CN112831554B - 一种SLE相关的环状RNA hsa_circ_0025843及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种环状RNA circ‑FGD4及其用途，所述环状RNA circ‑FGD4基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；另外，本发明提供了一种药物组合物、一种系统性红斑狼疮诊断试剂盒及circ‑FGD4基因作为靶基因在制备治疗系统性红斑狼疮的药物中的用途。circ‑FGD4基因及其表达产物作为诊断系统性红斑狼疮的标志物，使系统性红斑狼疮诊断更加准确、快速，作为制备治疗系统性红斑狼疮药物的靶基因为治疗系统性红斑狼疮提供了新的治疗靶点和治疗途径。

Description

一种SLE相关的环状RNA hsa_circ_0025843及其应用

技术领域

本发明涉及分子生物学和免疫技术领域，具体涉及一种SLE相关的环状 RNA hsa_circ_0025843及其应用。

背景技术

系统性红斑狼疮(Systemiclupuserthematosus，SLE)多年来一直被认为是 一种典型的超敏状态，这种状态是由器官特异性沉积免疫复合物后的炎症过程 介导的，伴随着包括补体系统在内的炎症途径的激活。在SLE患者中，存在着 免疫细胞功能障碍，特别是异常活化的T/B淋巴细胞，导致大量自身抗体的产 生，攻击自身组织器官造成损伤。在系统性红斑狼疮发病过程中，T和B淋巴细 胞起着至关重要的作用，特别是T淋巴细胞的再循环广泛的接触体内抗原物质， 加强免疫应答，进一步的发挥发挥细胞免疫和免疫调节功能，加强自身免疫性 并促进了机体本身的免疫排斥，加重了系统性红斑性狼疮的病情。虽然有大量 研究已表明遗传学、表观遗传学、环境因素及免疫学机制参与了系统性红斑狼 疮的发生发展,但其确定的关键机制仍然是未知数。故深入研究SLE发生和发展 中的分子机制、开发新的诊断标志物和治疗靶点成为当前SLE研究的热点和重 点领域。

环状RNA(circRNA)是一类不具有5'末端帽子和3'末端poly(A)尾巴、 并以共价键形成环形结构的非编码RNA分子，其广泛表达于不同物种中的RNA 分子，通常由前体mRNA(precursor messenger RNA,Pre-mRNA)经剪接环化产生 的共价闭合环状的非编码RNA。与传统的线性RNA(mRNA)不同的是环状RNA分子 具有闭合环状结构，比线性RNA结构稳定，表达更加稳定，丰度更高，也更不 易被降解，这些特点都使得环状RNA在疾病诊断与治疗方法上都更具开发应用 前景。通过过表达疾病过程中下调的环状RNA或抑制上调的环状RNA，将有极大 的可能缓解疾病的发生和发展。

Circ-FGD4(CircBase ID：hsa_circ_0025843)，其在基因组上的定位为： chr12:32751430-32764217strand:+，相应的线性基因为FGD4，环化序列有 738个碱基。申请人研究发现PBMC(外周血单个核细胞)中FGD4基因的RNA存 在环化现象，且环状RNA circ-FGD4在SLE病人PBMC及CD3+T细胞中表达量显 著上调，并抑制SLE病人T细胞的增殖，敲降circ-FGD4可逆转该过程，提示 circ-FGD4可能成为SLE诊断和治疗的新途径。

发明内容

针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种SLE相关的环状 RNA hsa_circ_0025843及其应用，，对环状RNA circ-FGD4在SLE病人中的表达及其对 CD3+T细胞生物学功能的研究。提供基于circ-FGD4基因及其表达产物在SLE的诊断 和治疗方面的用途。

为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：一种环状RNA circ-FGD4， 所述环状RNA circ-FGD4的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。所述环状 RNA circ-FGD4的结构是由如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列转录后经剪接形成 的首尾相连的环状RNA结构。

本发明还提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含上述环状RNA circ-FGD4。

本发明还提供了一种SLE诊断试剂盒，所述试剂盒包含能够扩增如上所述 的环状RNA circ-FGD4的引物。

优选地，所述扩增引物为由如SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示的DNA序 列组成的引物对。

本发明还提供了上述所述的环状RNA circ-FGD4在制备治疗SLE的药物中 的用途。

本发明还提供了circ-FGD4基因作为靶基因在制备治疗SLE的药物中的用 途，所述circ-FGD4基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

(1)本发明首先通过设计特异的环状RNA引物进行RT-PCR、Sanger测序、 RNaseR降解实验证实circ-FGD4基因的客观存在；

(2)本发明通过检测SLE病人中PBMC及CD3+T细胞circ-FGD4基因表达情 况，发现其相较于正常人表达明显上调，因此，可作为SLE的诊断标志；

(3)本发明对circ-FGD4基因进行了体外细胞功能学的研究，通过慢病毒感 染shRNA-circ-FGD4构建了敲降circ-FGD4基因的稳定CD3+T细胞系。敲降组T 细胞增殖明显高于负对照组和空白对照组，circ-FGD4抑制SLE病人T细胞的增 殖。敲降组IL-2水平显著升高，circ-FGD4对SLE T细胞IL-2分泌具有负性调 节作用。circ-FGD4基因及其表达产物可以应用在制备治疗SLE的药物中。综上， 沉默circ-FGD4后促进了CD3+T淋巴细胞的增殖及IL-2的分泌，对SLE的治疗 提供了帮助。circ-FGD4基因及其表达产物可以应用在制备治疗SLE的药物中。

circ-FGD4基因及其表达产物作为诊断SLE的标志物，使SLE诊断更加准确、 快速，作为制备治疗SLE药物的靶基因为治疗SLE提供了新的治疗靶点和治疗 途径。

下面结合说明书附图和具体实施例对本发明作进一步说明。

附图说明

图1为本发明实施例一的circRNA表达聚类热图；

图2为本发明实施例一的circ-FGD4结构示意图；

图3为本发明实施例一的生物信息分析流程示意图；

图4为本发明实施例二的circ_FGD4 Rnase R消化实验电泳示意图；

图5为本发明实施例二的Rnase R消化实验qPCR验证示意图；

图6为本发明实施例三的FISH细胞定位示意图；

图7为本发明实施例四的人PBMC中circ_FGD4差异表达的qRT-PCR结果 示意图；

图8为本发明实施例四的人CD3+T细胞中circ_FGD4差异表达的qRT-PCR 结果示意图；

图9为本发明实施例四的正常人与SLE病人PBMC-ROC曲线示意图；

图10为本发明实施例五的circ_FGD4-shRNA慢病毒感染CD3+T淋巴细胞 的效率检测结果示意图；

图11为本发明实施例六的has_circ_FGD4抑制SLE病人T细胞的增殖示 意图；

图12为本发明实施例七的circ_FGD4-shRNA侵染T细胞后分泌IL-2的表 达水平示意图。

具体实施方式

本发明首先通过设计能扩增环状RNA的特异性引物，PCR扩增出来FGD4基 因的环状RNA，接着进行RNaseR降解实验，确定了FGD4基因表达一种由738个 核苷酸组成的，具有闭合环状结构的环状RNA分子。同时，采用荧光原位杂交 的方法对环状RNA circ-FGD4进行细胞内定位实验。

进一步，本发明通过采用荧光定量PCR的方法检测circ-FGD4基因在SLE 样本中的表达差异，结果显示circ-FGD4基因在SLE的PBMC中的表达水平明显 高于正常人中的表达水平，并分析了circ-FGD4对SLE诊断的工作特征曲线， 故可制作检测该基因表达变化的试剂盒以用于诊断SLE。

接着，对circ-FGD4基因进行了体外细胞功能学的研究，

通过慢病毒感染shRNA-circ-FGD4构建了敲降circ-FGD4基因的稳定CD3+T 细胞系。敲降组T细胞增殖明显高于负对照组和空白对照组，circ-FGD4抑制 SLE病人T细胞的增殖。敲降组IL-2水平显著升高，circ-FGD4对SLE T细胞 IL-2分泌具有负性调节作用。circ-FGD4基因及其表达产物可以应用在制备治 疗SLE的药物中。综上，沉默circ-FGD4后可以促进了CD3+T淋巴细胞的增殖 及IL-2的分泌,对SLE的治疗提供了帮助。circ-FGD4基因及其表达产物可以应 用在制备治疗SLE的药物中。

本发明所涉及的技术均为分子克隆常规技术手段，其中涉及的酶、引物、 试剂以及反应条件在未作说明的情况下均可根据本领域技术人员的经验进行合 理选择，其中涉及试剂耗材属于市售的普通产品，其中涉及的检测手段以及仪 器也均为本领域技术人员所熟知并熟练掌握。

下面通过实施例和试验例对本发明的技术方案做进一步的说明，但不应理 解为对本发明的限制。

实施例一：circ_FGD4在临床样本中的发现及检测

参见图1至图3，

(1)高通量测序技术筛选出SLE患者外周血单个核细胞中环状RNA circ-FGD4

1、实验分组与血液样本的收集

SLE患者共30例(年龄39.5±12.1岁)，为温州医科大学附属第一医院、 温州医科大学附属第二医院风湿免疫科2016.11月到2017.5月门诊或住院病 人。所选病例均符合1997年美国风湿病协会(ARA)修订的SLE诊断标准。在 患者使用糖皮质激素、免疫抑制剂之前完成血标本采集和系统性红斑狼疮疾病 活动指数(Systemic Lupus ErythematosusDisease Activity Index,SLEDAI) 资料统计。正常对照组为健康志愿者30名(年龄35.8±10.0岁)，无自身免 疫性疾病或免疫抑制治疗史。对照组在年龄和性别上与患者相匹配。(女性： 27，男性：3，男女比1:9)。这项研究得到了温州医科大学研究伦理委员会的批 准，并获得了所有研究参与者的知情同意。高通量测序时，SLE患者按照SLEDAI 评分被均分为五组，实行混样,上机测序.1组为基本无活动组(3.2±0.9分)， 2组(6.3±0.7分)、3组(8.3±0.5分)为轻度活动组，4组为中度活动组(13.0 ±1.2分)，五组为重度活动组(19.0±2.6分).

从外周血单个核细胞(PBMC)的RNA样本的准备到上机检测、转录组测序， 建库、每一环节都会对数据的质量和数量有着较大的影响，而数据的质量和数 量会后面的生物信息解析有着直接影响。

2、生物信息分析流程如下图3所示。

环状RNA序列信息分析流程如图4所示。

circRNA表达聚类热图见图1，通过以上的测序，我们发现circ_FGD4在SLE 病人的PBMC中高表达。

(2)RT-PCR及Sanger测序验证环状RNA hsa_circ_0012152基因的来源 和序列

1、CD3+T淋巴细胞的分离与培养

1)实验前准备:实验开始30min前75％酒精棉擦拭分选架与磁分离器，并将 紫外打开灭菌整个超净台，预冷MACS buffer；

2)制备CD3+T细胞培养液:T淋巴细胞培养基50ml(anti-CD3anti-CD28刺 激因子100ug/ml 10％FBS青霉素,链霉素各500ul)；

3)将得到的PBMC的细胞悬液250g，离心10min后于15ml无菌离心管中按 照107个PBMC细胞用80ul MACSbufferl重悬，充分混匀，根据107个细胞加 入20ul的CD3阳性磁珠充分混匀，于4°孵育15min；

4)取出磁珠孵育好的PBMC，加入1-2ml MACS buffer于15ml离心管中， 1600rpm离心10min，弃上清；

5)取500ul MACS buffer洗涤空磁柱(MS柱)；

6)用500-1000ul MACS buffer重悬细胞于磁力架上分选，待500ul MACS buffer洗涤3次后，加入1ml MACS buffer，用活塞迅速推入无菌的1.5mlEP 管中，仔细混匀。将CD3阳性磁珠分选好的T细胞，取5×105/ml均匀接种在 24孔培养板中(500ul/孔)37°5％CO2培养箱中培养，2-3天后离心换液,显微镜 观察细胞状态。

2、CD3+T细胞基因组DNA(gDNA)的提取

1)实验前将水浴锅调至65℃；

2)将分离得到的CD3+T细胞悬液离心10min1600rpm；

3)离心后，直接加200ul溶液A，振荡至彻底混匀；

4)将20ul的RNase A加入CD3+T细胞悬浮液中，上下颠倒混匀，25-30度 放置10min；

5)将20ul的蛋白酶K加入上述混合液中，充分颠倒混匀，并置于65℃水浴 锅中消化30-60min，在此期间混匀颠倒离心管数次，直至样品消化完全为止；

6)加入2倍体积溶液B(使用前请先检查是否己加入无水乙醇)，充分颠倒 混匀，此时可能会出现絮状沉淀，不影响DNA的提取，可将溶液和絮状沉淀都 加入股附柱中，室温放置2min，12000rpm离心2min；

7)弃废液，将吸附柱放入收集管中，向吸附柱中加入700ul漂洗液， 12000rpm离心1min，弃废液，将吸附柱放入收集管中；

8)500ul漂洗液加入吸附柱中，12000rpm离心1min，弃废液，把吸附柱置 于收集管中，12000rpm空转2min；

9)将吸附柱敞口置于室温或55℃的烘箱里5-10分钟，将吸附柱放入一个新 的离心管中，将50-200ul经65℃水浴预热的双蒸水悬空滴向吸附膜的中央，室 温放置5min，12000rpm离心1min；

10)将离心所得DNA溶液重新加入吸附柱中，12000rpm离心2min，得到高 纯度的基因组DNA(gDNA)。

3、PCR及Sanger测序

环状RNA和内参GAPDH分别设计反向引物和正向引物各一对；PCR时设立一 组gDNA为模板对照，证实circRNA来自转录后剪切，而不是基因融合等突变， 参见表1。

circRNA name	Forward primer(上游引物)	Reverse primer(下游引物)
			circ_FGD4(反向引物)	CTCAAACTAGCTGCTCGGAACA	CTAAGAGGTCAAGTCGGTTGACA
mcirc_FGD4(正向引物)	TTCAGCACAAGAACGCTACCTT	GCTTCTTCCAACAGTTTGCAAT
			GADPH	TGACTTCAACAGCGACACCCA	CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA

表1

hsa_circ_0012152的序列见SEQ ID NO.1；PCR产物送测序公司测序，明确 检测到环化位点，结果见图2circ_FGD4结构示意图及Sanger测序结果。

实施例二：circ_FGD4的稳定性实验

参见图4至图5，

1、研究circ_FGD4对核酸外切酶(RNase R)的稳定性

(1)RNase R实验

以SLE患者与健康志愿者的CD3+T细胞为研究对象，分别提取RNA进行 RNAase R实验，分为RNAase R+,RNAase R－组。

反应体系：Storage Buffer：50mM Tris-HCl(pH 7.5),100mM NaCl,0.1 mM EDTA,1mM DTT,0.1％

X-100,50％Glycerol 10X Reaction Buffer：200mM Tris-HCl(pH 8.0),1M KCl,1mM MgCl2

按下列组分配置RNAase R+反应体系(冰上配制)，参见表2。

试剂名称	使用量
		RNA	>5ug
10X Reaction Buffer	5ul
		RNAase R	3-4ul/ng
RNase-free H2O	To 50ul

表2

将上述反应液充分混匀，置于37°水浴锅中15min。

(2)RNAase R实验后的逆转录反应

配制第一链cDNA合成反应液以1ug为定量，

在RNase free离心管中配制如下混合液：

逆转录反应体系参见表3。

试剂名称	使用量
		2×RT Buffer	10ul
TransScript RT Enzyme(M-MLV)	1ul
		Reverse Transcription Primer	2ul
Total RNA	10pg-1ug
		RNase free H2O	to 20ul
Total	Total 20

表3

用移液器轻轻吹打混匀。

按下列条件进行第一链cDNA合成反应

25℃ 10min；

42℃ 15min；

85℃ 5min；

完成上述逆转录反应后，将产物存于-20°以待备用。

根据环状RNA-00258453back-splicejunction位点的设计qRT-PCR引物序 列，参见表1

(3)1％琼脂糖凝胶的电泳

1)称量0.6g琼脂糖溶解在50ml 0.5×TBE电泳缓冲液中，轻轻摇匀，然后 置于微波炉中，中高火1-2min左右。

2)冷却至60°向其中加入4ul 6×GelRed同时轻轻倒入电泳槽水平板上

3)当琼脂糖胶凝固后，向电泳槽内加入约600ml的0.5×TBE电泳缓冲液， 然后缓慢的拔出梳子。

4)使用移液枪将DNA样品与6×GelRed的混合液加入到琼脂糖凝胶孔中， 孔/10-20μl，并且记录各孔样品的点样顺序和样品量。

5)接好电极导线，黑线接负极端，红线接正极端，打开电源开关，调电压 至110V，电泳约30min-1h，停止电泳即可。

我们对筛选出的circ_FGD4进行是否为环形结构进行RNase R消化实验验 证，提取5例SLE患者中CD3+T淋巴细胞的基因组DNA(gDNA)RNA以及RNA， 由于circRNA是闭合环状结构且没有polyA尾并用RNase R的消化total RNA， 并将RNase R消化后单链RNA逆转录为cDNA后，分别以cDNA和gDNA为模 板，用circ_FGD4的正向引物以及反向引物进行RT-PCR方法来扩增环化产物和 线性产物。琼脂糖凝胶电泳结果分析发现circ_FGD4的线性产物只能在total RNA未被RNase R消化cDNA模板及gDNA中被扩增出来，而circ_FGD4环形产 物无论在RNase R消化cDNA模板均可被扩增出来(图5)。同时采用qRT-PCR方 法此结果进行定量分析，在CD3+T细胞中，RNase R处理前后circ_FGD4的 表达水平没有明显的变化，而在用RNaseR处理后，线性circ_FGD4表达明显 下降(图6)。因此该实验证实了circ_FGD4在CD3+T中细胞系中以闭合环状 结构的形式存在。

实施例三：circ_FGD4的定位

参见图6，

circ_FGD4的Fish探针序列如下，参见表5。

表5

1)探针稀释：nmole/OD260＝4.17，则在每OD探针干粉制品中加入41.7μl 灭菌DEPC水，混匀后即得浓度约为100μM的储存液。

2)配制探针混合液：70μl Buffer E，2μl探针，28μl DEPC水，终体积 为100ul

3)涂片：将约20ul的T细胞悬液滴在-20度处理过的载玻片上，同时另取 一片载玻片做为推片，当细胞滴均匀地附着在两片之间时，两张载玻片的夹角 成30～40度，并将推片从细胞滴的左侧缓慢均匀的推向载玻片右侧，推出均匀 的细胞膜，然后将载玻片置于酒精灯上烤成白色薄膜即可。

4)将烤干的细胞涂片置于10cm dish中，滴加100μl 0.1％Buffer A消化 15min。

5)吸弃0.1％Buffer A，滴加PBS洗两次，每次5min。

6)将PBS吸净后，滴加100μl 2×Buffer C，将盛有dish玻片的dish置 于37°培养箱30min。

7)30min后，吸净2×Buffer C，向dish中滴加100μl 70％乙醇，置于室 温3min。

8)3min后，吸弃70％乙醇，向dish中滴加100μl 85％乙醇，室温放置3min。

9)3min后，吸弃85％乙醇，向dish中滴加100μl无水乙醇，室温放置3min。

10)吸弃无水乙醇，室温干燥。

11)Buffer E提前在37°水浴锅孵育2h。

12)将玻片水平放置于湿盒中，每张玻片滴加100μl探针混合液，73°变 性5min，并将湿盒置于37°培养箱杂交孵育过夜12～16h。

13)杂交次日，将样本从37°培养箱取出，吸弃探针混合液，每张玻片滴加 100μl的0.1％Buffer F洗涤5min。

14)吸弃0.1％Buffer F，向每张玻片滴加100μl的2×Buffer C并洗涤5min。

15)吸弃2×Buffer C，每张玻片滴加100μl的1×Buffer C洗涤5min， 吸弃洗涤液，于室温干燥。

16)每张玻片滴加100μl稀释后的DAPI工作液，避光染色20min，吸弃， 每张玻片滴加100μl PBS洗2次，每次2min；

17)滴加30ul甘油，盖上盖玻片，于荧光显微镜下观察。

采用RNA荧光原位杂交(RNA FISH)技术，以β-actin为对照(定位在 细胞核)，发现circ_FGD4主要定位于CD3+T淋巴细胞细胞浆中(图7)。

实施例四：qPCR检测circ_FGD4在SLE的PBMC及CD3+T细胞中的表达情况 并进行特异度和灵敏度分析

参见图7至图9，图7：circ_FGD4差异表达的qRT-PCR结果：为20例SLE 患者PBMC细胞及15例健康人中PBMC细胞中表达(circ_FGD4)，(****P<0.0001)

图8：qRT-PCR实验分析35例SLE患者CD3+T淋巴细胞及30例健康人中 CD3+T淋巴细胞中的hsa_circ_0025843表达水平(*P<0.05)

采用qRT-PCR方法(细胞来源及引物见上)分别检测了circ_FGD4在35例 SLE患者及健康人中PBMC和CD3+T淋巴细胞中的表达量，发现与健康人PBMC及 CD3+T淋巴细胞相比，circ_FGD4在SLE患者CD3+T细胞中明显高表达，参见图 7和图8。

考虑到临床更容易获得病人PBMC，利用PBMC中检测出来的circ_FGD4的表 达量值绘制ROC曲线并计算曲线下面积AUC来评价circ_FGD4诊断SLE灵敏度 和特异度。当AUC＜0.5时，表示诊断无意义；AUC＝0.5-0.7时，表示诊断准确 性较低；AUC＝0.7-0.9时，表示诊断准确性中等；AUC＞0.9时，表示诊断准确 性高。灵敏度为纵坐标代表真阳性率，(1-特异性)为横坐标代表假阳性率。

结果见图9，结果显示，AUC＝1.000，标准误为0.001，p＜0.0001(95％ CI:100.00％—100.00％)。说明采用环状RNA作为标志物对于诊断SLE的效果非 常优秀。

以上结果提示circ_FGD4核苷酸序列如SEQ ID No.1所示可作为SLE发 生和转移的诊断标志物。并且可将上述结SLE诊断生物标志物制备成SLE诊断 产品，产品选自制剂、芯片或试剂盒。产品中包括特异性识别环状RNA circ_FGD4的引物对，包括上游引物和下游引物，上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。

实施例五：circ_FGD4-shRNA慢病毒及其稳定细胞系构建

参见图10，图10：circ_FGD4-shRNA慢病毒感染CD3+T淋巴细胞的效率检 测结果：circ_FGD4-shRNA慢病毒侵染CD3+T淋巴细胞后荧光图A为：NC-shRNA 侵染SLE T细胞24h、48h(200X)，图B为：Blank 24h、48h(200X)，图 C为circ_FGD4-shRNA1#侵染SLE T细胞24h、48h(200X)，图D为 circ_FGD4-shRNA2#侵染SLE T细胞24h、48h(200X)

1、shcircRNA慢病毒的感染CD3+T淋巴细胞

1)CD3+T淋巴细胞在6cm dish中培养至80-90％融合时，300rpm离心3min， 倾去培养液，用3mLPBS洗涤细胞两次。

2)加入2mL含10％FBS的1640培养基，吹打使CD3+T淋巴单细胞形成悬 液。

3)血球计数板计数，将细胞稀释至3×105细胞/mL。

4)按2×104细胞/孔的浓度接种48孔板，取慢病毒原液50uL，用含10％FBS 的1640培养液按1∶10(注：预实验发现这个稀释浓度最好，侵染效率均到90％ 以上)的比例稀释，并加入终浓度为1X的病毒感染试剂。

5)每孔加入上述450μL稀释的病毒混合液(含细胞)，置于37℃5％CO2 培养箱中培养0h、24h、48h，观测慢病毒感染结果。

2、稳定细胞株鉴定

构建好的稳定细胞株荧光显微镜下拍照观察，第一组：负对照shRNA慢病 毒感染SLE T细胞组(NC-shRNA)；第二组：未感染的SLE T细胞为空白对照 组(BLANK)；第三组circ-FGD4-shRNA1#慢病毒感染SLE T细胞 (circ_FGD4-shRNA1#)；第四组：用circ_FGD4-shRNA2#慢病毒感染SLE T细 胞组(circ_FGD4-shRNA2#)。分别于感染后24h、48h检测感染效率,荧光显 微镜下可观察到转染后的绿色荧光CD3+T淋巴细胞数占总细胞数的90％以上(见 图11:A.B.C)circ_FGD4-shRNA慢病毒侵染CD3+T淋巴细胞后荧光图A为： NC-shRNA侵染SLE T细胞24h、48h(200X)图B为：Blank 24h、48h(200X) 图C为circ_FGD4-shRNA1#侵染SLE T细胞24h、48h(200X)。

结果显示，敲降效果显著，可以用于后续实验。

实施例六：CCK8实验检测CD3+T淋巴细胞的增殖情况

参见图11，图11：circ-FGD4抑制SLE病人T细胞的增殖。图A：感染前 SLE病人组T细胞增殖明显低于健康人组(P<0.01)，图B：而感染后24h circ_FGD4-shRNA1#组T细胞增殖明显高于负对照组和空白对照组(P<0.01, P<0.01)，且circ_FGD4-shRNA1#组T细胞增殖优于circ_FGD4-shRNA2#组(P <0.05)；图C：转染48h后circ_FGD4-shRNA1#组T细胞增殖明显高于负对照组。

我们分别收集了10例SLE活动期患者和10例健康人的血样，分离PBMCs， 再用CD3+T磁珠分离T淋巴细胞并培养，并将实验分组：

第一组：健康人T细胞组(NC)；

第二组：未感染的SLE T细胞为空白对照(BLANK)；

第三组：负对照shRNA慢病毒感染SLE T细胞组(NC-shRNA组)；

第四组：用circ_FGD4-shRNA1#慢病毒感染SLE T淋巴细胞组；

第五组：用circ_FGD4-shRNA2#慢病毒感染SLE T细胞组。

分别调整各组细胞密度至5x104/ml，每孔接种100μl于96孔板中，置37 ℃,5％CO2的细胞培养箱中培养24h，每组设5个复孔。分别于感染24h和48h 后，将10μl的CCK-8溶液加入96孔板的相应孔中，然后在培养箱中继续培养 3h，最后用酶标仪在450nm波长处测各孔的吸光值。

结果显示感染前SLE病人组T细胞增殖明显低于健康人组[(0.76±0.21) 与(1.97±0.15)，P＜0.01](图11A),而感染后24h circ_FGD4-shRNA1#组T 细胞增殖明显高于NC-shRNA组[(1.72±0.18)与(0.89±0.06)，P＜0.01] 和SLE(Blank)组[(1.72±0.18)与(1.04±0.25)，P＜0.01]，且 circ_FGD4-shRNA1#组T细胞增殖优于circ_FGD4-shRNA2#组[(1.72±0.18)与 (1.27±0.11)，P＜0.05](图11B)；转染48h后circ_FGD4-shRNA1#组T细胞 增殖明显高于NC-shRNA组[(1.87±0.33)与(1.08±0.13)，P＜0.05]和 SLE(Blank)组[(1.87±0.33)与(1.30±0.10)，P＜0.05]，且 circ_FGD4-shRNA1#组T细胞增殖优于circ_FGD4-shRNA2#组[(1.87±0.33)与 (1.35±0.14)，P＜0.05](图11C)。

实施例七：细胞因子(IL-2)酶联接免疫吸附剂(ELISA)的测定

参见图12，图12：circ_FGD4-shRNA侵染T细胞后分泌IL-2的表 达水平示意图

1)收集慢病毒shcirRNA分别感染SLE患者与健康人的CD3+T淋巴细胞的培 养上清液。

2)用0.05M PH9的碳酸盐包被缓冲液将抗体稀释至蛋白质含量为1～10μ g/ml。

3)在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.1ml，4℃过夜。

4)第二日，吸取孔内溶液，用缓冲液洗涤3次，次/3min。

5)在上述的包被板反应孔中加入0.1ml加入稀释好的待测样品，37℃孵育1 小时，然后洗涤。

6)将100ul稀释好的酶标抗体加入各反应孔中，37℃温箱中孵育0.5～1小 时，洗涤，加底物液显色，向各个反应孔中加入现配的TMB底物溶液100ul，37℃ 孵育10～30分钟。

终止反应：向各个反应孔中加入2M硫酸0.05ml。

结果判定：在ELISA检测仪上，以空白对照孔调零后在450nm波长处测各 孔O·D值，即为反应液的O·D值。

我们为进一步探索circ_FGD4是否对CD3+T淋巴细胞细胞因子的影响，我 们采用ELISA方法检测了IL-2的分泌量，分别收集22例SLE和22例健康人血 样，分离PBMCs，再磁珠分离T细胞并培养，并将其实验分组，IL-2分组：

第一组：健康人T细胞组(NC组)；

第二组：SLE T细胞组(SLE组)；

第三组：负对照shRNA慢病毒感染SLE T细胞组(NC-shRNA组)；

第四组：未感染的SLE T细胞为空白对照(BLANK，注：这个组与第二组相 同)；

第五组：用circ_FGD4-shRNA1#慢病毒感染SLE T细胞组(circ_FGD4 -shRNA1#组)。

上述各组感染24h收集细胞上清液，ELISA检测IL-2的表达量，根据相 应的标准曲线计算浓度，ELISA结果显示circ_FGD4抑制IL-2的分泌。

SEQ1:

GAGACTAATGAGCAAAAACTTCACAAAATAGCCAATGAACTTTTGCTTACTGAAAGAGCTTATGTCAACCGACTTGACCTCTTAGATCAGGTATTTTATTGCAAACTGTTGGAAGAAGCAAACCGAGGCTCGTTTC CAGCAGAGATGGTGAATAAAATCTTTTCTAATATTTCATCAATAAATGCCTTCCATAGTAAATTCCTCTT GCCAGAGCTGGAGAAACGAATGCAAGAATGGGAAACTACTCCTAGAATTGGAGACATCCTTCAGAAA TTGGCACCATTCCTTAAGATGTATGGAGAATATGTGAAAGGATTTGATAATGCAATGGAATTGGTTAAA AACATGACAGAACGTATTCCCCAGTTCAAATCAGTGGTTGAAGAAATTCAGAAACAGAAAATCTGTG GGAGCTTAACTTTGCAGCATCACATGCTAGAACCTGTTCAGCGGATTCCCCGGTATGAGATGCTCCTTA AGGACTATCTAAGGAAATTGCCTCCTGATTCCCTGGACTGGAATGATGCTAAAAAATCACTTGAAATTA TATCTACAGCAGCAAGCCATTCTAATAGTGCAATAAGGAAAATGGAGAACCTAAAGAAACTCTTAGAG ATTTATGAAATGTTGGGAGAAGAAGAAGACATTGTAAACCCTTCAAATGAACTAATAAAAGAAGGAC AGATCCTCAAACTAGCTGCTCGGAACACTTCAGCACAAGAACGCTACCTTTTCTTA

SEQ2:

CTCAAACTAGCTGCTCGGAACA

SEQ3：CTAAGAGGTCAAGTCGGTTGACA

SEQ4：TTCAGCACAAGAACGCTACCTT

SEQ5:GCTTCTTCCAACAGTTTGCAAT

circ-FGD4基因及其表达产物作为诊断系统性红斑狼疮的标志物，使系统性 红斑狼疮诊断更加准确、快速，作为制备治疗系统性红斑狼疮药物的靶基因为 治疗系统性红斑狼疮提供了新的治疗靶点和治疗途径。

上述实施例对本发明的具体描述，只用于对本发明进行进一步说明，不能 理解为对本发明保护范围的限定，本领域的技术工程师根据上述发明的内容对 本发明作出一些非本质的改进和调整均落入本发明的保护范围之内。

序列表

<120> 一种SLE相关的环状RNA hsa_circ_0025843及其应用

<140> 202011282277X

<141> 2020-11-17

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 738

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 1

gagactaatg agcaaaaact tcacaaaata gccaatgaac ttttgcttac tgaaagagct 60

tatgtcaacc gacttgacct cttagatcag gtattttatt gcaaactgtt ggaagaagca 120

aaccgaggct cgtttccagc agagatggtg aataaaatct tttctaatat ttcatcaata 180

aatgccttcc atagtaaatt cctcttgcca gagctggaga aacgaatgca agaatgggaa 240

actactccta gaattggaga catccttcag aaattggcac cattccttaa gatgtatgga 300

gaatatgtga aaggatttga taatgcaatg gaattggtta aaaacatgac agaacgtatt 360

ccccagttca aatcagtggt tgaagaaatt cagaaacaga aaatctgtgg gagcttaact 420

ttgcagcatc acatgctaga acctgttcag cggattcccc ggtatgagat gctccttaag 480

gactatctaa ggaaattgcc tcctgattcc ctggactgga atgatgctaa aaaatcactt 540

gaaattatat ctacagcagc aagccattct aatagtgcaa taaggaaaat ggagaaccta 600

aagaaactct tagagattta tgaaatgttg ggagaagaag aagacattgt aaacccttca 660

aatgaactaa taaaagaagg acagatcctc aaactagctg ctcggaacac ttcagcacaa 720

gaacgctacc ttttctta 738

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 2

ctcaaactag ctgctcggaa ca 22

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 3

ctaagaggtc aagtcggttg aca 23

Claims (3)

1.能够扩增cDNA序列如SEQ ID NO:1所示的环状RNAhsa_circ_0025843的引物在制备系统性红斑狼疮诊断试剂盒中的应用。

2.如权利要求1中所述的扩增引物，其特征在于，为由如SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示的DNA序列组成的引物对。

3.靶向沉默hsa_circ_0025843的shRNA在制备治疗系统性红斑狼疮的药物中的用途。

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