열되며, 미세 유체채널과 멤브레인을 포함하는 하부층; 및 상기 하부층 상에 배열되며, 배양액 챔버, 피부 세포가 3차원으로 배양되며, 신축 가능한 탄성 재질로 제조되는 피부 세포 배양 챔버를 포함하는 상부층;을 포함하고, 상기 피부 세포 배양 챔버에는 피부 세포의 3차원 세포배양을 위한 지지체 및 피부 세포가 들어 있고, 피부 세포의 위쪽 표면은 공기에 노출된 상태로 피부 세포가 3차원으로 배양되며, 상기 하부층의 멤브레인은 미세 유체채널과 연결되며, 상부층의 피부 세포 배양 챔버 아래에 위치하며, 피부 세포가 배양액에 잠겨있지 않고, 상기 미세 유체채널은 피부 세포 배양 챔버 아래의 멤브레인과 배양액 챔버를 연결하여 배양액과 산소를 피부 세포 배양 챔버 내의 피부 세포로 공급하고, 노폐물과 이산화탄소를 피부 세포로부터 회수하는 피부 칩을 준비하는 단계;
    (나) 배양액 챔버에 배양액을 가하는 단계;
    (다) 피부 세포 배양 챔버 내측 표면에 교차 링커를 이용하여 피브로넥틴을 부착하는 단계;
    (라) 피브로넥틴이 부착된 피부 세포 배양 챔버에 피부 세포의 3차원 세포배양을 위한 지지체 및 진피층을 형성하는 단계;
    (마) 진피층 위에 표피층을 형성하여 3D 피부 세포를 제조하는 단계;
    (바) 3D 피부 세포를 공기에 노출하여 3~28일 동안 배양하는 단계; 및
    (사) 3D 피부 세포를 배양한 피부 칩에 압축 응력을 매일 일정 시간 동안 인가하여 피부 세포에 이완과 수축을 반복하는 단계;를 포함하는 노화 피부 모델 제조방법.
  13. 청구항 12에 있어서,
    상기 (바) 단계는 중력 흐름을 이용하여 3D 피부 세포를 배양하는 것을 특징으로 하는 노화 피부 모델 제조방법.
  14. 청구항 12에 있어서,
    상기 (사) 단계의 일정 시간은 매일 6~18시간임을 특징으로 하는 노화 피부 모델 제조방법.
  15. 청구항 12에 있어서,
    상기 (사) 단계의 압축 응력은
    (a) 0.01~0.10 Hz 주기;
    (b) 1~10% 압축 변형률; 및
    (c) 0.1~0.7 MPa 강도; 중 하나 이상의 조건을 만족하도록 인가하는 것을 특징으로 하는 노화 피부 모델 제조방법.
  16. 청구항 1 내지 청구항 11 중 어느 한 항의 노화 피부 모델을 이용하여 피부 외용 조성물의 효능을 평가하는 방법.
  17. 청구항 16에 있어서,
    상기 피부 외용 조성물은 화장료 조성물, 피부 외용 약제 또는 독성 시험물질임을 특징으로 하는 피부 외용 조성물의 효능을 평가하는 방법.
  18. 1) 하나 이상의 피부 칩을 장착할 수 있는 랙,
    2) 피부 칩을 랙에 안정적으로 고정하기 위한 서스펜션,
    3) 피부 칩을 올려 두기 위한 바닥판,
    4) 랙과 서스펜션을 조립할 수 있는 고정된 윗판,
    5) 모터의 직선 왕복운동을 피부 칩에 전달하는 이동형 윗판,
    6) 모터와 이동형 윗판을 연결시켜주는 브릿지 판,
    7) 이동형 윗판과 브릿지 판을 연결시켜주는 브릿지; 및
    8) 랙에 장착된 피부 칩에 압축응력을 가하는 모터;를 포함하며, 피부 칩에 압축응력을 인가하는 기계적 자극 구동 시스템.
  19. 청구항 18에 있어서,
    상기 7)의 브릿지는 열전도도가 낮은 경량성 폴리머 재질을 포함하는 것을 특징으로 하는 기계적 자극 구동 시스템.
  20. 청구항 18에 있어서,
    상기 피부 칩은 기저층; 상기 기저층 상에 배열되며, 미세 유체채널과 멤브레인을 포함하는 하부층; 및 상기 하부층 상에 배열되며, 배양액 챔버, 피부 세포가 3차원으로 배양되며, 신축 가능한 탄성 재질로 제조되는 피부 세포 배양 챔버를 포함하는 상부층;을 포함하고, 상기 피부 세포 배양 챔버에는 피부 세포의 3차원 세포배양을 위한 지지체 및 피부 세포가 들어 있고, 피부 세포의 위쪽 표면은 공기에 노출된 상태로 피부 세포가 3차원으로 배양되며, 상기 하부층의 멤브레인은 미세 유체채널과 연결되며, 상부층의 피부 세포 배양 챔버 아래에 위치하며, 피부 세포가 배양액에 잠겨있지 않고, 상기 미세 유체채널은 피부 세포 배양 챔버 아래의 멤브레인과 배양액 챔버를 연결하여 배양액과 산소를 피부 세포 배양 챔버 내의 피부 세포로 공급하고, 노폐물과 이산화탄소를 피부 세포로부터 회수하는 것을 특징으로 하는 기계적 자극 구동 시스템.
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