JP7235350B2 - マルトース結合タンパク質リンカを用いた三次元線維芽細胞集合体、及びそれを含むインビトロ3d皮膚真皮モデル - Google Patents
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Description
vitro)三次元皮膚真皮モデルを提供する。
本実施例においては、線維芽細胞を、線維芽細胞に結合する活性を有するタンパク質がコーティングされた表面を有する培養容器で培養し、三次元線維芽細胞集合体を形成した。
三次元線維芽細胞集合体を形成を誘導する培養方法を構築するために、線維芽細胞の細胞接着特性、接着基質による細胞接着シグナル、及び細胞形態を分析した。
非組織細胞培養用96ウェルプレート(NTCP:non-tissue culture treated 96-wellplate、ポリスチレン材質で表面が疎水性を帯びる、Falcon社)に、それぞれECMフィブロネクチン(20μg/ml)、MBP(10μg/ml)、MBP-VEGF(10μg/ml)、MBP-HBD(100μg/ml)及びMBP-FGF2(10μg/ml)を4時間コーティングした後、PBSで3回洗浄した。その後、100μg/mlBSAを利用して、1時間ブロッキングしてPBSで3回洗浄した。1ウェル当たり5x104cells/cm2の線維芽細胞を無血清DMEM培地に懸濁した後、それぞれのタンパク質がコーティングされた96ウェルプレートに播種し、37℃培養器において1時間溶解した後、細胞の形態を観察した。接着された細胞を細胞溶解バッファで溶解した後、BCA(bicinchoninic acid)アッセイによってタンパク質を測定することにより、接着された細胞を定量した。
前記実施例1の(1.1)において、それぞれフィブロネクチン及びMBP-FGF2でコーティングされたNTCPで培養された線維芽細胞の細胞の形態を比較するために、接着後30分、1時間、4時間経った線維芽細胞をパロイジン(palloidin)で染色した。
前記実施例1の(1.1)において、それぞれフィブロネクチン及びMBP-FGF2でコーティングされたNTCPで培養された線維芽細胞の細胞接着シグナルを比較するために、焦点接着キナーゼ(FAK:focal adhesion kinase)のリン酸化を測定した。FAKのリン酸化測定のために、接着後30分、1時間、4時間経った線維芽細胞を抗ホスホ-FAK抗体(Cell signalling社)を利用して、ウェスタンブロット分析を行った。
実施例1の(1.3)ないし(1.3)の結果を基に、三次元線維芽細胞組織体を形成するための培養方法を構築した。
(3.1)細胞外基質(ECM)分泌能分析
実施例1の(2)において、多種のMBP-FGF2でコーティングされたウェル-NTCP(12,24,48,96ウェル)に、1.25×105cells/cm2細胞濃度で播種して形成された三次元細胞集合体をPBSで数回洗浄し、4%パラホルムアルデヒドを30分間室温で処理することによって固定化した。その後、多様な濃度のエタノールを(50~100%)利用して脱水させた後、パラフィンを利用して、包埋した。製造されたパラフィンブロックは、ミクロトームを利用して、厚さ4μmに切り、スライドグラスに固定させた後、H&E染色、及びフィブロネクチンとコラーゲンタイプ1とに対する免疫学的染色とを行った。コラーゲンタイプ1の染色は、蛍光免疫染色を行った。前述のところで準備したスライドグラスを、まず、BSA(4%)で1時間処理し、その後、一次抗体を含んだPBSに浸し、一晩反応させた後、PBSで3回洗浄て、それを、再び二次抗体と暗室で1時間反応させた。DAPIを利用した核染色を追加して行った後、共焦点顕微鏡で分析した。対照群は、一次抗体を使用せず、同一処理を行って分析した。
実施例1の(2)において、1.25×105cells/cm2細胞濃度で、MBP-FGF2でコーティングされた96ウェルNTCPに播種して形成された三次元細胞集合体を回収し、血管内皮細胞成長因子(VEGF)分泌量を測定した。
(1)インビトロ三次元人工真皮モデルの製造
インビトロ三次元人工真皮モデルを製造するために、まず、線維芽細胞を培養した。具体的には、ヒト真皮線維芽細胞を、組織培養フラスコを使用して、37℃、5% CO2及び95% O2の大気条件において、そのグルコースダルベッコ変形イーグル培地(high glucose Dulbecco’s modified Eagle’s medium)(DMEM、ウェルゼン、大邱、大韓民国)で培養した。継代数5のヒト真皮線維芽細胞を全ての実験について使用した。
前述のところで製作した三次元線維芽細胞集合体の人工真皮モデルとしての特性を分析するために下記の実験を行った。
細胞外基質関連遺伝子であるコラーゲン、フィブロネクチン及びエラスチンの遺伝子発現量を分析するために、qRT-PCR(quantitative real-time polymerase chain reaction)を使用した。
三次元線維芽細胞集合体のコラーゲン分析を行うために、ヒドロキシプロリンアッセイ(hydroxyproline assay)、免疫染色及びウェスタンブロッティングを行った。
三次元線維芽細胞集合体のマトリックスメタロプロテアーゼ(MMP)1発現分析のために、RT-PCRを行った。RT-PCRは、前記実施例2の(2.1)と同一方法で遂行し、その結果を図15(a)に示した。
本実施例においては、前記三次元線維芽細胞集合体がMMP阻害剤のスクリーニングに使用可能であるかということを追加して確認するために、既存に知られたMMP阻害剤を処理し、MMP分泌量を確認した。
Claims (4)
- 線維芽細胞を、線維芽細胞に結合する活性を有したタンパク質がコーティングされた表面を有する培養容器中の液体培地内で培養し、培養された前記線維芽細胞が前記表面から離脱されて形成された線維芽細胞集合体を含む培養物を得る段階と、
前記培養物から前記線維芽細胞集合体を分離する段階と、を含む線維芽細胞集合体を生産する方法であり、
前記線維芽細胞に結合する活性を有したタンパク質と前記線維芽細胞との結合は、線維芽細胞と線維芽細胞との結合より弱く、
前記培養する段階において、前記線維芽細胞は、培養初期には、前記培養容器の前記表面に接着して増殖した後、成長するにつれ、前記培養容器の前記表面から離脱し、
前記線維芽細胞に結合する活性を有したタンパク質は、線維芽細胞成長因子(FGF)であり、
前記線維芽細胞成長因子は、ポリペプチドリンカによって前記培養容器の前記表面に固定されており、
前記ポリペプチドリンカは、カルボキシル末端を介して、前記線維芽細胞成長因子のアミノ末端と結合し、アミノ末端に存在する疎水性ドメインを介して、疎水性表面を有する培養容器に固定できるものであり、
前記ポリペプチドリンカは、マルトース結合タンパク質(MBP)である、方法。 - 前記線維芽細胞に結合する活性を有したタンパク質は、培地内において、線維芽細胞とフィブロネクチンとが結合するより、前記線維芽細胞とさらに弱く結合することを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 前記培養容器の前記表面は、シラン化された表面、炭化水素コーティングされた表面、高分子表面及び金属表面で構成された群から選択される疎水性表面であることを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 前記高分子がポリスチレン、ポリメチルメタクリレート(PMMA)、ポリエチレンテレフタレート(PET)、ポリ塩化ビニル(PVC)、ポリエチレン(PE)、ポリプロピレン(PP)、ポリテトラフルオロエチレン(PTFE)、ポリ(L-乳酸)(PLLA)、ポリ(D,L-乳酸)(PDLLA)、ポリ(グリコール酸)(PGA)、ポリ(カプロラクトン)(PCL)、ポリ(ヒドロキシアルカノエート)、ポリジオキサノン(PDS)、ポリトリメチレンカーボネート、及びそれらの共重合体から構成された群から選択されることを特徴とする請求項3に記載の方法。
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Patent Citations (1)
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Non-Patent Citations (2)
Title |
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Acta Biomaterialia,2012年,Vol. 8,pp.1759-1767 |
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