CN110082529A - 一种肿瘤细胞表面标志物及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种肿瘤细胞表面标志物，包括CD24和FXYD3。本发明还公开了CD24的检测试剂和FXYD3的检测试剂的联合使用在制备肿瘤细胞检测试剂盒中的应用。本发明通过高通量测序、免疫组化实验结合肿瘤球实验发现通过检测细胞表面的分子标志物CD24和FXYD3，能够准确有效地筛选出癌组织中的循环肿瘤细胞，为癌症的诊断和治疗提供了新的准确有效的解决方案。

Description

一种肿瘤细胞表面标志物及其应用
技术领域
本发明涉及细胞分辨技术领域，尤其是一种鼻咽癌细胞表面标志物及其应用。
背景技术
目前临床上通过分选肿瘤病人血液中的循环肿瘤细胞(Circulating TumorCells,CTCs)，进行预后监测和开展个体化治疗，成为一种趋势。鼻咽癌俗称广东癌，主要发病于我国南方及东南亚。鼻咽癌临床症状不明显，大多数初诊病人都已经是中晚期伴随淋巴结转移。鼻咽癌对放化疗敏感，目前五年生存率已达到80％。复发转移，特别是远处转移是鼻咽癌的主要死亡原因。筛选鼻咽癌CTCs是无创监测鼻咽癌复发转移以及进一步地根据CTCs的分子特征开展个体化治疗的重要手段。
遗憾的是，绝大多数的鼻咽癌是未分化或者低分化的非角化性细胞癌，缺少明显的上皮标志。因此，目前临床上广泛使用的上皮标志物(Epcam)筛选CTCs的办法不能适用于鼻咽癌。临床上还有另外一种办法分选CTCs是根据细胞的尺寸。一般来说，肿瘤细胞的尺寸要比血细胞大，因此过滤掉小尺寸细胞，就能得到CTCs。但是，鼻咽癌细胞的尺寸并不大，甚至比单核细胞小，因此这种方法也不适用于鼻咽癌。所以，找到有效的标志物区分鼻咽癌细胞和血细胞就成为有效筛选鼻咽癌CTCs的前提。
发明内容
基于上述问题，本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种区分鼻咽癌细胞和血细胞的有效标志物，用以准确地筛选出鼻咽癌中的循环肿瘤细胞。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种肿瘤细胞表面标志物，所述标志物包括CD24和FXYD3。
作为上述技术方案的进一步优化，所述肿瘤细胞为循环肿瘤细胞。
作为上述技术方案的进一步优化，所述肿瘤为鼻咽癌。
作为本发明的另一个方面，CD24的检测试剂和FXYD3的检测试剂的联合使用在制备肿瘤细胞检测试剂盒中的应用。
作为上述技术方案的进一步优化，所述肿瘤细胞为循环肿瘤细胞。
作为上述技术方案的进一步优化，所述肿瘤为鼻咽癌。
作为上述技术方案的进一步优化，所述CD24的检测试剂为CD24磁珠。需要说明的是，CD24的检测试剂包括但不限于CD24磁珠，还可以是其它能特异性检测CD24的试剂，例如，CD24的单克隆抗体。
作为上述技术方案的进一步优化，所述FXYD3的检测试剂为FXYD3的单克隆抗体。
综上所述，本发明的有益效果为：
本发明通过高通量测序、免疫组化实验结合肿瘤球实验发现通过检测细胞表面的分子标志物CD24和FXYD3，能够准确有效地筛选出癌组织中的循环肿瘤细胞，为癌症的诊断和治疗提供了新的准确有效的解决方案。
附图说明
图1为第一例鼻咽癌组织的1024个细胞转录组t-SNE聚类图；
图2为四例鼻咽癌组织的10X t-SNE转录组聚类图；
图3为鼻咽癌细胞株SUNE1的肿瘤球实验，其中：(A)CD24阴性细胞，(B)CD24阳性细胞，(C)CD24阳性细胞与CD24阴性细胞的肿瘤球形成数目对比；
图4为FXYD3在鼻咽癌组织中的免疫组化结果图，箭头所示为FXYD3阳性的癌巢。
具体实施方式
为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。如无特别说明，本发明中的实验方法均为常规方法。
实施例1单细胞转录组测序
五例鼻咽癌组织的10x genomics高通量单细胞转录组测序分析，以区分鼻咽癌细胞群体和非肿瘤细胞群体(包括T细胞、B细胞和单核巨噬细胞等)。
实验方法:分别从广州市第十二人民医院、南方医科大学南方医院和南方医科大学第三附属医院获得五例新鲜鼻咽癌组织(参见表1)。癌组织离体马上放入组织培养液中，冰上保存，并在两个小时之内制成细胞悬液。细胞计数仪检测活细胞比例超过90％之后，送给广州序科码生物技术有限责任公司进行10X genomics建库。建库之后，送给北京安诺优达基因科技有限公司进行测序。测序平台为Illumina Hiseq X，测序深度为包lane测序。
表1五例鼻咽癌组织的临床信息
完成第一例(NPC1)鼻咽癌组织的10X genomics测序后，得到1024个细胞的测序数据。TSNE聚类结果如图1所示，1024个细胞可以分成6个亚群。根据每个亚群的标签基因，用GenCLiP软件做基因功能富集分析发现：1和3亚群为B细胞，2亚群为单核巨噬细胞，4和5亚群为T细胞，6亚群为鼻咽癌细胞。
后续又测序了四例鼻咽癌组织(NPC2～5)，分别得到第二例1832个细胞(参见图2A)，第三例1997个细胞(参见图2B)，第四例1064个细胞(参见图2C)，第五例1862个细胞(参见图2D)的转录组聚类图。其中，第二例鼻咽癌组织用CD3、CD19和CD14三种磁珠来过滤掉T细胞、B细胞和单核巨噬细胞。
在本发明中，定义鼻咽癌细胞为至少有一个KRT基因(即，编码角化蛋白的基因)的表达值大于等于5；而定义非肿瘤细胞为任何KRT基因的表达值都小于1。如表1所示，五个样品的鼻咽癌细胞数分别为：145，1421，306，269和444；非肿瘤细胞数分别为：719，1，1104，476和435。
实施例2
采用如下分析流程(参见表2)：
1)由于实施例1中第二例(NPC2)鼻咽癌组织几乎不包含非肿瘤细胞，所以在除第二例鼻咽癌组织以外的其它四例鼻咽癌组织中，筛选至少有一个角化基因表达值大于等于5的细胞，定义为鼻咽癌细胞；而筛选所有角化基因表达值都小于1的细胞定义为非肿瘤细胞。
2)定义表达值大于1为表达，小于1为不表达。筛选在至少一例鼻咽癌组织中，75％以上的鼻咽癌细胞表达而10％以下的非肿瘤细胞表达的基因。同时，考察常用的上皮标志物EPCAM和MUC1在五例样品中的表达情况。
结果如表2所示，虽然EPCAM和MUC1在非肿瘤细胞中基本不表达，但是它们在鼻咽癌细胞中的表达比例也不高，因此，它们(EPCAM和MUC1)不能作为筛选鼻咽癌CTCs的表面标志物。而在所有编码角化蛋白基因中，发现KRT19在鼻咽癌细胞中的表达比例是最高的，而且在非肿瘤细胞中不表达。但是角化蛋白由于主要是细胞内表达，而无法作为筛选鼻咽癌CTCs(循环肿瘤细胞)的表面标志物。
表2特征性基因在五例鼻咽癌组织的表达分布
注：s1-s5分别代表五例样品；npc代表鼻咽癌细胞；other代表非肿瘤细胞。
为此，筛选出至少在一例鼻咽癌组织中，超过75％的鼻咽癌细胞表达(表达值大于等1)而低于10％的非肿瘤细胞表达的基因；再进一步根据Gene Ontology(www.geneontology.org)，从中筛选编码细胞膜蛋白基因。结果如表2所示，只有CD24和FXYD3基因在五例鼻咽癌组织中，鼻咽癌细胞的表达比例都超过75％而在其它细胞中表达比例低于10％。由此，通过比较分析鼻咽癌细胞群体和非肿瘤细胞群体，发现新的鼻咽癌细胞表面标志物CD24和FXYD3。
实施例3
实验方法：购买CD24磁珠，用来分选鼻咽癌细胞株SUNE1，进行肿瘤球实验。其中，肿瘤球形成实验的步骤如下：
1)取对数生长的细胞，将细胞消化，用PBS洗两次，计数。
2)将细胞稀释至104/ml，6孔板(JET:TCP001006)里每孔加入3ml含DMEM.F12(Corning:10-092-CVR)的肿瘤球3D培养基，取100ul的细胞悬液加至6孔板，1000个细胞/孔。
3)将细胞铺匀，培养7-10天左右。
4)镜下观察,不同倍数视野拍照，统计肿瘤球数量等。
结果如图3所示，CD24阳性细胞无论肿瘤球大小还是数目都明显比CD24阴性细胞多，说明CD24阳性的鼻咽癌细胞比CD24阴性的鼻咽癌细胞具有更强的成瘤能力。因此，CD24可以作为鼻咽癌细胞的表面标志物。但是，进一步检索文献发现，CD24正常情况下，主要在成熟的粒细胞和B细胞中表达(参见https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/100133941)，因此，在循环细胞中，CD24无法区分肿瘤细胞和白细胞，必须寻找新的辅助标志物。
实施例4
为了能区分上皮细胞和白细胞，采用免疫组化检测FXYD3在鼻咽癌组织和淋巴结组织中的表达情况。其中，免疫组化的实验步骤如下：
烤片60分，脱蜡至水，柠檬酸盐修复3分，过氧化氢封闭10分，一抗(FXYD3抗体，购自abcam公司，货号：ab205534)60分，二抗(酶标山羊抗兔IgG聚合物，购自中杉金桥，货号：PV-6001)按试剂说明书，DAB显色在光镜下控制时间。
结果如图4所示，发现FXYD3在淋巴组织中不表达，而在100例鼻咽癌组织中60例强阳性表达，35例弱阳性表达，5例不表达。由此可见，FXYD3在鼻咽癌组织中普遍高表达，而在淋巴造血系统中不表达，可以作为筛选鼻咽癌CTCs的表面标志物。
综上所述，CD24和FXYD3都在鼻咽癌细胞中广泛高表达。CD24可以用来区分肿瘤和非肿瘤细胞，而FXYD3可以用来区分鼻咽上皮细胞和白细胞。因此，将CD24和FXYD3的检测试剂联合使用可以用来筛选循环细胞中的鼻咽癌细胞，筛选结果准确而有效。
最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (8)

1.一种肿瘤细胞表面标志物，其特征在于，所述标志物包括CD24和FXYD3。
2.根据权利要求1所述的标志物，其特征在于，所述肿瘤细胞为循环肿瘤细胞。
3.根据权利要求1所述的标志物，其特征在于，所述肿瘤为鼻咽癌。
4.CD24的检测试剂和FXYD3的检测试剂的联合使用在制备肿瘤细胞检测试剂盒中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述肿瘤细胞为循环肿瘤细胞。
6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述肿瘤为鼻咽癌。
7.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述CD24的检测试剂为CD24磁珠。
8.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述FXYD3的检测试剂为FXYD3的单克隆抗体。
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