KR102236977B1 - 3차원 섬유아세포집합체 및 그의 생산방법 - Google Patents

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Abstract

3차원 섬유아세포집합체 및 그의 제조방법을 제공한다. 상기 섬유아세포집합체 및 그의 제조방법은 배양 용기에서 단시간에 다량의 3차원 섬유아세포집합체를 용이하게 수득할 수 있고, 세포외기질에 둘러싸인 3차원 섬유아세포집합체를 세포원으로서 섬유 세포의 손상 없이 주사 제제로 생체 내 이식이 가능하여, 세포치료제 또는 약학적 조성물로서 사용 가능하다.

Description

3차원 섬유아세포집합체 및 그의 생산방법{Three-dimensional fibroblast cluster and method for producing thereof}
3차원 섬유아세포집합체 및 그의 생산방법에 관한 것이다.
최근에 세포치료기술은 난치병 등의 치료의 새로운 분야로 각광받고 있다. 이전까지는 인간의 난치병 치료를 위해 장기이식 또는 유전자 치료 등이 제시되었으나, 면역거부, 공급 장기 부족, 벡터개발 또는 질환 유전자에 대한 지식부족으로 효율적인 실용화가 미진하였다.
이에 세포치료기술에 대한 관심이 고조되어, 생체내에서 분리한 세포를 생체외에서 증식하여 이식하는 기술이 상용화되고 있으며, 인공피부, 연골 또는 섬유조직의 재건 등 실용화가 계속 진행되어 왔다. 섬유아세포는 간질성 세포외기질(ECM)을 생산하고 유지하는 세포로서, 세포외기질에 의해 섬유아세포가 유기적으로 연결되어 있다. 또한, 섬유아세포는 면역방어를 다양한 사이토카인 및 생리활성인자를 생산하는 세포로 잘 알려져 있다.
이러한 섬유아세포를 세포치료제 혹은 조직공학 소재로서 활용하기 위해서는 섬유아세포를 2차원적으로 배양하여 대량증식 후 트립신과 같은 효소로 처리하였으나, 이러한 섬유아세포에서는 생성된 세포외기질이 분해되어 이식하는 단계에서 세포외기질의 역할을 기대할 수 없었다. 조직공학기술로 생분해성 합성고분자 혹은 천연고분자를 이용하여 스캐폴드라고 하는 인공적인 3차원 다공성 세포외기질을 이용하여 섬유아세포를 비롯한 다양한 세포를 삼차원 세포집합체로 배양하고자 하는 연구가 이루어졌다. 그러나, 이는 생분해속도 또는 염증 반응 등 소재의 한계가 있어서 상용화에 어려움이 있으며, 이에 3차원 세포 집합체 형성을 유도하는 기술이 요구되고 있다.
일 양상은 섬유아세포를 섬유아세포에 결합하는 활성을 가진 단백질이 코팅된 표면을 갖는 배양 용기 중의 액체 배지 중에서 배양하여, 상기 표면으로부터 섬유아세포가 이탈되어 형성된 섬유아세포집합체(fibroblast cluster)를 포함하는 배양물을 얻는 단계; 및 상기 배양물로부터 섬유아세포집합체를 분리하는 단계를 포함하는 섬유아세포집합체를 생산하는 방법으로서, 상기 섬유아세포에 결합하는 활성을 가진 단백질은 섬유아세포와 섬유아세포 사이의 결합보다 더 약하게 섬유아세포와 결합하는 것인 방법을 제공하는 것이다.
다른 양상은 상기 방법에 의해 제조된 섬유아세포집합체를 제공하는 것이다.
일 양상은 섬유아세포를 섬유아세포에 결합하는 활성을 가진 단백질이 코팅된 표면을 갖는 배양 용기 중의 액체 배지 중에서 배양하여, 상기 표면으로부터 섬유아세포가 이탈되어 형성된 섬유아세포집합체(fibroblast cluster)를 포함하는 배양물을 얻는 단계; 및 상기 배양물로부터 섬유아세포집합체를 분리하는 단계를 포함하는 섬유아세포집합체를 생산하는 방법으로서, 상기 섬유아세포에 결합하는 활성을 가진 단백질은 섬유아세포와 섬유아세포 사이의 결합보다 더 약하게 섬유아세포와 결합하는 것인 방법을 제공한다.
다른 양상은 섬유아세포가 액체 배지 중에서 섬유아세포에 결합하는 활성을 가진 단백질이 코팅된 표면을 갖는 배양 용기의 표면에 접착되고, 상기 섬유아세포에 결합하는 활성을 가진 단백질은 섬유아세포와 섬유아세포 사이의 결합보다 더 약하게 섬유아세포와 결합하는 것인, 섬유아세포집합체 형성을 위한 배양 용기를 제공한다.
본 발명에서 용어 "섬유아세포(fibroblast)"('섬유세포'와 호환적으로 사용됨)는 섬유성 결합조직의 성분을 이루는 세포로 포유류의 결합조직의 세포를 의미할 수 있다. 섬유아세포는 세포외기질 및 콜라겐을 생산할 수 있으며, 상처 치유, 예를 들면, 피부의 흉터, 화상, 욕창 또는 창상을 치료하는 역할을 수행할 수 있다.
용어 "섬유아세포집합체(fibroblast cluster)" 또는 "3차원 섬유아세포집합체" ('섬유아세포조직체'와 호환적으로 사용됨)는 2 이상의 세포가 밀집된 상태를 말하며, 조직 상태일 수도 있고, 단일 세포 상태일 수도 있다. 각각의 세포 집합체는 조직 자체 또는 일부, 또는 단일 세포의 집합체로 존재할 수 있으며, 섬유아세포 유사-조직체를 포함할 수 있다. 또한, 용어 "3차원(three-dimension)"은 2차원이 아닌 기하학적인 3개의 파라미터(예를 들면, 깊이, 넓이, 높이 또는 X, Y, Z 축) 모델을 갖는 입체를 의미할 수 있으며, 따라서 일 구체예에 따른 섬유아세포집합체는 3차원 배양, 즉 배양 용기에서 탈착되어 부유상태로 배양되어 세포가 증식함에 따라 입체적으로 구형, 시트(sheet) 또는 그와 유사한 3차원의 형태(예를 들면, 유사 조직체)를 갖는 섬유아세포집합체를 의미할 수 있다. 또한 일 구체예에 따른 섬유아세포집합체는 조직공학기술로 인공적인 3차원 다공성 세포외기질, 예를 들면, 시트, 하이드로겔, 막, 스캐폴드 등과 같은 생분해성 합성 고분자 혹은 천연 고분자 지지체를 사용할 필요 없이, 그 자체로서 3차원 섬유아세포집합체가 형성되는 것을 의미할 수 있으며, 상기 조직공학기술은 세포가 아닌 매트릭스가 3차원인 것으로 일 구체예에 따른 3차원 섬유아세포집합체와는 구별된다.
상기 섬유아세포의 배양 용기에의 파종은 배양 용기에 섬유아세포를 첨가하는 것, 또는 배양 용기에 섬유아세포를 접착시키는 것을 포함하는 섬유아세포를 배양 용기에서 배양하기 위해 수행되는 모든 행위를 포함할 수 있다.
용어 "세포의 접착 또는 세포의 결합"은 세포와 세포 사이의 접착 또는 결합 및 세포와 배양 용기 또는 생체재료의 표면 사이의 접착 또는 결합을 포함하는 의미로 사용될 수 있다. 배양 용기 또는 생체재료의 표면에서 일어나는 세포의 접착 또는 결합은 다양한 메카니즘을 가질 수 있다. 예를 들면, 생물학적 인식을 매개로 하는 특이적 세포접착 및 정전기적 혹은 표면에너지에 의해 좌우되는 비특이적 세포접착이 있다. 특이적인 세포접착은 세포외기질(extracellular matrix;ECM) 단백질인 콜라겐, 피브로넥틴, 라미닌 등에 존재하는 특정의 펩타이드(예, arginine-glycine-aspartid acid;RGD)를 세포막에 존재하는 수용체에 의해 결합시켜 일어나는 접착을 의미할 수 있다. 비특이적인 세포접착은 전기적으로 음성을 띠는 인지질을 갖는 세포막이 접착하는 표면을 전기적으로 양성을 띠게하여 세포의 접착이 유도되는 접착을 의미할 수 있다.
배양 용기는 소수성을 띠는 표면, 예를 들면 물 접촉각이 90 내지 150˚인 표면을 포함할 수 있으며, 섬유아세포에 접착 또는 결합 활성을 갖는 단백질이 표면에 코팅된 것일 수 있다. 상기 개질된 표면을 갖는 배양 용기는 세포-세포 사이의 결합보다 세포-접착 기질(예를 들면, 배양 용기의 표면에 코팅된 세포와 결합하는 활성을 갖는 단백질 또는 성장 인자) 사이의 결합이 더 약하게 유도되는 표면을 포함할 수 있다. 상기 섬유아세포는 혈액세포와는 달린 세포외기질에 접착하여 생육하는 상피세포 혹은 중간엽세포와 같은 접착의존성 세포로서, 접착 기질에 세포가 접착하지 않으면 세포사가 유도되며, 이러한 세포사를 아노이키스(anokis)라고 한다. 일 구체예에 따른 배양 방법은 세포-접착 기질 사이의 접착 또는 결합에 있어, 세포사가 유도되지 않으면서, 세포-접착 기질 사이의 접착 또는 결합을 세포-세포 사이의 접착 또는 결합에 비해 약하게 유도함으로써, 2 차원 단층으로 배양이 되지 않는다. 즉, 상기 섬유아세포는 배양 초기에는 약한 세포-접착 기질 사이의 접착 또는 결합이 유도되고, 세포-세포 사이의 접착 또는 결합이 유도되어 이러한 세포 사이의 결합에 의해 2차원 섬유아세포집합체가 형성되고, 배양 시간이 길어짐에 따라 2차원 섬유아세포집합체는 배양 용기 표면에서 탈착 또는 이탈이 되고, 탈착 또는 이탈된 2차원 섬유아세포집합체가 배양 용기에서 부유된 상태로 계속해서 배양되어 3차원의 섬유아세포 집합체를 형성할 수 있다.
상기 세포-세포 사이의 접착 또는 결합보다 세포-접착 기질(예를 들면, 배양 용기의 표면에 코팅된 세포와 결합하는 활성을 갖는 단백질 또는 성장 인자) 사이의 접착 또는 결합이 더 약하게 유도될 수 있도록 배양 용기의 표면을 개질하는 방법은 섬유아세포와 결합하는 활성을 가진 단백질을 사용함으로써 유도될 수 있다.
상기 세포-접착 기질 사이의 접착 또는 결합은 섬유아세포의 세포막에 존재하는 인테그린(integrin)과 결합하는 단백질, 예를 들면, 콜라겐, 피브로넥틴, 라미닌 등을 사용할 경우 강하게 유도된다. 용어 "인테그린(integrin)"은 세포막에 존재하여 피브로넥틴, 콜라겐등의 세포외기질에 세포가 접착할 때 작용하는 수용체분자를 의미할 수 있으며, α 또는 β 두 개의 소단위 헤테로 2 합체로 구성되는 막관통형 당단백질로, 모든 유형의 인테그린을 포함할 수 있다. 따라서, 상기 섬유아세포에 결합하는 활성을 가진 단백질은 배지 중에서 섬유아세포와 피브로넥틴이 결합하는 것보다 상기 섬유아세포와 더 약하게 결합되는 것일 수 있다. 또한, 상기 섬유아세포에 결합하는 활성을 가진 단백질은 배지 중에서 섬유아세포와 피브로넥틴이 결합하는 것보다 상기 섬유아세포와 60 내지 95%의 활성으로 결합되는 것일 수 있으며, 예를 들면, 60, 70, 80, 90, 또는 95% 일 수 있다. 따라서, 상기 섬유아세포에 결합하는 활성을 가진 단백질은 인테그린과 결합하지 않는 단백질을 포함할 수 있다. 또한, 일 구체예에 있어서, 상기 인테그린과 결합하지 않는 단백질은 섬유아세포의 세포막에 존재하는 헤파란 설페이트 프로테오글리칸(heparan sulfate proteoglycan)에 결합하는 단백질을 포함할 수 있다. 일 구체예에 있어서, 상기 헤파란 설페이트 프로테오글리칸과 결합하는 단백질은 섬유아세포성장인자(FGF)일 수 있다. 또한, 상기 단백질은 5 내지 100 ㎍/ml의 농도로 배양 용기 표면에 고정되는 것일 수 있다.
상기 용어 "섬유아세포성장인자(Fibroblast growth factor, FGF)"는 성장 인자의 한 종류로, 섬유아세포를 자극하여 증식성을 유도하는 성장인자를 의미할 수 있다. 섬유아세포성장인자는 헤파린 결합(heparin-binding) 단백질로, 상기한 바와 같이 섬유아세포의 헤파란 설페이트 프로테오글리칸과 상호작용을 할 수 있다. FGF는 22개의 종류를 포함할 수 있으며, 예를 들면, FGF 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 또는 22를 포함할 수 있다. 상기 FGF의 종류는 이름이 다를지라도, 통상의 당업자가 동일한 단백질을 의미하는 것으로 인식될 수 있다면 모두 포함할 수 있다. 예를 들면, FGF 11, 12, 13 및 14는 "iFGF" 라고도 알려져 있으며, FGF 15는 "FGF 15/19" 라고도 알려져 있다. 또한, 예를 들면, FGF 1 또는 FGF 2는 "헤파린 결합 성장인자 1(heparin-binding growth factor 1, HBGF-1" 또는 "헤파린 결합 성장인자 2(heparin-binding growth factor 2, HBGF-2"를 포함할 수 있다.
배양 용기 표면에 대한 상기 섬유아세포에 결합하는 활성을 가진 단백질의 고정화는 폴리펩티드를 고체 기질 표면에 고정하는데 이용되는 것으로 당해 기술분야에 공지된 모든 방법에 의해 달성될 수 있는데, 예를 들면, 물리적인 흡착, 비선택적인 화학반응에 의한 공유결합 등을 이용할 수 있다. 이러한 고정화 방법의 예로는, 단백질에 바이오틴(biotin)을 결합시킨 후, 이 단백질을 스트렙타비딘(streptavidin)이나 아비딘(avidin)으로 처리된 고체 표면에 적용시킴으로써 바이오틴-스트렙타비딘/아비딘 결합을 이용하여 단백질을 고정하는 방법; 플라즈마를 이용하여 기판 위에 활성기(화학결합에 의해 단백질을 고정하기 위한 화학적 작용기)를 집적시켜 단백질을 고정하는 방법; 고체 기판 표면에 졸-겔(sol-gel)법을 이용하여 비표면적이 충분히 증가된 다공성 졸-겔 박막을 형성한 후에, 상기 다공성 박막에 물리적인 흡착에 의해 단백질을 고정하는 방법; 플라즈마 반응에 의하여 폴리테트라플루오로에틸렌(PTFE) 표면에 항혈전성 단백질을 고정하는 방법; 양이온성 아미노 잔기가 2개의 효소에 2개 이상 연속적으로 융합된 효소를 결합시켜 단백질을 고정하는 방법; 기질을 이용하여 고체상 지지대에 결합되어 있는 소수성 고분자 층에 단백질을 고정하는 방법; 플라스틱 표면에서 완충성분을 이용하여 단백질을 고정하는 방법; 알코올 용액에서 소수성 표면을 가지는 고체 표면에 단백질을 접촉시켜 단백질을 고정하는 방법 등을 포함할 수 있다.
또한, 재조합적으로 대량 발현 및 용이한 정제가 가능한 폴리펩티드 링커를 사용하여 상기 폴리펩티드 링커의 카르복실 말단에 성장인자(예를 들면, FGF)의 아미노 말단이 융합되어 있는 폴리펩티드 링커-성장인자(예를 들면, FGF) 재조합 단백질 형태로 고정화를 수행할 수 있다. 상기 성장인자를 폴리펩티드 링커를 이용하여 성장인자 본래의 생물학적 활성을 유지하면서 재조합 단백질 형태로 소수성 표면에 고정시킨 후 고정된 성장인자의 섬유아세포에 대한 접착활성을 이용하여 상기 표면에 섬유아세포를 접착시킴으로써 섬유아세포의 효율적인 배양을 도모할 수 있다.
본 발명에 적합한 폴리펩티드 링커는 그의 카르복실 말단을 통해 성장인자의 아미노 말단과 결합하고 그의 아미노 말단에 존재하는 소수성 도메인을 통해 소수성 표면을 갖는 배양 용기에 흡착할 수 있는 것으로서, 재조합적으로 대량 발현 및 용이한 정제가 가능하고 섬유아세포의 배양에 영향을 미치지 않는 것이면 어느 것이든 사용할 수 있다. 폴리펩티드 링커로는 에를 들면, 말토오스 결합 단백질(maltose-binding protein, MBP), 하이드로포빈 (hydrophobin), 소수성 세포 투과성 펩티드(hydrophobic cell penetrating peptides, CPPs) 등을 포함할 수 있다.
MBP(NCBI GenBank Accession No. AAB59056)는 대장균(Escherichia coli)의 세포막을 가로질러 원형질막공간에 위치하며 세포 내로 말토오스나 말토덱스트린(maltodextrin)과 같은 당류의 이동에 관여하는 막 주변(periplasm) 단백질을 의미할 수 있다. MBP는 유용한 외래 단백질을 재조합 단백질 형태로 생산하기 위해 주로 이용되는데, 세포 내의 유전자 malE로부터 해독되어 만들어지고, 클로닝된 malE 유전자의 하부 (downstream)에 외래 단백질의 유전자를 삽입하여 세포 내에서 발현시키면 2개의 단백질이 결합한 재조합 단백질을 손쉽게 대량으로 생산할 수 있다. 특히, 발현시키고자 하는 단백질의 크기가 작거나 다른 숙주세포 내에서는 그 안정성이 떨어지는 외래 단백질인 경우, 이와 같이 MBP를 이용하여 재조합 단백질 형태로 세포 내에서 발현시키는 것이 유리할 수 있다. 이처럼 malE 유전자가 결합된 유전자로부터 발현되는 외래 단백질은 MBP가 말토오스에 결합 친화력을 갖는다는 특성을 이용하여 분리할 수 있다. 예를 들어, 말토오스가 다중화된 형태인 아밀로스(amylose)가 코팅된 수지와 세포 파쇄액을 반응시키고, 반응시킨 수지를 수차례 세척하여 오염된 다른 단백질을 제거한 후, 고농도의 말토오스를 첨가하여 경쟁시킴으로써 원하는 단백질만을 간단하게 용출시킬 수 있다.
상기 MBP-세포 접착 기질(예를 들면, 성장인자) 재조합 단백질은 당업계의 통상적인 화학적 합성 또는 유전자 재조합 기술 등을 이용하여 제조하거나, 이를 발현하는 형질전환 세균을 적절한 조건 하에서 배양한 후 배양액으로부터 재조합 단백질을 회수함으로써 수득될 수 있다. 이와 같이 수득된 MBP-세포 접착 기질 재조합 단백질을 소수성 표면을 갖는 배양 용기에 고정시키는 과정은 특별한 처리를 요구하지 않고 재조합 단백질에서 폴리펩티드 링커의 아미노 말단에 위치한 소수성 도메인을 이용한 소수성 표면과의 물리적 흡착에 의해 자발적으로 이루어질 수 있다.
또한, 상기 세포-세포 사이의 접착 또는 결합보다 세포-접착 기질(예를 들면, 섬유아세포에 결합하는 활성을 가진 단백질) 사이의 접착 또는 결합이 더 약하게 유도될 수 있도록 하는 방법은 섬유아세포와 기질(예를 들면, 배양 용기의 표면) 사이의 접착 또는 결합을 약화시키는 물질을 처리함으로써 유도될 수 있다.
상기 표면이 소수성을 띠는 배양 용기, 예를 들면 물 접촉각이 90 내지 150˚인 표면을 갖는 배양 용기는 통상적인 세포 배양 용기에 소수성을 부여하는 고분자로 표면 처리되거나 그러한 고분자로 제조된 세포 배양 용기일 수 있다. 이러한 소수성 고분자로는, 이에 한정되는 것은 아니지만, 폴리스티렌(polystyrene), 폴리메틸메타크릴레이트(PMMA), 폴리에틸렌 테레프탈레이트(PET), 폴리비닐클로라이트(PVC), 폴리에틸렌(PE), 폴리프로필렌(PP), 폴리테트라플루오르에틸렌(PTFE), 지방족 폴리에스테르계 고분자로서, 폴리(L-락트산)(PLLA), 폴리(D,L-락트산）(PDLLA), 폴리(글리콜산)(PGA), 폴리(카프로락톤)(PCL), 폴리(하이드록시알카노에이트), 폴리다이옥산온(PDS), 폴리트라이메틸렌카보네이트 중에서 선택된 1 종이거나, 또는 이들 단위들의 공중합체인 폴리(락트산-co-글리콜산)(PLGA), 폴리(L-락트산-co-카프로락톤)(PLCL), 폴리(글리콜산-co-카프로락톤)(PGCL), 이들의 유도체 등을 예로 들 수 있다. 또한 일 구체예에 따른 적합한 배양 용기는 소수성 표면으로 실란화된 표면(silanized surface), 탄소나노튜브(CNT) 표면, 탄화수소 코팅된 표면(hydrocarbon coated surface), 금속(예컨대, 스테인레스 스틸, 티탄, 금, 백금 등) 표면을 갖는 것일 수 있다.
상기 섬유아세포를 배양 용기에 파종하기 전에, 상기 섬유아세포는 계대 증식된 배양된 세포를 사용할 수 있다. 상기 계대 증식하는 방법은 공지의 방법에 의해 분리된 섬유아세포를 공지의 방법으로 계대 증식한 것일 수 있다. 예를 들면, 상기 분리된 섬유아세포는 이후의 3차원 섬유아세포접합체 형성에 1 계대 배양된 세포를 그대로 사용하거나, 10 계대 이상 배양된 세포를 사용할 수 있다.
상기 섬유아세포를 파종하는 농도는 1.0×104 내지 2.0×105 세포/cm2의 세포농도로 파종한 것일 수 있다. 또한, 예를 들면, 상기 세포 농도는 7.5×104 내지 1.5×105 세포/cm2, 또는 1.25×105 세포/cm2 일 수 있다. 상기 세포의 농도는 1.0×104 이상이면 3차원의 세포집합체를 형성할 수 있으며, 1.25×105 세포/cm2 이상이면 육안으로 식별이 가능한 크기의 3차원 세포집합체를 형성할 수 있다.
또한, 상기 배양 기간은 1일 내지 1주일 일 수 있다. 상기 배양에 적합한 배지는 섬유아세포의 배양 및/또는 분화에 통상적으로 사용되는 배지로서 혈청 혹은 무혈청을 함유한 것이면 어느 것이나 제한 없이 사용될 수 있으며, 예를 들면 DMEM(Dulbeco's modified eagle medium), Ham's F12, 이들의 혼합물 등에 혈청을 첨가한 배지를 사용할 수 있다.
상기한 바와 같이, 섬유아세포가 3차원 섬유아세포집합체를 형성하는 단계는 세포-접착 기질 사이의 결합에 의해 초기에 형성된 2차원 섬유아세포집합체가 배양 용기 표면에서 탈착이 되고, 탈착된 2차원 섬유아세포집합체가 배양 용기에서 부유된 상태로 계속해서 배양됨으로써, 3차원 세포 집합체를 형성할 수 있다.
배양 용기 표면에 섬유아세포를 접착시켜 배양하여 형성된 섬유아세포집합체는 육안으로 검출가능한 크기의 직경을 가지고 있어 피펫을 사용하여 분리하거나, 여과 또는 원심분리 등의 방법에 의해 용이하게 수득할 수 있다. 즉, 상기 배양 용기로부터 형성된 섬유아세포집합체를 수득하는 단계는 효소의 처리 없이 이루어질 수 있다. 이렇게 수득된 3차원 세포집합체는 콜라게나제, 트립신 또는 디스파제(dispase)를 이용한 효소학적 처리, 압력을 이용한 기계적인 처리, 또는 이들의 병용 처리에 의해 집합체 형태를 와해시켜 단일 세포 형태로 사용하거나, 3차원 세포집합체 형태 그대로 사용할 수 있다.
다른 양상은 상기의 방법에 의해 제조된 섬유아세포집합체를 제공한다.
섬유아세포집합체를 제조하는 방법에 대해서는 상기한 바와 같다.
상기 섬유아세포집합체는 육안으로 식별가능한 크기의 구형 또는 시트일 수 있으며, 예를 들면, 직경이 300 내지 2000 ㎛인 구형의 섬유아세포집합체일 수 있고, 일 구체예에 있어서, 300 내지 1000 ㎛ 일 수 있다. 상기 구형의 섬유아세포집합체의 직경은 일 구체예에 따른 배양 방법에 의해 통상의 당업자가 육안으로 식별가능한 크기로 조절할 수 있다. 또한 일 구체예에 따른 구형의 섬유아세포집합체는 직경 400 ㎛ 내에 3.0×105 내지 1.0×106 개의 섬유세포를 포함할 수 있다. 또한 일 구체예에 있어서, 상기 섬유아세포집합체는 상피세포성장인자(EGF), 세포외기질(ECM) 또는 혈관내피성장인자(VEGF)를 분비할 수 있다.
따라서, 일 구체예에 따른 섬유아세포집합체는 세포치료제 또는 생리활성물질의 공급시에 세포원(source)로서 유용하게 사용될 수 있으며, 이하, 상기 섬유아세포집합체의 용도는 다음과 같다.
또 다른 양상은 일 구체예에 따른 섬유아세포집합체를 포함하는 피부 재생 또는 혈관 신생을 위한 세포치료제를 제공한다.
또한, 일 구체예에 따른 섬유아세포집합체 또는 그의 배양액을 유효성분으로 포함하는 피부 흉터, 화상, 욕창, 또는 허혈성 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
상기한 바와 같이, 섬유아세포집합체는 상피세포성장인자, 세포외기질 또는 혈관내피성장인자를 분비할 수 있기 때문에, 이를 필요로 하는 개체에 이식되어 세포원으로서의 역할을 수행함으로써 피부 재생, 또는 혈관 신생을 촉진할 수 있다. 또한 피부 재생 또는 혈관 신생을 촉진함으로써, 피부 흉터, 화상, 욕창 또는 허혈성 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물에도 유용하게 이용될 수 있다. 상기 허혈성 질환은 예를 들면, 허혈성 심장질환, 허혈성 심근경색, 허혈성 심부전, 허혈성 장염, 허혈성 혈관질환, 허혈성 안질환, 허혈성 망막증, 허혈성 녹내장, 허혈성 신부전, 허혈성 대머리, 허혈성 뇌졸중 및 허혈성 하지질환을 포함하는 것일 수 있다.
일 구체예 따른 세포치료제 또는 약학적 조성물의 투여량은 유효성분인 세포집합체를 구성하는 섬유아세포집합체를 기준으로 1.0× 105 내지 1.0× 108 세포/kg(체중), 또는 1.0× 107 내지 1.0× 108 세포/kg(체중)일 수 있다. 다만, 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성별, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있고, 당업자라면 이러한 요인들을 고려하여 투여량을 적절히 조절할 수 있다. 투여 횟수는 1회 또는 임상적으로 용인가능한 부작용의 범위 내에서 2회 이상이 가능하고, 투여 부위에 대해서도 1개소 또는 2개소 이상에 투여할 수 있다. 인간 이외의 동물에 대해서도, kg당 인간과 동일한 투여량으로 하거나, 또는 예를 들면 목적의 동물과 인간과의 기관(심장 등)의 용적비(예를 들면, 평균값) 등으로 상기의 투여량을 환산한 양을 투여할 수 있다. 일 구체예에 따른 치료의 대상동물로서는, 인간 및 그 밖의 목적으로 하는 포유동물을 예로 들 수 있고, 구체적으로는 인간, 원숭이, 마우스, 래트, 토끼, 양, 소, 개, 말, 돼지 등이 포함된다.
일 구체예에 따른 세포치료제 또는 약학적 조성물은 유효성분으로서 세포집합체와 약학적으로 허용가능한 담체 및/또는 첨가물을 포함할 수 있다. 예를 들어, 멸균수, 생리식염수, 관용의 완충제(인산, 구연산, 그 밖의 유기산 등), 안정제, 염, 산화방지제(아스코르브산 등), 계면활성제, 현탁제, 등장화제, 또는 보존제 등을 포함할 수 있다. 국소 투여를 위해, 생체고분자(biopolymer) 등의 유기물, 하이드록시아파타이트 등의 무기물, 구체적으로는 콜라겐 매트릭스, 폴리락트산 중합체 또는 공중합체, 폴리에틸렌글리콜 중합체 또는 공중합체 및 그의 화학적 유도체 등과 조합시키는 것도 바람직하다. 일 구체예에 따른 세포치료제 또는 약학적 조성물이 주사에 적당한 제형으로 조제되는 경우에는, 세포집합체가 약학적으로 허용가능한 담체 중에 용해되어 있거나 또는 용해되어 있는 용액상태로 동결된 것일 수 있다.
일 구체예에 따른 세포치료제 또는 약학적 조성물은 그 투여방법이나 제형에 따라 필요한 경우, 현탁제, 용해보조제, 안정화제, 등장화제, 보존제, 흡착방지제, 계면활성화제, 희석제, 부형제, pH 조정제, 무통화제, 완충제, 환원제, 산화방지제 등을 적절히 포함할 수 있다. 상기에 예시된 것들을 비롯하여 본 발명에 적합한 약 학적으로 허용되는 담체 및 제제는 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., 1995]에 상세히 기재되어 있다.
일 구체예에 따른 세포치료제 또는 약학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질 중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 분말, 과립, 정제 또는 캡슐 형태일 수 있다.
또한 다른 양상은 일 구체예에 따른 섬유아세포집합체가 생분해성 고분자 스캐폴드에 적재(loading)된 조직공학용 지지체를 제공한다.
상기한 바와 같이, 일 구체예에 따른 섬유아세포집합체는 상피세포성장인자, 세포외기질 또는 혈관내피성장인자를 분비할 수 있기 때문에, 스캐폴드에 적재된 상태로 이를 필요로 하는 개체에 이식되어 피부 재생, 또는 혈관 신생을 촉진할 수 있다. 상기 조직공학용 지지체는 생분해성 고분자를 성형하여 만든 지지체에 섬유아세포집합체가 적재되어 있는 것일 수 있다.
상기 생분해성 고분자는 생체 내에서 일정 기간 후 자발적으로 서서히 분해되는 것으로, 생체적합성, 혈액친화성, 항석회화 특성, 세포의 영양성분 및 세포간 기질 형성능 중에서 하나 이상의 특성을 갖춘 고분자를 포함할 수 있다. 이러한 생분해성 고분자는 본 발명에서 특별히 그 종류를 한정하지는 않으나, 대표적으로 피브린, 콜라겐, 젤라틴, 키토산, 알지네이트, 히알루론산, 덱스트란, 폴리락트산, 폴리글리콜산(poly(glycolic acid), PGA), 폴리(락트산-co-글리콜산)(poly(lactic-co-glycolic acid), PLGA), 폴리-ε-(카프로락톤), 폴리안하이드리드, 폴리오르토에스테르, 폴리비닐알코올, 폴리에틸렌글리콜, 폴리우레탄, 폴리아크릴산, 폴리-N-이소프로필아크릴아마이드, 폴리(에틸렌옥사이드)-폴리(프로필렌옥사이드)-폴리(에틸렌옥사이드) 공중합체, 이들의 공중합체, 이들의 혼합물 등이 사용될 수 있다. 이때 복합 지지체 중의 생분해성 고분자의 함량은 지지체의 성형의 관점 또는 세포집합체의 적재의 관점에서 5 내지 99 중량%인 것일 수 있다. 상기 복합 지지체는 기존의 공지된 방법, 예를 들어, 염 침출법(solvent-casting and particle-leaching technique), 가스발포법(gas forming technique), 고분자 섬유를 부직포로 만들어 고분자 메쉬(mesh)로 제조하는 방법(fiber extrusion and fabric forming process), 상분리법(thermally induced phase separation technique), 유화 동결 건조법(emulsion freeze drying method), 고압 기체 팽창법(high pressure gas expansion) 등에 따라 생분해성 고분자를 성형하여 제조할 수 있다.
상기와 같이 성형 제조된 지지체는 적재된 세포집합체를 이식된 조직 내로 전달하고, 3차원적으로 세포가 부착 성장하여 새로운 조직이 형성되도록 하는 역할을 할 수 있다. 이때 복합 지지체에 세포가 부착 성장되는 측면에서, 지지체의 공극의 크기와 구조가 영향을 미칠 수 있는데, 영양액이 지지체 내부까지 고르게 침투하여 세포가 잘 성장될 수 있도록 하기 위해서는 공극이 서로 연결된(inter-connecting) 구조를 갖는 것일 수 있다. 또한, 상기 지지체에서 공극은 50 내지 600 ㎛의 평균 직경을 갖는 것일 수 있다.
또 다른 양상은 일 구체예에 따른 섬유아세포집합체를 포함하는 약물 스크리닝용 3차원 배양 시스템을 제공한다.
상기 3차원 섬유아세포집합체는 생체 내 환경을 모방한 인위적인 세포 형태를 갖는 것으로서, 실제의 세포 형태 및 기능 연구, 또는 치료제(예를 들면, 상기의 피부 질환 또는 혈관 질환) 등에 유용하게 사용될 수 있다. 따라서, 상기 3차원 섬유아세포집합체를 포함하는 약물 스크리닝용 3차원 배양 시스템은 의약품 또는 화장품 등의 질병 치료제 효능 테스트, 또는 염증 및 알레르기 테스트 등을 위한 실험에 있어서, 동물실험을 대체할 수 있다.
일 양상에 따른 섬유아세포집합체 또는 그의 제조방법에 의하면, 배양 용기에서 단시간에 다량의 3차원 섬유아세포집합체를 용이하게 수득할 수 있고, 세포외기질에 둘러싸인 3차원 섬유아세포집합체를 세포원으로서 섬유 세포의 손상 없이 주사 제제로 생체 내 이식이 가능하다.
도 1은 일 구체예에 따른 3차원 섬유아세포집합체의 제작 과정을 도식적으로 나타낸 도면이다.
도 2는 일 구체예에 따른 섬유아세포의 세포접착률을 단백질 양에 따라 정량화한 그래프를 나타낸 도면이다.
도 3은 일 구체예에 따른 섬유아세포의 세포 형태 형광염색 사진을 나타낸 도면이다.
도 4는 일 구체예에 따른 섬유아세포의 FAK의 인산화 활성을 나타낸 도면이다.
도 5는 일 구체예에 따른 3차원 섬유아세포집합체 형성 사진을 나타낸 도면이다.
도 6은 일 구체예에 따른 3차원 섬유아세포집합체 형성 사진을 나타낸 도면이다.
도 7은 일 구체예에 따른 3차원 섬유아세포집합의 H&E 염색 결과를 나타낸 도면이다.
도 8은 일 구체예에 따른 3차원 섬유아세포집합체의 제1형 콜라겐 면역형광학적 염색 결과를 나타낸 도면이다.
도 9는 일 구체예에 따른 3차원 섬유아세포집합체의 VEGF 분비량을 나타낸 도면이다.
이하 본 발명을 실시예에 의해 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.
실시예 1: 3차원 섬유아세포집합체 형성
본 실시예에서는 섬유아세포를 섬유아세포에 결합하는 활성을 갖는 단백질이 코팅된 표면을 갖는 배양 용기에서 배양하여 3차원 섬유아세포집합체를 형성하였다.
도 1은 일 구체예에 따른 3차원 섬유아세포집합체의 제작 과정을 도식적으로 나타낸 도면이다.
도 1을 참조하여 설명하면, 섬유아세포를 MBP-FGF2 코팅된 배양 용기에 파종하였다. 이후, 섬유아세포가 배양 용기 표면에서 2차원적으로 배양되면서 탈착되고, 탈착 또는 이탈된 2차원 섬유아세포집합체가 배양 용기에서 부유된 상태로 계속해서 배양되어 1일 후부터는 3차원 섬유아세포집합체가 형성되었다. 일 구체예에 따라 형성된 3차원 섬유아세포집합체는 세포외기질 및 혈관내피성장인자(VEGF) 분비능을 가진다는 것이 확인되었다. 이하에서, 도 1에 제시된 3차원 섬유아세포집합체 형성 과정 및 특성 분석 방법 및 결과를 설명한다.
1. 섬유아세포의 세포접착 특성 및 접착 후 형태 변화 분석
3차원 섬유아세포집합체를 형성을 유도하는 배양 방법을 구축하기 위해, 섬유아세포의 세포접착 특성, 접착기질에 따른 세포접착 시그널 및 세포 형태를 분석하였다.
(1) 섬유아세포의 세포접착 분석
비-조직세포 배양용 96-웰 플레이트(Non-Tissue Culture Treated 96-well Plate, "NTCP", 폴리스티렌 재질로 표면이 소수성을 띰, Falcon사)에 각각 ECM 피브로넥틴(fibronectin) (20 ㎍/ml), MBP (10 ㎍/ml) , MBP-VEGF(10 ㎍/ml), MBP-HBD (100 ㎍/ml), 및 MBP-FGF2 (10 ㎍/ml)를 4시간 동안 코팅한 후 PBS로 3번 세척하였다. 그 후 100 ㎍/ml BSA를 이용해 1시간 동안 블록킹하고 PBS로 3번 세척하였다. 1 웰 당 5x104cells/cm2의 섬유아세포를 무혈청 DMEM배지에 현탁한 후 각각의 단백질이 코팅된 96 웰 플레이트에 파종하여 37℃ 배양기에서 주어진 1 시간 동안 용해한 후, 세포의 형태를 관찰하였다. 접착된 세포를 세포 용해 버퍼로 용해한 후 BCA(bicinchoninic acid) 어세이에 의해 단백질을 측정함으로서 접착된 세포를 정량하였다.
도 2는 일 구체예에 따른 섬유아세포의 세포접착률을 단백질 양에 따라 정량화한 그래프를 나타낸 도면이다.
도 2에서 나타난 바와 같이, BSA, MBP, 및 MBP-VEGF로 코팅한 NTCP에서는 세포 접착이 일어나지 않았다. 한편, MBP-FGF2로 코팅된 NTCP에서는 세포 파종 후 한 시간 후에 세포막의 인테그린과 결합하는 ECM-피브로넥틴보다 낮은 접착율을 나타내었다.
(2) 섬유아세포의 접착기질에 따른 세포 형태 분석
상기 실시예 1의 1(1)에서 각각 피브로넥틴 및 MBP-FGF2로 코팅된 NTCP에서 배양된 섬유아세포의 세포의 형태를 비교하기 위하여 접착 후 30분, 1시간, 4시간 된 섬유아세포를 팔로이딘(palloidin)으로 염색하였다.
도 3은 일구체예에 따른 섬유아세포의 세포 형태 형광염색 사진을 나타낸 도면이다.
도 3에 나타난 바와 같이, MBP-FGF2에 접착된 섬유아세포는 피브로넥틴에 접착된 섬유아세포에 비해 세포골격이 활성화되지 않음을 확인할 수 있다. 이는 MBP-FGF에 접착된 섬유아세포의 접착이 피브로넥틴에 접착한 섬유아세포에 비교해서 세포막에 존재하는 세포접착분자인 인테그린(integrin)을 매개로 한 세포접착활성이 제한되어 있다는 것을 의미한다.
(3) 섬유아세포의 접착기질에 따른 세포접착 시그널 분석
상기 실시예 1의 1(1)에서 각각 피브로넥틴 및 MBP-FGF2로 코팅된 NTCP에서 배양된 섬유아세포의 세포접착 시그널을 비교하기 위하여 초점 접착 키나아제 (focal adhesion kinase) (FAK)의 인산화를 측정하였다. FAK의 인산화 측정하기 위하여 접착 후 30분, 1시간, 4시간 된 섬유아세포를 항 포스포-FAK 항체(Cell signalling사)를 이용하여 웨스턴 블랏 분석을 수행하였다.
도 4는 일 구체예에 따른 섬유아세포의 FAK의 인산화 활성을 나타낸 도면이다.
도 4에 나타난 바와 같이, MBP-FGF2에 접착된 섬유아세포는 피브로넥틴에 접착된 섬유아세포에 비해 FAK의 인산화가 활성화되지 않음을 확인할 수 있다. 이는 MBP-FGF2에 접착된 섬유아세포에서 인테그린을 매개로 한 세포접착활성이 낮다는 것을 의미한다.
2. 3차원 섬유아세포집합체 형성
실시예 1의 1(1) 내지 (3)의 결과를 바탕으로, 3차원 섬유아세포직체를 형성하기 위한 배양방법을 구축하였다.
섬유아세포를 고농도 글루코즈 DMEM 배지(FGM 배지)를 함유하는 MBP-FGF2로 코팅된 폴리스틸렌 표면이 가동된 12, 24, 48, 및 96-웰 NTCP의 각 웰에 0.5×104 세포/cm2 내지 1.5×105 세포/cm2의 세포농도로 파종한 후, 37℃ 정치배양기에서 각각 1, 2, 3일간 배양하였다. 배양 초기에는 시트형태로 존재하는 섬유아세포는 시간이 지남에 따라 배양표면에서 탈착되어 1일 후부터 세포체로서 존재하여 트립신과 같은 효소처리 없이 피펫으로 쉽게 회수가 가능하다.
도 5는 일 구체예에 따른 3차원 섬유아세포집합체 형성 사진을 나타낸 도면이다.
도 5에 나타난 바와 같이, FGM을 이용하여 배양 시에 1.25×105 세포/cm2 이상의 세포 농도에서 효율적인 3차원 섬유아세포집합체 형성을 유도함을 확인할 수 있다. 이보다 낮은 세포 농도 조건에서는 세포-세포 간 상호작용을 위해 요구되는 세포 간 거리가 충분히 가깝지 않아서 세포집합체 형성이 잘 이루어지지 않을 수 있다. FGM이 아닌 배지에서도 세포집합체는 형성되나, FGM에서의 세포집합체 형성 세포 농도보다 높은 조건이 요구될 수 있다.
도 6은 일 구체예에 따른 3차원 섬유아세포집합체 형성 사진을 나타낸 도면이다.
도 6에 나타낸 바와 같이, 웰 크기에 따라 MBP-FGF2로 코팅된 표면에서 육안으로 검출되는 400 내지 1000 ㎛ 이상 크기의 3차원 구형 세포집합체를 형성함을 확인할 수 있다.
3. 3차원 섬유아세포집합체의 분비능 분석
(1) 세포외기질(ECM) 분비능 분석
실시예 1의 2에서 다양한 종류의 MBP-FGF2로 코팅된 웰-NTCP (12, 24, 48, 96-웰)에 1.25 ×105 cells/cm2 세포 농도로 파종하여 형성된 3차원 세포집합체를 PBS로 수회 세척하고 4% 파라포름알데히드를 30분 간 실온에서 처리함으로써 고정화하였다. 그 후 다양한 농도의 에탄올을(50~100%) 이용하여 탈수 한 후, 파라핀을 이용하여 포매하였다. 제조된 파라핀 블록은 마이크로톰을 이용해 두께 4㎛로 자르고 슬라이드 글라스에 고정시킨 후 H&E 염색 및 피브로넥틴과 콜라겐 타입 1에 대한 면역학적 염색을 수행하였다. 콜라겐 타입 1의 염색은 형광면역염색을 수행하였다. 상기에서 준비된 슬라이드 글라스를 먼저 BSA(4%)에 1시간 동안 처리하였고 그 후 일차 항체를 함유한 PBS에 담가 밤새 반응시킨 후 PBS로 3회 세척하고, 이를 다시 이차 항체와 암실에서 1시간 동안 반응시켰다. DAPI를 이용한 핵 염색을 추가로 수행한 후 공초점 현미경으로 분석하였다. 대조군은 일차 항체를 사용하지 않고 동일한 처리를 수행하여 분석하였다.
도 7은 일 구체예에 따른 3차원 섬유아세포집합체에 H&E 염색 결과를 나타낸 도면이다.
도 7에 나타난 바와 같이, 배양 1일 후 모든 웰에서 동일한 농도로 처리한 섬유아세포들이 세포집합체를 형성하는 것을 확인하였다.
도 8은 일 구체예에 따른 3차원 섬유아세포집합체의 제 1형 콜라겐 면역형광학적 염색 결과를 나타낸 도면이다.
도 8에 나타난 바와 같이, 콜라겐이 3차원 섬유아세포집합체 내 전반적으로 염색된 것을 확인할 수 있고, 이를 통해 세포집합체 형성 시 콜라겐이 많이 분비되는 것을 알 수 있다.
(2) 혈관내피성장인자(VEGF) 분비량 분석
실시예 1의 2에서 1.25×105 cells/cm2 세포농도로 MBP-FGF2로 코팅된 96-웰 NTCP에 파종하여 형성된 3차원 세포집합체를 회수하여 혈관내피세포성장인자(VEGF) 분비량을 측정하였다.
구체적으로, 형성된 3차원 세포집합체를 10개씩 모아 6-웰 NTCP로 옮긴 후 PBS로 1회 세척하였다. 추가적으로 FBS를 함유하지 않은 alpha MEM (Lonza사)으로 1회 세척한 뒤 alpha MEM (1.5 mL)을 넣고 정치배양기에 1일 간 배양하였다. 이 후 미리 정해둔 날짜마다 배양액을 수득하고 동량의 새 배양액을 넣어주었다. 수득한 배양액 내 존재하는 VEGF는 ELISA 키트 (R&D사)를 이용하여 정량하였다. 키트 사용 방법은 공급사의 프로토콜을 따라 진행하였다. 도 9은 일 구체예에 따른 3차원 섬유아세포집합체의 VEGF 분비량을 나타낸 도면이다.
도 9는 일 구체예에 따른 3차원 섬유아세포집합체의 VEGF 분비량을 나타낸 도면이다.
도 9에 나타낸 바와 같이, 3차원 섬유아세포집합체는 2차원적으로 배양된 세포보다 VEGF양이 두 배 이상 증가함을 알 수 있었다.

Claims (20)

  1. 섬유아세포를 MBP-FGF2가 코팅된 표면을 갖는 배양 용기 중의 액체 배지 중에서 배양하여, 상기 표면으로부터 섬유아세포가 이탈되어 형성된 섬유아세포집합체(fibroblast cluster)를 포함하는 배양물을 얻는 단계; 및
    상기 배양물로부터 섬유아세포집합체를 분리하는 단계;를 포함하는 섬유아세포집합체를 생산하는 방법으로서,
    상기 MBP-FGF2는 섬유아세포와 섬유아세포 사이의 결합보다 더 약하게 섬유아세포와 결합하는 것인 방법.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 배양하는 단계에서, 상기 섬유아세포는 배양 초기에는 배양 용기의 표면에 접착하여 증식한 후 성장함에 따라 배양 용기의 표면으로부터 이탈하는 것인 방법.
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 MBP-FGF2는 배지 중에서 섬유아세포와 피브로넥틴이 결합하는 것보다 상기 섬유아세포와 더 약하게 결합하는 것인 방법.
  4. 청구항 1에 있어서, 상기 MBP-FGF2는 섬유아세포의 세포막에 존재하는 인테그린(integrin)과 결합하지 않는 것인 방법.
  5. 청구항 1에 있어서, 상기 MBP-FGF2는 섬유아세포의 세포막에 존재하는 헤파란 설페이트 프로테오글리칸(heparan sulfate proteoglycan)에 결합하는 것인 방법.
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 청구항 1에 있어서, 상기 배양 용기의 표면은 실란화된 표면(silanized surface), 탄화수소 코팅된 표면(hydrocarbon coated surface), 고분자 표면 및 금속 표면으로 구성된 군으로부터 선택되는 소수성 표면인 것인 방법.
  9. 청구항 8에 있어서, 상기 고분자가 폴리스티렌(polystyrene), 폴리메틸메타크릴레이트(PMMA), 폴리에틸렌 테레프탈레이트(PET), 폴리비닐클로라이드(PVC), 폴리에틸렌(PE), 폴리프로필렌(PP), 폴리테트라플루오르에틸렌(PTFE), 폴리(L-락트산)(PLLA), 폴리(D,L-락트산）(PDLLA), 폴리(글리콜산)(PGA), 폴리(카프로락톤)(PCL), 폴리(하이드록시알카노에이트), 폴리다이옥산온(PDS), 폴리트라이메틸렌카보네이트, 및 그들의 공중합체로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  10. 청구항 1에 있어서, 상기 섬유아세포를 배양하기 전에 섬유아세포를 계대 증식하는 것을 더 포함하는 것인 방법.
  11. 청구항 1에 있어서, 상기 섬유아세포를 1.0×104 내지 2.0×105 세포/cm2의 세포 농도로 파종하는 것인 방법.
  12. 청구항 1에 있어서, 상기 배양은 1일 내지 1주일 동안 수행하는 것인 방법.
  13. 청구항 1에 있어서, 상기 형성된 섬유아세포집합체를 배양물로부터 분리하는 단계는 효소의 처리 없이 분리하는 것인 방법.
  14. 청구항 1에 있어서, 상기 섬유아세포집합체는 구형상, 시트(sheet) 또는 그 조합인 것인 방법.
  15. 청구항 1의 방법에 의해 제조된 섬유아세포집합체는 구형이고, 직경이 300 내지 1000 ㎛이며, 직경 400 ㎛ 당 3.0×105 내지 1.0×106의 세포를 포함하는 것인 섬유아세포집합체.
  16. 삭제
  17. 청구항 15에 있어서, 상기 섬유아세포집합체는 세포외기질(ECM) 또는 혈관내피성장인자(VEGF)를 분비하는 것인 섬유아세포집합체.
  18. 섬유아세포가 액체 배지 중에서 MBP-FGF2가 코팅된 표면을 갖는 배양 용기의 표면에 접착되고, 상기 MBP-FGF2는 섬유아세포와 섬유아세포 사이의 결합보다 더 약하게 섬유아세포와 결합하는 것인, 섬유아세포집합체 형성을 위한 배양 용기.
  19. 청구항 15의 섬유아세포집합체 또는 그의 배양액을 유효성분으로 포함하는 피부 흉터, 화상, 욕창 또는 창상의 예방 및 치료용 약학적 조성물.
  20. 청구항 15의 섬유아세포집합체 또는 그의 배양액을 포함하는 허혈성 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물.
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