CN118147266A - 一种用体外细胞评价化妆品及原料控油功效的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用体外细胞评价化妆品及原料控油功效的方法，测试方法为：体外培养皮脂腺细胞传代细胞系，将待测样品加入细胞中进行测试，首先测试样品的细胞毒性，再选择无细胞毒性的浓度，采用荧光染色技术，结合荧光检测设备进行油脂抑制测试，通过统计学手段分析评价样品的控油功效。旨在提供一种采用细胞作为检测手段用于评价化妆品控油功效的测试方法，该方法采用细胞替代人体试验，符合实验动物“3R”原则，测试方法经济快捷，测试过程可控，测试体系标准化，避免因人体个体差异引起的较大的结果偏差。本测试方法还通过多次实际应用，建立了控油功效的判定标准；本测试方法用于评价化妆品及其原料的控油功效评价，属于化妆品测试技术领域。
Description
技术领域
本发明涉及一种测试方法，具体地说，是一种用体外细胞评价化妆品及其原料控油功效的测试方法；属于化妆品测试技术领域。
技术背景
化妆品控油功效，指使用化妆品后有助于减缓施用部位皮脂分泌和沉积，或使施用部位出油现象不明显。具有控油功效的化妆品，应当通过化妆品功效宣称评价试验方式，可以同时结合文献资料或研究数据分析结果，进行功效宣称评价。根据化妆品功效宣称评价项目要求，控油功效可采用人体功效评价试验、消费者使用测试和实验室试验三种方法中任一种方法进行评价。
目前，针对化妆品控油功效的评价，还没有统一的国家标准和行业标准。人体功效评价是化妆品控油功效的一种常用方法，但该方法周期长，费用高，且在测试过程中，在受试者的筛选上存在一定的困难，受试者在使用样品过程中的监督问题、人员个体差异问题均严重影响到测试结果；在体外测试方法中，目前也没有统一的标准，部分测试方法存在重复性差，科学性不足、误差大等问题。
为了科学、有效地进行化妆品及原料的功效测试，开发一种细胞测试方法，用于化妆品及原料的控油功效评价十分有必要。
发明内容
为此，本发明的目的是通过检测样品对人皮脂腺细胞油脂合成的抑制作用，从而评价样品的控油功效；该方法经济快捷，测试过程可控，测试体系标准化，可以避免因人体个体差异引起较大的结果偏差。
一种用体外细胞评价化妆品及原料控油功效的方法，依次包括下述步骤：
步骤1、传代培养细胞；
步骤2、样品细胞毒性测试
将样品用细胞培养基稀释成4～8个不同浓度，加入按步骤1培养好的细胞板中，测定样品的细胞毒性，根据测定结果计算细胞活力，筛选出细胞活力在85％或以上、细胞形态与细胞对照组无明显差异的浓度，作为无明显细胞毒性的样品浓度；
步骤3、样品油脂抑制测试
将步骤2将培养好的长满单层细胞板，弃去培养液，用PBS洗1～2次，将样品用细胞培养基稀释至无明显细胞毒性的浓度，加入细胞板中，50μL/孔，同时设空白对照组(BC)、阴性对照组(NC)和阳性(PC)对照组。其中空白对照组加100μL/孔的细胞培养基，阴性对照组加入50μL/孔的细胞培养基，阳性对照组加50μL/孔的阳性对照物；加样完毕，除了空白对照组，其他组均加入50μL/孔的造模剂，置温度37℃、CO2浓度5.0％条件下培养20～48h。培养结束后，弃去细胞培养液，用PBS轻轻冲洗2次，弃去，每孔加入100μL的荧光染色液，避光反应10～30min，用荧光酶标仪检测每孔的荧光强度；
步骤4、结果统计分析
油脂抑制率(％)＝[1-(MFI样品-MFIBC)/(MFINC-MFIBC)]×100
式中：
MFI样品指样品组的荧光强度均值；
MFINC为阴性对照组的荧光强度均值；
MFIBC为空白对照组的荧光强度均值；
步骤5、结果判定
用统计学软件进行统计及显著性分析，计算P值，P＜0.05表示具有显著性差异。当空白对照组(BC组)与阴性对照组(NC组)相比P小于0.05时，具有显著差异，试验成立。样品组油脂抑制率为正数且与阴性对照组(NC组)相比具有显著差异(p＜0.05)，可判定为样品具有控油功效。
具体地，所述细胞为人皮脂腺细胞，本发明所述的人皮脂腺细胞，来源于各个细胞保藏中心或其他商业模式；
进一步地，所述的传代培细胞的过程为：取成长良好单层的细胞，弃去细胞培养基，用新鲜无血清培养基或PBS轻轻清洗1次，弃去，加入适量(以浸没所有细胞单层表面为准)的0.25％EDTA-胰酶溶液消化1～5min，弃去EDTA-胰酶溶液，加入5～10ml含10％牛血清的DMEM培养基，吹打分散细胞，使细胞均匀分散。取细胞悬液计数，根据细胞数调整细胞浓度至5.0×104～2.0×105cell/ml，放置温度37℃、CO2浓度5.0％条件下培养24～72h。
进一步地，细胞毒性测试的具体过程为：在进行细胞毒性测试前，调整人皮脂腺细胞细胞浓度至5.0×104～2.0×105cell/ml，加入96孔细胞培养板中，100μL/孔。将细胞板盖好，封边，置温度37℃、CO2浓度5.0％条件下培养24±4h，至细胞融合度达80％以上时用于细胞毒性检测；将培养好的细胞板，弃去培养液；将样品用细胞培养基稀释成4～8个不同浓度，加入细胞板中，同时设不加样品的细胞对照组、不加细胞及样品的空白对照组，100μL/孔，培养20～48h后，显微镜下观察细胞状态，弃去培养液，洗细胞板1～2次，加入MTT溶液，继续培养2～6h，弃去培养液，加入150μL/孔的DMSO，震荡5～10min，于570nm处测定吸光值。根据吸光值测定结果采用公式细胞活力(％)＝(OD样品-OD空白)/(OD阴性-OD空白)×100计算细胞活力，其中OD样品为样品组的OD值，OD阴性为细胞对照组的OD值，OD空白为空白组的OD值。根据细胞活力结果，筛选出细胞活力在85％或以上的样品浓度，作为无明显细胞毒性的样品浓度供下一步实验；
进一步地，样品油脂抑制测试的具体过程为：重新培养细胞，调整细胞浓度至5.0×104～2.0×105cell/ml，加入96孔细胞培养板中，100μl/孔。将细胞板盖好，封边，置温度37℃、CO2浓度5.0％条件下培养24±4h用于细胞油脂抑制测试；将上一步培养好的细胞板，弃去培养液，用PBS洗1～2次，将样品用细胞培养基稀释至无明显细胞毒性的浓度，加入细胞板中，50μL/孔，同时设空白对照组、阴性对照组和阳性对照组。其中空白对照组(BC)加100μL/孔的细胞培养基，阴性对照组(NC)加入50μL/孔的细胞培养基，阳性对照组(PC)加50μL/孔的阳性对照物；加样完毕，除了空白对照组，其他组均加入50μL/孔的造模剂，置温度37℃、CO2浓度5.0％条件下培养20～48h。培养结束后，弃去细胞培养液，用PBS轻轻冲洗1～2次，弃去，每孔加入100μL的荧光染色液，避光反应10～30min，用荧光酶标仪检测荧光强度。
进一步地，所述的细胞培养板为96孔细胞培养板。
进一步地，所述的培养是将细胞板盖好，封边，置温度37℃、CO2浓度5.0％条件下培养24～72h。
进一步地，选择无明显细胞毒性的样品浓度进行细胞油脂抑制测试时，可根据实验需要选择多个不同的浓度。
进一步地，所述造模剂为睾酮和亚油酸的混合液。
进一步地，所述造模剂的配制方法为：用无水乙醇分别配制睾酮溶液和的亚油酸溶液，再混合即得。
进一步地，所述睾酮溶液和亚油酸溶液的混合比例按体积为1：(0.5-2)。
进一步地，所述造模剂使用前用细胞培养基稀释10～2000倍。
进一步地，所述睾酮溶液的浓度为1～100mg/ml，所述亚油酸溶液的浓度为10～200umol/ml。
进一步地，上述的一种用体外细胞评价化妆品及原料控油功效的方法，所述的阳性对照物为地塞米松磷酸钠。
具体地，所述地塞米松磷酸钠的使用方法为：称取地塞米松磷酸钠粉末溶于磷酸盐缓冲液(PBS)中，使终浓度为0.1～10mg/ml。
进一步地，上述的一种用体外细胞评价化妆品及原料控油功效的方法，所述的荧光染色液为尼罗红。
具体地，所述尼罗红的使用方法为：用DMSO将尼罗红配制成0.5mg/ml的浓度，避光冷冻保存。使用时完全解冻后用PBS稀释10～200倍，现配现用。
进一步地，上述的一种用体外细胞评价化妆品及原料控油功效的方法，所述判定标准为，用统计学软件进行统计及显著性分析，计算P值，P＜0.05表示具有显著性差异。当空白对照组(BC组)与阴性对照组(NC组)相比P小于0.05时，具有显著差异，试验成立。样品组油脂抑制率为正数且与阴性对照组(NC组)相比具有显著差异(p＜0.05)，可判定为样品具有控油功效。
具体的，所述统计学软件为GraphPadPrism、EXCEL或其他。
与现有技术相比，本发明具有的有益效果如下：
本发明提供的技术方案采用体外培养人皮脂腺细胞，建立细胞模型，将待测样品加入细胞中进行测试，首先测试样品的细胞毒性，再选择无细胞毒性的浓度进行细胞油脂抑制测试，然后通过荧光染色的技术手段，结合荧光检测设备检测细胞油脂，最后通过统计学手段分析样品对细胞油脂合成的抑制率，从而评价样品的控油功效。本测试方法通过多次实际应用，建立了控油功效的判定标准，该方法经济快捷，测试过程可控程度高，测试体系标准化，避免因人体个体差异引起的较大的结果偏差，具有良好的应用前景。
附图说明
图1是样品的细胞毒性活力曲线图；
图2是细胞油脂抑制测试荧光强度结果图；
图3是细胞油脂抑制测试结果图；
图4是细胞油脂荧光染色图；
图5是样品使用前后受试者皮肤油脂含量变化对比图。
具体实施方式
下面对本发明实施的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的主要测试流程，对于未特别注明的工艺参数或者条件，可参照常规技术进行。
实施例
本发明提供的一种用体外细胞评价化妆品及原料控油功效的方法，采用体外细胞作为测试手段，用于评价化妆品及其原料的控油功效。
其中，所述的细胞测试方法主要分为细胞传代培养、样品细胞毒性测试、细胞油脂抑制测试。
采用人皮脂腺细胞进行测试。本发明所述的人皮脂腺细胞，，可来源于各个细胞保藏中心或其他商业模式购得。本实施例所述的人皮脂腺细胞为SZ95株，来源于复旦医学院。
一、细胞的培养
将冻存的人皮脂腺细胞从液氮罐取出，进行细胞的复苏和传代培养。
复苏培养具体方式为：将冻存细胞在37℃左右水浴快速溶解，1000rpm低速离心5min，弃去上清液，底部细胞用含10％牛血清的DMEM培养基重悬，转移至T25细胞瓶中，放置温度37℃、CO2浓度5.0％条件下培养48h，当细胞融合度达80％以上时进行传代培养。
传代培养具体方式为：弃去细胞培养基，用新鲜无血清培养基或PBS轻轻清洗1次，弃去，加入适量(以浸没所有细胞单层表面为准)的0.25％EDTA-胰酶溶液消化2min，弃去EDTA-胰酶溶，加入5ml含10％牛血清的DMEM培养基，吹打分散细胞，使细胞均匀分散。取细胞悬液计数，根据细胞数调整细胞浓度至2.0×105cell/ml，放置温度37℃、CO2浓度5.0％条件下培养48h。
为保证细胞的活力和稳定，本方法采用复苏后2代以上的细胞进行测试，细胞复苏后传代代数控制在100代之内。
二、细胞毒性测试：
调整步骤一)培养好的细胞浓度至2.0×105cell/ml，加入96孔细胞培养板中，100μL/孔。将细胞板盖好，封边，置温度37℃、CO2浓度5.0％条件下培养24h，至细胞融合度达80％以上时用于细胞毒性检测。
将上述培养好的细胞板，弃去培养液。将样品用细胞培养基稀释成8个不同浓度，加入细胞板中，同时设不加样品的细胞对照组、不加细胞及样品的空白对照组，100μL/孔，培养24h后，显微镜下观察细胞状态，弃去培养液，洗细胞板2次，加入MTT溶液，继续培养4h，弃去培养液，加入150μL/孔的DMSO，震荡10min，于570nm处测定吸光值。
根据结果采用公式细胞活力(％)＝(OD样品-OD空白)/(OD阴性-OD空白)×100计算细胞活力，其中OD样品为样品组的OD值，OD阴性为细胞对照组的OD值，OD空白为空白组的OD值。根据细胞活力结果并结合细胞形态，筛选出细胞活力在85％或以上、细胞形态与细胞对照组无明显差异的浓度，作为无明显细胞毒性的样品浓度供下一步实验。
所述的无明显细胞毒性的样品浓度筛选标准：该浓度下细胞的形态与空白对照组无明显差异，细胞毒性测试结果显示相对细胞活力不低于85％。
三、细胞油脂抑制测试
按步骤一)的方法重新培养细胞，调整细胞浓度至2.0×105cell/ml，加入96孔细胞培养板中，100μL/孔。将细胞板盖好，封边，置温度37℃、CO2浓度5.0％条件下培养24h用于细胞油脂抑制测试；
将培养好的细胞板，弃去培养液，用PBS洗2次，将样品用细胞培养基稀释至无明显细胞毒性的浓度，加入细胞板中，50μL/孔，同时设空白对照组、阴性对照组和阳性对照组。其中空白对照组(BC)加100μL/孔的细胞培养基，阴性对照组(NC)加入50μL/孔的细胞培养基，阳性对照组(PC)加50μL/孔的地塞米松磷酸钠；加样完毕，除了空白对照组，其他组均加入50μL/孔的造模剂，置温度37℃、CO2浓度5.0％条件下培养20～48h。
培养结束后，弃去细胞培养液，用PBS轻轻冲洗2次，弃去，每孔加入100μL的尼罗红染色液，避光反应30min，用荧光酶标仪在Ex/Em＝485nm/565nm处检测荧光强度。
4.结果统计分析
油脂抑制率(％)＝[1-(MFI样品-MFIBC)/(MFINC-MFIBC)]×100
式中：
MFI样品指样品组的荧光强度均值；
MFINC为阴性对照组的荧光强度均值；
MFIBC为空白对照组的荧光强度均值。
本发明还公开了应用本测试方法判定样品控油功效的标准，具体实施方式为：
根据上述实施方式第4项的测试结果，用统计学软件进行统计及显著性分析，计算P值，P＜0.05表示具有显著性差异。当空白对照组(BC组)与阴性对照组(NC组)相比P小于0.05时，具有显著差异，试验成立。样品组油脂抑制率为正数且与阴性对照组(NC组)相比具有显著差异(p＜0.05)，可判定为样品具有控油功效。
应用例
1、一种具有控油功效化妆品A测试方法：
1.1、样品名称：双剂控油水乳。
1.2、方法：
1.2.1、细胞测试方法：按本发明所述的方法进行样品的控油功效测试。首先将样品稀释成20％的初始浓度，再稀释成8个不同浓度在人皮脂腺细胞上开展细胞毒性实验，具体浓度详见表1。根据细胞毒性结果，选择无细胞毒性的浓度进行细胞油脂抑制测试，计算细胞油脂抑制率，评价测试样品的控油效果。
1.2.2、人体测试方法：通过10例健康中国受试者连续使用测试样品20天，比较使用前后受试者的皮肤油脂含量变化，评价测试样品的控油效果。
变化率(百分比)＝(使用后数据均值-使用前数据均值)/使用前数据均值。
1.2.3、数据统计分析：细胞测试数据采用双尾t检验，P＜0.05时表示具有显著性差异。人体测试数据先用SPSS软件采用Shapiro-WilkTest进行数据改善值正态分布的显著性检验，Sig.(双侧)＞0.01，则呈正态分布，进行配对t检验；Sig.(双侧)＜0.01，则呈非正态分布，进行Wilcoxon检验，P＜0.05时表示具有显著性差异。
若P＞0.05，表示无显著性差异，记为“n.s.”；
若P＜0.05表示有显著性差异，且0.01≤P＜0.05，记“*”；0.001≤P＜0.01，记
为“**”；0.0001≤P＜0.001，记为“***”；P＜0.0001，记为“****”。
1.3、结果
1.3.1、细胞毒性结果
将样品稀释成8个不同浓度在人皮脂腺细胞上开展细胞毒性实验，细胞毒性结果显示，样品在0.006％浓度下，细胞的存活率为93.40％，无明显细胞毒性。因此，可选择0.006％以下的浓度进行下一步实验。在本实验中，选择0.006％的浓度作为无明显细胞毒性的浓度进行下一步试验。结果详情见表1、图1。
表1样品的细胞毒性检测结果
| 浓度(％，V/V) | 0.00 | 0.006 | 0.020 | 0.064 | 0.201 | 0.634 | 2.003 | 6.329 | 20.000 |
| 细胞存活率(％) | 100.00 | 93.40 | 79.10 | 75.25 | 76.57 | 80.24 | 79.46 | 69.45 | -0.01 |
| SD | 10.78 | 0.06 | 0.98 | 2.67 | 2.41 | 4.27 | 6.16 | 4.25 | 1.89 |
1.3.2、细胞油脂抑制测试结果
选择0.006％的浓度作为无明显细胞毒性的浓度，在人皮脂腺细胞上开展细胞油脂抑制测试。根据实验结果可知，空白对照组(BC组)与阴性对照组(NC组)相比P＜0.05，具有显著差异，试验成立。当样品浓度为0.006％时，样品组的油脂抑制率为22.46％，与NC组相比，具有显著性差异(P＜0.05)。测试结果见表2、图2、图3、图4。
表2细胞油脂抑制测试结果
| 组别 | MFI | SD | P值 | 显著性 | 抑制率(％) |
| BC | 200.17 | 3.25 | ＜0.0001 | **** | / |
| NC | 430.58 | 3.98 | / | / | / |
| PC | 300.83 | 2.60 | ＜0.0001 | **** | 43.29 |
| 双剂控油水乳 | 378.83 | 1.16 | ＜0.0001 | **** | 22.46 |
1.3.3、人体试验结果
通过10例健康中国受试者使用该测试样品20天，受试者油脂含量下降了45.08％，且与使用前相比具有显著性(P＜0.05)，说明测试样品具有控油效果。结果详见表3、表4和图5。
表3皮肤油脂含量描述性统计结果
表4皮肤油脂含量统计分析结果
注：皮肤油脂含量越小，皮肤油脂分泌越不明显。
由上可知，本测试方法通过实际应用，建立了控油功效的判定标准，经济快捷，测试过程可控程度高，测试体系标准化，避免因人体个体差异引起的较大的结果偏差，具有良好的应用前景。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种用体外细胞评价化妆品及原料控油功效的方法，其特征在于，依次包括下述步骤：
步骤1、传代培养细胞；
步骤2、样品细胞毒性测试
将样品用细胞培养基稀释成4～8个不同浓度，加入按步骤1培养好的细胞板中，测定样品的细胞毒性，根据测定结果计算细胞活力，筛选出细胞活力在85％或以上、细胞形态与细胞对照组无明显差异的浓度，作为无明显细胞毒性的样品浓度；
步骤3、样品油脂抑制测试
将步骤2将培养好的长满单层细胞板，弃去培养液，用PBS洗1～2次，将样品用细胞培养基稀释至无明显细胞毒性的浓度，加入细胞板中，50μL/孔，同时设空白对照组(BC)、阴性对照组(NC)和阳性(PC)对照组。其中空白对照组加100μL/孔的细胞培养基，阴性对照组加入50μL/孔的细胞培养基，阳性对照组加50μL/孔的阳性对照物；加样完毕，除了空白对照组，其他组均加入50μL/孔的造模剂，置温度37℃、CO2浓度5.0％条件下培养20～48h，培养结束后，弃去细胞培养液，用PBS轻轻冲洗1～2次，弃去，每孔加入100μL的荧光染色液，避光反应10～30min，用荧光酶标仪检测每孔的荧光强度；
步骤4、结果统计分析
油脂抑制率(％)＝[1-(MFI样品-MFIBC)/(MFINC-MFIBC)]×100
式中：
MFI样品指样品组的荧光强度均值；
MFINC为阴性对照组的荧光强度均值；
MFIBC为空白对照组的荧光强度均值；
步骤5、结果判定
用统计学软件进行统计及显著性分析，计算P值，P＜0.05表示具有显著性差异，当空白对照组(BC组)与阴性对照组(NC组)相比P小于0.05时，具有显著差异，试验成立，样品组油脂抑制率为正数且与阴性对照组(NC组)相比具有显著差异(p＜0.05)，可判定为样品具有控油功效。
2.根据权利要求1所述的一种用体外细胞评价化妆品及原料控油功效的方法，其特征在于，所述造模剂为睾酮和亚油酸的混合液。
3.根据权利要求2所述的一种用体外细胞评价化妆品及原料控油功效的方法，其特征在于，所述造模剂的配制方法为：用无水乙醇分别配制睾酮溶液和的亚油酸溶液，再混合即得。
4.根据权利要求3所述的一种用体外细胞评价化妆品及原料控油功效的方法，其特征在于，所述睾酮溶液和亚油酸溶液的混合比例按体积为1：(0.5-2)。
5.根据权利要求2所述的一种用体外细胞评价化妆品及原料控油功效的方法，其特征在于，所述造模剂使用前用细胞培养基稀释10～2000倍。
6.根据权利要求3所述的一种用体外细胞评价化妆品及原料控油功效的方法，其特征在于，所述睾酮溶液的浓度为1～100mg/ml，所述亚油酸溶液的浓度为10～200umol/ml。
7.根据权利要求1所述的一种用体外细胞评价化妆品及原料控油功效的方法，其特征在于，所述的阳性对照物为地塞米松磷酸钠。
8.根据权利要求7所述的一种用体外细胞评价化妆品及原料控油功效的方法，其特征在于，所述阳性对照物的使用方法为：称取地塞米松磷酸钠粉末溶于磷酸盐缓冲液(PBS)中，配制成0.1～10mg/ml的浓度。
9.根据权利要求1所述的一种用体外细胞评价化妆品及原料控油功效的方法，其特征在于，所述的荧光染色剂为尼罗红。
10.根据权利要求9所述的一种用体外细胞评价化妆品及原料控油功效的方法，其特征在于，所述的荧光染色剂的使用方法为：用DMSO将尼罗红配制成0.5mg/ml的浓度，避光冷冻保存，使用时完全解冻后用PBS稀释10～200倍，现配现用。
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