CN114292894B

CN114292894B - 一种用体外细胞评价化妆品及原料紧致功效的方法

Info

Publication number: CN114292894B
Application number: CN202210045156.6A
Authority: CN
Inventors: 郭沈涛; 崔玉矫; 徐文枫; 陈媛; 苏秀妹; 莫思琪
Original assignee: Guangdong Youzhi Testing Technology Co ltd
Current assignee: Guangdong Youzhi Testing Technology Co ltd
Priority date: 2022-01-14
Filing date: 2022-01-14
Publication date: 2023-08-11
Anticipated expiration: 2042-01-14
Also published as: CN114292894A

Abstract

本发明公开了一种用体外细胞评价化妆品及原料紧致功效的方法，旨在提供一种采用细胞作为检测手段用于评价化妆品紧致功效的测试方法，该方法采用细胞替代人体试验，符合实验动物“3R”原则，测试方法经济快捷，测试过程可控，测试体系标准化，避免因人体个体差异引起的较大的结果偏差。所述测试方法为，体外培养皮肤成纤维细胞传代细胞系，将待测样品加入细胞中进行测试，首先测试样品的细胞毒性，再选择无细胞毒性的浓度进行弹性蛋白表达测试，通过统计学手段分析评价样品的紧致功效。本测试方法还通过多次实际应用，建立了紧致功效的判定标准；本测试方法用于评价化妆品及其原料的紧致功效评价，属于化妆品技术领域。

Description

一种用体外细胞评价化妆品及原料紧致功效的方法

技术领域

本发明涉及一种测试方法，具体地说，是一种化妆品及其原料紧致功效的测试方法；属于化妆品测试技术领域。

技术背景

化妆品紧致功效，指使用化妆品后有助于保持皮肤的紧实度、弹性。具有紧致功效的化妆品，应当通过化妆品功效宣称评价试验方式，可以同时结合文献资料或研究数据分析结果，进行功效宣称评价。根据化妆品功效宣称评价项目要求，紧致功效可采用人体功效评价试验、消费者使用测试和实验室试验三种方法中任一种方法进行评价。

弹性纤维由弹性蛋白和微原纤维构成，分布于真皮及皮下组织，使皮肤具有弹性。随着年龄的增长和外界环境的影响，一方面弹性蛋白的合成能力逐渐降低，另一方面体内弹性蛋白酶的产生增多，蛋白降解加速，最终导致皮肤表层变薄，失去水分和弹性。因此，降低体内弹性蛋白酶的产生速度或抑制其活性，或者促进皮肤弹性蛋白的合成能力均有助于保持皮肤的紧实度和弹性。同时，及时给皮肤补充水分，也有助于保持皮肤屏障正常，促进紧致的效果。

人皮肤成纤维细胞能在体内合成原弹性蛋白并分泌至胞外，原弹性蛋白在赖氨酰氧化酶等的催化氧化下形成其特有的交联结构而形成弹性蛋白。因此，人皮肤成纤维细胞可以作为研究化妆品促进弹性蛋白合成的细胞模型，通过测定给药后，空白组与实验组弹性蛋白含量上调率，评价受试物是否具有促进弹性蛋白合成的能力，从而评价样品的紧致功效。

发明内容

为此，本发明的目的是通过检测样品促进人皮肤成纤维细胞中弹性蛋白合成的作用，从而评价样品的紧致功效；该方法经济快捷，测试过程可控，测试体系标准化，避免因人体个体差异引起的较大的结果偏差。

一种用体外细胞评价化妆品及原料紧致功效的方法，依次包括下述步骤：

(1)体外培养人皮肤成纤维细胞传代细胞系，本发明所述的人皮肤成纤维细胞传代细胞系，是一种传代细胞系，可来源于各个细胞保藏中心或其他商业模式购得；

(2)调整人皮肤成纤维细胞细胞浓度至3.0×10⁴～5.0×10⁴cell/mL，加入96孔细胞培养板中，100μl/孔。将细胞板盖好，封边，置温度37℃、CO₂浓度5.0％条件下培养24±2h，至细胞融合度达50％以上时用于细胞毒性检测；

(3)将2)培养好的细胞板，弃去培养液；将样品用细胞培养基稀释成50％浓度，再以的稀释因子稀释成6-8个不同浓度，加入细胞板中，同时设不加样品的细胞对照组、不加细胞及样品的空白对照组，100μl/孔，培养44-48h后，显微镜下观察细胞状态，弃去培养液，洗细胞板1-2次，加入MTT溶液，继续培养2-6h，弃去培养液，加入150μl/孔的DMSO，震荡5-10min，于570nm处测定吸光值。根据吸光值测定结果采用公式细胞活力(％)＝(OD_样品-OD_空白)/(OD_阴性-OD_空白)×100％计算细胞活力，其中OD_样品为样品组的OD值，OD_阴性为细胞对照组的OD值，OD_空白为空白组的OD值。根据细胞活力结果，筛选出细胞活力在90％或以上的样品浓度，作为无明显细胞毒性的样品浓度供下一步实验；

(4)重新培养细胞，调整细胞浓度至3.0×10⁴～5.0×10⁴cell/mL，加入96孔细胞培养板中，100μl/孔。将细胞板盖好，封边，置温度37℃、CO₂浓度5.0％条件下培养24±2h用于样品弹性蛋白表达测试；

(5)将(4)培养好的细胞板，弃去培养液，用PBS洗1-2次。根据(3)细胞毒性测定的结果，将样品稀释至无明显细胞毒性的浓度，加入细胞板中，100μl/孔，共加样3孔，同时设空白对照和阳性对照，其中空白对照加100μl/孔的DMEM，阳性对照加100μl/孔的含100ng/ml重组人转化生长因子TGF-β的DMEM培养基。加样完毕，置温度37℃、CO₂浓度5.0％条件下培养22-48h。培养结束后，从细胞板中每孔取细胞培养液进行弹性蛋白含量检测。

(6)采用酶联免疫吸附(ELISA)方法进行细胞培养液弹性蛋白含量测试，具体测试方法按照人弹性蛋白酶联免疫试剂盒的使用说明书进行。根据ELISA试剂盒标准曲线，分别计算出样品组、空白对照组和阳性对照组的弹性蛋白含量。

(7)结果统计分析

弹性蛋白表达上调率(％)＝(T-C)/C×100％

式中，T指样品组的弹性蛋白含量平均值，C为空白对照组的弹性蛋白含量平均值。

进一步的，上述的一种用体外细胞评价化妆品及原料紧致功效的方法，所述的人皮肤成纤维细胞的培养方法为：取长成良好单层的细胞，弃去细胞培养基，用新鲜无血清培养基或PBS轻轻清洗1次，弃去，加入适量(以浸没所有细胞单层表面为准)的0.25％EDTA-胰酶溶液消化1～5min，弃去EDTA-胰酶溶液，加入8～10ml含10％牛血清的DMEM培养基，吹打分散细胞，使细胞均匀分散。取细胞悬液计数，根据细胞数调整细胞浓度至3.0×10⁴～5.0×10⁴cell/mL，放置温度37℃、CO₂浓度5.0％条件下培养24～72h。

进一步的，上述的一种用体外细胞评价化妆品及原料紧致功效的方法，所述的细胞培养板为96孔细胞培养板。

进一步的，上述的一种用体外细胞评价化妆品及原料紧致功效的方法，所述步骤2)至步骤4)所述的培养是将细胞板盖好，封边，置温度37℃、CO₂浓度5.0％条件下培养24～48h。

进一步的，上述的一种用体外细胞评价化妆品及原料紧致功效的方法，所述洗细胞板采用PBS溶液洗。

进一步的，上述的弹性蛋白表达测试的方法是将样品加入细胞后培养22-48h，培养结束后，从细胞板中每孔取细胞培养液进行弹性蛋白含量检测。

进一步的，上述的弹性蛋白含量检测采用酶联免疫吸附(ELISA)方法。

进一步的，上述的一种用体外细胞评价化妆品及原料紧致功效的方法，所述判定标准为，当阳性对照组的弹性蛋白表达上调率≥20％时，试验成立。用GraphPad Prism软件或其他统计学软件进行统计及显著性分析，计算P值，P＜0.01表示具有显著性差异。样品组与空白对照组相比，当P＜0.01且样品组的弹性蛋白上调率为正数时，可判定样品具有紧致功效。

与现有技术相比，本发明提供的技术方案采用体外培养人皮肤成纤维细胞，将待测样品加入细胞中进行测试，首先测试样品的细胞毒性，再选择无细胞毒性的浓度进行人皮肤成纤维细胞弹性蛋白表达及弹性蛋白含量测定试验，通过统计学手段分析评价样品的紧致功效。本测试方法还通过多次实际应用，建立了紧致功效的判定标准，该方法经济快捷，测试过程可控，测试体系标准化，避免因人体个体差异引起的较大的结果偏差。本发明公开的方法属于实验室试验方法。

附图说明

图1是样品的细胞毒性曲线图；

图2是弹性蛋白含量检测结果；

图3是样品使用前后皮肤回弹时间的变化趋势；

图4是样品的细胞毒性曲线图；

图5是弹性蛋白含量检测结果。

具体实施方式

下面对本发明实施的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的主要测试流程，对于未特别注明的工艺参数或者条件，可参照常规技术进行。

实施例1

本发明提供的一种用体外细胞评价化妆品及原料紧致功效的方法，采用体外细胞作为测试手段，用于评价化妆品及其原料的紧致功效。

其中，所述的细胞测试方法主要分为细胞传代培养、样品细胞毒性测试、样品弹性蛋白含量测试。

具体实施方式为：

采用人皮肤成纤维细胞进行测试。本发明所述的人皮肤成纤维细胞传代细胞系，是一种传代细胞系，可来源于各个细胞保藏中心或其他商业模式购得。本发明所述的人皮肤成纤维细胞为HFF-1株，来源于中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。

一、细胞的培养

将冻存的人皮肤成纤维细胞从液氮罐取出，进行细胞的复苏和传代培养。

复苏培养具体方式为：将冻存细胞在37℃左右水浴快速溶解，800～1000rpm低速离心5～10min，弃去上清液，底部细胞用含10％牛血清的DMEM培养基重悬，转移置T25细胞瓶中，放置温度37℃、CO₂浓度5.0％条件下培养24～72h，当细胞融合度达80％以上时进行传代培养。

传代培养具体方式为：弃去细胞培养基，用新鲜无血清培养基或PBS轻轻清洗1次，弃去，加入适量(以浸没所有细胞单层表面为准)的0.25％EDTA-胰酶溶液消化1～5min，弃去EDTA-胰酶溶，加入8～10ml含10％牛血清的DMEM培养基，吹打分散细胞，使细胞均匀分散。取细胞悬液计数，根据细胞数调整细胞浓度至3.0×10⁴～5.0×10⁴cell/mL，放置温度37℃、CO₂浓度5.0％条件下培养24～72h。

为保证细胞的活力和稳定，本方法采用复苏后2代以上的细胞进行测试，细胞复苏后传代代数控制在30代之内。

二、细胞毒性测试：

调整步骤一)培养好的细胞浓度至3.0×10⁴～5.0×10⁴cell/mL，加入96孔细胞培养板中，100μL/孔。将细胞板盖好，封边，置温度37℃、CO₂浓度5.0％条件下培养24±2h，至细胞融合度达50％以上时用于细胞毒性检测。

将上述培养好的细胞板，弃去培养液。将样品用细胞培养基稀释成50％浓度，再以的稀释因子稀释成6-8个不同浓度，加入细胞板中，同时设不加样品的细胞对照组、不加细胞及样品的空白对照组，100μl/孔，培养44-48h后，显微镜下观察细胞状态，弃去培养液，洗细胞板1-2次，加入MTT溶液，继续培养2-6h，弃去培养液，加入150μl/孔的DMSO，震荡5-10min，于570nm处测定吸光值。

根据结果采用公式细胞活力(％)＝(OD_样品-OD_空白)/(OD_阴性-OD_空白)×100％计算细胞活力，其中OD_样品为样品组的OD值，OD_阴性为细胞对照组的OD值，OD_空白为空白组的OD值。根据细胞活力结果并结合细胞形态，筛选出细胞活力在90％或以上、细胞形态与细胞对照组无明显差异的浓度，作为无明显细胞毒性的样品浓度供下一步实验。

所述的无明显细胞毒性的样品浓度筛选标准：该浓度下细胞的形态与空白对照组无明显差异，细胞毒性测试结果显示相对细胞活力不低于90％。

三、样品弹性蛋白含量测试

按步骤一)的方法重新培养细胞，调整细胞浓度至3.0×10⁴～5.0×10⁴cell/mL，加入96孔细胞培养板中，100μl/孔。将细胞板盖好，封边，置温度37℃、CO₂浓度5.0％条件下培养24±2h用于样品弹性蛋白表达测试；

将培养好的细胞板，弃去培养液，用PBS洗1-2次。根据细胞毒性测试的结果，将样品稀释至无明显细胞毒性的浓度，加入细胞板中，100μl/孔，共加样3孔，同时设空白对照和阳性对照，其中空白对照加100μl/孔的DMEM，阳性对照加100μl/孔的含100ng/ml重组人转化生长因子TGF-β的DMEM培养基。加样完毕，置温度37℃、CO₂浓度5.0％条件下培养22-48h。培养结束后，从细胞板中每孔取细胞培养液进行弹性蛋白含量检测。

采用酶联免疫吸附(ELISA)方法进行细胞培养液弹性蛋白含量测试，具体测试方法按照人弹性蛋白酶联免疫试剂盒的使用说明书进行。根据ELISA试剂盒标准曲线，分别计算出样品组、空白对照组和阳性对照组的弹性蛋白含量。

4.结果统计分析

弹性蛋白表达上调率(％)＝(T-C)/C×100％

本发明还公开了应用本测试方法判定样品舒缓功效的标准，具体实施方式为：

根据上述实施方式第4项的测试结果，当阳性对照组的弹性蛋白表达上调率≥20％时，试验成立。用GraphPad Prism软件或其他统计学软件进行统计及显著性分析，计算P值，P＜0.01表示具有显著性差异。样品组与空白对照组相比，当P＜0.01且样品组的弹性蛋白上调率为正数时，可判定样品具有紧致功效。

用细胞方法检测无紧致功效的样品，可选择采用人体评价方法进一步判定。

采用本申请提供的技术方案进行下述化妆品及其原料检测，其方法和结果如下：

应用例1

1、一种具有紧致功效化妆品A测试方法：

1.1、样品名称：二裂酵母水2#。

1.2、方法：

1.2.1、细胞测试方法：按本发明所述的方法进行样品的紧致功效测试。首先将样品稀释成50％的初始浓度，再按的稀释因子稀释成6个不同浓度在人皮肤成纤维细胞上开展细胞毒性实验，具体浓度详见表1。根据细胞毒性结果，选择无细胞毒性的浓度进行弹性蛋白表达试验。

1.2.2、人体测试方法：通12例健康中国受试者连续使用测试样品28天，比较使用前后受试者的皮肤回弹时间变化，评价测试样品的紧致效果。数据统计分析：统计分析软件为SPSS，采用Shapiro-WilkTest进行数据改善值正态分布的显著性检验，Sig.(双侧)＞0.01，则呈正态分布，进行配对t检验。Sig.(双侧)＜0.01，则呈非正态分布，进行Wilcoxon检验。

“n.s.”表示无统计学差异，P＞0.05；“*”表示有显著性差异，且0.01≤P＜0.05，记“*”；0.001≤P＜0.01，记“**”；p＜0.001，记：“***”。

变化率(百分比)＝(使用后数据均值-使用前数据均值)/使用前数据均值。

1.3、结果

1.3.1、细胞毒性结果

将样品稀释成6个不同浓度在人皮肤成纤维细胞上开展细胞毒性实验，细胞毒性结果显示，样品在1.09％浓度下，HFF-1细胞的存活率为107.60％，无明显细胞毒性。因此，选择1％浓度进行下一步实验。结果详情见表1、图1。

表1样品的细胞毒性检测结果

1.3.2、弹性蛋白含量测试结果

将样品稀释为无细胞毒性的浓度，即1％浓度，在人皮肤成纤维细胞上开展弹性蛋白表达试验。根据实验结果可知，组间复孔的OD值的变异系数CV值≤20％，PC组与NC组相比，弹性蛋白上调率≥20％，实验体系有效。当样品浓度为1％时，弹性蛋白含量为0.76±0.013ng/mL，与NC组相比，弹性蛋白含量的上调率为38.79％，具有显著性差异(P＜0.01)。检测结果见表2、图2。

表2弹性蛋白含量检测结果

1.3.3、人体试验结果

通过12例健康中国受试者使用该测试样品28天，受试者皮肤回弹时间下降了19.86％，且与使用前相比具有显著性(P＜0.01)；说明测试样品具有紧致效果。

表3各测试指标描述性统计结果

表4皮肤回弹时间测试统计分析结果

注：皮肤回弹时间越低，表示皮肤越紧致。

应用例2

一种具有紧致功效化妆品B测试方法：

2.1、样品名称：抗皱紧致精华水6#。

2.2、方法：按本发明所述的方法进行样品的紧致功效测试。首先将样品稀释成50％的初始浓度，再按的稀释因子稀释成6个不同浓度在人皮肤成纤维细胞上开展细胞毒性实验，具体浓度详见表1。根据细胞毒性结果，选择无细胞毒性的浓度进行弹性蛋白表达试验。

2.3、结果

2.3.1、细胞毒性结果

将样品稀释成6个不同浓度在人皮肤成纤维细胞上开展细胞毒性实验，细胞毒性结果显示，样品在1.09％浓度下，HFF-1细胞的存活率为100.62％，无明显细胞毒性。因此，选择1％浓度进行下一步实验。结果详情见表5、图4。

表5样品的细胞毒性检测结果

2.3.2、弹性蛋白含量测定结果

将样品稀释为所需浓度，进行弹性蛋白含量测定实验。根据实验结果可知，组间复孔的OD值的变异系数CV值≤20％，PC组与NC组相比，弹性蛋白上调率≥20％，实验体系有效。样品浓度为1％时，弹性蛋白含量为0.83±0.080ng/mL，与NC组相比，弹性蛋白含量的上调率为50.48％，具有显著性差异(P＜0.01)。检测结果见表6、图5。

表6弹性蛋白含量检测结果

Claims

1.一种用体外细胞评价化妆品及原料紧致功效的方法，其特性在于，依次包括下述步骤：

1)人皮肤成纤维细胞传代培养

2)样品细胞毒性测试

将步骤1)培养好的细胞板，调整细胞浓度至3.0×10⁴～5.0×10⁴cell/mL，再次培养至细胞融合度达50％以上时，收集细胞培养基，将样品用细胞培养基稀释成50％浓度，再以的稀释因子稀释成6-8个不同浓度，加入细胞板中，同时设不加样品的细胞对照组、不加细胞及样品的空白对照组，100μl/孔，培养44-48h后，弃去培养液，洗细胞板1-2次，加入MTT溶液，继续培养2-6h，弃去培养液，加入150μl/孔的DMSO，震荡5-10min，于570nm处测定吸光值，筛选出细胞活力在90％或以上、细胞形态与细胞对照组无明显差异的浓度，作为无明显细胞毒性的样品浓度；

所述的细胞活力计算公式为：

细胞活力(％)＝(OD_样品-OD_空白)/(OD_阴性-OD_空白)×100％，

其中OD_样品为样品组的OD值，OD_阴性为细胞对照组的OD值，OD_空白为空白组的OD值；

3)样品弹性蛋白含量测试

将步骤1)培养好的细胞板，调整细胞浓度至3.0×10⁴～5.0×10⁴cell/mL，加入96孔细胞培养板中，100μl/孔，再次培养后，弃去培养液，用PBS洗1-2次，将样品稀释至无明显细胞毒性的浓度，加入细胞板中，同时设空白对照组和阳性对照组，其中空白对照组加100μl/孔的DMEM，阳性对照加100μl/孔的含100ng/ml重组人转化生长因子TGF-β的DMEM培养基；加样完毕，置温度37℃、CO₂浓度5.0％条件下培养22-48h后，从细胞板中每孔取细胞培养液，采用酶联免疫吸附方法进行细胞培养液弹性蛋白含量测试，根据ELISA试剂盒标准曲线，分别计算出样品组、空白对照组和阳性对照组的弹性蛋白含量；

4)结果统计分析

a.弹性蛋白表达上调率(％)＝(T-C)/C×100％

式中，T指样品组的弹性蛋白含量平均值，C为空白对照组的弹性蛋白含量平均值；

阳性对照组的弹性蛋白表达上调率≥20％时，试验成立；

b.用GraphPadPrism软件或其他统计学软件进行统计及显著性分析，计算P值，P<0.01表示具有显著性差异；样品组与空白对照组相比，当P<0.01且样品组的弹性蛋白上调率为正数时，可判定样品具有紧致功效；

所述的人皮肤成纤维细胞传代培养方式为：将冻存的人皮肤成纤维细胞从液氮罐取出，进行细胞的复苏培养和传代培养；

所述的传代培养具体方式：将复苏培养后的细胞板弃去细胞培养基，用新鲜无血清培养基或PBS轻轻清洗1次，弃去，加入适量0.25％EDTA-胰酶溶液浸没所有细胞单层表面消化1～5min，弃去EDTA-胰酶溶液，加入8～10ml含10％牛血清的DMEM培养基，吹打分散细胞，使细胞均匀分散，取细胞悬液计数，根据细胞数调整细胞浓度至3.0×10⁴～5.0×10⁴cell/mL，放置温度37℃、CO₂浓度5.0％条件下培养24～72h。

2.根据权利要求1所述的一种用体外细胞评价化妆品及原料紧致功效的方法，其特性在于，所述的人皮肤成纤维细胞为HFF-1株。

3.根据权利要求1所述的一种用体外细胞评价化妆品及原料紧致功效的方法，其特性在于，所述的复苏培养方式为：将冻存细胞在37℃左右水浴快速溶解，800～1000rpm低速离心5～10min，弃去上清液，底部细胞用含10％牛血清的DMEM培养基重悬，转移置T25细胞瓶中，放置温度37℃、CO₂浓度5.0％条件下培养24～72h，当细胞融合度达80％以上时进行传代培养。

4.根据权利要求1所述的一种用体外细胞评价化妆品及原料紧致功效的方法，其特性在于，步骤2)、步骤3)所述的再次培养是将细胞板盖好，封边，置调整细胞浓度后的细胞板在37℃、CO2浓度5.0％条件下培养24±2h。