CN116716401A - 生物标志物polq在制备检测或评估胶质瘤预后情况的产品中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供生物标志物POLQ在制备检测或评估胶质瘤预后情况的产品中的应用，属于生物检测技术领域，本发明包括检测生物样本中的生物标志物POLQ的表达水平,从而对胶质瘤的发展进行检测和评估；所述生物样本取自胶质瘤组织，通过生物信息学和实验验证表明POLQ对于诊断肺癌患者预后有着较好的敏感性，且对胶质瘤细胞的恶性生物学行为有重要促进作用。
Description
技术领域
本发明涉及生物检测技术领域，具体涉及生物标志物POLQ在制备检测或评估胶质瘤预后情况的产品中的应用。
背景技术
胶质瘤是起源于胶质细胞或前体细胞的神经肿瘤，其发病率约占原发性中枢系统肿瘤的 30%，在原发恶性脑肿瘤中则约占 75%，因此被认为是最常见的中枢神经系统恶性肿瘤。根据肿瘤的病理学特征可将胶质瘤分为I-IV级，I级患者在接受手术后可达痊愈而IV患者五年生存率仅为5%。因此，早期诊断和治疗对于胶质瘤患者至关重要；
生物体在生命活动过程中容易受到来自不同因素的 DNA 损害，包括环境因素与内部因素，环境因素如阳光中的紫外线成分、电离辐射和许多基因毒性化学物质，会导致DNA 结构的改变，如果不修复，可能会导致突变，增加癌症风险。而POLQ的编码产物DNA 聚合酶在生物体内承担着重要的功能包括跨损伤合成(TLS)，DNA 双键断修复 (DSB)等任务。近期研究发现POLQ在多种肿瘤组织内出现表达升高的情况，并且介导和参与肿瘤发生和发展中的多种生物学进程。而通过POLQ基因表达量的判断及其表达的干预，能对肿瘤的发现和发展提供新的诊断和治疗方案。然而，目前尚无POLQ在胶质瘤方面的研究。
发明内容
有鉴于此，本发明提供生物标志物POLQ在制备检测或评估胶质瘤预后情况的产品中的应用，通过生物信息学和实验验证表明POLQ对于诊断肺癌患者预后有着较好的敏感性，且对胶质瘤细胞的恶性生物学行为有重要促进作用。
生物标志物POLQ在制备用于检测或评估胶质瘤预后情况的产品中的应用，包括检测生物样本中的生物标志物POLQ的表达水平,从而对胶质瘤的发展进行检测和评估；所述生物样本取自胶质瘤组织。
进一步的，其中所述生物标志物POLQ在NCBI的Gene ID为10721。
进一步的，包括检测所述生物标志物POLQ的DNA含量的试剂。
进一步的，所述试剂为特异性识别POLQ基因的探针。
进一步的，包括检测所述生物标志物POLQ的mRNA含量的试剂。
进一步的，所述试剂为特异性扩增POLQ基因的引物，所述试剂是在mRNA水平上检测生物标志物POLQ表达水平的试剂。
进一步的，包括检测所述生物标志物POLQ的蛋白质含量的试剂。
进一步的，所述试剂为特异性结合POLQ基因编码的蛋白的结合剂。
进一步的，所述胶质瘤为脑胶质瘤。
进一步的，与对照组的生物样本相比，所述生物标志物POLQ在脑胶质瘤组织中的表达水平上调。
综上所述，本申请与现有技术相比至少具有以下一种有益技术效果：
本发明通过生物信息学数据分析证实在胶质瘤患者的肿瘤组织中，POLQ基因的表达水平显著高于正常。随后利用生物信息学数据，通过生存分析和ROC曲线发现POLQ的表达水平增高对胶质瘤患者总生存期的不利影响，通过单因素和多因素回归分析发现POLQ是胶质瘤患者的独立预后危险因素。进一步的细胞生物学实验证实POLQ表达降低可显著抑制胶质瘤细胞的增殖和迁移能力。总之，本发明的生物标志物能够有效的判断患者的预后情况。
附图说明
图1为本发明GEO数据分析工具确定POLQ在胶质瘤患者组织中的表达差异结果图；
图2为本发明基于TCGA测序数据、CGGA芯片数据和CGGA测序数据三个数据库的POLQ生存分析图；
图3为本发明基于TCGA测序数据、CGGA芯片数据和CGGA测序数据三个数据库的POLQ 预后ROC曲线图；
图4为本发明基于多个数据库单因素和多因素分析确定POLQ是胶质瘤患的独立预后危险因素组合图，其中A：基于TCGA胶质瘤患者的单因素分析；B:基于TCGA胶质瘤患者的多因素分析；C：基于CGGA胶质瘤患者芯片数据的单因素分析；D：基于CGGA胶质瘤患者芯片数据的多因素分析；E：基于CGGA胶质瘤患者测序数据的单因素分析；F: 基于CGGA胶质瘤患者测序数据的多因素分析；
图5为本发明敲减POLQ抑制胶质瘤细胞增殖和迁移能力的示意图，其中A：CCK8实验检测敲减POLQ对229人胶质瘤细胞增殖能力的影响；B：克隆形成实验检测敲减POLQ对229人胶质瘤细胞增殖能力的影响；C:免疫荧光实验检测敲减POLQ对229人胶质瘤细胞增殖能力的影响；D：细胞划痕实验检测敲减POLQ对229人胶质瘤细胞迁移能力的影响；E：Transwell实验检测敲减POLQ对229人胶质瘤细胞迁移能力的影响。*表示P<0.05；**表示P<0.01；***表示P<0.001。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例的附图1-4，对本发明实施例的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于所描述的本发明的实施例，本领域普通技术人员所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
一、以下实施例一至实施例四是通过生物信息学对POLQ标志物的验证。
生物信息学数据来源：GEO、TCGA和CGGA公开数据库；
实施例一
本实施例为明确POLQ在胶质瘤患者中的表达差异。
从上述数据库中获取34个胶质瘤患者和13例正常脑组织样本的基因表达数据及相应的临床数据，两组数据的合集为GSE50161数据集，通过含有34个胶质瘤样本和13例正常脑组织样本的GSE50161数据集，使用R语言的limma包进行差异分析，使用单因素方差分析的方法对数据进行统计学分析；确定POLQ在胶质瘤患者组织中的表达差异，得出其表达差异和预后。
结果表明在胶质瘤的组织中相比于正常组织，log2FC绝对值大于1即POLQ表达量在胶质瘤中的表达量超过正常组织两倍(一般认为log2FC绝对值大于1即表达相差两倍以上有意义)，且p＜0.05具有统计学差异。
如图1所示，表明POLQ在正常组中表达水平低于肿瘤组。
实施例二
本实施例为明确POLQ对胶质瘤患者预后的影响。
利用多个公共肿瘤数据库的胶质瘤数据中的1668例患者进行预后分析，包括TCGA测序数据、CGGA芯片数据和CGGA测序数据。
首先通过上述三个数据库中，每个库中获取一组，共获取三组胶质瘤患者的转录组数据和临床信息，进行生存分析；
如图2所示，结果发现POLQ在肿瘤中表达量越高，患者可能的生存期就越短，且具有统计学意义。
实施例三
本实施例为明确POLQ对胶质瘤患者预后的诊断价值进行了ROC分析。
通过TCGA测序数据、CGGA芯片数据和CGGA测序数据三个数据库，每个库中获取一组，共获取三组胶质瘤患者的转录组数据和临床信息，进行ROC分析；
如图3所示，结果显示在一年、三年、五年三个时间点，POLQ的曲线下面积几乎均大于0.7，也就意味着POLQ对胶质瘤患者的预后具有较好的诊断价值。
实施例四
本实施例为明确POLQ是否能作为胶质瘤患者的独立诊断预后因素。
利用TCGA测序数据、CGGA芯片数据和CGGA测序数据三个数据库患者的临床信息，进行了单因素分析和多因素分析，如图4所示，发现POLQ是三组胶质瘤患者的不良预后独立的一个因素。
二、以下实施例五至实施例九是通过实验对POLQ标志物的验证。
实验细胞及培养基：胶质瘤细胞LN229，培养基：GIBICO DMEM高糖，血清：GIBICO南美胎牛血清。
敲除手段：小干扰RNA（siRNA），有时称为短干扰RNA或沉默RNA，是一类双链RNA分子，它干扰了表达与互补的核苷酸序列的特定基因的转录后降解的mRNA，从而防止翻译。
在以下实施例当中，我们使用POLQ-siRNA敲减POLQ在胶质瘤细胞LN229中的表达水平，从细胞生物学水平证实POLQ对胶质瘤发生和发展的作用。
细胞培养：
日常细胞培养的步骤为：从37℃恒温孵箱中取出前述细胞系，置于已经经过至少30分钟紫外消毒的超净台中，用1ml移液枪吸出直径6cm细胞培养皿中残存的培养基，并用无菌PBS 1ml清洗两到三次随后弃去PBS，用5ml移液枪加入4-5ml新的含10％血清的对应培养基，然后放入37℃恒温孵箱继续培养。
细胞转染：
（1）将细胞接种于细胞培养6孔板中；转染时细胞密度约为40%。
（2）按照试剂说明书制备20pmol/μL siRNA。
（3）准备两个EP管，分别标记为siRNA和siMate；
（4）对于6孔板，向标有siRNA的EP中加入94ul的无血清培养基，并分别加入对应的siRNA稀释液6ul；向标有siMate的管子里添加93.5μl无血清培养液和6.5μl的转染试剂；室温静置5分钟。
（5）将siMate管中的混合试剂转移至siRNA管中，并使用移液器轻轻吹打混匀，室温静置15-20分钟，制成完全转染体系。
（6）弃掉6孔板中原有的培养液，使用PBS轻柔浸洗，重复2-3遍后，每孔加入1.8mL无血清培养液。
（7）6孔板中每孔加200μl 转染体系液体；随即转入培养箱。
（8）4h后向各孔中加入等体积含有血清的培养基，12-24h换成完全培养基。
实施例五
CCK8实验：
（1）将转染后的LN229细胞种到96孔板；1000个细胞/孔。
（2）将96孔板转至细胞培养箱中培养。
（3）分别在0h、12h、24h、48h、72h和96h时，弃掉原培养基，向每个孔中加入90μL无血清培养基，再加入10μL CCK8溶液（Solarbio，China），在37℃下继续培养4小时。
（4）终止培养，在酶联免疫检测仪450 nm处测量各孔的吸光值。
（5）结果如图5A所示，敲减 POLQ后229 细胞的增殖能力显著下降
实施例六
克隆形成实验
（1）将转染过的LN229细胞接种于6孔板中，每孔细胞数量控制在200个左右。
（2）将6孔板转细胞培养孵箱中进行培养10天。
（3）10天后向6孔板中加入4%多聚甲醛固定细胞集落30分钟。
（4）吸去多聚甲醛并加入1%结晶紫染色5分钟。
（5）弃掉结晶紫溶液并漂洗。
（6）观察集落并拍照，ImageJ计数。
（7）结果如图5B所示，敲减 POLQ 后229 细胞的单细胞克隆形成能力显著下降。
实施例七
免疫荧光实验
（1）当转染后的LN229细胞密度在培养瓶的85%左右时，用预热胰酶消化细胞后重悬细胞于完全培养基中，充分吹打，使之成单细胞悬液，计数。
（2）12孔板放细胞爬片，合适的细胞密度接种细胞。
（3）3、24小时或者48小时后，根据细胞生长速度快慢，观察判断细胞密度，约90%时进行细胞免疫荧光。
（4）弃掉原培养基，PBS溶液轻柔浸洗5分钟，重复3次。
（5）向孔内加入4%多聚甲醛1ml，室温固定细胞20分钟。
（6）弃掉多聚甲醛，PBS溶液轻柔浸洗5分钟，重复3次。
（7）孔内加入0.5%曲拉通打孔半小时。
（8）弃除曲拉通，PBS洗5分钟，洗3次。
（9）用10%的与二抗同源的山羊血清封闭细胞爬片2小时。
（10）弃掉封闭液，向每孔添加根据说明书配制的一抗，放进湿盒，在4℃冰箱中反应一晚上。
（11）吸去一抗，PBS溶液轻柔浸洗5分钟，重复3次。
（12）向孔内加入根据说明书配制的二抗，在黑暗环境下室温反应1小时。
（13）吸去二抗，PBS溶液轻柔浸洗5分钟，重复3次。
（14）向玻片上滴加DAPI；避光孵育5-10min。
（15）用PBS溶液洗去DAPI，每次5分钟，洗3次。
（16）取出爬片后用吸水纸吸干爬片上的液体，然后用含抗荧光淬灭剂的封片液封片，最后在荧光显微镜下观察并采集图像，注意选择抗体对应的激发光源。
（17）结果如图5C所示，敲减 POLQ 后229 细胞的增殖能力显著下降。
实施例八
细胞划痕实验
（1）将消化重悬转染后的LN229细胞接种于6孔板中培养。
（2）当细胞密度为90%-100%时，使用200μl的无菌枪头在培养板中用力“一”字划开；PBS洗去漂起细胞，重复三次后0h照相。
（3）添加部分不含血清的普通培养基，放进细胞培养箱中。
（4）24h和48h后弃培养液，PBS清洗后镜下照相。
（5）结果如图5D所示，敲减 POLQ 后229 细胞的迁移能力显著下降。
实施例九
Transwell迁移实验
（1）24孔板内提前放置Transwell小室，24孔板加入500μL的无血清培养基。
（2）各组LN229细胞培养密度达到80%后进行消化，制备无血清细胞悬液。
（3）每个小室加入3.0x105个细胞，缓慢接种至Transwell小室的上室中。
（4）每个下室中加入含20%胎牛血清的完全培养基，不要产生气泡。
（5）在细胞培养箱中继续培养24 h后，去除完全培养基，加入PBS溶液清洗3次。
再向每孔中加入500μL的4%的多聚甲醛溶液室温固定30 min，加入PBS溶液清洗3次，风干聚碳酸脂膜。
（6）再向每孔中加入500μL的0.5%结晶紫溶液进行染色1h，加入PBS溶液清洗。
（7）室温干燥后放置在显微镜下，随机选取五个视野进行观察并拍摄。
（8）结果如图5E所示，敲减 POLQ 后229 细胞的迁移能力显著下降。
本发明通过生物信息学数据分析证实在胶质瘤患者的肿瘤组织中，POLQ基因的表达水平显著高于正常。
随后利用生物信息学数据，通过生存分析和ROC曲线发现POLQ的表达水平增高对胶质瘤患者总生存期的不利影响，通过单因素和多因素回归分析发现POLQ是胶质瘤患者的独立预后危险因素。
进一步的细胞生物学实验证明POLQ表达降低可显著抑制胶质瘤细胞的增殖和迁移能力。
总之，本发明的生物标志物能够有效的判断患者的预后情况。
以上所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明所述原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.生物标志物POLQ在制备用于检测或评估胶质瘤预后情况的产品中的应用，包括检测生物样本中的生物标志物POLQ的表达水平,从而对胶质瘤的发展进行检测和评估；所述生物样本取自胶质瘤组织。
2.如权利要求1所述的生物标志物POLQ在制备检测或评估胶质瘤的产品中的应用，其中所述生物标志物POLQ在NCBI的Gene ID为10721。
3.如权利要求1所述的生物标志物POLQ在制备检测或评估胶质瘤的产品中的应用，包括检测所述生物标志物POLQ的DNA含量的试剂。
4.如权利要求3所述的生物标志物POLQ在制备检测或评估胶质瘤的产品中的应用，所述试剂为特异性识别POLQ基因的探针。
5.如权利要求1所述的生物标志物POLQ在制备检测或评估胶质瘤的产品中的应用，包括检测所述生物标志物POLQ的mRNA含量的试剂。
6.如权利要求5所述的生物标志物POLQ在制备检测或评估胶质瘤的产品中的应用，所述试剂为特异性扩增POLQ基因的引物，所述试剂是在mRNA水平上检测生物标志物POLQ表达水平的试剂。
7.如权利要求1所述的生物标志物POLQ在制备检测或评估胶质瘤的产品中的应用，包括检测所述生物标志物POLQ的蛋白质含量的试剂。
8.如权利要求7所述的生物标志物POLQ在制备检测或评估胶质瘤的产品中的应用，所述试剂为特异性结合POLQ基因编码的蛋白的结合剂。
9.如权利要求1~8所述的生物标志物POLQ在制备检测或评估胶质瘤的产品中的应用，所述胶质瘤为脑胶质瘤。
10.如权利要求9所述的生物标志物POLQ在制备检测或评估胶质瘤的产品中的应用，与对照组的生物样本相比，所述生物标志物POLQ在脑胶质瘤组织中的表达水平上调。
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