WO2017082491A1 - 3차원 섬유아세포집합체 및 그를 포함하는 인 비트로 3d 피부 진피 모델 - Google Patents

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WO2017082491A1
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fibroblast
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김상헌
최종훈
박귀덕
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한국과학기술연구원
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    • G01N33/5743—Specifically defined cancers of skin, e.g. melanoma

Definitions

  • a three-dimensional fibroblast assembly a method for producing the same, an in vitro 3D dermal dermal model comprising the same, and a method for screening drugs using the same.
  • organ transplantation or gene therapy has been proposed for the treatment of intractable disease in humans, but its practical application is insufficient due to immune rejection, lack of supply organs, vector development or lack of knowledge of disease genes.
  • Fibroblasts are cells that produce and maintain interstitial extracellular matrix (ECM), and fibroblasts are organically linked by extracellular matrix. Fibroblasts are also well known as cells that produce a variety of cytokines and bioactive factors for immune defense.
  • fibroblasts were cultured in two dimensions and treated with enzymes such as trypsin after mass proliferation.
  • enzymes such as trypsin after mass proliferation.
  • the extracellular matrix produced was decomposed and transplanted.
  • the role of extracellular matrix could not be expected.
  • Tissue engineering techniques have been conducted to cultivate various cells including fibroblasts into three-dimensional cell aggregates using artificial three-dimensional porous extracellular matrix called scaffolds using biodegradable synthetic polymers or natural polymers.
  • this is difficult to commercialize due to the limitations of materials such as biodegradation rate or inflammatory response, and thus a technique for inducing the formation of three-dimensional cell aggregates is required.
  • the skin tissue of the human body is divided into three parts, consisting of the epidermal layer that forms the outermost of the skin, the dermis layer below it, and the subcutaneous tissue.
  • the epidermal layer is composed of epithelial cells differentiated into several layers from the basement membrane that allows the epidermal layer and the dermal layer to bind tightly, as well as melanocytes and immune cells.
  • the dermal layer below the epidermal layer is mainly fibroblasts and It consists of several extracellular matrices secreted by the cells. It is known that the dermal layer is closely related to skin health and aging.
  • Collagen is a major protein that makes up 90% of the dermal layer, maintaining skin connective tissue and providing elasticity to the skin.
  • the number and function of fibroblasts decrease with increasing external factors and age, and this is known as a major cause of aging.
  • Reduction of cells results in the synthesis of fibrous components and loss of moisture in the skin tissue and changes in the stratum corneum.
  • the increase in collagenase reduces the crosslinked form of collagen, which reduces skin smoothness, moisture, and elasticity.
  • Increased collagen content and synthesis means increased skin moisture and elasticity.
  • MMP protease matrix metalloproteinase
  • Type I collagen is typical collagen in the skin and is broken down by the action of MMP-1.
  • MMP-1 activity is regulated by inhibitors such as TIMP-1, which are secreted to maintain skin homeostasis.
  • Biomolecules such as MMPs and TIMPs are secreted by cells including fibroblasts.
  • MMP-1 degrades extracellular matrix, thereby promoting tumor metastasis and progression.
  • Collagen synthesis and degradation by MMP-1 plays an important role in cancer metastasis.
  • drugs and substances targeting MMP-1 / collagen have been developed for the purpose of treating cancer or cosmetic compositions.
  • MMPs are known to be overexpressed in inflammatory diseases, such as arthritis, or pathological conditions such as cancer, for example cancer metastasis, and MMP inhibitors targeting MMPs are developed as therapeutic agents for such diseases. have.
  • 2D cell-based assays have been developed for screening such drugs targeting MMPs or collagen
  • 2D cell-based assays are limited due to drug sensitivity, drug penetration into cells and tissues, Inadequate for accurately predicting the response of living organisms.
  • the study of skin using one kind of skin cells has a limitation, and the three-dimensional skin model developed to overcome this is artificial skin, but existing artificial skin There are limitations that make screening drugs difficult. Therefore, if a high-throughput drug can be screened at high speed, the development of a new skin model system that can simulate the skin environment is required.
  • One aspect is a culture comprising a fibroblast cluster formed by releasing fibroblasts from the surface by culturing the fibroblasts in a liquid medium in a culture vessel having a surface coated with a protein having activity to bind the fibroblasts. Obtaining water; And separating the fibroblast assembly from the culture, wherein the protein having activity to bind the fibroblast is weaker than the binding between the fibroblast and the fibroblast. It is to provide a way to.
  • Another aspect is to provide a fibroblast aggregate produced by the above method.
  • Another aspect provides an in vitro three dimensional dermal dermal model comprising fibroblast aggregates cultured from fibroblasts.
  • Another aspect is a culture comprising fibroblast clusters formed by releasing fibroblasts from the surface by culturing the fibroblasts in a liquid medium in a culture vessel having a surface coated with a protein having activity to bind fibroblasts.
  • Another aspect includes treating a test substance in the fibroblast assembly or in vitro three dimensional dermal dermal model; Measuring the level of expression or activity of MMPs in the test substance treated fibroblast assembly or skin dermal model; Comparing the level of expression or activity of the measured MMP with that of the untreated control; And selecting a substance that reduces the expression or activity of the MMP as compared to the control group.
  • Another aspect includes treating a test substance in a three-dimensional dermal model of the fibroblast assembly or in vitro; Measuring the level of expression or activity of collagen in the test substance-treated fibroblast assembly or skin dermal model; Comparing the level of expression or activity of collagen measured with that of an untreated control; And it provides a method for screening a substance that increases the expression or activity of collagen comprising the step of selecting a substance that increased the expression or activity of collagen compared to the control.
  • One aspect is a culture comprising a fibroblast cluster formed by releasing fibroblasts from the surface by culturing the fibroblasts in a liquid medium in a culture vessel having a surface coated with a protein having activity to bind the fibroblasts. Obtaining water; And separating the fibroblast assembly from the culture, wherein the protein having activity to bind the fibroblast is weaker than the binding between the fibroblast and the fibroblast. It provides a way to.
  • the fibroblasts are adhered to the surface of a culture vessel having a surface coated with a protein having activity that binds to the fibroblasts in liquid medium, and the protein having activity that binds to the fibroblasts is between the fibroblasts and the fibroblasts. It provides a culture vessel for forming fibroblast aggregates, which binds fibroblasts weaker than binding.
  • fibroblast is a cell constituting a component of fibrous connective tissue and may refer to a cell of a mammalian connective tissue. Fibroblasts can produce extracellular matrix and collagen and can play a role in wound healing, for example, treating scars, burns, bedsores or wounds on the skin.
  • fibroblast cluster or "three-dimensional fibroblast assembly” (used interchangeably with “fibroblast tissue”) refers to a state in which two or more cells are dense and may be in a tissue state or in a single cell state. It may be. Each cell aggregate may exist as the tissue itself or as a part, or as a collection of single cells, and may comprise a fibroblast like-tissue.
  • the term "three-dimension” may refer to a three-dimensional model having three non-dimensional geometrical parameters (eg, depth, width, height or X, Y, Z axis), Therefore, the fibroblast aggregate according to one embodiment is three-dimensional culture, that is, detached from the culture vessel and cultured in a suspended state, and as the cell proliferates in a three-dimensional spherical, sheet or similar three-dimensional form (for example, May refer to a fibroblast aggregate having a similar tissue).
  • the fibroblast assembly according to one embodiment is a tissue engineering technique, without the need for using an artificial three-dimensional porous extracellular matrix, for example, biodegradable synthetic polymer or natural polymer support such as sheet, hydrogel, membrane, scaffold, etc. It may mean that the three-dimensional fibroblast assembly is formed by itself, and the tissue engineering technique is distinguished from the three-dimensional fibroblast assembly according to one embodiment, wherein the matrix is three-dimensional rather than the cell.
  • the seeding of the fibroblasts into the culture vessel may include all actions performed for culturing the fibroblasts in the culture vessel, including adding the fibroblasts to the culture vessel, or adhering the fibroblasts to the culture vessel. .
  • adhesion of cells or binding of cells can be used to include adhesion or binding between cells and cells and adhesion between cells and the surface of the culture vessel or biomaterial.
  • the adhesion or binding of cells occurring on the culture vessel or on the surface of the biomaterial can have a variety of mechanisms. For example, there are specific cell adhesion mediated by biological recognition and non-specific cell adhesion that depends on electrostatic or surface energy.
  • Specific cell adhesion occurs by binding specific peptides (eg, arginine-glycine-aspartid acid (RGD)) present in extracellular matrix (ECM) proteins collagen, fibronectin, laminin, etc. by receptors present on the cell membrane. It can mean adhesion.
  • Non-specific cell adhesion may mean adhesion to which the adhesion of cells is induced by making the surface of the cell membrane having an electrically negative phospholipid adhere to the positive surface.
  • the culture vessel may comprise a hydrophobic surface, for example, a surface having a water contact angle of 90 to 150 °, and coated with a protein having adhesion or binding activity to the fibroblasts.
  • Culture vessels with modified surfaces have weaker binding between cell-adhesive substrates (e.g., proteins or growth factors with activity that bind cells coated on the surface of the culture vessel) than cell-cell binding. It may include a surface to be derived.
  • the fibroblasts are adhesion-dependent cells, such as epithelial cells or mesenchymal cells that grow by adhering to extracellular matrix with blood cells, and induce cell death when cells do not adhere to the adhesion matrix. These cell deaths are anoikis (anokis). ).
  • the method of culturing provides for adhesion or binding between cell-adhesive substrates, by inducing adhesion or binding between cell-adhesive substrates weakly compared to cell-cell adhesion or binding, without inducing cell death. It is not cultured in two-dimensional monolayers.
  • the fibroblasts induce the adhesion or binding between the weak cell-adhesive matrix at the beginning of the culture, the adhesion or binding between the cell-cells is induced to form a two-dimensional fibroblast assembly by the binding between these cells, As the incubation time becomes longer, the two-dimensional fibroblast aggregate becomes detached or detached from the surface of the culture vessel, and the detached or detached two-dimensional fibroblast aggregate is continuously cultured in a suspended state in the culture vessel to obtain a three-dimensional fibroblast assembly. Can be formed.
  • adhesion or binding between cell-adhesive substrates e.g., proteins or growth factors with activity that binds to cells coated on the surface of the culture vessel
  • cell-adhesive substrates e.g., proteins or growth factors with activity that binds to cells coated on the surface of the culture vessel
  • the method of modifying the surface of the culture vessel can be induced by using a protein having activity to bind fibroblasts.
  • Adhesion or binding between the cell-adhesive substrates is strongly induced when using proteins such as collagen, fibronectin, laminin, and the like that bind to integrin present in the cell membrane of fibroblasts.
  • the term "integrin” may refer to a receptor molecule present in the cell membrane and acting when the cell adheres to an extracellular matrix such as fibronectin or collagen, and is a transmembrane composed of two subunit heterodimers ⁇ or ⁇ . As a type glycoprotein, it can include all types of integrins. Therefore, the protein having the activity of binding to the fibroblasts may be more weakly bound to the fibroblasts than to bind the fibroblasts and fibronectin in the medium.
  • the protein having activity that binds to the fibroblasts may be that the fibroblasts and 60 to 95% of the activity than the fibroblasts and fibronectin binding in the medium, for example, 60, 70, 80 Can be 90, or 95%.
  • a protein having activity that binds to fibroblasts may include a protein that does not bind to integrins.
  • the protein that does not bind to integrin may include a protein that binds to heparan sulfate proteoglycan (heparan sulfate proteoglycan) present in the cell membrane of the fibroblasts.
  • the protein that binds to the heparan sulfate proteoglycan may be fibroblast growth factor (FGF).
  • FGF fibroblast growth factor
  • the protein may be fixed to the culture vessel surface at a concentration of 5 to 100 ⁇ g / ml.
  • Fibroblast growth factor is a type of growth factor, it may mean a growth factor that stimulates fibroblasts to induce proliferation.
  • Fibroblast growth factor is a heparin-binding protein, which can interact with heparan sulfate proteoglycan of fibroblasts as described above.
  • FGF may include 22 kinds, for example, FGF 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, or 22.
  • the kinds of FGFs may include all different names, as long as those skilled in the art can recognize the same protein.
  • FGFs 11, 12, 13 and 14 are also known as "iFGFs” and FGF 15 is also known as "FGF 15/19".
  • FGF 1 or FGF 2 may refer to "heparin-binding growth factor 1 (HBGF-1) or” heparin-binding growth factor 2 (HBGF-2 "). It may include.
  • Immobilization of a protein having activity that binds the fibroblasts to the culture vessel surface can be accomplished by any method known in the art to be used to immobilize polypeptides on solid substrate surfaces, e.g. physical Adsorption, covalent bonding by non-selective chemical reactions, and the like can be used.
  • An example of such an immobilization method uses biotin-streptavidin / avidin binding by binding biotin to a protein and then applying the protein to a solid surface treated with streptavidin or avidin.
  • a polypeptide linker-growth factor in which the amino terminus of the growth factor (eg, FGF) is fused to a carboxyl terminus of the polypeptide linker using a polypeptide linker capable of recombinant mass expression and easy purification.
  • immobilization can be performed in the form of FGF) recombinant protein.
  • a polypeptide linker suitable for the present invention is capable of adsorbing to a culture vessel having a hydrophobic surface through its carboxyl terminus and binding to the amino terminus of growth factors and present through a hydrophobic domain present at its amino terminus, thereby allowing for recombinant mass expression and Any one can be used as long as it can be easily purified and does not affect the culture of fibroblasts.
  • Polypeptide linkers may include, for example, maltose-binding protein (MBP), hydrophobins, hydrophobic cell penetrating peptides (CPPs), and the like.
  • MBP (NCBI GenBank Accession No. AAB59056) refers to a membrane protein periplasm that is located in the plasma membrane space across the cell membrane of Escherichia coli and is involved in the transport of sugars such as maltose or maltodextrin into the cell. can do.
  • MBP is mainly used to produce useful foreign proteins in the form of recombinant proteins, which are translated from the gene malE in the cell and expressed in the cell by inserting the gene of the foreign protein downstream of the cloned malE gene. Recombinant proteins combined with dog proteins can be easily produced in large quantities.
  • foreign proteins expressed from the gene to which the malE gene is bound can be separated using the characteristics that MBP has a binding affinity for maltose. For example, by reacting amylose-coated resin and cell lysate with maltose-multiplexed form, washing the reacted resin several times to remove other contaminated proteins, and then adding high concentrations of maltose to compete. Only the desired protein can be eluted simply.
  • the MBP-cell adhesion substrate (eg, growth factor) recombinant protein may be prepared using a conventional chemical synthesis or genetic recombination technique in the art, or cultured under the appropriate conditions to express a transforming bacterium from the culture medium. It can be obtained by recovering the recombinant protein.
  • the process of immobilizing the MBP-cell adhesion matrix recombinant protein thus obtained in a culture vessel having a hydrophobic surface does not require any special treatment and can be used for physical adsorption with a hydrophobic surface using a hydrophobic domain located at the amino terminus of the polypeptide linker in the recombinant protein. Can be done voluntarily.
  • a method that allows the adhesion or binding between cell-adhesive substrates eg, proteins with activity that binds to fibroblasts
  • cell-adhesive substrates eg, proteins with activity that binds to fibroblasts
  • It can be induced by treating a substance that weakens the adhesion or bonding between (eg, the surface of the culture vessel).
  • a culture vessel having a hydrophobic surface for example, a culture vessel having a surface having a water contact angle of 90 to 150 °, is a cell culture vessel surface-treated or made of a polymer that gives hydrophobicity to a conventional cell culture vessel.
  • Such hydrophobic polymers include, but are not limited to, polystyrene, polymethyl methacrylate (PMMA), polyethylene terephthalate (PET), polyvinyl chlorite (PVC), polyethylene (PE), and polypropylene (PP).
  • PTFE Polytetrafluoroethylene
  • aliphatic polyester polymer poly (L-lactic acid) (PLLA), poly (D, L-lactic acid) (PDLLA), poly (glycolic acid) (PGA), poly ( Poly (lactic acid-co-glycolic acid) (PLGA), which is one selected from caprolactone) (PCL), poly (hydroxyalkanoate), polydioxanone (PDS), polytrimethylenecarbonate, or a copolymer of these units ), Poly (L-lactic acid-co-caprolactone) (PLCL), poly (glycolic acid-co-caprolactone) (PGCL), derivatives thereof, etc.
  • suitable culture vessels Is a hydrophobic surface silanized surface, carbon nanotubes (CNT) Surface, hydrocarbon coated surface, metal (eg, stainless steel, titanium, gold, platinum, etc.) surface.
  • the fibroblasts Before seeding the fibroblasts into the culture vessel, the fibroblasts can use passaged cultured cells.
  • the passage propagation method may be a passage passage propagation of the fibroblasts separated by a known method.
  • the isolated fibroblasts can be used as-cultured cells for one passage or subsequent generation for three-dimensional fibroblast assembly, or cells cultured for more than 10 passages.
  • the concentration for seeding the fibroblasts may be seeded at a cell concentration of 1.0 ⁇ 10 4 to 2.0 ⁇ 10 5 cells / cm 2 .
  • the cell concentration may be 7.5 ⁇ 10 4 to 1.5 ⁇ 10 5 cells / cm 2 , or 1.25 ⁇ 10 5 cells / cm 2 .
  • concentration of the cells is 1.0 ⁇ 10 4 or more, three-dimensional cell aggregates can be formed, and if 1.25 ⁇ 10 5 cells / cm 2 or more, three-dimensional cell aggregates of visible size can be formed.
  • the culture period may be 1 day to 1 week.
  • the medium suitable for the culture may be any medium containing serum or serum free as a medium commonly used for culturing and / or differentiating fibroblasts.
  • DMEM Denssion Eagle's modified eagle medium
  • Ham's F12 Or a medium in which serum is added can be used.
  • the step in which the fibroblasts form the three-dimensional fibroblast aggregates is a two-dimensional fibroblast aggregate initially formed by the binding between the cell-adhesive substrates and the detached two-dimensional fibroblasts on the surface of the culture vessel.
  • a three-dimensional cell aggregate can be formed.
  • Fibroblast aggregates formed by attaching and culturing fibroblasts to the culture vessel surface have a diameter of a detectable size with the naked eye and can be easily separated by a pipette, or easily obtained by filtration or centrifugation. That is, the step of obtaining the fibroblast aggregate formed from the culture vessel can be made without the treatment of enzymes.
  • the three-dimensional cell aggregate thus obtained is used in single cell form by breaking down the aggregate form by enzymatic treatment with collagenase, trypsin or dispase, mechanical treatment using pressure, or a combination thereof. It can be used in the form of a three-dimensional cell aggregate.
  • Another aspect provides a fibroblast assembly prepared by the above method.
  • the method for producing the fibroblast aggregate is as described above.
  • the fibroblast aggregate may be a spherical or sheet of visually identifiable size, for example, may be a spherical fibroblast aggregate of 300 to 2000 ⁇ m in diameter, and in one embodiment, may be 300 to 1000 ⁇ m. have.
  • the diameter of the spherical fibroblast aggregate can be adjusted to a size that can be visually recognized by those skilled in the art by the culture method according to one embodiment.
  • the spherical fibroblast aggregate according to one embodiment may include 3.0 ⁇ 10 5 to 1.0 ⁇ 10 6 fibrous cells within 400 ⁇ m in diameter.
  • the fibroblast aggregate may secrete epidermal growth factor (EGF), extracellular matrix (ECM) or vascular endothelial growth factor (VEGF).
  • EGF epidermal growth factor
  • ECM extracellular matrix
  • VEGF vascular endothelial growth factor
  • the fibroblast aggregate according to one embodiment may be usefully used as a cell source when supplying a cell therapeutic agent or a bioactive substance, and the use of the fibroblast aggregate is as follows.
  • Another aspect provides a cell therapy for skin regeneration or angiogenesis comprising a fibroblast assembly according to one embodiment.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for the prevention and treatment of skin scars, burns, bedsores, or ischemic diseases comprising the fibroblast aggregate or a culture medium thereof according to one embodiment.
  • the fibroblast aggregate can secrete epidermal growth factor, extracellular matrix or vascular endothelial growth factor, it is transplanted into an individual in need thereof to act as a cell source, thereby regenerating skin or angiogenesis.
  • Can promote by promoting skin regeneration or angiogenesis, it can be usefully used in pharmaceutical compositions for the prevention and treatment of skin scars, burns, bedsores or ischemic diseases.
  • the ischemic diseases include, for example, ischemic heart disease, ischemic myocardial infarction, ischemic heart failure, ischemic enteritis, ischemic vascular disease, ischemic eye disease, ischemic retinopathy, ischemic glaucoma, ischemic renal failure, ischemic baldness, ischemic stroke and ischemic leg disease It may be.
  • the dosage of the cell therapy or pharmaceutical composition is 1.0 ⁇ 10 5 to 1.0 ⁇ 10 8 cells / kg (body weight), or 1.0 ⁇ 10 7 to based on the fibroblast aggregate constituting the cell aggregate as an active ingredient.
  • 1.0 ⁇ 10 8 cells / kg body weight The dosage may be variously prescribed by such factors as the formulation method, the mode of administration, the age, weight, sex, morbidity, food, time of administration, route of administration, rate of excretion, and reaction sensitivity of the patient. These factors can be taken into account to properly adjust the dosage.
  • the number of administrations may be one or two or more times within the range of clinically acceptable side effects, and may be administered to one or two or more sites of administration.
  • the same dosages as humans per kg or the above dosages are converted into volume ratios (for example, average values) of organs (heart, etc.) between the target animal and humans.
  • One dose may be administered.
  • the target animal for the treatment include humans and mammals for other purposes, and specifically, humans, monkeys, mice, rats, rabbits, sheep, cattle, dogs, horses, pigs, and the like. Included.
  • the cell therapy agent or pharmaceutical composition may include a cell aggregate and a pharmaceutically acceptable carrier and / or additive as an active ingredient.
  • a pharmaceutically acceptable carrier examples include sterile water, physiological saline, conventional buffers (phosphate, citric acid, other organic acids, etc.), stabilizers, salts, antioxidants (ascorbic acid, etc.), surfactants, suspending agents, isotonic agents, or preservatives. can do.
  • organic substances such as biopolymers, inorganic substances such as hydroxyapatite, specifically collagen matrix, polylactic acid polymers or copolymers, polyethylene glycol polymers or copolymers, and chemical derivatives thereof.
  • the cell aggregate may be dissolved in a pharmaceutically acceptable carrier or frozen in solution.
  • Cell therapy or pharmaceutical composition is a suspension, dissolution aid, stabilizer, isotonic agent, preservative, adsorption agent, surfactant, diluent, excipient, pH adjuster, if necessary according to the administration method or formulation
  • a passivating agent, a buffer, a reducing agent, an antioxidant, etc. can be included suitably.
  • Pharmaceutically acceptable carriers and formulations suitable for the present invention including those exemplified above, are described in detail in Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., 1995.
  • a cell therapy or pharmaceutical composition according to one embodiment is formulated using a pharmaceutically acceptable carrier and / or excipient according to a method which can be easily carried out by one of ordinary skill in the art. It may be prepared in unit dose form or incorporated into a multi-dose container. The formulations can then be in the form of solutions, suspensions or emulsions in oil or aqueous media or in the form of powders, granules, tablets or capsules.
  • Yet another aspect provides a tissue engineering support in which a fibroblast assembly according to one embodiment is loaded onto a biodegradable polymer scaffold.
  • the fibroblast aggregate may secrete epidermal growth factor, extracellular matrix or vascular endothelial growth factor
  • the fibroblast assembly is implanted in a scaffold and implanted into the subject in need thereof. May promote regeneration or angiogenesis.
  • the tissue engineering support may be a fibroblast aggregate loaded on a support made by molding a biodegradable polymer.
  • the biodegradable polymer is spontaneously degraded after a certain period of time in vivo, and may include a polymer having at least one of biocompatibility, blood affinity, anticalcification properties, cellular nutritional components, and intercellular matrix-forming ability. .
  • biodegradable polymers are not particularly limited in the present invention, but typically, fibrin, collagen, gelatin, chitosan, alginate, hyaluronic acid, dextran, polylactic acid, polyglycolic acid (poly (glycolic acid), PGA), Poly (lactic-co-glycolic acid), PLGA, poly- ⁇ - (caprolactone), polyanhydrides, polyorthoesters, polyvinyl alcohol, polyethylene glycol, polyurethane , Polyacrylic acid, poly-N-isopropylacrylamide, poly (ethylene oxide) -poly (propylene oxide) -poly (ethylene oxide) copolymer, copolymers thereof, mixtures thereof and the like can be used.
  • the content of the biodegradable polymer in the composite support may be from 5 to 99% by weight in terms of forming the support or loading of the cell aggregate.
  • the composite support is made of a known mesh, such as a salt-casting and particle-leaching technique, a gas forming technique, a polymer fiber made of a non-woven fabric into a polymer mesh.
  • a known mesh such as a salt-casting and particle-leaching technique, a gas forming technique, a polymer fiber made of a non-woven fabric into a polymer mesh.
  • the support manufactured by molding as described above may serve to deliver the loaded cell aggregate into the transplanted tissue, and to attach and grow cells in three dimensions to form new tissue.
  • the size and structure of the pores of the support may affect the growth and adhesion of cells to the complex support.
  • the pores may be interconnected (inter-). connecting) may have a structure.
  • the pores in the support may be one having an average diameter of 50 to 600 ⁇ m.
  • Another aspect provides a three-dimensional culture system for drug screening comprising a fibroblast aggregate according to one embodiment.
  • the three-dimensional fibroblast assembly has an artificial cell morphology that mimics the in vivo environment, and can be usefully used for actual cell morphology and function studies, or therapeutic agents (for example, skin diseases or vascular diseases). Therefore, the three-dimensional culture system for drug screening comprising the three-dimensional fibroblast aggregates can replace animal experiments in the test for disease efficacy test, such as drugs or cosmetics, or inflammation and allergy test.
  • Another aspect provides an in vitro three dimensional dermal dermal model comprising fibroblast aggregates cultured from fibroblasts.
  • Another aspect provides an in vitro model for screening drugs including fibroblast aggregates cultured from fibroblasts, eg, MMP inhibitors or agents that increase the expression or activity of collagen in cells.
  • fibroblast aggregates cultured from fibroblasts eg, MMP inhibitors or agents that increase the expression or activity of collagen in cells.
  • Another aspect is a culture comprising fibroblast clusters formed by releasing fibroblasts from the surface by culturing the fibroblasts in a liquid medium in a culture vessel having a surface coated with a protein having activity to bind fibroblasts.
  • In vitro Provides a method for manufacturing a model.
  • the fibroblast aggregate and its preparation method are as described above.
  • the present disclosure may provide a composition or model for drug screening comprising a fibroblast aggregate cultured from fibroblasts.
  • the drug may be a skin aging enhancer, an inflammatory disease, arthritis or cancer treatment.
  • an in vitro three-dimensional dermal dermal model comprising fibroblast aggregates cultured from fibroblasts may be for the screening of skin aging enhancers, inflammatory diseases, arthritis, or cancer therapeutics.
  • the fibroblast aggregate may be one that exhibits the pathological properties of the skin according to aging.
  • the fibroblast aggregate may be one in which the expression or activity of collagen is decreased or the expression or activity of matrix metalloproteinase (MMP) is increased.
  • MMP matrix metalloproteinase
  • the fibroblast assembly may additionally have reduced expression or activity of fibronectin or increased expression or activity of elastin.
  • the decrease or increase in the expression or activity may mean that the expression or activity of the above-mentioned protein or gene is reduced or increased in comparison with normal cells or compared to two-dimensionally cultured fibroblasts.
  • the collagen may comprise collagen type I, II, III, IV, V, VI, VII, VIII, IX, X, XI, XII, XIII, or XIV.
  • the MMP may include any one or more of MMP 1 to 28.
  • the reduction of collagen can lead to the synthesis of fibrous components and loss of moisture in the skin tissue and to changes in the stratum corneum.
  • the collagen may be degraded by MMP. Therefore, the fibroblast assembly according to one embodiment, in which the expression or activity of collagen is reduced or the expression or activity of MMP is increased, may be usefully used for screening drugs for improving aging of the skin.
  • the drug for improving aging of the skin may include a drug having a moisturizing effect of the skin, an increase in elasticity, a decrease in wrinkles, and an antioxidant activity.
  • the MMP may degrade the extracellular matrix and thereby promote tumor metastasis and progression, whereby collagen synthesis and degradation may play a role in cancer metastasis.
  • MMPs are known to be overexpressed in inflammatory diseases, such as arthritis, or pathological conditions such as cancer, for example cancer metastasis, and MMP inhibitors targeting MMPs are developed as therapeutic agents for such diseases.
  • inflammatory diseases such as arthritis
  • pathological conditions such as cancer, for example cancer metastasis
  • MMP inhibitors targeting MMPs are developed as therapeutic agents for such diseases.
  • the fibroblast assembly according to one embodiment in which the expression or activity of collagen is reduced or the expression or activity of MMP is increased, can be usefully used for screening therapeutic agents for inflammatory diseases, arthritis, or cancer.
  • the inflammatory diseases include dermatitis, conjunctivitis, peritonitis, periodontitis, rhinitis, otitis media, sore throat, tonsillitis, pneumonia, gastric ulcer, gastritis, Crohn's disease, colitis, hemorrhoids, gout, ankylosing spondylitis, rheumatic fever, lupus, fibromyalgia, psoriatic arthritis , Osteoarthritis, rheumatoid arthritis, periarthritis, tendinitis, hay salt, peritonitis, myositis, hepatitis, cystitis, nephritis, Sjogren's syndrome, multiple sclerosis, and acute and chronic inflammatory diseases.
  • the arthritis may also be osteoarthritis, or rheumatoid arthritis.
  • the cancer therapeutic agent may include a substance that inhibits the proliferation of cells of the cancer itself, and may also include a substance that inhibits
  • Culture of the fibroblasts from the fibroblast aggregates can be differentiated by adhering the fibroblasts to a culture vessel having a hydrophobic surface.
  • the fibroblasts are adhered to a culture vessel having a hydrophobic surface, the fibroblasts are detached from the culture vessel as the density of the adhered fibroblasts increases to form a fibroblast assembly.
  • the culture is additionally at least 12 hours, or at least 1 day or more, for example 12 hours to 15 days, 1 to 15 days, 3 days after being cultured with the fibroblast assembly or after the fibroblast assembly is formed. To 10 days, 3 to 7 days, or 5 to 7 days may be further cultured.
  • the medium suitable for the culture may be any medium containing serum or serum free as a medium commonly used for culturing and / or differentiating fibroblasts.
  • DMEM Denbeco's modified eagle medium
  • Ham's F12 Or a medium in which serum is added can be used.
  • Detailed description of the method for forming the cell aggregate by culturing will be described later.
  • fibroblast aggregates cultured from fibroblasts are three-dimensionally cultured, they can effectively simulate the in vivo environment and contain extracellular matrix, which can be usefully used as an in vitro dermal dermal model.
  • skin dermis model (used to be used interchangeably with 'dermal equivalent') may mean that the structure or shape of dermal tissue or dermis is modeled, and within the dermis. It can mean a model considered to reveal the interrelationships between cells, their relationship to their structure or morphology.
  • Another aspect includes treating a test substance in the fibroblast assembly or in vitro three dimensional dermal dermal model; Measuring the level of expression or activity of MMPs in the test substance treated fibroblast assembly or skin dermal model; Comparing the level of expression or activity of the measured MMP with that of the untreated control; And it provides a method for screening a substance that reduces the expression or activity of MMP comprising the step of selecting a substance that reduces the expression or activity of MMP compared to the control.
  • Another aspect includes treating a test substance in a three-dimensional dermal model of the fibroblast assembly or in vitro; Measuring the level of expression or activity of collagen in the test substance-treated fibroblast assembly or skin dermal model; Comparing the level of expression or activity of collagen measured with that of an untreated control; And it provides a method for screening a substance that increases the expression or activity of collagen comprising the step of selecting a substance that increased the expression or activity of collagen compared to the control.
  • the test substance is selected from the group consisting of low molecular weight compounds, antibodies, antisense nucleotides, short interfering RNA, short hairpin RNA, nucleic acids, proteins, peptides, other extracts, and natural products. It can be any one.
  • the step of treating the test substance may include contacting the fibrous cell aggregate or the in vitro three-dimensional skin dermal model with the test substance.
  • the contacting may include, for example, injecting a solution containing a concentration of a test substance into each well containing one or more fibroblast assemblies or in vitro three-dimensional dermal dermal models.
  • the expression or activity level of MMP or collagen may be measured by Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR), enzyme immunoassay (ELISA), immunohistochemistry, Western Blotting immunoprecipitation ( It may be measured by any one selected from the group consisting of immunoprecipitation, immunofluorescence and flow cytometry (FACS).
  • the measurement of the expression or activity level of the MMP or collagen may include measuring the amount of secreted MMP or collagen in the culture.
  • the measurement of the content of collagen in the culture solution may be measured through a hydroxyproline assay.
  • a substance which reduces the expression or activity of MMP compared to the control group can be selected as an expression inhibitor or activity inhibitor or candidate substance of MMP.
  • Substances or candidates that reduce the expression or activity of the MMP may be skin aging enhancers or cancer therapeutics.
  • a substance that increases the expression or activity of collagen compared to the control group may be selected as an expression or activity inhibitor of collagen or a candidate substance.
  • Substances or candidates that reduce the expression or activity of the collagen may be skin aging enhancers or cancer treatments.
  • the fibroblast aggregates cultured from fibroblasts have reduced expression or activity of collagen, or the expression or activity of MMP is increased, so that the fibroblast aggregates according to one embodiment may express collagen or MMP. Or it can be usefully used for screening substances related to activity.
  • a drug screening device comprising a well plate having one or more wells, wherein one or more of the fibroblast aggregates are seeded in the wells.
  • the fibroblast aggregate is as described above.
  • the candidate substance may be the same or different candidate substance.
  • the culture can be arbitrarily determined by a person skilled in the art.
  • the assay may include, for example, an MMP secretion assay using ELISA from the culture, or an ECM secretion assay using western blotting from the fibroblast assembly, or immunohistochemical staining.
  • a large amount of three-dimensional fibroblast assembly can be easily obtained in a short time in a culture vessel, and the fibrous cell is surrounded by an extracellular matrix as a three-dimensional fibroblast assembly as a cell source. There is an effect that can be implanted in vivo with an injection formulation without damaging the condition.
  • the in vitro three-dimensional dermal model and the method for screening drugs using the three-dimensional cell aggregates can not only mimic the in vivo environment of the skin having structural and functional complexity, but also MMP Alternatively, there is an effect capable of high-throughput screening of substances related to extracellular matrix including collagen.
  • FIG. 1 is a diagram showing a manufacturing process of a three-dimensional fibroblast aggregate according to an embodiment.
  • Figure 2 is a diagram showing a graph quantifying the cell adhesion rate of fibroblasts according to an embodiment according to the amount of protein.
  • Figure 3 is a view showing a cell fluorescence staining picture of the fibroblasts according to one embodiment.
  • Figure 4 is a view showing the phosphorylation activity of FAK of fibroblasts according to one embodiment.
  • Figure 5 is a view showing a three-dimensional fibroblast aggregate formation photograph according to one embodiment.
  • Figure 6 is a view showing a three-dimensional fibroblast aggregate formation photograph according to one embodiment.
  • Figure 7 is a view showing the H & E staining results of the three-dimensional fibroblast assembly according to one embodiment.
  • FIG. 8 is a diagram showing the results of type I collagen immunofluorescence staining of a three-dimensional fibroblast aggregate according to one embodiment.
  • FIG. 9 is a view showing the amount of VEGF secretion of the three-dimensional fibroblast aggregate according to one embodiment.
  • FIG. 10 is a photograph of a process of forming a three-dimensional fibroblast aggregate according to one embodiment under a microscope.
  • FIG. 10 is a photograph of a process of forming a three-dimensional fibroblast aggregate according to one embodiment under a microscope.
  • Figure 11 is a graph showing the relative expression of the extracellular matrix related genes of the three-dimensional fibroblast assembly according to one embodiment.
  • Figure 12 is a graph showing the results of measuring the collagen content of the three-dimensional fibroblast aggregate according to a hydroxyproline assay.
  • Figure 13 is a diagram showing the results of measuring the amount of collagen type I expression of the three-dimensional fibroblast aggregate according to one embodiment by immunostaining.
  • FIG. 14 is a view showing the results of measuring the amount of collagen type I expression of the three-dimensional fibroblast aggregates according to one embodiment by Western blotting.
  • 15 is a graph showing the expression and secretion amount of MMP 1 of the three-dimensional fibroblast aggregate according to one embodiment.
  • 16 is a view showing the amount of MMP1 secretion of cells after the treatment of the MMP1 inhibitor to the three-dimensional fibroblast aggregate according to one embodiment.
  • FIG. 17 is a diagram showing the amount of MMP1 secretion of cells after treatment of MMP1 inhibitors to fibroblasts cultured in two dimensions in order to induce MMP1 overexpression.
  • FIG. 18 is a diagram schematically illustrating a drug screening apparatus including a three-dimensional fibroblast aggregate and a method for screening drugs using the same, according to one embodiment.
  • the fibroblasts were cultured in a culture vessel having a surface coated with a protein having an activity of binding to the fibroblasts to form a three-dimensional fibroblast aggregate.
  • FIG. 1 is a diagram showing a manufacturing process of a three-dimensional fibroblast aggregate according to an embodiment.
  • fibroblasts were seeded in MBP-FGF2 coated culture vessel. Thereafter, the fibroblasts were detached while culturing in two dimensions on the surface of the culture vessel, and the detached or detached two-dimensional fibroblast aggregate was continuously cultured in a suspended state in the culture vessel to form a three-dimensional fibroblast assembly from one day thereafter. . It was confirmed that the three-dimensional fibroblast aggregate formed according to one embodiment has extracellular matrix and vascular endothelial growth factor (VEGF) secretion ability.
  • VEGF vascular endothelial growth factor
  • Figure 2 is a diagram showing a graph quantifying the cell adhesion rate of fibroblasts according to an embodiment according to the amount of protein.
  • NTCP coated with BSA, MBP, and MBP-VEGF showed lower adhesion rate than ECM-fibronectin binding to integrin of cell membrane after one hour after cell seeding.
  • Example 1 In order to compare the morphology of the cells of fibroblasts cultured in NTCP coated with fibronectin and MBP-FGF2, respectively, in Example 1 (1.1), filoblasts (palloidin 30 minutes, 1 hour, and 4 hours after adhesion) were compared. ).
  • Figure 3 is a view showing a cell fluorescence staining picture of the fibroblasts according to one embodiment.
  • the fibroblasts adhered to MBP-FGF2 can be confirmed that the cytoskeleton is not activated compared to the fibroblasts adhered to fibronectin.
  • the adhesion of fibroblasts adhered to MBP-FGF is limited to cell adhesion activity through integrin, a cell adhesion molecule present in the cell membrane, compared to fibroblasts adhered to fibronectin.
  • FAM focal adhesion kinase
  • Figure 4 is a view showing the phosphorylation activity of FAK of fibroblasts according to one embodiment.
  • Fibroblasts were 0.5 ⁇ 10 4 cells / cm 2 to 1.5 in each well of a 12, 24, 48, and 96-well NTCP run on a polystyrene surface coated with MBP-FGF2 containing high glucose DMEM medium (FGM medium). After seeding at a cell concentration of 10 5 cells / cm 2, the cells were cultured in a 37 ° C. incubator for 1, 2, and 3 days, respectively. At the beginning of the culture, fibroblasts present in sheet form are detached from the culture surface over time and present as cell bodies after 1 day, and can be easily recovered by pipette without enzyme treatment such as trypsin.
  • FGM medium high glucose DMEM medium
  • Figure 5 is a view showing a three-dimensional fibroblast aggregate formation photograph according to one embodiment.
  • Figure 6 is a view showing a three-dimensional fibroblast aggregate formation photograph according to one embodiment.
  • Example 1 1.25 ⁇ 10 5 cells / cm 2 in well-NTCP (12, 24, 48, 96-well) coated with various types of MBP-FGF2 in Example 1 (2) Three-dimensional cell aggregates formed by seeding at cell concentration were fixed several times with PBS and treated with 4% paraformaldehyde for 30 minutes at room temperature. After dehydration using various concentrations of ethanol (50 ⁇ 100%), and then embedded in paraffin. The prepared paraffin block was cut to 4 ⁇ m in thickness using a microtome, fixed on a slide glass, and subjected to H & E staining and immunological staining for fibronectin and collagen type 1. Collagen type 1 staining was performed by fluorescence immunostaining.
  • the slide glass prepared above was first treated with BSA (4%) for 1 hour, and then immersed in PBS containing primary antibody and reacted overnight, then washed three times with PBS, and then reacted with secondary antibody for 1 hour in the dark. I was. Nuclear staining with DAPI was further performed and analyzed by confocal microscopy. Controls were analyzed by performing the same treatment without the use of primary antibodies.
  • Figure 7 is a view showing the results of H & E staining on the three-dimensional fibroblast aggregates according to one embodiment.
  • FIG. 8 is a diagram showing the results of type I collagen immunofluorescence staining of a three-dimensional fibroblast aggregate according to one embodiment.
  • the collagen is generally stained in the three-dimensional fibroblast assembly, through which the collagen is secreted much when the cell assembly is formed.
  • Example 1 (2) the three-dimensional cell aggregate formed by seeding in 96-well NTCP coated with MBP-FGF2 at 1.25 ⁇ 10 5 cells / cm 2 cell concentration was recovered, and the vascular endothelial growth factor (VEGF) secretion was recovered. Measured.
  • VEGF vascular endothelial growth factor
  • FIG. 9 is a view showing the amount of VEGF secretion of the three-dimensional fibroblast aggregate according to one embodiment.
  • FIG. 9 is a view showing the amount of VEGF secretion of the three-dimensional fibroblast aggregate according to one embodiment.
  • the three-dimensional fibroblast aggregates were found to increase more than twice the amount of VEGF than cells cultured in two dimensions.
  • Example 2 in beat ( In vitro ) Preparation of 3D Artificial Dermal Model and Its Characterization
  • fibroblasts were first cultured. Specifically, human dermal fibroblasts were treated with high glucose Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM, Welzen) at 37 ° C., 5% CO 2 , and 95% O 2 at atmospheric conditions using a tissue culture flask. , Daegu, South Korea). Passage 5 human dermal fibroblasts were used for all experiments.
  • DMEM Dulbecco's modified Eagle's medium
  • the culture vessel for the three-dimensional culture of fibroblasts was prepared as follows. MBP (maltose binding protein) -FGF (fibroblasts) in Non-Tissue Culture Treated 96-well Plate ("NTCP", Falcon, polystyrene) Growth factor) (20 ⁇ g / ml) was coated at room temperature for 4 hours. Next, washing with PBS three times to remove unbound MBP-FGF.
  • MBP maltose binding protein
  • FGF fibroblasts
  • NCP Non-Tissue Culture Treated 96-well Plate
  • PBS polystyrene Growth factor
  • the fibroblasts were seeded in the culture vessel to prepare a three-dimensional fibroblast aggregate. Specifically, fibroblasts were seeded on the 96 well plate in fibroblast growth medium (FGM, Lonza) at a concentration of 1.25 ⁇ 10 5 cells / cm 2 per well and cultured at 37 ° C. The fibroblasts were detached while culturing two-dimensionally on the surface of the culture vessel, and the detached or detached two-dimensional fibroblast assembly was continuously cultured in a suspended state in the culture vessel to form spontaneously the three-dimensional fibroblast assembly within 24 hours. . The formed three-dimensional fibroblast aggregates were collected on the first day (1 day), the third day (3 day) and the fifth day (5 day) of culture, respectively. Carl Zeiss, Germany), the results are shown in FIG.
  • the 3D fibroblast aggregate is referred to as '3DCM'.
  • the fibroblasts were cultured two-dimensionally as a comparative example. Specifically, tissue cells were inoculated with 1.25x10 5 cells / cm 2 of adipose stem cells per well in a 96-well plate (TCP) for culture and then cultured in fibroblast growth medium (FGM, Lonza), and the three-dimensional cell aggregates. Similarly, cells were collected on the first day (1 day), the third day (3 day) and the fifth day (5 day) of culture for characterization of artificial dermal model.
  • TCP 96-well plate
  • FGM fibroblast growth medium
  • '2D' the two-dimensionally cultured cells
  • FIG. 10 is a photograph of a process of forming a three-dimensional fibroblast aggregate according to one embodiment under a microscope.
  • FIG. 10 is a photograph of a process of forming a three-dimensional fibroblast aggregate according to one embodiment under a microscope.
  • the following experiment was performed to analyze the characteristics of the three-dimensional fibroblast assembly prepared as an artificial dermal model.
  • Quantitative Real-Time Polymerase Chain Reaction was used to analyze gene expression levels of extracellular matrix related genes collagen, fibronectin, and elastin.
  • RNA from 3DCM and 2D was extracted at different times (day 1, day 3, and day 5) using the Qiagen miniprep kit (Qiagen Inc., USA) according to the manufacturer's instructions.
  • the extracted RNA was dissolved in nuclease-free water and RNA concentration was quantified using NanoDrop ND1000 spectrophotometer (Thermo Fisher Scientific).
  • Complementary DNA synthesis was performed using Maxime RT PreMix (iNtRon, South Korea) according to the manufacturer's instructions. All target primer sequences were purchased from Bioneer (South Korea).
  • Figure 11 is a graph showing the relative expression of the extracellular matrix-related genes of the three-dimensional fibroblast assembly according to one embodiment.
  • collagen type 1 and fibronectin can be confirmed that the expression level is almost three times lower in 3DCM than 2D, and in the case of elastin, the expression amount is increased in 3DCM compared to 2D.
  • the expression levels of 2D and 3DCM were similar on the first day of culturing, but it was confirmed that significantly increased from the third day of culturing.
  • the three-dimensional fibroblast assembly according to one embodiment is reduced in the expression of collagen and fibronectin, and the expression of elastin can be useful in the development of substances targeting them by simulating the environment of the skin dermis It can be seen.
  • Hydroxyproline assay immunostaining and western blotting were performed for collagen analysis of three-dimensional fibroblast aggregates.
  • 2D, and 3DCM (3 ⁇ 10 6 cells) were collected at different times (day 1, day 3 and day 5) using RIPA buffer (Sigma-Aldrich) for hydroxyproline assays at 120 ° C. Hydrolyzed with 12 N HCl solution for 3 h at. Assays were performed using the hydroxyproline kit (Sigma-Aldrich) according to the manufacturer's instructions. Absorbance was measured at 560 nm using Multisakn (Thermo) and the results are shown in FIG. 12.
  • the 3DCM and 2D collected at different times for immunostaining were washed three times with PBS and immobilized with 4% PFA for 30 minutes. Since, the compound OCT (optimal cutting temperature compound); embedded in (TISSUE-TEK ⁇ c 4583 Sakura Finetek USA, Inc.) and frozen at -28 °C and was cut in 6 ⁇ m thickness. To avoid nonspecific binding, sections were incubated in BSA (4%) for 1 hour at room temperature. Thereafter, the cells were incubated overnight at 4 ° C. with primary antibodies against collagen I (Rabit, Abicam).
  • the same cultured cells were solubilized with RIPA buffer (Sigma-Aldrich) along with a protease inhibitor cocktail for Western blotting.
  • the lysate was then centrifuged at 15,000 g for 30 minutes at 4 ° C., diluted in a Laemmli sample containing 2% SDS and 5% (v / v) 2-mercaptoethanol and at 90 ° C. for 5 minutes. Heated. Proteins were separated by SCD-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) with the use of a 10% resolving gel and transferred to nitrocellulose membrane (Bio-Rad, USA). The membranes were incubated overnight at 4 ° C.
  • Figure 12 is a graph showing the results of measuring the collagen content of the three-dimensional fibroblast aggregate according to a hydroxyproline assay.
  • FIG. 13 is a view showing the results of measuring the amount of collagen expression of the three-dimensional fibroblast aggregate according to an embodiment by immunostaining.
  • FIG. 14 is a view showing the results of measuring the amount of collagen expression of the three-dimensional fibroblast aggregates according to one embodiment by Western blotting.
  • collagen type I staining was decreased during incubation in 3DCM, but not in 2D.
  • the results indicate that collagen type I degraded during culturing in a three-dimensional culture system.
  • the three-dimensional fibroblast aggregate according to one embodiment has a reduced expression of collagen, which can be usefully used for screening candidate substances that increase the content of collagen.
  • RT-PCR was performed for expression analysis of matrix metalloproteinase (MMP) 1 of the three-dimensional fibroblast assembly. RT-PCR was carried out in the same manner as in (2.1) of Example 2, the results are shown in Figure 15a.
  • MMP matrix metalloproteinase
  • ELISA was performed to analyze the total amount of MMP-1 secretion. Specifically, culture medium was prepared from normal 2D, 3DCM at different times (day 1, day 3, and day 5). Assays were performed according to the manufacturer's instructions using the Quantikine ELISA Human Total MMP 1 Kit (R & D System). Absorbance was measured at 560 nm using Multisakn (Thermo) and the results are shown in FIG. 15B.
  • 15 is a graph showing MMP1 expression and secretion levels of three-dimensional fibroblast aggregates according to one embodiment.
  • the expression level of the MMP1 gene in 3DCM is significantly increased compared to 2D.
  • the secretion amount of MMP1 was also significantly increased compared to 2D in 3DCM.
  • the three-dimensional fibroblast aggregate according to one embodiment is significantly increased in the expression of MMP can be usefully used in the development of a target material.
  • the amount of secretion of MMP was confirmed by treating a known MMP inhibitor.
  • retinoic acid (10 mM) diluted in fibroblast growth media (Fibroblast Growth Media, FGM, Lonza Co., Ltd.) on the 3D fibroblast aggregate prepared on day 1 of culture in Example 2 (1).
  • abietic acid (abietic acid) (100 m M)
  • transforming growth factor-beta was inoculated with 1 (Transforming growth factor-b1, TGF-b1) (5 ng / ml).
  • TGF-b1 matrix metalloproteinase-1
  • MMP1 matrix metalloproteinase-1
  • fibroblasts irradiated with ultraviolet B were used to compare the inhibitory ability of the MMP inhibitor using the fibroblasts cultured in two dimensions. Specifically, after seeding fibroblasts suspended in high glucose DMEM medium at a concentration of 2.5 X 10 5 cells / cm 2 in a tissue culture treated 6-well plate, 37 ° C. Incubated for 1 day. Then, washed three times with PBS, serum-free MEM medium was put and incubated for 1 hour in a 37 °C stationary incubator. After washing three times with PBS, UV B (20 mJ / cm 2 ) was irradiated to induce MMP1 overexpression.
  • fibroblast growth medium (Fibroblast Growth Media, FGM, Lonza Co.) of various concentrations of the retinoic acid in dilute (2, 10, 40 m M ), abietic acid (20, 100, 400 m M ), TGF- After inoculating b1 (1, 5, 20, ng / ml), and further incubated for 2 days at 37 °C incubator, the culture solution was recovered to measure the amount of MMP1 secretion. The measurement was quantified using an ELISA kit (R & D), the usage was carried out according to the supplier's protocol and the results are shown in FIG.
  • 16 is a view showing the amount of MMP1 secretion of cells after the treatment of the MMP1 inhibitor to the three-dimensional fibroblast aggregate according to one embodiment.
  • FIG. 17 is a diagram showing the amount of MMP1 secretion of cells after treatment of MMP1 inhibitors to fibroblasts cultured in two dimensions in order to induce MMP1 overexpression.
  • the secretion amount of MMP1 increased by 2.1 times 2.4 times as the culture time was 2 and 4 days later.
  • retinoic acid and abietin acid-treated fibroblast aggregates showed about 80% and 81% of the secretion, respectively, compared with the control group, and the TGF-b1 treated group showed about 60%.
  • the fibroblasts irradiated with UVB cultured in two dimensions showed about 1.3 times higher MMP1 secretion than the fibroblasts not irradiated.
  • retinoic acid-treated fibroblasts showed that MMP1 secretion was reduced to about 30% compared to the control group, and compared with TGF-b1 treatment group, it was reduced to 25-35% depending on the throughput.
  • Especially abietic acid by fibroblasts handle showed the secretion of about 2% compared to the case were treated for more than 100 m M decreased the secretion about half when treated 20 m M control.
  • the amount of secretion decreased during treatment with the inhibitor is the same.
  • the decrease was 32.7 times higher than that of the retinoic acid treated group, the TGF-b1 was 1.7-2.4 times higher, and the abietinic acid was 1.7-40 times higher.
  • the sensitivity of the cells to the drug in 2D is significantly high that it is not suitable for drug screening, and it can be seen that 3DCM can be usefully used for screening drugs containing MMP inhibitors.
  • FIG. 18 is a diagram schematically illustrating a drug screening apparatus including a three-dimensional fibroblast aggregate and a method for screening drugs using the same, according to one embodiment.
  • a drug screening device including a well plate having one or more wells, and seeded with three-dimensional fibroblast aggregates according to one or more embodiments.
  • the three-dimensional fibroblast aggregate may include 3.0 ⁇ 10 5 to 1.0 ⁇ 10 6 cells per cell aggregate.
  • the diameter of the cell aggregate may be 300 to 2000 ⁇ m, and the shape may be spherical (including spheroid) or a sheet.
  • the drug, that is, the candidate substance is as described above.
  • the candidate substance may be the same or different candidate substance.
  • the culture can be arbitrarily determined by a person skilled in the art.
  • the assay may include, for example, an MMP secretion assay using an ELISA from the culture, or an ECM secretion assay using Western blotting or immunohistochemical staining from the three-dimensional fibroblast assembly.

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Abstract

3차원 섬유아세포집합체, 그의 제조방법, 및 섬유아세포로부터 배양된 섬유아세포집합체를 포함하는 인 비트로(In vitro) 3차원 피부 진피 모델 및 그를 사용하여 약물을 스크리닝하는 방법을 제공한다.

Description

3차원 섬유아세포집합체 및 그를 포함하는 인 비트로 3D 피부 진피 모델
3차원 섬유아세포집합체, 그의 생산방법, 그를 포함하는 인 비트로 3D 피부 진피 모델 및 그를 사용하여 약물을 스크리닝하는 방법에 관한 것이다.
최근에 세포치료기술은 난치병 등의 치료의 새로운 분야로 각광받고 있다. 이전까지는 인간의 난치병 치료를 위해 장기이식 또는 유전자 치료 등이 제시되었으나, 면역거부, 공급 장기 부족, 벡터개발 또는 질환 유전자에 대한 지식부족으로 효율적인 실용화가 미진하였다.
이에 세포치료기술에 대한 관심이 고조되어, 생체내에서 분리한 세포를 생체외에서 증식하여 이식하는 기술이 상용화되고 있으며, 인공피부, 연골 또는 섬유조직의 재건 등 실용화가 계속 진행되어 왔다. 섬유아세포는 간질성 세포외기질(ECM)을 생산하고 유지하는 세포로서, 세포외기질에 의해 섬유아세포가 유기적으로 연결되어 있다. 또한, 섬유아세포는 면역방어를 다양한 사이토카인 및 생리활성인자를 생산하는 세포로 잘 알려져 있다.
이러한 섬유아세포를 세포치료제 혹은 조직공학 소재로서 활용하기 위해서는 섬유아세포를 2차원적으로 배양하여 대량증식 후 트립신과 같은 효소로 처리하였으나, 이러한 섬유아세포에서는 생성된 세포외기질이 분해되어 이식하는 단계에서 세포외기질의 역할을 기대할 수 없었다. 조직공학기술로 생분해성 합성고분자 혹은 천연고분자를 이용하여 스캐폴드라고 하는 인공적인 3차원 다공성 세포외기질을 이용하여 섬유아세포를 비롯한 다양한 세포를 삼차원 세포집합체로 배양하고자 하는 연구가 이루어졌다. 그러나, 이는 생분해속도 또는 염증 반응 등 소재의 한계가 있어서 상용화에 어려움이 있으며, 이에 3차원 세포 집합체 형성을 유도하는 기술이 요구되고 있다.
한편, 인체의 피부조직은 크게 세 부분으로 나뉘어지는데, 피부의 가장 바깥쪽을 이루는 표피층과 그 아래층의 진피층, 그리고 피하조직으로 이루어진다. 이 중 표피층은 표피층과 진피층이 단단하게 결합할 수 있도록 하는 기저막(basement membrane)으로부터 여러 층으로 분화된 상피세포와 그 밖에 멜라닌세포, 면역세포로 이루어지며, 표피층 아래의 진피층은 주로 섬유아세포와 이 세포가 분비한 여러 세포외기질(extracellular matrix)로 이루어진다. 진피층은 피부 건강 및 노화와 밀접하게 연관되어 있음이 알려져 있다.
콜라겐은 진피층의 90%를 차지하는 주요 단백질로서 피부 결합 조직을 유지하고, 피부에 탄력을 제공한다. 일반적으로 외부 요인 및 나이 증가에 따라 섬유아세포의 수 및 기능이 감소하고, 이것이 노화의 주요 원인으로 알려져 있다. 세포의 감소는 피부 조직에의 섬유질 성분 합성 및 수분의 손실, 및 각질층의 변화를 일으킨다. 또한, 콜라게나아제의 증가는 가교 형태의 콜라겐을 감소시키고, 이것은 피부의 매끄러움, 수분, 및 탄력을 감소시킨다. 콜라겐 함량 및 합성 증가는 피부의 수분 및 탄력의 증가를 의미한다.
피부 매트릭스 내의 콜라겐의 분해 및 합성은 프로테아제인 MMP(matrix metalloproteinase)에 의해 조절된다. 구조 및 기능적 특성에 따라, MMP는 다수의 종류로 나뉜다. 타입 I 콜라겐은 피부의 전형적인 콜라겐으로 MMP-1의 작용에 의해 분해된다. MMP-1 활성은 피부의 항상성을 유지하기 위해 분비되는 TIMP-1과 같은 억제제에 의해 조절된다. MMPs 및 TIMPs와 같은 생분자는 섬유아세포를 포함하는 세포에 의해 분비된다. 또한, MMP-1은 세포외기질을 분해하고, 그에 의해 종양 전이 및 진행을 촉진한다. MMP-1에 의한 콜라겐 합성 및 분해는 암 전이에서 중요한 역할을 한다. 따라서, MMP-1/콜라겐을 표적으로 하는 약물 및 물질은 암 치료제 또는 화장료 조성물의 목적으로 개발되고 있다.
또한, MMP는 염증성 질환, 예를 들면, 관절염, 또는 암, 예를 들면 암 전이 등과 같은 병리학적 조건에서 과발현되는 것으로 알려져 있으며, MMP를 타겟으로 하는 MMP 억제제는 상기와 같은 질환의 치료제로서 개발되고 있다.
이러한, MMP 또는 콜라겐을 표적으로 하는 약물을 스크리닝하기 위한 2D 세포-기반 어세이가 개발되어 있으나, 2D 세포-기반 어세이는 약물의 민감도, 세포 및 조직에 대한 약물 침투의 문제로 인해 제한적이고, 살아있는 생명체의 반응을 정확하게 예측하는데 부적절하다. 또한, 이와 같은 피부의 구조적, 기능적인 복잡성 때문에 한 종류의 피부세포를 이용한 피부 연구는 한계를 가지게 되며 이를 극복하고자 개발한 3차원적 구조의 피부 모델이 인공 피부이나, 기존의 인공 피부는 고속으로 약물을 스크리닝하기 어려운 제한점이 있다. 따라서, 고속으로 약물을 스크리닝(high-throughput)할 수 있으면, 피부의 환경을 모사할 수 있는 새로운 피부 모델 시스템의 개발이 요구된다.
일 양상은 섬유아세포를 섬유아세포에 결합하는 활성을 가진 단백질이 코팅된 표면을 갖는 배양 용기 중의 액체 배지 중에서 배양하여, 상기 표면으로부터 섬유아세포가 이탈되어 형성된 섬유아세포집합체(fibroblast cluster)를 포함하는 배양물을 얻는 단계; 및 상기 배양물로부터 섬유아세포집합체를 분리하는 단계를 포함하는 섬유아세포집합체를 생산하는 방법으로서, 상기 섬유아세포에 결합하는 활성을 가진 단백질은 섬유아세포와 섬유아세포 사이의 결합보다 더 약하게 섬유아세포와 결합하는 것인 방법을 제공하는 것이다.
다른 양상은 상기 방법에 의해 제조된 섬유아세포집합체를 제공하는 것이다.
다른 양상은 섬유아세포로부터 배양된 섬유아세포집합체를 포함하는 인 비트로(In vitro) 3차원 피부 진피 모델을 제공한다.
다른 양상은 섬유아세포를 섬유아세포에 결합하는 활성을 가진 단백질이 코팅된 표면을 갖는 배양 용기 중의 액체 배지 중에서 배양하여, 상기 표면으로부터 섬유아세포가 이탈되어 형성된 섬유아세포집합체(fibroblast cluster)를 포함하는 배양물을 얻는 단계로서, 상기 섬유아세포에 결합하는 활성을 가진 단백질은 섬유아세포와 섬유아세포 사이의 결합보다 더 약하게 섬유아세포와 결합하는 것인 단계; 및 상기 배양물로부터의 섬유아세포집합체를 적어도 12시간 동안 추가적으로 배양하는 단계를 포함하는 포함하는 인 비트로 3차원 인공 피부 모델을 제조하는 방법을 제공한다.
다른 양상은 상기 섬유아세포집합체 또는 인 비트로 3차원 피부 진피 모델에 피검 물질을 처리하는 단계; 상기 피검 물질이 처리됨 섬유아세포집합체 또는 피부 진피 모델의 MMP의 발현 또는 활성의 수준을 측정하는 단계; 측정된 MMP의 발현 또는 활성의 수준을 무처리 대조군의 수준과 비교하는 단계; 및 대조군에 비하여 MMP의 발현 또는 활성을 감소시킨 물질을 선별하는 단계를 포함하는 MMP의 발현 또는 활성을 감소시키는 물질을 스크리닝하는 방법을 제공한다.
또 다른 양상은 상기 섬유아세포집합체 또는 인 비트로 3차원 피부 진피 모델에 피검 물질을 처리하는 단계; 상기 피검 물질이 처리됨 섬유아세포집합체 또는 피부 진피 모델의 콜라겐의 발현 또는 활성의 수준을 측정하는 단계; 측정된 콜라겐의 발현 또는 활성의 수준을 무처리 대조군의 수준과 비교하는 단계; 및 대조군에 비하여 콜라겐의 발현 또는 활성을 증가시킨 물질을 선별하는 단계를 포함하는 콜라겐의 발현 또는 활성을 증가시키는 물질을 스크리닝하는 방법을 제공한다.
일 양상은 섬유아세포를 섬유아세포에 결합하는 활성을 가진 단백질이 코팅된 표면을 갖는 배양 용기 중의 액체 배지 중에서 배양하여, 상기 표면으로부터 섬유아세포가 이탈되어 형성된 섬유아세포집합체(fibroblast cluster)를 포함하는 배양물을 얻는 단계; 및 상기 배양물로부터 섬유아세포집합체를 분리하는 단계를 포함하는 섬유아세포집합체를 생산하는 방법으로서, 상기 섬유아세포에 결합하는 활성을 가진 단백질은 섬유아세포와 섬유아세포 사이의 결합보다 더 약하게 섬유아세포와 결합하는 것인 방법을 제공한다.
다른 양상은 섬유아세포가 액체 배지 중에서 섬유아세포에 결합하는 활성을 가진 단백질이 코팅된 표면을 갖는 배양 용기의 표면에 접착되고, 상기 섬유아세포에 결합하는 활성을 가진 단백질은 섬유아세포와 섬유아세포 사이의 결합보다 더 약하게 섬유아세포와 결합하는 것인, 섬유아세포집합체 형성을 위한 배양 용기를 제공한다.
본 발명에서 용어 "섬유아세포(fibroblast)"('섬유세포'와 호환적으로 사용됨)는 섬유성 결합조직의 성분을 이루는 세포로 포유류의 결합조직의 세포를 의미할 수 있다. 섬유아세포는 세포외기질 및 콜라겐을 생산할 수 있으며, 상처 치유, 예를 들면, 피부의 흉터, 화상, 욕창 또는 창상을 치료하는 역할을 수행할 수 있다.
용어 "섬유아세포집합체(fibroblast cluster)" 또는 "3차원 섬유아세포집합체" ('섬유아세포조직체'와 호환적으로 사용됨)는 2 이상의 세포가 밀집된 상태를 말하며, 조직 상태일 수도 있고, 단일 세포 상태일 수도 있다. 각각의 세포 집합체는 조직 자체 또는 일부, 또는 단일 세포의 집합체로 존재할 수 있으며, 섬유아세포 유사-조직체를 포함할 수 있다. 또한, 용어 "3차원(three-dimension)"은 2차원이 아닌 기하학적인 3개의 파라미터(예를 들면, 깊이, 넓이, 높이 또는 X, Y, Z 축) 모델을 갖는 입체를 의미할 수 있으며, 따라서 일 구체예에 따른 섬유아세포집합체는 3차원 배양, 즉 배양 용기에서 탈착되어 부유상태로 배양되어 세포가 증식함에 따라 입체적으로 구형, 시트(sheet) 또는 그와 유사한 3차원의 형태(예를 들면, 유사 조직체)를 갖는 섬유아세포집합체를 의미할 수 있다. 또한 일 구체예에 따른 섬유아세포집합체는 조직공학기술로 인공적인 3차원 다공성 세포외기질, 예를 들면, 시트, 하이드로겔, 막, 스캐폴드 등과 같은 생분해성 합성 고분자 혹은 천연 고분자 지지체를 사용할 필요 없이, 그 자체로서 3차원 섬유아세포집합체가 형성되는 것을 의미할 수 있으며, 상기 조직공학기술은 세포가 아닌 매트릭스가 3차원인 것으로 일 구체예에 따른 3차원 섬유아세포집합체와는 구별된다.
상기 섬유아세포의 배양 용기에의 파종은 배양 용기에 섬유아세포를 첨가하는 것, 또는 배양 용기에 섬유아세포를 접착시키는 것을 포함하는 섬유아세포를 배양 용기에서 배양하기 위해 수행되는 모든 행위를 포함할 수 있다.
용어 "세포의 접착 또는 세포의 결합"은 세포와 세포 사이의 접착 또는 결합 및 세포와 배양 용기 또는 생체재료의 표면 사이의 접착 또는 결합을 포함하는 의미로 사용될 수 있다. 배양 용기 또는 생체재료의 표면에서 일어나는 세포의 접착 또는 결합은 다양한 메카니즘을 가질 수 있다. 예를 들면, 생물학적 인식을 매개로 하는 특이적 세포접착 및 정전기적 혹은 표면에너지에 의해 좌우되는 비특이적 세포접착이 있다. 특이적인 세포접착은 세포외기질(extracellular matrix;ECM) 단백질인 콜라겐, 피브로넥틴, 라미닌 등에 존재하는 특정의 펩타이드(예, arginine-glycine-aspartid acid;RGD)를 세포막에 존재하는 수용체에 의해 결합시켜 일어나는 접착을 의미할 수 있다. 비특이적인 세포접착은 전기적으로 음성을 띠는 인지질을 갖는 세포막이 접착하는 표면을 전기적으로 양성을 띠게하여 세포의 접착이 유도되는 접착을 의미할 수 있다.
배양 용기는 소수성을 띠는 표면, 예를 들면 물 접촉각이 90 내지 150˚인 표면을 포함할 수 있으며, 섬유아세포에 접착 또는 결합 활성을 갖는 단백질이 표면에 코팅된 것일 수 있다. 상기 개질된 표면을 갖는 배양 용기는 세포-세포 사이의 결합보다 세포-접착 기질(예를 들면, 배양 용기의 표면에 코팅된 세포와 결합하는 활성을 갖는 단백질 또는 성장 인자) 사이의 결합이 더 약하게 유도되는 표면을 포함할 수 있다. 상기 섬유아세포는 혈액세포와는 달린 세포외기질에 접착하여 생육하는 상피세포 혹은 중간엽세포와 같은 접착의존성 세포로서, 접착 기질에 세포가 접착하지 않으면 세포사가 유도되며, 이러한 세포사를 아노이키스(anokis)라고 한다. 일 구체예에 따른 배양 방법은 세포-접착 기질 사이의 접착 또는 결합에 있어, 세포사가 유도되지 않으면서, 세포-접착 기질 사이의 접착 또는 결합을 세포-세포 사이의 접착 또는 결합에 비해 약하게 유도함으로써, 2 차원 단층으로 배양이 되지 않는다. 즉, 상기 섬유아세포는 배양 초기에는 약한 세포-접착 기질 사이의 접착 또는 결합이 유도되고, 세포-세포 사이의 접착 또는 결합이 유도되어 이러한 세포 사이의 결합에 의해 2차원 섬유아세포집합체가 형성되고, 배양 시간이 길어짐에 따라 2차원 섬유아세포집합체는 배양 용기 표면에서 탈착 또는 이탈이 되고, 탈착 또는 이탈된 2차원 섬유아세포집합체가 배양 용기에서 부유된 상태로 계속해서 배양되어 3차원의 섬유아세포 집합체를 형성할 수 있다.
상기 세포-세포 사이의 접착 또는 결합보다 세포-접착 기질(예를 들면, 배양 용기의 표면에 코팅된 세포와 결합하는 활성을 갖는 단백질 또는 성장 인자) 사이의 접착 또는 결합이 더 약하게 유도될 수 있도록 배양 용기의 표면을 개질하는 방법은 섬유아세포와 결합하는 활성을 가진 단백질을 사용함으로써 유도될 수 있다.
상기 세포-접착 기질 사이의 접착 또는 결합은 섬유아세포의 세포막에 존재하는 인테그린(integrin)과 결합하는 단백질, 예를 들면, 콜라겐, 피브로넥틴, 라미닌 등을 사용할 경우 강하게 유도된다. 용어 "인테그린(integrin)"은 세포막에 존재하여 피브로넥틴, 콜라겐등의 세포외기질에 세포가 접착할 때 작용하는 수용체분자를 의미할 수 있으며, α 또는 β 두 개의 소단위 헤테로 2 합체로 구성되는 막관통형 당단백질로, 모든 유형의 인테그린을 포함할 수 있다. 따라서, 상기 섬유아세포에 결합하는 활성을 가진 단백질은 배지 중에서 섬유아세포와 피브로넥틴이 결합하는 것보다 상기 섬유아세포와 더 약하게 결합되는 것일 수 있다. 또한, 상기 섬유아세포에 결합하는 활성을 가진 단백질은 배지 중에서 섬유아세포와 피브로넥틴이 결합하는 것보다 상기 섬유아세포와 60 내지 95%의 활성으로 결합되는 것일 수 있으며, 예를 들면, 60, 70, 80, 90, 또는 95% 일 수 있다. 따라서, 상기 섬유아세포에 결합하는 활성을 가진 단백질은 인테그린과 결합하지 않는 단백질을 포함할 수 있다. 또한, 일 구체예에 있어서, 상기 인테그린과 결합하지 않는 단백질은 섬유아세포의 세포막에 존재하는 헤파란 설페이트 프로테오글리칸(heparan sulfate proteoglycan)에 결합하는 단백질을 포함할 수 있다. 일 구체예에 있어서, 상기 헤파란 설페이트 프로테오글리칸과 결합하는 단백질은 섬유아세포성장인자(FGF)일 수 있다. 또한, 상기 단백질은 5 내지 100 ㎍/ml의 농도로 배양 용기 표면에 고정되는 것일 수 있다.
상기 용어 "섬유아세포성장인자(Fibroblast growth factor, FGF)"는 성장 인자의 한 종류로, 섬유아세포를 자극하여 증식성을 유도하는 성장인자를 의미할 수 있다. 섬유아세포성장인자는 헤파린 결합(heparin-binding) 단백질로, 상기한 바와 같이 섬유아세포의 헤파란 설페이트 프로테오글리칸과 상호작용을 할 수 있다. FGF는 22개의 종류를 포함할 수 있으며, 예를 들면, FGF 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 또는 22를 포함할 수 있다. 상기 FGF의 종류는 이름이 다를지라도, 통상의 당업자가 동일한 단백질을 의미하는 것으로 인식될 수 있다면 모두 포함할 수 있다. 예를 들면, FGF 11, 12, 13 및 14는 "iFGF" 라고도 알려져 있으며, FGF 15는 "FGF 15/19" 라고도 알려져 있다. 또한, 예를 들면, FGF 1 또는 FGF 2는 "헤파린 결합 성장인자 1(heparin-binding growth factor 1, HBGF-1" 또는 "헤파린 결합 성장인자 2(heparin-binding growth factor 2, HBGF-2"를 포함할 수 있다.
배양 용기 표면에 대한 상기 섬유아세포에 결합하는 활성을 가진 단백질의 고정화는 폴리펩티드를 고체 기질 표면에 고정하는데 이용되는 것으로 당해 기술분야에 공지된 모든 방법에 의해 달성될 수 있는데, 예를 들면, 물리적인 흡착, 비선택적인 화학반응에 의한 공유결합 등을 이용할 수 있다. 이러한 고정화 방법의 예로는, 단백질에 바이오틴(biotin)을 결합시킨 후, 이 단백질을 스트렙타비딘(streptavidin)이나 아비딘(avidin)으로 처리된 고체 표면에 적용시킴으로써 바이오틴-스트렙타비딘/아비딘 결합을 이용하여 단백질을 고정하는 방법; 플라즈마를 이용하여 기판 위에 활성기(화학결합에 의해 단백질을 고정하기 위한 화학적 작용기)를 집적시켜 단백질을 고정하는 방법; 고체 기판 표면에 졸-겔(sol-gel)법을 이용하여 비표면적이 충분히 증가된 다공성 졸-겔 박막을 형성한 후에, 상기 다공성 박막에 물리적인 흡착에 의해 단백질을 고정하는 방법; 플라즈마 반응에 의하여 폴리테트라플루오로에틸렌(PTFE) 표면에 항혈전성 단백질을 고정하는 방법; 양이온성 아미노 잔기가 2개의 효소에 2개 이상 연속적으로 융합된 효소를 결합시켜 단백질을 고정하는 방법; 기질을 이용하여 고체상 지지대에 결합되어 있는 소수성 고분자 층에 단백질을 고정하는 방법; 플라스틱 표면에서 완충성분을 이용하여 단백질을 고정하는 방법; 알코올 용액에서 소수성 표면을 가지는 고체 표면에 단백질을 접촉시켜 단백질을 고정하는 방법 등을 포함할 수 있다.
또한, 재조합적으로 대량 발현 및 용이한 정제가 가능한 폴리펩티드 링커를 사용하여 상기 폴리펩티드 링커의 카르복실 말단에 성장인자(예를 들면, FGF)의 아미노 말단이 융합되어 있는 폴리펩티드 링커-성장인자(예를 들면, FGF) 재조합 단백질 형태로 고정화를 수행할 수 있다. 상기 성장인자를 폴리펩티드 링커를 이용하여 성장인자 본래의 생물학적 활성을 유지하면서 재조합 단백질 형태로 소수성 표면에 고정시킨 후 고정된 성장인자의 섬유아세포에 대한 접착활성을 이용하여 상기 표면에 섬유아세포를 접착시킴으로써 섬유아세포의 효율적인 배양을 도모할 수 있다.
본 발명에 적합한 폴리펩티드 링커는 그의 카르복실 말단을 통해 성장인자의 아미노 말단과 결합하고 그의 아미노 말단에 존재하는 소수성 도메인을 통해 소수성 표면을 갖는 배양 용기에 흡착할 수 있는 것으로서, 재조합적으로 대량 발현 및 용이한 정제가 가능하고 섬유아세포의 배양에 영향을 미치지 않는 것이면 어느 것이든 사용할 수 있다. 폴리펩티드 링커로는 에를 들면, 말토오스 결합 단백질(maltose-binding protein, MBP), 하이드로포빈 (hydrophobin), 소수성 세포 투과성 펩티드(hydrophobic cell penetrating peptides, CPPs) 등을 포함할 수 있다.
MBP(NCBI GenBank Accession No. AAB59056)는 대장균(Escherichia coli)의 세포막을 가로질러 원형질막공간에 위치하며 세포 내로 말토오스나 말토덱스트린(maltodextrin)과 같은 당류의 이동에 관여하는 막 주변(periplasm) 단백질을 의미할 수 있다. MBP는 유용한 외래 단백질을 재조합 단백질 형태로 생산하기 위해 주로 이용되는데, 세포 내의 유전자 malE로부터 해독되어 만들어지고, 클로닝된 malE 유전자의 하부 (downstream)에 외래 단백질의 유전자를 삽입하여 세포 내에서 발현시키면 2개의 단백질이 결합한 재조합 단백질을 손쉽게 대량으로 생산할 수 있다. 특히, 발현시키고자 하는 단백질의 크기가 작거나 다른 숙주세포 내에서는 그 안정성이 떨어지는 외래 단백질인 경우, 이와 같이 MBP를 이용하여 재조합 단백질 형태로 세포 내에서 발현시키는 것이 유리할 수 있다. 이처럼 malE 유전자가 결합된 유전자로부터 발현되는 외래 단백질은 MBP가 말토오스에 결합 친화력을 갖는다는 특성을 이용하여 분리할 수 있다. 예를 들어, 말토오스가 다중화된 형태인 아밀로스(amylose)가 코팅된 수지와 세포 파쇄액을 반응시키고, 반응시킨 수지를 수차례 세척하여 오염된 다른 단백질을 제거한 후, 고농도의 말토오스를 첨가하여 경쟁시킴으로써 원하는 단백질만을 간단하게 용출시킬 수 있다.
상기 MBP-세포 접착 기질(예를 들면, 성장인자) 재조합 단백질은 당업계의 통상적인 화학적 합성 또는 유전자 재조합 기술 등을 이용하여 제조하거나, 이를 발현하는 형질전환 세균을 적절한 조건 하에서 배양한 후 배양액으로부터 재조합 단백질을 회수함으로써 수득될 수 있다. 이와 같이 수득된 MBP-세포 접착 기질 재조합 단백질을 소수성 표면을 갖는 배양 용기에 고정시키는 과정은 특별한 처리를 요구하지 않고 재조합 단백질에서 폴리펩티드 링커의 아미노 말단에 위치한 소수성 도메인을 이용한 소수성 표면과의 물리적 흡착에 의해 자발적으로 이루어질 수 있다.
또한, 상기 세포-세포 사이의 접착 또는 결합보다 세포-접착 기질(예를 들면, 섬유아세포에 결합하는 활성을 가진 단백질) 사이의 접착 또는 결합이 더 약하게 유도될 수 있도록 하는 방법은 섬유아세포와 기질(예를 들면, 배양 용기의 표면) 사이의 접착 또는 결합을 약화시키는 물질을 처리함으로써 유도될 수 있다.
상기 표면이 소수성을 띠는 배양 용기, 예를 들면 물 접촉각이 90 내지 150˚인 표면을 갖는 배양 용기는 통상적인 세포 배양 용기에 소수성을 부여하는 고분자로 표면 처리되거나 그러한 고분자로 제조된 세포 배양 용기일 수 있다. 이러한 소수성 고분자로는, 이에 한정되는 것은 아니지만, 폴리스티렌(polystyrene), 폴리메틸메타크릴레이트(PMMA), 폴리에틸렌 테레프탈레이트(PET), 폴리비닐클로라이트(PVC), 폴리에틸렌(PE), 폴리프로필렌(PP), 폴리테트라플루오르에틸렌(PTFE), 지방족 폴리에스테르계 고분자로서, 폴리(L-락트산)(PLLA), 폴리(D,L-락트산）(PDLLA), 폴리(글리콜산)(PGA), 폴리(카프로락톤)(PCL), 폴리(하이드록시알카노에이트), 폴리다이옥산온(PDS), 폴리트라이메틸렌카보네이트 중에서 선택된 1 종이거나, 또는 이들 단위들의 공중합체인 폴리(락트산-co-글리콜산)(PLGA), 폴리(L-락트산-co-카프로락톤)(PLCL), 폴리(글리콜산-co-카프로락톤)(PGCL), 이들의 유도체 등을 예로 들 수 있다. 또한 일 구체예에 따른 적합한 배양 용기는 소수성 표면으로 실란화된 표면(silanized surface), 탄소나노튜브(CNT) 표면, 탄화수소 코팅된 표면(hydrocarbon coated surface), 금속(예컨대, 스테인레스 스틸, 티탄, 금, 백금 등) 표면을 갖는 것일 수 있다.
상기 섬유아세포를 배양 용기에 파종하기 전에, 상기 섬유아세포는 계대 증식된 배양된 세포를 사용할 수 있다. 상기 계대 증식하는 방법은 공지의 방법에 의해 분리된 섬유아세포를 공지의 방법으로 계대 증식한 것일 수 있다. 예를 들면, 상기 분리된 섬유아세포는 이후의 3차원 섬유아세포접합체 형성에 1 계대 배양된 세포를 그대로 사용하거나, 10 계대 이상 배양된 세포를 사용할 수 있다.
상기 섬유아세포를 파종하는 농도는 1.0×104 내지 2.0×105 세포/cm2의 세포농도로 파종한 것일 수 있다. 또한, 예를 들면, 상기 세포 농도는 7.5×104 내지 1.5×105 세포/cm2, 또는 1.25×105 세포/cm2 일 수 있다. 상기 세포의 농도는 1.0×104 이상이면 3차원의 세포집합체를 형성할 수 있으며, 1.25×105 세포/cm2 이상이면 육안으로 식별이 가능한 크기의 3차원 세포집합체를 형성할 수 있다.
또한, 상기 배양 기간은 1일 내지 1주일 일 수 있다. 상기 배양에 적합한 배지는 섬유아세포의 배양 및/또는 분화에 통상적으로 사용되는 배지로서 혈청 혹은 무혈청을 함유한 것이면 어느 것이나 제한 없이 사용될 수 있으며, 예를 들면 DMEM(Dulbeco's modified eagle medium), Ham's F12, 이들의 혼합물 등에 혈청을 첨가한 배지를 사용할 수 있다.
상기한 바와 같이, 섬유아세포가 3차원 섬유아세포집합체를 형성하는 단계는 세포-접착 기질 사이의 결합에 의해 초기에 형성된 2차원 섬유아세포집합체가 배양 용기 표면에서 탈착이 되고, 탈착된 2차원 섬유아세포집합체가 배양 용기에서 부유된 상태로 계속해서 배양됨으로써, 3차원 세포 집합체를 형성할 수 있다.
배양 용기 표면에 섬유아세포를 접착시켜 배양하여 형성된 섬유아세포집합체는 육안으로 검출가능한 크기의 직경을 가지고 있어 피펫을 사용하여 분리하거나, 여과 또는 원심분리 등의 방법에 의해 용이하게 수득할 수 있다. 즉, 상기 배양 용기로부터 형성된 섬유아세포집합체를 수득하는 단계는 효소의 처리 없이 이루어질 수 있다. 이렇게 수득된 3차원 세포집합체는 콜라게나제, 트립신 또는 디스파제(dispase)를 이용한 효소학적 처리, 압력을 이용한 기계적인 처리, 또는 이들의 병용 처리에 의해 집합체 형태를 와해시켜 단일 세포 형태로 사용하거나, 3차원 세포집합체 형태 그대로 사용할 수 있다.
다른 양상은 상기의 방법에 의해 제조된 섬유아세포집합체를 제공한다.
섬유아세포집합체를 제조하는 방법에 대해서는 상기한 바와 같다.
상기 섬유아세포집합체는 육안으로 식별가능한 크기의 구형 또는 시트일 수 있으며, 예를 들면, 직경이 300 내지 2000 ㎛인 구형의 섬유아세포집합체일 수 있고, 일 구체예에 있어서, 300 내지 1000 ㎛ 일 수 있다. 상기 구형의 섬유아세포집합체의 직경은 일 구체예에 따른 배양 방법에 의해 통상의 당업자가 육안으로 식별가능한 크기로 조절할 수 있다. 또한 일 구체예에 따른 구형의 섬유아세포집합체는 직경 400 ㎛ 내에 3.0×105 내지 1.0×106 개의 섬유세포를 포함할 수 있다. 또한 일 구체예에 있어서, 상기 섬유아세포집합체는 상피세포성장인자(EGF), 세포외기질(ECM) 또는 혈관내피성장인자(VEGF)를 분비할 수 있다.
따라서, 일 구체예에 따른 섬유아세포집합체는 세포치료제 또는 생리활성물질의 공급시에 세포원(source)로서 유용하게 사용될 수 있으며, 이하, 상기 섬유아세포집합체의 용도는 다음과 같다.
다른 양상은 일 구체예에 따른 섬유아세포집합체를 포함하는 피부 재생 또는 혈관 신생을 위한 세포치료제를 제공한다.
또한, 일 구체예에 따른 섬유아세포집합체 또는 그의 배양액을 유효성분으로 포함하는 피부 흉터, 화상, 욕창, 또는 허혈성 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
상기한 바와 같이, 섬유아세포집합체는 상피세포성장인자, 세포외기질 또는 혈관내피성장인자를 분비할 수 있기 때문에, 이를 필요로 하는 개체에 이식되어 세포원으로서의 역할을 수행함으로써 피부 재생, 또는 혈관 신생을 촉진할 수 있다. 또한 피부 재생 또는 혈관 신생을 촉진함으로써, 피부 흉터, 화상, 욕창 또는 허혈성 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물에도 유용하게 이용될 수 있다. 상기 허혈성 질환은 예를 들면, 허혈성 심장질환, 허혈성 심근경색, 허혈성 심부전, 허혈성 장염, 허혈성 혈관질환, 허혈성 안질환, 허혈성 망막증, 허혈성 녹내장, 허혈성 신부전, 허혈성 대머리, 허혈성 뇌졸중 및 허혈성 하지질환을 포함하는 것일 수 있다.
일 구체예 따른 세포치료제 또는 약학적 조성물의 투여량은 유효성분인 세포집합체를 구성하는 섬유아세포집합체를 기준으로 1.0× 105 내지 1.0× 108 세포/kg(체중), 또는 1.0× 107 내지 1.0× 108 세포/kg(체중)일 수 있다. 다만, 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성별, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있고, 당업자라면 이러한 요인들을 고려하여 투여량을 적절히 조절할 수 있다. 투여 횟수는 1회 또는 임상적으로 용인가능한 부작용의 범위 내에서 2회 이상이 가능하고, 투여 부위에 대해서도 1개소 또는 2개소 이상에 투여할 수 있다. 인간 이외의 동물에 대해서도, kg당 인간과 동일한 투여량으로 하거나, 또는 예를 들면 목적의 동물과 인간과의 기관(심장 등)의 용적비(예를 들면, 평균값) 등으로 상기의 투여량을 환산한 양을 투여할 수 있다. 일 구체예에 따른 치료의 대상동물로서는, 인간 및 그 밖의 목적으로 하는 포유동물을 예로 들 수 있고, 구체적으로는 인간, 원숭이, 마우스, 래트, 토끼, 양, 소, 개, 말, 돼지 등이 포함된다.
일 구체예에 따른 세포치료제 또는 약학적 조성물은 유효성분으로서 세포집합체와 약학적으로 허용가능한 담체 및/또는 첨가물을 포함할 수 있다. 예를 들어, 멸균수, 생리식염수, 관용의 완충제(인산, 구연산, 그 밖의 유기산 등), 안정제, 염, 산화방지제(아스코르브산 등), 계면활성제, 현탁제, 등장화제, 또는 보존제 등을 포함할 수 있다. 국소 투여를 위해, 생체고분자(biopolymer) 등의 유기물, 하이드록시아파타이트 등의 무기물, 구체적으로는 콜라겐 매트릭스, 폴리락트산 중합체 또는 공중합체, 폴리에틸렌글리콜 중합체 또는 공중합체 및 그의 화학적 유도체 등과 조합시키는 것도 바람직하다. 일 구체예에 따른 세포치료제 또는 약학적 조성물이 주사에 적당한 제형으로 조제되는 경우에는, 세포집합체가 약학적으로 허용가능한 담체 중에 용해되어 있거나 또는 용해되어 있는 용액상태로 동결된 것일 수 있다.
일 구체예에 따른 세포치료제 또는 약학적 조성물은 그 투여방법이나 제형에 따라 필요한 경우, 현탁제, 용해보조제, 안정화제, 등장화제, 보존제, 흡착방지제, 계면활성화제, 희석제, 부형제, pH 조정제, 무통화제, 완충제, 환원제, 산화방지제 등을 적절히 포함할 수 있다. 상기에 예시된 것들을 비롯하여 본 발명에 적합한 약 학적으로 허용되는 담체 및 제제는 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., 1995]에 상세히 기재되어 있다.
일 구체예에 따른 세포치료제 또는 약학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질 중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 분말, 과립, 정제 또는 캡슐 형태일 수 있다.
또한 다른 양상은 일 구체예에 따른 섬유아세포집합체가 생분해성 고분자 스캐폴드에 적재(loading)된 조직공학용 지지체를 제공한다.
상기한 바와 같이, 일 구체예에 따른 섬유아세포집합체는 상피세포성장인자, 세포외기질 또는 혈관내피성장인자를 분비할 수 있기 때문에, 스캐폴드에 적재된 상태로 이를 필요로 하는 개체에 이식되어 피부 재생, 또는 혈관 신생을 촉진할 수 있다. 상기 조직공학용 지지체는 생분해성 고분자를 성형하여 만든 지지체에 섬유아세포집합체가 적재되어 있는 것일 수 있다.
상기 생분해성 고분자는 생체 내에서 일정 기간 후 자발적으로 서서히 분해되는 것으로, 생체적합성, 혈액친화성, 항석회화 특성, 세포의 영양성분 및 세포간 기질 형성능 중에서 하나 이상의 특성을 갖춘 고분자를 포함할 수 있다. 이러한 생분해성 고분자는 본 발명에서 특별히 그 종류를 한정하지는 않으나, 대표적으로 피브린, 콜라겐, 젤라틴, 키토산, 알지네이트, 히알루론산, 덱스트란, 폴리락트산, 폴리글리콜산(poly(glycolic acid), PGA), 폴리(락트산-co-글리콜산)(poly(lactic-co-glycolic acid), PLGA), 폴리-ε-(카프로락톤), 폴리안하이드리드, 폴리오르토에스테르, 폴리비닐알코올, 폴리에틸렌글리콜, 폴리우레탄, 폴리아크릴산, 폴리-N-이소프로필아크릴아마이드, 폴리(에틸렌옥사이드)-폴리(프로필렌옥사이드)-폴리(에틸렌옥사이드) 공중합체, 이들의 공중합체, 이들의 혼합물 등이 사용될 수 있다. 이때 복합 지지체 중의 생분해성 고분자의 함량은 지지체의 성형의 관점 또는 세포집합체의 적재의 관점에서 5 내지 99 중량%인 것일 수 있다. 상기 복합 지지체는 기존의 공지된 방법, 예를 들어, 염 침출법(solvent-casting and particle-leaching technique), 가스발포법(gas forming technique), 고분자 섬유를 부직포로 만들어 고분자 메쉬(mesh)로 제조하는 방법(fiber extrusion and fabric forming process), 상분리법(thermally induced phase separation technique), 유화 동결 건조법(emulsion freeze drying method), 고압 기체 팽창법(high pressure gas expansion) 등에 따라 생분해성 고분자를 성형하여 제조할 수 있다.
상기와 같이 성형 제조된 지지체는 적재된 세포집합체를 이식된 조직 내로 전달하고, 3차원적으로 세포가 부착 성장하여 새로운 조직이 형성되도록 하는 역할을 할 수 있다. 이때 복합 지지체에 세포가 부착 성장되는 측면에서, 지지체의 공극의 크기와 구조가 영향을 미칠 수 있는데, 영양액이 지지체 내부까지 고르게 침투하여 세포가 잘 성장될 수 있도록 하기 위해서는 공극이 서로 연결된(inter-connecting) 구조를 갖는 것일 수 있다. 또한, 상기 지지체에서 공극은 50 내지 600 ㎛의 평균 직경을 갖는 것일 수 있다.
또 다른 양상은 일 구체예에 따른 섬유아세포집합체를 포함하는 약물 스크리닝용 3차원 배양 시스템을 제공한다.
상기 3차원 섬유아세포집합체는 생체 내 환경을 모방한 인위적인 세포 형태를 갖는 것으로서, 실제의 세포 형태 및 기능 연구, 또는 치료제(예를 들면, 상기의 피부 질환 또는 혈관 질환) 등에 유용하게 사용될 수 있다. 따라서, 상기 3차원 섬유아세포집합체를 포함하는 약물 스크리닝용 3차원 배양 시스템은 의약품 또는 화장품 등의 질병 치료제 효능 테스트, 또는 염증 및 알레르기 테스트 등을 위한 실험에 있어서, 동물실험을 대체할 수 있다.
또 다른 양상은 섬유아세포로부터 배양된 섬유아세포집합체를 포함하는 인 비트로(In vitro) 3차원 피부 진피 모델을 제공한다.
다른 양상은 섬유아세포로부터 배양된 섬유아세포집합체를 포함하는 약물, 예를 들면, MMP 저해제 또는 세포 내 콜라겐의 발현 또는 활성 증가제를 스크리닝하기 위한 인 비트로(In vitro) 모델을 제공한다.
다른 양상은 섬유아세포를 섬유아세포에 결합하는 활성을 가진 단백질이 코팅된 표면을 갖는 배양 용기 중의 액체 배지 중에서 배양하여, 상기 표면으로부터 섬유아세포가 이탈되어 형성된 섬유아세포집합체(fibroblast cluster)를 포함하는 배양물을 얻는 단계로서, 상기 섬유아세포에 결합하는 활성을 가진 단백질은 섬유아세포와 섬유아세포 사이의 결합보다 더 약하게 섬유아세포와 결합하는 것인 단계; 및 상기 배양물로부터의 섬유아세포집합체를 적어도 12시간 동안 추가적으로 배양하는 단계를 포함하는 포함하는 인 비트로 3차원 피부 피부 모델, 또는 MMP 저해제 또는 세포 내 콜라겐의 발현 또는 활성 증가제를 스크리닝하기 위한 인 비트로(In vitro) 모델을 제조하는 방법을 제공한다.
상기 섬유아세포집합체 및 그의 제조방법에 대해서는 상기한 바와 같다.
일 구체예에 있어서, 본 명세서는 섬유아세포로부터 배양된 섬유아세포집합체를 포함하는 약물 스크리닝을 위한 조성물 또는 모델을 제공할 수 있다. 상기 약물은 피부 노화 개선제, 염증성 질환, 관절염 또는 암 치료제일 수 있다. 따라서, 예를 들면, 섬유아세포로부터 배양된 섬유아세포집합체를 포함하는 인 비트로 3차원 피부 진피 모델은 피부 노화 개선제, 염증성 질환, 관절염, 또는 암 치료제의 스크리닝을 위한 것일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 섬유아세포 집합체는 피부의 노화에 따른 병리학적 특성을 타나내는 것일 수 있다. 예를 들면, 상기 섬유아세포집합체는 콜라겐의 발현 또는 활성이 감소되어 있거나, 또는 매트릭스 메탈로프로테아제(matrix metalloproteinase: MMP)의 발현 또는 활성이 증가되어 있는 것일 수 있다. 상기 섬유아세포집합체는 추가적으로 피브로넥틴의 발현 또는 활성이 감소되어 있거나, 또는 엘라스틴의 발현 또는 활성이 증가되어 있는 것일 수 있다. 본 명세서에서 상기 발현 또는 활성의 감소 또는 증가는 정상세포에 비해 또는 2차원적으로 배양된 섬유아세포에 비해 상기 언급된 단백질 또는 유전자의 발현 또는 활성이 감소 또는 증가되어 있는 것을 의미할 수 있다. 상기 콜라겐은 콜라겐 타입 I, II, III, IV, V, VI, VII, VIII, IX, X, XI, XII, XIII, 또는 XIV를 포함할 수 있다. 또한, 상기 MMP는 MMP 1 내지 28 중 어느 하나 이상을 포함할 수 있다.
상기 배경기술에 언급되었듯이, 상기 콜라겐의 감소는 피부 조직에의 섬유질 성분 합성 및 수분의 손실, 및 각질층의 변화를 일으킬 수 있다. 또한 상기 콜라겐은 MMP에 의해 분해될 수 있다. 따라서 콜라겐의 발현 또는 활성이 감소된, 또는 MMP의 발현 또는 활성이 증가된 일 구체예에 따른 섬유아세포집합체는 피부의 노화를 개선하기 위한 약물을 스크리닝하는데 유용하게 사용될 수 있다. 예를 들면, 상기 피부의 노화를 개선하기 위한 약물은 피부의 보습 효과, 탄력의 증가, 주름의 감소, 및 항산화 활성을 갖는 약물을 포함할 수 있다. 또한, 상기 MMP는 세포외기질을 분해하고, 그에 의해 종양 전이 및 진행을 촉진할 수 있고, 그에 의한 콜라겐 합성 및 분해는 암 전이에서 역할을 할 수 있다. 또한, MMP는 염증성 질환, 예를 들면, 관절염, 또는 암, 예를 들면 암 전이 등과 같은 병리학적 조건에서 과발현되는 것으로 알려져 있으며, MMP를 타겟으로 하는 MMP 억제제는 상기와 같은 질환의 치료제로서 개발되고 있다. 따라서, 따라서 콜라겐의 발현 또는 활성이 감소된, 또는 MMP의 발현 또는 활성이 증가된 일 구체예에 따른 섬유아세포집합체는 염증성 질환, 관절염, 또는 암 치료제를 스크리닝하는데 유용하게 사용될 수 있다. 상기 염증성 질환은 피부염, 결막염, 복막염, 치주염, 비염, 중이염, 인후염, 편도염, 폐렴, 위궤양, 위염, 크론병, 대장염, 치질, 통풍, 강직성 척추염, 류마티스 열, 루푸스, 섬유근통 (fibromyalgia), 건선관절염, 골관절염, 류마티스 관절염, 견관절주위염, 건염, 건초염, 건주위염, 근육염, 간염, 방광염, 신장염, 쇼그렌 증후군(sjogren's syndrome), 다발성 경화증, 및 급성 및 만성 염증 질환으로 이루어진 군으로부터 선택된 것일 수 있다. 또한 상기 관절염은 골관절염, 또는 류마티스 관절염일 수 있다. 상기 암 치료제는 암 자체의 세포의 증식을 억제하는 물질을 포함할 뿐만 아니라, 암의 전이를 억제하는 물질도 포함할 수 있다.
상기 섬유아세포로부터 섬유아세포집합체로의 배양은 상기 섬유아세포를 표면이 소수성을 띠는 배양용기에 접착시켜 배양함으로써 분화시킬 수 있다. 상세하게는 상기 섬유아세포를 표면이 소수성을 띠는 배양용기에 접착시켜 배양하면 상기 접착된 섬유아세포의 밀도가 증가함에 따라 섬유아세포가 배양용기로부터 탈착되어 섬유아세포집합체를 형성하게 된다. 또한, 상기 배양은 섬유아세포집합체로 배양된 후, 또는 섬유아세포집합체가 형성된 후, 추가적으로 적어도 12시간 이상, 또는 적어도 1일 이상, 예를 들면 12시간 내지 15일, 1일 내지 15일, 3일 내지 10일, 3일 내지 7일, 또는 5일 내지 7일 더 배양된 것일 수 있다. 상기 배양에 적합한 배지는 섬유아세포의 배양 및/또는 분화에 통상적으로 사용되는 배지로서 혈청 혹은 무혈청을 함유한 것이면 어느 것이나 제한 없이 사용될 수 있으며, 예를 들면 DMEM(Dulbeco's modified eagle medium), Ham's F12, 이들의 혼합물 등에 혈청을 첨가한 배지를 사용할 수 있다. 상기 배양하여 세포집합체를 형성하는 방법의 상세한 설명은 후술한다.
일 구체예에 따른 섬유아세포로부터 배양된 섬유아세포집합체는 3차원적으로 배양된 것이기 때문에 생체 내 환경을 잘 모사할 수 있으며, 세포외기질을 포함하고 있어, 인 비트로 피부 진피 모델로 유용하게 사용될 수 있다. 본 명세서에서 용어 "피부 진피 모델(skin dermis model)"('인공 진피(dermal equivalent)'와 호환적으로 사용됨)은 진피 조직 또는 진피의 구조나 형상을 모식화한 것을 의미할 수 있으며, 진피 내 세포간의 상호작용, 구조나 형태와의 관련성을 밝히기 위해 고려된 모형을 의미할 수 있다.
다른 양상은 상기 섬유아세포집합체 또는 인 비트로 3차원 피부 진피 모델에 피검 물질을 처리하는 단계; 상기 피검 물질이 처리됨 섬유아세포집합체 또는 피부 진피 모델의 MMP의 발현 또는 활성의 수준을 측정하는 단계; 측정된 MMP의 발현 또는 활성의 수준을 무처리 대조군의 수준과 비교하는 단계; 및 대조군에 비하여 MMP의 발현 또는 활성을 감소시킨 물질을 선별하는 단계를 포함하는 MMP의 발현 또는 활성을 감소시키는 물질을 스크리닝하는 방법을 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 상기 섬유아세포집합체 또는 인 비트로 3차원 피부 진피 모델에 피검 물질을 처리하는 단계; 상기 피검 물질이 처리됨 섬유아세포집합체 또는 피부 진피 모델의 콜라겐의 발현 또는 활성의 수준을 측정하는 단계; 측정된 콜라겐의 발현 또는 활성의 수준을 무처리 대조군의 수준과 비교하는 단계; 및 대조군에 비하여 콜라겐의 발현 또는 활성을 증가시킨 물질을 선별하는 단계를 포함하는 콜라겐의 발현 또는 활성을 증가시키는 물질을 스크리닝하는 방법을 제공하는 것이다.
상기 스크리닝 방법에 있어서, 피검 물질은 저분자 화합물, 항체, 안티센스 뉴클레오티드, 작은 간섭 RNA(short interfering RNA), 짧은 헤어핀 RNA(short hairpin RNA), 핵산, 단백질, 펩티드, 기타 추출물 및 천연물로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.
상기 피검 물질을 처리하는 단계는 상기 섬유아세포집합체 또는 인 비트로 3차원 피부 진피 모델과 피검 물질을 접촉시키는 단계를 포함할 수 있다. 상기 접촉은 예를 들면, 하나 이상의 섬유아세포집합체 또는 인 비트로 3차원 피부 진피 모델이 포함되어 있는 각 웰에, 일정 농도의 피검 물질을 포함하는 용액을 주입하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 MMP 또는 콜라겐의 발현 또는 활성 수준의 측정은 역전사 중합효소 연쇄반응(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction, RT-PCR), 효소면역분석법(ELISA), 면역조직화학, 웨스턴 블롯(Western Blotting) 면역침강(immunoprecipitation), 면역형광법(immunofluorescence) 및 유세포 분석법(FACS)으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나로 측정하는 것일 수 있다. 또한 상기 MMP 또는 콜라겐의 발현 또는 활성 수준의 측정은 배양액 중 분비된 MMP 또는 콜라겐의 함량을 측정하는 것을 포함할 수 있다. 상기 배양액 중 콜라겐의 함량의 측정은 히드록시프롤린 어세이를 통해 측정하는 것일 수 있다.
상기 측정된 MMP의 발현 또는 활성의 수준을 무처리 대조군의 수준과 비교하여, 대조군에 비하여 MMP의 발현 또는 활성을 감소시킨 물질을 MMP의 발현 또는 활성 억제제 물질 또는 후보 물질로 선별할 수 있다. 상기 MMP의 발현 또는 활성을 감소기키는 물질 또는 후보 물질은 피부 노화 개선제 또는 암 치료제일 수 있다. 또한, 상기 측정된 콜라겐의 발현 또는 활성의 수준을 무처리 대조군의 수준과 비교하여, 대조군에 비하여 콜라겐의 발현 또는 활성을 증가시킨 물질을 콜라겐의 발현 또는 활성 억제제 물질 또는 후보 물질로 선별할 수 있다. 상기 콜라겐의 발현 또는 활성을 감소시키는 물질 또는 후보 물질은 피부 노화 개선제 또는 암치료제 일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 섬유아세포로부터 배양된 섬유아세포집합체는 콜라겐의 발현 또는 활성이 감소되어 있거나, 또는 MMP의 발현 또는 활성이 증가되어 있어, 일 구체예에 따른 섬유아세포집합체는 콜라겐 또는 MMP의 발현 또는 활성과 관련된 물질을 스크리닝하는데 유용하게 사용될 수 있다.
다른 구체예에 있어서, 본 명세서는 하나 이상의 웰을 갖는 웰 플레이트를 포함하고, 상기 웰에 하나 이상의 상기 섬유아세포집합체가 파종된 약물 스크리닝 장치가 제공된다. 상기 섬유아세포집합체에 대해서는 상기한 바와 같다.
또한, 상기 약물 스크리닝 장치의 각 웰에 후보 물질을 포함하는 용액을 주입하는 단계; 상기 후보 물질이 주입된 웰을 포함하는 웰 플레이트를 배양하는 단계; 상기 웰 플레이트로부터 상기 섬유아세포집합체를 수집하거나 또는 상기 웰 플레이트로부터 배양액을 회수하는 단계; 및 상기 수집된 섬유아세포로부터 어세이를 수행하거나 또는 상기 배양액으로부터 어세이를 수행하는 단계를 포함하는 약물 스크리닝하는 방법이 제공된다. 상기 후보 물질은 동일하거나 상이한 후보 물질일 수 있다. 상기 배양은 통상의 기술자가 임의로 배양 시간 및 온도를 결정할 수 있다. 상기 어세이는 예를 들면, 상기 배양액으로부터 ELISA를 사용하는 MMP 분비 어세이, 또는 상기 섬유아세포집합체로부터 웨스턴블랏팅, 또는 면역조직화학염색을 사용하는 ECM 분비 어세이를 포함할 수 있다.
일 양상에 따른 섬유아세포집합체 또는 그의 제조방법에 의하면, 배양 용기에서 단시간에 다량의 3차원 섬유아세포집합체를 용이하게 수득할 수 있고, 세포외기질에 둘러싸인 3차원 섬유아세포집합체를 세포원으로서 섬유 세포의 손상 없이 주사 제제로 생체 내 이식이 가능한 효과가 있다.
다른 양상에 따른 인 비트로 3차원 피부 진피 모델 및 그를 사용하여 약물을 스크리닝 하는 방법은 3차원 세포 집합체로 이루어져 있어 구조적, 기능적인 복잡성을 갖는 피부의 생체 내 환경을 잘 모방할 수 있을 뿐만 아니라, MMP 또는 콜라겐을 포함하는 세포외기질과 관련된 물질을 고속(high-throughput)으로 스크리닝할 수 있는 효과가 있다.
도 1은 일 구체예에 따른 3차원 섬유아세포집합체의 제작 과정을 도식적으로 나타낸 도면이다.
도 2는 일 구체예에 따른 섬유아세포의 세포접착률을 단백질 양에 따라 정량화한 그래프를 나타낸 도면이다.
도 3은 일 구체예에 따른 섬유아세포의 세포 형태 형광염색 사진을 나타낸 도면이다.
도 4는 일 구체예에 따른 섬유아세포의 FAK의 인산화 활성을 나타낸 도면이다.
도 5는 일 구체예에 따른 3차원 섬유아세포집합체 형성 사진을 나타낸 도면이다.
도 6은 일 구체예에 따른 3차원 섬유아세포집합체 형성 사진을 나타낸 도면이다.
도 7은 일 구체예에 따른 3차원 섬유아세포집합의 H&E 염색 결과를 나타낸 도면이다.
도 8은 일 구체예에 따른 3차원 섬유아세포집합체의 제1형 콜라겐 면역형광학적 염색 결과를 나타낸 도면이다.
도 9는 일 구체예에 따른 3차원 섬유아세포집합체의 VEGF 분비량을 나타낸 도면이다.
도 10은 일 구체예에 따른 3차원 섬유아세포집합체의 형성 과정을 현미경으로 관찰한 사진이다.
도 11는 일 구체예에 따른 3차원 섬유아세포집합체의 세포외기질 관련 유전자의 상대적 발현량을 나타낸 그래프이다.
도 12는 일 구체예에 따른 3차원 섬유아세포집합체의 콜라겐 함량을 히드록시프롤린 어세이로 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 13은 일 구체예에 따른 3차원 섬유아세포집합체의 콜라겐 타입 I 발현량을 면역 염색으로 측정한 결과를 나타낸 도면이다.
도 14는 일 구체예에 따른 3차원 섬유아세포집합체의 콜라겐 타입 I 발현량을 웨스턴 블랏팅으로 측정한 결과를 나타낸 도면이다.
도 15는 일 구체예에 따른 3차원 섬유아세포집합체의 MMP 1 발현량 및 분비량을 나타낸 그래프이다.
도 16은 일 구체예에 따른 3차원 섬유아세포집합체에 MMP1 저해제를 처리한 후의 세포의 MMP1 분비량을 나타낸 도면이다.
도 17은 MMP1 과발현을 유도하기 위해 자외선 조사된, 2차원에서 배양된 섬유아세포에 MMP1 저해제를 처리한 후의 세포의 MMP1 분비량을 나타낸 도면이다.
도 18은 일 구체예에 따른 3차원 섬유아세포집합체를 포함하는 약물 스크리닝 장치 및 그를 사용하여 약물을 스크리닝하는 방법을 도식화하여 나타낸 도면이다.
이하 본 발명을 실시예에 의해 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.
실시예 1: 3차원 섬유아세포집합체 형성 및 그의 특성 분석
본 실시예에서는 섬유아세포를 섬유아세포에 결합하는 활성을 갖는 단백질이 코팅된 표면을 갖는 배양 용기에서 배양하여 3차원 섬유아세포집합체를 형성하였다.
도 1은 일 구체예에 따른 3차원 섬유아세포집합체의 제작 과정을 도식적으로 나타낸 도면이다.
도 1을 참조하여 설명하면, 섬유아세포를 MBP-FGF2 코팅된 배양 용기에 파종하였다. 이후, 섬유아세포가 배양 용기 표면에서 2차원적으로 배양되면서 탈착되고, 탈착 또는 이탈된 2차원 섬유아세포집합체가 배양 용기에서 부유된 상태로 계속해서 배양되어 1일 후부터는 3차원 섬유아세포집합체가 형성되었다. 일 구체예에 따라 형성된 3차원 섬유아세포집합체는 세포외기질 및 혈관내피성장인자(VEGF) 분비능을 가진다는 것이 확인되었다. 이하에서, 도 1에 제시된 3차원 섬유아세포집합체 형성 과정 및 특성 분석 방법 및 결과를 설명한다.
(1) 섬유아세포의 세포접착 특성 및 접착 후 형태 변화 분석
3차원 섬유아세포집합체를 형성을 유도하는 배양 방법을 구축하기 위해, 섬유아세포의 세포접착 특성, 접착기질에 따른 세포접착 시그널 및 세포 형태를 분석하였다.
(1.1) 섬유아세포의 세포접착 분석
비-조직세포 배양용 96-웰 플레이트(Non-Tissue Culture Treated 96-well Plate, "NTCP", 폴리스티렌 재질로 표면이 소수성을 띰, Falcon사)에 각각 ECM 피브로넥틴(fibronectin) (20 ㎍/ml), MBP (10 ㎍/ml) , MBP-VEGF(10 ㎍/ml), MBP-HBD (100 ㎍/ml), 및 MBP-FGF2 (10 ㎍/ml)를 4시간 동안 코팅한 후 PBS로 3번 세척하였다. 그 후 100 ㎍/ml BSA를 이용해 1시간 동안 블록킹하고 PBS로 3번 세척하였다. 1 웰 당 5x104cells/cm2의 섬유아세포를 무혈청 DMEM배지에 현탁한 후 각각의 단백질이 코팅된 96 웰 플레이트에 파종하여 37℃ 배양기에서 주어진 1 시간 동안 용해한 후, 세포의 형태를 관찰하였다. 접착된 세포를 세포 용해 버퍼로 용해한 후 BCA(bicinchoninic acid) 어세이에 의해 단백질을 측정함으로서 접착된 세포를 정량하였다.
도 2는 일 구체예에 따른 섬유아세포의 세포접착률을 단백질 양에 따라 정량화한 그래프를 나타낸 도면이다.
도 2에서 나타난 바와 같이, BSA, MBP, 및 MBP-VEGF로 코팅한 NTCP에서는 세포 접착이 일어나지 않았다. 한편, MBP-FGF2로 코팅된 NTCP에서는 세포 파종 후 한 시간 후에 세포막의 인테그린과 결합하는 ECM-피브로넥틴보다 낮은 접착율을 나타내었다.
(1.2) 섬유아세포의 접착기질에 따른 세포 형태 분석
상기 실시예 1의 (1.1)에서 각각 피브로넥틴 및 MBP-FGF2로 코팅된 NTCP에서 배양된 섬유아세포의 세포의 형태를 비교하기 위하여 접착 후 30분, 1시간, 4시간 된 섬유아세포를 팔로이딘(palloidin)으로 염색하였다.
도 3은 일구체예에 따른 섬유아세포의 세포 형태 형광염색 사진을 나타낸 도면이다.
도 3에 나타난 바와 같이, MBP-FGF2에 접착된 섬유아세포는 피브로넥틴에 접착된 섬유아세포에 비해 세포골격이 활성화되지 않음을 확인할 수 있다. 이는 MBP-FGF에 접착된 섬유아세포의 접착이 피브로넥틴에 접착한 섬유아세포에 비교해서 세포막에 존재하는 세포접착분자인 인테그린(integrin)을 매개로 한 세포접착활성이 제한되어 있다는 것을 의미한다.
(1.3) 섬유아세포의 접착기질에 따른 세포접착 시그널 분석
상기 실시예 1의 (1.1)에서 각각 피브로넥틴 및 MBP-FGF2로 코팅된 NTCP에서 배양된 섬유아세포의 세포접착 시그널을 비교하기 위하여 초점 접착 키나아제 (focal adhesion kinase) (FAK)의 인산화를 측정하였다. FAK의 인산화 측정하기 위하여 접착 후 30분, 1시간, 4시간 된 섬유아세포를 항 포스포-FAK 항체(Cell signalling사)를 이용하여 웨스턴 블랏 분석을 수행하였다.
도 4는 일 구체예에 따른 섬유아세포의 FAK의 인산화 활성을 나타낸 도면이다.
도 4에 나타난 바와 같이, MBP-FGF2에 접착된 섬유아세포는 피브로넥틴에 접착된 섬유아세포에 비해 FAK의 인산화가 활성화되지 않음을 확인할 수 있다. 이는 MBP-FGF2에 접착된 섬유아세포에서 인테그린을 매개로 한 세포접착활성이 낮다는 것을 의미한다.
(2) 3차원 섬유아세포집합체 형성
실시예 1의 (1.3) 내지 (1.3)의 결과를 바탕으로, 3차원 섬유아세포직체를 형성하기 위한 배양방법을 구축하였다.
섬유아세포를 고농도 글루코즈 DMEM 배지(FGM 배지)를 함유하는 MBP-FGF2로 코팅된 폴리스틸렌 표면이 가동된 12, 24, 48, 및 96-웰 NTCP의 각 웰에 0.5×104 세포/cm2 내지 1.5×105 세포/cm2의 세포농도로 파종한 후, 37℃ 정치배양기에서 각각 1, 2, 3일간 배양하였다. 배양 초기에는 시트형태로 존재하는 섬유아세포는 시간이 지남에 따라 배양표면에서 탈착되어 1일 후부터 세포체로서 존재하여 트립신과 같은 효소처리 없이 피펫으로 쉽게 회수가 가능하다.
도 5는 일 구체예에 따른 3차원 섬유아세포집합체 형성 사진을 나타낸 도면이다.
도 5에 나타난 바와 같이, FGM을 이용하여 배양 시에 1.25×105 세포/cm2 이상의 세포 농도에서 효율적인 3차원 섬유아세포집합체 형성을 유도함을 확인할 수 있다. 이보다 낮은 세포 농도 조건에서는 세포-세포 간 상호작용을 위해 요구되는 세포 간 거리가 충분히 가깝지 않아서 세포집합체 형성이 잘 이루어지지 않을 수 있다. FGM이 아닌 배지에서도 세포집합체는 형성되나, FGM에서의 세포집합체 형성 세포 농도보다 높은 조건이 요구될 수 있다.
도 6은 일 구체예에 따른 3차원 섬유아세포집합체 형성 사진을 나타낸 도면이다.
도 6에 나타낸 바와 같이, 웰 크기에 따라 MBP-FGF2로 코팅된 표면에서 육안으로 검출되는 400 내지 1000 ㎛ 이상 크기의 3차원 구형 세포집합체를 형성함을 확인할 수 있다.
(3) 3차원 섬유아세포집합체의 분비능 분석
(3.1) 세포외기질 (ECM) 분비능 분석
실시예 1의 (2)에서 다양한 종류의 MBP-FGF2로 코팅된 웰-NTCP (12, 24, 48, 96-웰)에 1.25 ×105 cells/cm2 세포 농도로 파종하여 형성된 3차원 세포집합체를 PBS로 수회 세척하고 4% 파라포름알데히드를 30분 간 실온에서 처리함으로써 고정화하였다. 그 후 다양한 농도의 에탄올을(50~100%) 이용하여 탈수 한 후, 파라핀을 이용하여 포매하였다. 제조된 파라핀 블록은 마이크로톰을 이용해 두께 4㎛로 자르고 슬라이드 글라스에 고정시킨 후 H&E 염색 및 피브로넥틴과 콜라겐 타입 1에 대한 면역학적 염색을 수행하였다. 콜라겐 타입 1의 염색은 형광면역염색을 수행하였다. 상기에서 준비된 슬라이드 글라스를 먼저 BSA(4%)에 1시간 동안 처리하였고 그 후 일차 항체를 함유한 PBS에 담가 밤새 반응시킨 후 PBS로 3회 세척하고, 이를 다시 이차 항체와 암실에서 1시간 동안 반응시켰다. DAPI를 이용한 핵 염색을 추가로 수행한 후 공초점 현미경으로 분석하였다. 대조군은 일차 항체를 사용하지 않고 동일한 처리를 수행하여 분석하였다.
도 7은 일 구체예에 따른 3차원 섬유아세포집합체에 H&E 염색 결과를 나타낸 도면이다.
도 7에 나타난 바와 같이, 배양 1일 후 모든 웰에서 동일한 농도로 처리한 섬유아세포들이 세포집합체를 형성하는 것을 확인하였다.
도 8은 일 구체예에 따른 3차원 섬유아세포집합체의 제 1형 콜라겐 면역형광학적 염색 결과를 나타낸 도면이다.
도 8에 나타난 바와 같이, 콜라겐이 3차원 섬유아세포집합체 내 전반적으로 염색된 것을 확인할 수 있고, 이를 통해 세포집합체 형성 시 콜라겐이 많이 분비되는 것을 알 수 있다.
(3.2) 혈관내피성장인자( VEGF ) 분비량 분석
실시예 1의 (2)에서 1.25×105 cells/cm2 세포농도로 MBP-FGF2로 코팅된 96-웰 NTCP에 파종하여 형성된 3차원 세포집합체를 회수하여 혈관내피세포성장인자(VEGF) 분비량을 측정하였다.
구체적으로, 형성된 3차원 세포집합체를 10개씩 모아 6-웰 NTCP로 옮긴 후 PBS로 1회 세척하였다. 추가적으로 FBS를 함유하지 않은 alpha MEM (Lonza사)으로 1회 세척한 뒤 alpha MEM (1.5 mL)을 넣고 정치배양기에 1일 간 배양하였다. 이 후 미리 정해둔 날짜마다 배양액을 수득하고 동량의 새 배양액을 넣어주었다. 수득한 배양액 내 존재하는 VEGF는 ELISA 키트 (R&D사)를 이용하여 정량하였다. 키트 사용 방법은 공급사의 프로토콜을 따라 진행하였다. 도 9은 일 구체예에 따른 3차원 섬유아세포집합체의 VEGF 분비량을 나타낸 도면이다.
도 9는 일 구체예에 따른 3차원 섬유아세포집합체의 VEGF 분비량을 나타낸 도면이다.
도 9에 나타낸 바와 같이, 3차원 섬유아세포집합체는 2차원적으로 배양된 세포보다 VEGF양이 두 배 이상 증가함을 알 수 있었다.
실시예 2: 인 비트로( In vitro ) 3차원 인공 진피 모델의 제조 및 그의 특성 분석
(1) 인 비트로 3차원 인공 진피 모델의 제조
인 비트로 3차원 인공 진피 모델을 제조하기 위해, 우선 섬유아세포를 배양하였다. 구체적으로, 인간 진피 섬유아세포를 조직 배양 플라스크를 사용하여 37 ℃, 5% CO2, 및 95% O2의 대기 조건에서 고 글루코오스 돌베코 변형 이글 배지(high glucose Dulbecco's modified Eagle's medium) (DMEM, 웰젠, 대구, 대한민국)로 배양하였다. 계대수 5의 인간 진피 섬유아세포를 모든 실험에 대하여 사용하였다.
이후, 섬유아세포의 3차원 배양을 위한 배양 용기는 하기와 같이 제작하였다. 비-조직세포 배양용 96-웰 플레이트(Non-Tissue Culture Treated 96-well Plate, "NTCP", 폴리스티렌 재질로 표면이 소수성을 띰, Falcon사)에 MBP(말토오즈 결합 단백질)-FGF(섬유아세포 성장인자) (20 ㎍/ml)를 상온에서 4시간 동안 코팅하였다. 다음으로, PBS로 3번 세척하여 결합하지 않은 MBP-FGF를 제거하였다. 상기 배양 용기에 대한 상세한 제조방법은 대한민국 공개특허 제10-2010-0122778호에 기재되어 있으며, 상기 문헌은 그 전체가 참조로서 본 명세서에 포함된다.
상기 배양 용기에 상기 섬유아세포를 파종하여 3차원 섬유아세포집합체를 제조하였다. 구체적으로, 1 웰 당 1.25x105cells/cm2의 농도로 섬유아세포를 섬유아세포성장 배지(FGM, Lonza) 중 상기 96 웰 플레이트에 파종하여 37℃에서 배양하였다. 섬유아세포가 배양 용기 표면에서 2차원적으로 배양되면서 탈착되고, 탈착 또는 이탈된 2차원 섬유아세포집합체가 배양 용기에서 부유된 상태로 계속해서 배양되어 24시간 이내에 3차원 섬유아세포집합체가 자발적으로 형성되었다. 형성된 3차원 섬유아세포집합체를 배양 1일째(1 day), 3일째(3 day) 및 5일째(5 day)에 각각 수집하였고, 접착성 섬유아세포의 3차원 섬유아세포집합체의 형성 과정을 위상차 현미경(Carl Zeiss, 독일)으로 관찰하였고, 그 결과를 도 10에 나타내었다. 이하에서 상기 3차원 섬유아세포집합체를 '3DCM'이라 표시한다.
또한, 비교예로서 상기 섬유아세포를 2차원적으로 배양하였다. 구체적으로, 조직세포 배양용 96-웰 플레이트(TCP)에 웰당 1.25x105cells/cm2의 지방줄기세포를 접종한 후 섬유아세포성장 배지(FGM, Lonza)에서 배양하였고, 상기 3차원 세포집합체와 동일하게 인공 진피 모델 특성 분석을 위해 배양 1일째(1 day), 3일째(3 day) 및 5일째(5 day)의 세포를 수집하였다. 이하에서 상기 2차원적으로 배양된 세포를 '2D'라 표시한다.
도 10은 일 구체예에 따른 3차원 섬유아세포집합체의 형성 과정을 현미경으로 관찰한 사진이다.
도 10에 나타낸 바와 같이, 육안으로 검출되는 400 내지 1000 ㎛ 이상 크기의 3차원 구형 세포집합체가 형성되었음을 확인할 수 있다.
(2) 인 비트로 3차원 인공 진피 모델의 특성 분석
상기에서 제작한 3차원 섬유아세포집합체의 인공 진피 모델로서의 특성을 분석하기 위해 하기의 실험을 수행하였다.
(2.1) 3차원 섬유아세포 집합체의 세포외기질(ECM) 유전자 발현 분석
세포외기질 관련 유전자인 콜라겐, 피브로넥틴, 및 엘라스틴의 유전자 발현량을 분석하기 위해 qRT-PCR(Quantitative Real-Time Polymerase Chain Reaction)을 사용하였다.
구체적으로, 3DCM 및 2D로부터 총 RNA를 상이한 시간(1일째, 3일째, 및 5일째)에 Qiagen miniprep 키트(Qiagen Inc., 미국)를 사용하여 제조사의 지시에 따라 추출하였다. 추출된 RNA를 뉴클리아제-무첨가 물에 용해시키고, RNA 농도를 NanoDrop ND1000 분광광도계(Thermo Fisher Scientific)을 사용하여 정량화하였다. 상보적 DNA 합성은 Maxime RT PreMix(iNtRon, 대한민국)을 사용하여 제조사의 지시에 따라 수행하였다. 모든 타겟 프라이머 서열은 바이오니어(대한민국)으로부터 구입하였다. 모든 중합연쇄 반응은 ABI Prism 7500(Applied Biosystems)를 사용하여 수행하였고, 유전자 발현 수준은 SYBR Premix Ex Taq(TaKaRa, 일본)을 사용하여 정량화하였다. 상대적 유전자 발현 수준은 상대적 Ct 방법(comparative Ct method)을 사용하여 계산하였고, 그 결과를 도 11에 나타내었다.
도 11은 일 구체예에 따른 3차원 섬유아세포집합체의 세포외기질 관련 유전자의 상대적 발현량을 나타낸 그래프이다.
도 11에 나타낸 바와 같이, 콜라겐 타입 1 및 피브로넥틴은 2D에 비해 3DCM에서 발현량이 거의 3배 정도 낮음을 확인할 수 있고, 엘라스틴의 경우, 발현량이 2D에 비해 3DCM에서 증가되어 있는 것을 확인할 수 있다. 특히 엘라스틴의 경우, 배양 1일째에는 2D와 3DCM의 발현량이 유사하나, 배양 3일부터는 현저하게 증가되어 있는 것을 확인할 수 있다. 상기의 결과로, 일 구체예에 따른 3차원 섬유아세포집합체는 콜라겐 및 피브로넥틴의 발현이 감소되고, 엘라스틴의 발현 증가된 피부 진피의 환경을 모사하여 이들을 타겟으로 하는 물질의 개발에 유용하게 사용될 수 있음을 알 수 있다.
(2.2) 3차원 섬유아세포집합체의 콜라겐 발현량 분석
3차원 섬유아세포집합체의 콜라겐 분석하기 위해 히드록시프롤린 어세이(hydroxyproline assay), 면역 염색 및 웨스턴 블랏팅을 수행하였다.
구체적으로, 히드록시프롤린 어세이를 위해 RIPA 버퍼(Sigma-Aldrich)를 사용하여 상이한 시간(1일째, 3일째 및 5일째)에 2D, 및 3DCM(3 X 106 세포)를 수집하여, 120 ℃에서 3시간 동안 12 N HCl 용액으로 가수분해 하였다. 어세이는 히드록시프롤린 키트(Sigma-Aldrich)를 사용하여 제조사의 지시에 따라 수행하였다. 흡광도는 Multisakn(Thermo)를 사용하여 560 nm에서 측정하였고, 그 결과를 도 12에 나타내었다.
면역 염색을 위해 상이한 시간에 수집한 상기 3DCM 및 2D를 PBS로 세 번 세척하고, 30분 동안 4% PFA로 고정화하였다. 이후, OCT 화합물(optimal cutting temperature compound)(TISSUE-TEK￠c 4583; Sakura Finetek USA, Inc.)에 포매하고, -28 ℃에서 동결하고 6 ㎛ 두께로 잘라내었다. 비특이적인 결합을 피하기 위해, 절편을 상온에서 1시간 동안 BSA(4%)에서 인큐베이션하였다. 이후에, 4 ℃에서 콜라겐 I에 대한 1차 항체(Rabit, Abicam)로 하룻밤 동안 인큐베이션하였다. 이후에, 시료를 PBS로 세척하고, 1% BSA 내의 상응하는 형광 컨쥬게이트 2차 항체(Donkey anti-rabbit)(Life Technologies)로 1시간 동안 상온에 인큐베이션하였다. 또한, DAPI(4,5-디아미디노-2-페닐인돌)(Vector Laboratories)를 핵 염색을 위해 사용하였다. 대조군은 동일한 조건 하에서 1차 항체 없이 수행하였으며, 공초점 현미경(Carl Zeiss)으로 관찰하였고, 그 결과를 도 13에 나타내었다.
웨스턴 블랏팅을 위해 상기와 동일한 배양된 세포를 프로테아제 억제제 칵테일(protease inhibitor cocktail)과 함께 RIPA버퍼(Sigma-Aldrich)로 가용화하였다. 이후에 상기 용해물을 4 ℃에서 30분 동안 15,000 g에서 원심분리하였고, 2% SDS 및 5%(v/v) 2-머캅토에탄올을 함유하는 Laemmli 시료에 희석하였으며, 90 ℃에서 5분동안 가열하였다. 단백질을 10% 리졸빙 겔(resolving gel)의 사용과함께 SCD-폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE)로 분리하였고, 니트로셀룰로오스 막(Bio-Rad, 미국)에 옮겨 두었다. 상기 막을 콜라겐 타입 I(Colla1, Boster Bio CO. Ltd) 및 β-액틴(Santan Cruz Biotechnology)에 대한 1차 항체와 함께 4 ℃에서 하룻밤동안 인큐베이션하였다. 검출을 위해 상기 막을 상온에서 1시간동안 퍼옥시다아제-컨쥬게이트 항체(Santa Cruz Biotechnology)와 함께 인큐베이션하였다. 이미지 분석기(LSA3000, Fujifilm)로 화학발광 이미지를 형성하여 스캐닝을 수행하였고, 그 결과를 도 14에 나타내었다.
도 12는 일 구체예에 따른 3차원 섬유아세포집합체의 콜라겐 함량을 히드록시프롤린 어세이로 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 13은 일 구체예에 따른 3차원 섬유아세포집합체의 콜라겐 발현량을 면역 염색으로 측정한 결과를 나타낸 도면이다.
도 14는 일 구체예에 따른 3차원 섬유아세포집합체의 콜라겐 발현량을 웨스턴 블랏팅으로 측정한 결과를 나타낸 도면이다.
도 12 에 나타낸 바와 같이, 3DCM으로부터 분비된 총 콜라겐의 양은 배양 시간이 길어짐에 따라 증가함을 확인할 수 있고, 2D에 비해 감소되어 있는 것을 확인할 수 있다. 상기의 결과는 상기 실시예 2의 (2.1)의 결과와 일치함을 알 수 있다.
또한, 도 13에 나타낸 바와 같이, 3DCM에서 배양 동안 콜라겐 타입 I 염색이 감소한 반면, 2D에서는 감소되지 않음을 확인할 수 있다. 상기의 결과는 콜라겐 타입 I이 3차원 배양 시스템 내에서 배양 동안 분해된 것을 나타낸다.
또한, 도 14에 나타낸 바와 같이, 도 12의 결과와 일치하게 3DCM에서 배양 동안 콜라겐 타입 I이 단편화 되는 반면, 2D에서는 그렇지 않음을 확인할 수 있다.
상기의 결과로 일 구체예에 따른 3차원 섬유아세포집합체는 콜라겐의 발현이 감소되어 있어, 콜라겐의 함량을 증가시키는 후보 물질의 스크리닝에 유용하게 사용될 수 있음을 알 수 있다.
(2.3) 3차원 섬유아세포집합체의 MMP 발현 분석
3차원 섬유아세포집합체의 매트릭스 메탈로프로테이나제(matrix metalloproteinase: MMP) 1의 발현 분석을 위해 RT-PCR을 수행하였다. RT-PCR은 상기 실시예 2의 (2.1)과 동일한 방법으로 수행하였고, 그 결과를 도 15a에 나타내었다.
또한, 총 MMP-1의 분비량을 분석하기 위해, ELISA를 수행하였다. 구체적으로, 배양 배지를 정상 2D, 3DCM로부터 각 상이한 시간(1일째, 3일째, 및 5일째)에 제조하였다. 어세이는 Quantikine ELISA 인간 총 MMP 1 키트(R&D System)를 사용하여 제조사의 지시에 따라 수행하였다. 흡광도는 Multisakn(Thermo)를 사용하여 560 nm에서 측정하였고, 그 결과를 도 15b에 나타내었다.
도 15는 일 구체예에 따른 3차원 섬유아세포집합체의 MMP1 발현량 및 분비량을 나타낸 그래프이다.
도 15에 나타낸 바와 같이, 3DCM에서 MMP1 유전자의 발현량은 2D에 비해 현저하게 발현량이 증가되어 있음을 확인할 수 있다. 또한, ELISA 분석에서와 같이 MMP1의 분비량도 3DCM에서 2D에 비해 현저하게 증가되어 있음을 확인할 수 있다. 상기의 결과로, 일 구체예에 따른 3차원 섬유아세포집합체는 MMP의 발현이 현저하게 증가되어 있어 이를 타겟으로 하는 물질의 개발에 유용하게 사용될 수 있음을 알 수 있다.
(3) 3차원 섬유아세포집합체를 이용한 MMP 저해제의 저해능 평가
본 실시예에서는 상기 3차원 섬유아세포집합체가 MMP 저해제의 스크리닝에 사용가능한지 추가적으로 확인하기 위해, 기존에 알려진 MMP 저해제를 처리하여 MMP의 분비량을 확인하였다.
구체적으로, 상기 실시예 2의 (1)에서 제작한 배양 1일째의 3차원 섬유아세포집합체에 섬유아세포 성장 배지 (Fibroblast Growth Media, FGM, Lonza사)에 희석된 레티노산 (retinoic acid) (10 mM), 아비에틴산 (Abietic acid) (100 mM), 변형성장인자-베타 1 (Transforming Growth Factor-b1, TGF-b1) (5 ng/ml)을 접종하였다. 이후에, 추가로, 2일, 및 4일간 37 ℃한 후, 정치배양기에서 배양한 뒤 배양액을 회수하여 기질금속단백분해효소-1 (matrix metalloproteinase-1, MMP1) 분비량을 측정하였다. 측정은 ELISA 키트 (R&D사)를 이용하여 정량하였고, 사용법은 공급사의 프로토콜을 따라 진행하였고, 그 결과를 도 16에 나타내었다.
3차원 섬유아세포집합체의 대조군으로, 2차원에서 배양된 섬유아세포를 이용한 MMP 저해제의 저해능 비교를 위해 자외선 B를 조사한 섬유아세포를 사용하였다. 구체적으로, 조직세포 배양용 6-웰 플레이트 (Tissue culture treated 6-well plate)에 2.5 X 105 세포/cm2 세포농도로 고농도 글루코즈 DMEM 배지에 현탁된 섬유아세포를 파종한 후, 37 ℃ 정치배양기에서 1일간 배양하였다. 그 후 PBS로 3회 반복 세척하고 무혈청 MEM배지를 넣어주고 37 ℃ 정치배양기에서 1 시간 동안 배양하였다. 그리고 PBS를 이용하여 3회 반복 세척한 뒤, MMP1 과발현을 유도하기 위해 자외선 B (20 mJ/cm2)를 조사하였다. 자외선 조사 후 섬유아세포성장배지(Fibroblast Growth Media, FGM, Lonza사)에 희석된 여러 농도의 레티노산 (2, 10, 40 mM), 아비에틴산 (20, 100, 400 mM), TGF-b1 (1, 5, 20, ng/ml)을 접종한 후, 추가로 2일간 37 ℃ 정치배양기에서 배양한 뒤 배양액을 회수하여 MMP1 분비량을 측정하였다. 측정은 ELISA 키트 (R&D사)를 이용하여 정량하였고, 사용법은 공급사의 프로토콜을 따라 진행하였고 그 결과를 도 17에 나타내었다.
도 16은 일 구체예에 따른 3차원 섬유아세포집합체에 MMP1 저해제를 처리한 후의 세포의 MMP1 분비량을 나타낸 도면이다.
도 17은 MMP1 과발현을 유도하기 위해 자외선 조사된, 2차원에서 배양된 섬유아세포에 MMP1 저해제를 처리한 후의 세포의 MMP1 분비량을 나타낸 도면이다.
도 16에 나타난 바와 같이, MMP1 저해제가 처리되지 않은 섬유아세포집합체의 경우, 배양 시간이 2, 4일 경과함에 따라 MMP1의 분비량이 각각 2.1배 2.4배 가량 증가하였다. 반면, 레티노산 및 아비에틴산을 처리한 섬유아세포집합체의 경우 대조군 대비 각각 80%, 81% 가량의 분비량을 보였으며, TGF-b1을 처리한 군의 분비량은 약 60% 가량으로 나타났다.
도 17에 나타난 바와 같이, 2차원에서 배양된 자외선B를 조사한 섬유아세포는 조사하지 않은 섬유아세포 대비 약 1.3배 가량 높은 MMP1 분비량을 보였다. 그러나 레티노산을 처리한 섬유아세포는 MMP1 분비량이 대조군 대비 약 30%로 감소되었고, TGF-b1 처리군과의 비교 시 처리량에 따라 25~35%로 감소됨을 보였다. 특히 아비에틴산을 처리한 섬유아세포는 20 mM 처리 시 약 절반 가량 분비량이 감소하였으나 100 mM 이상을 처리하였을 경우 대조군 대비 약 2%의 분비량을 보였다. 3DCM을 이용하여 평가한 결과와 비교하여 저해제 처리시 분비량이 감소하는 경향은 동일하다. 그러나, 2D의 MMP 저해제의 대조군 대비 감소폭은 3DCM과 비교하여, 레티노산 처리군은 2.7배, TGF-b1은 1.7 내지 2.4배, 아비에틴산은 1.7 내지 40배 높은 것으로 나타났다.
상기의 결과로 2D의 경우 약물에 대한 세포의 감도가 현저하게 높아 약물 스크리닝에는 적합하지 않음을 알 수 있고, MMP 저해제를 포함한 약물의 스크리닝에 3DCM이 유용하게 사용될 수 있음을 알 수 있다.
도 18은 일 구체예에 따른 3차원 섬유아세포집합체를 포함하는 약물 스크리닝 장치 및 그를 사용하여 약물을 스크리닝하는 방법을 도식화하여 나타낸 도면이다. 도 18를 참조하여 설명하면, 하나 이상의 웰을 갖는 웰 플레이트를 포함하고, 상기 웰에 하나 이상의 일 구체예에 따른 3차원 섬유아세포집합체가 파종된 약물 스크리닝 장치가 제공된다. 상기 3차원 섬유아세포집합체는 각 세포집합체당 3.0×105 내지 1.0×106 개의 세포를 포함할 수 있다. 또한 세포집합체의 직경은 300 내지 2000 ㎛일 수 있으며, 형상은 구형(스페로이드 포함), 또는 시트일 수 있다. 상기 약물, 즉 후보 물질에 대해서는 상기한 바와 같다. 상기 약물 스크리닝 장치의 각 웰에 후보 물질을 포함하는 용액을 주입하는 단계; 상기 후보 물질이 주입된 웰을 포함하는 웰 플레이트를 배양하는 단계; 상기 웰 플레이트로부터 상기 3차원 섬유아세포집합체를 수집하거나 또는 상기 웰 플레이트로부터 배양액을 회수하는 단계; 및 상기 수집된 섬유아세포로부터 어세이를 수행하거나 또는 상기 배양액으로부터 어세이를 수행하는 단계를 포함하는 약물 스크리닝 하는 방법이 제공된다. 상기 후보 물질은 동일하거나 상이한 후보 물질일 수 있다. 상기 배양은 통상의 기술자가 임의로 배양 시간 및 온도를 결정할 수 있다. 상기 어세이는 예를 들면, 상기 배양액으로부터 ELISA를 사용하는 MMP 분비 어세이, 또는 상기 3차원 섬유아세포집합체로부터 웨스턴블랏팅, 또는 면역조직화학염색을 사용하는 ECM 분비 어세이를 포함할 수 있다.

Claims (35)

  1. 섬유아세포를 섬유아세포에 결합하는 활성을 가진 단백질이 코팅된 표면을 갖는 배양 용기 중의 액체 배지 중에서 배양하여, 상기 표면으로부터 섬유아세포가 이탈되어 형성된 섬유아세포집합체(fibroblast cluster)를 포함하는 배양물을 얻는 단계; 및
    상기 배양물로부터 섬유아세포집합체를 분리하는 단계;를 포함하는 섬유아세포집합체를 생산하는 방법으로서,
    상기 섬유아세포에 결합하는 활성을 가진 단백질은 섬유아세포와 섬유아세포 사이의 결합보다 더 약하게 섬유아세포와 결합하는 것인 방법.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 배양하는 단계에서, 상기 섬유아세포는 배양 초기에는 배양 용기의 표면에 접착하여 증식한 후 성장함에 따라 배양 용기의 표면으로부터 이탈하는 것인 방법.
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 섬유아세포에 결합하는 활성을 가진 단백질은 배지 중에서 섬유아세포와 피브로넥틴이 결합하는 것보다 상기 섬유아세포와 더 약하게 결합하는 것인 방법.
  4. 청구항 1에 있어서, 상기 섬유아세포에 결합하는 활성을 가진 단백질은 섬유아세포의 세포막에 존재하는 인테그린(integrin)과 결합하지 않는 것인 방법.
  5. 청구항 1에 있어서, 상기 섬유아세포에 결합하는 활성을 가진 단백질은 섬유아세포의 세포막에 존재하는 헤파란 설페이트 프로테오글리칸(heparan sulfate proteoglycan)에 결합하는 것인 방법.
  6. 청구항 1에 있어서, 상기 섬유아세포에 결합하는 활성을 가진 단백질은 섬유아세포 성장 인자(FGF)인 것인 방법.
  7. 청구항 1에 있어서, 상기 단백질은 말토오스 결합 단백질(maltose-binding protein, MBP), 하이드로포빈(hydrophobin) 및 소수성 세포 투과성 펩티드(hydrophobic cell penetrating peptides, CPPs)로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 또는 그의 조합에 의해 배양 용기 표면에 고정되어 있는 것인 방법.
  8. 청구항 1에 있어서, 상기 배양 용기의 표면은 실란화된 표면(silanized surface), 탄화수소 코팅된 표면(hydrocarbon coated surface), 고분자 표면 및 금속 표면으로 구성된 군으로부터 선택되는 소수성 표면인 것인 방법.
  9. 청구항 8에 있어서, 상기 고분자가 폴리스티렌(polystyrene), 폴리메틸메타크릴레이트(PMMA), 폴리에틸렌 테레프탈레이트(PET), 폴리비닐클로라이드(PVC), 폴리에틸렌(PE), 폴리프로필렌(PP), 폴리테트라플루오르에틸렌(PTFE), 폴리(L-락트산)(PLLA), 폴리(D,L-락트산）(PDLLA), 폴리(글리콜산)(PGA), 폴리(카프로락톤)(PCL), 폴리(하이드록시알카노에이트), 폴리다이옥산온(PDS), 폴리트라이메틸렌카보네이트, 및 그들의 공중합체로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  10. 청구항 1에 있어서, 상기 섬유아세포를 배양하기 전에 섬유아세포를 계대 증식하는 것을 더 포함하는 것인 방법.
  11. 청구항 1에 있어서, 상기 섬유아세포를 1.0×104 내지 2.0×105 세포/cm2의 세포 농도로 파종하는 것인 방법.
  12. 청구항 1에 있어서, 상기 배양은 1일 내지 1주일 동안 수행하는 것인 방법.
  13. 청구항 1에 있어서, 상기 형성된 섬유아세포집합체를 배양물로부터 분리하는 단계는 효소의 처리 없이 분리하는 것인 방법.
  14. 청구항 1에 있어서, 상기 섬유아세포집합체는 구형상, 시트(sheet) 또는 그 조합인 것인 방법.
  15. 청구항 1의 방법에 의해 제조된 섬유아세포집합체.
  16. 청구항 15에 있어서, 구형이고, 직경이 300 내지 2000 ㎛이며, 직경 400 ㎛ 당 3.0×105 내지 1.0×106의 세포를 포함하는 것인 섬유아세포집합체.
  17. 청구항 15에 있어서, 상기 섬유아세포집합체는 세포외기질(ECM) 또는 혈관내피성장인자(VEGF)를 분비하는 것인 섬유아세포집합체.
  18. 섬유아세포로부터 배양된 섬유아세포집합체를 포함하는 인 비트로(In vitro) 3차원 피부 진피 모델.
  19. 청구항 18에 있어서, 상기 세포집합체는 구형이고, 직경이 300 내지 2000 ㎛인 것인 모델.
  20. 청구항 18에 있어서, 상기 배양은 섬유아세포집합체로 배양된 후 추가적으로 적어도 12시간 이상 더 배양된 것인 모델.
  21. 청구항 18에 있어서, 상기 피부 진피 모델은 피부 노화 개선제, 염증성 질환, 관절염, 또는 암 치료제의 스크리닝을 위한 것인 모델.
  22. 청구항 18에 있어서, 상기 섬유아세포집합체는 피부의 노화에 따른 병리학적 특성을 나타내는 것인 모델.
  23. 청구항 18에 있어서, 상기 섬유아세포집합체는 콜라겐의 발현 또는 활성이 감소되어 있거나, 또는 매트릭스 메탈로프로테아제(matrix metalloproteinase: MMP)의 발현 또는 활성이 증가되어 있는 것인 모델.
  24. 청구항 23에 있어서, 상기 섬유아세포집합체는 추가적으로 피브로넥틴의 발현 또는 활성이 감소되어 있거나, 또는 엘라스틴의 발현 또는 활성이 증가되어 있는 것인 모델.
  25. 섬유아세포를 섬유아세포에 결합하는 활성을 가진 단백질이 코팅된 표면을 갖는 배양 용기 중의 액체 배지 중에서 배양하여, 상기 표면으로부터 섬유아세포가 이탈되어 형성된 섬유아세포집합체(fibroblast cluster)를 포함하는 배양물을 얻는 단계로서, 상기 섬유아세포에 결합하는 활성을 가진 단백질은 섬유아세포와 섬유아세포 사이의 결합보다 더 약하게 섬유아세포와 결합하는 것인 단계; 및
    상기 배양물로부터의 섬유아세포집합체를 적어도 12시간 동안 추가적으로 배양하는 단계를 포함하는 포함하는 인 비트로 3차원 피부 진피 모델을 제조하는 방법.
  26. 청구항 25에 있어서, 상기 섬유아세포에 결합하는 활성을 가진 단백질은 섬유아세포의 세포막에 존재하는 인테그린(integrin)과 결합하지 않는 것인 방법.
  27. 청구항 25에 있어서, 상기 적어도 12시간 동안 추가적으로 배양된 섬유아세포집합체는 콜라겐의 발현 또는 활성이 감소되어 있거나, 또는 매트릭스 메탈로프로테아제(matrix metalloproteinase: MMP)의 발현 또는 활성이 증가되어 있는 것인 방법.
  28. 청구항 25에 있어서, 상기 섬유아세포집합체는 추가적으로 피브로넥틴의 발현 또는 활성이 감소되어 있거나, 또는 엘라스틴의 발현 또는 활성이 증가되어 있는 것인 방법.
  29. 섬유아세포로부터 배양된 섬유아세포집합체를 포함하는 약물 스크리닝을 위한 인 비트로(In vitro) 모델.
  30. 청구항 29에 있어서, 상기 약물은 MMP 저해제 또는 세포 내 콜라겐의 발현 또는 활성 증가제인 것인 모델.
  31. 청구항 29에 있어서, 상기 약물은 염증성 질환, 관절염, 또는 암의 치료제인 것인 모델.
  32. 청구항 18의 섬유아세포집합체에 피검 물질을 처리하는 단계;
    상기 피검 물질이 처리됨 섬유아세포집합체의 MMP의 발현 또는 활성의 수준을 측정하는 단계;
    측정된 MMP의 발현 또는 활성의 수준을 무처리 대조군의 수준과 비교하는 단계; 및
    대조군에 비하여 MMP의 발현 또는 활성을 감소시킨 물질을 선별하는 단계를 포함하는 MMP의 발현 또는 활성을 감소시키는 물질을 스크리닝하는 방법.
  33. 청구항 32에 있어서, 상기 MMP의 발현 또는 활성을 감소시키는 물질은 피부 노화 개선제, 염증성 질환, 관절염, 또는 암 치료제인 것인 방법.
  34. 청구항 18의 섬유아세포집합체에 피검 물질을 처리하는 단계;
    상기 피검 물질이 처리됨 섬유아세포집합체의 콜라겐의 발현 또는 활성의 수준을 측정하는 단계;
    측정된 콜라겐의 발현 또는 활성의 수준을 무처리 대조군의 수준과 비교하는 단계; 및
    대조군에 비하여 콜라겐의 발현 또는 활성을 증가시킨 물질을 선별하는 단계를 포함하는 콜라겐의 발현 또는 활성을 증가시키는 물질을 스크리닝하는 방법.
  35. 청구항 34에 있어서, 상기 콜라겐의 발현 또는 활성을 증가시키는 물질은 피부의 노화 개선제인 것인 방법.
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