JP2013116088A

JP2013116088A - 線維芽細胞の細胞老化状態の評価方法

Info

Publication number: JP2013116088A
Application number: JP2011265910A
Authority: JP
Inventors: Tomonobu Ezure; 智暢江連; Misato Sugawara; 美郷菅原
Original assignee: Shiseido Co Ltd
Current assignee: Shiseido Co Ltd
Priority date: 2011-12-05
Filing date: 2011-12-05
Publication date: 2013-06-13

Abstract

【課題】細胞老化状態の適切な評価と、細胞老化の防止及び軽減とのために、細胞老化の前後で大きく変化するマーカーを利用する、線維芽細胞の細胞老化状態の評価方法と、被験処理条件による線維芽細胞の細胞老化阻害効果の評価方法と、前記評価方法を実施するためのキットと、線維芽細胞の細胞老化を抑制する化合物のスクリーニング方法とを開発する。
【解決手段】本発明は、生物学的試料中のＯＬＦＭＬ２Ａ及び／又はＣＲＬＦ１の遺伝子産物の発現量ｅを決定するステップを含む、線維芽細胞の細胞老化状態の評価方法を提供する。本発明は、被験処理条件による線維芽細胞の細胞老化阻害効果の評価方法を提供する。本発明の評価方法は、（１）被験処理前の生物学的試料中のＯＬＦＭＬ２Ａ及び／又はＣＲＬＦ１の遺伝子産物の発現量Ｅ_０を決定するステップと、（２）被験処理後の生物学的試料中のＯＬＦＭＬ２Ａ及び／又はＣＲＬＦ１の遺伝子産物の発現量Ｅ_１を決定するステップとを含む。
【選択図】なし

Description

本発明は、線維芽細胞の細胞老化状態の評価方法と、被験処理条件による線維芽細胞の細胞老化阻害効果の評価方法と、前記評価方法を実施するためのキットと、線維芽細胞の細胞老化を抑制する化合物のスクリーニング方法とに関する。

細胞分裂を不可逆的に停止する細胞老化は、アポトーシスとともに、加齢、酸化ストレス、ゲノムの不安定化等によって誘導されるがん発生を抑制するための生体防御メカニズムとして機能する。一般的に、細胞老化状態の進行は、がん発生のリスクが高いことを示す。また、細胞老化は、線維芽細胞の増殖、並びに、コラーゲン、エラスチン、ヒアルロン酸等の細胞外マトリクス成分の産生を低下させ、シワ、たるみ、褥瘡等の皮膚状態の悪化を生じさせると考えられている。したがって、細胞老化状態を適切に評価すること、細胞老化を防止及び軽減することは、健康上及び美容上重要である。

本発明の課題は、細胞老化の前後で大きく変化するマーカーを利用する、線維芽細胞の細胞老化状態の評価方法と、被験処理条件による線維芽細胞の細胞老化阻害効果の評価方法と、前記評価方法を実施するためのキットと、線維芽細胞の細胞老化を抑制する化合物のスクリーニング方法とを開発することである。

本発明者は、オルファクトメジン様２Ａ（以下、「ＯＬＦＭＬ２Ａ」という。）及びサイトカイン受容体様因子１（以下、「ＣＲＬＦ１」という。）の遺伝子産物の発現量が、継代培養を繰り返した線維芽細胞で増大することを見出した。この発見は、前記ＯＬＦＭＬ２Ａ及びＣＲＬＦ１の遺伝子産物の発現量は加齢にともなう細胞老化で増大することを示す。そこで本発明者は、ＯＬＦＭＬ２Ａ及び／又はＣＲＬＦ１を利用する、線維芽細胞の細胞老化状態の評価方法と、被験処理条件による線維芽細胞の細胞老化阻害効果の評価方法と、前記評価方法を実施するためのキットと、線維芽細胞の細胞老化を抑制する化合物のスクリーニング方法とに関する本発明を想到した。

本発明は、生物学的試料中のＯＬＦＭＬ２Ａ及び／又はＣＲＬＦ１の遺伝子産物の発現量ｅを決定するステップを含む、線維芽細胞の細胞老化状態の評価方法を提供する。本発明の線維芽細胞の細胞老化状態の評価方法では、正常な生物学的試料中のＯＬＦＭＬ２Ａ及び／又はＣＲＬＦ１の遺伝子産物の発現量ｅ_０と、細胞老化状態の生物学的試料中のＯＬＦＭＬ２Ａ及び／又はＣＲＬＦ１の遺伝子産物の発現量ｅ_１とに基づいて評価される場合がある。本発明の線維芽細胞の細胞老化状態の評価方法において、前記ＯＬＦＭＬ２Ａ及び／又はＣＲＬＦ１の遺伝子産物の発現量は、ＯＬＦＭＬ２Ａ及び／又はＣＲＬＦ１のｍＲＮＡ及び／又はタンパク質の存在量に基づいて決定される場合がある。

本発明は、被験処理条件による線維芽細胞の細胞老化阻害効果の評価方法を提供する。本発明の評価方法は、（１）被験処理前の生物学的試料中のＯＬＦＭＬ２Ａ及び／又はＣＲＬＦ１の遺伝子産物の発現量Ｅ_０を決定するステップと、（２）被験処理後の生物学的試料中のＯＬＦＭＬ２Ａ及び／又はＣＲＬＦ１の遺伝子産物の発現量Ｅ_１を決定するステップと、（３）Ｅ_０及びＥ_１に基づいて、前記被験処理条件の細胞老化阻害効果を評価するステップとを含む。

本発明の評価方法において、前記生物学的試料は、被験者から採取された血液、細胞及び組織からなるグループから選択される少なくとも１種類から調製される場合がある。

本発明は、被験処理条件による培養線維芽細胞の細胞老化阻害効果の評価方法を提供する。本発明の評価方法は、（１）前記培養線維芽細胞の細胞老化処理前のＯＬＦＭＬ２Ａ及び／又はＣＲＬＦ１の遺伝子産物の発現量Ｅ’_０を決定するステップと、（２）前記培養線維芽細胞の細胞老化処理後のＯＬＦＭＬ２Ａ及び／又はＣＲＬＦ１の遺伝子産物の発現量Ｅ’_１を決定するステップと、（３）Ｅ’_０及びＥ’_１に基づいて、前記被験処理条件の細胞老化阻害効果を評価するステップとを含む。

本発明の評価方法において、前記被験処理条件は、試験化合物が添加された培地中での前記培養線維芽細胞の細胞老化処理の場合がある。

本発明の評価方法において、前記線維芽細胞は哺乳類由来の線維芽細胞株の場合がある。

本発明の評価方法において、前記ＯＬＦＭＬ２Ａ及び／又はＣＲＬＦ１の遺伝子産物の発現量は、ＯＬＦＭＬ２Ａ及び／又はＣＲＬＦ１のｍＲＮＡ及び／又はタンパク質の存在量に基づいて決定される場合がある。

本発明の評価方法において、前記ＯＬＦＭＬ２Ａ及び／又はＣＲＬＦ１の遺伝子産物の発現量は、対照遺伝子のｍＲＮＡ及び／又はタンパク質の存在量を基準とする相対値として決定される場合がある。

本発明の評価方法において、前記ＯＬＦＭＬ２Ａ及び／又はＣＲＬＦ１のｍＲＮＡは、ＲＴ−ＰＣＲ法又は固相雑種形成法で検出される場合がある。本発明の評価方法において、前記ＯＬＦＭＬ２Ａ及び／又はＣＲＬＦ１のｍＲＮＡは、前記ＯＬＦＭＬ２Ａ及び／又はＣＲＬＦ１のｍＲＮＡに特異的なプライマー対及び／又はプローブを用いるＲＴ−ＰＣＲ法又は固相雑種形成法で検出される場合がある。

本発明の評価方法において、前記ＯＬＦＭＬ２Ａ及び／又はＣＲＬＦ１のタンパク質は、ＥＬＩＳＡ法、ウエスタンブロット法、免疫沈降法及び免疫比濁法からなるグループから選択される少なくとも１つの方法で検出される場合がある。本発明の評価方法において、前記ＯＬＦＭＬ２Ａ及び／又はＣＲＬＦ１のタンパク質は、前記ＯＬＦＭＬ２Ａ及び／又はＣＲＬＦ１のタンパク質に特異的な抗体を用いるＥＬＩＳＡ法、ウエスタンブロット法、免疫沈降法及び免疫比濁法からなるグループから選択される少なくとも１つの方法で検出される場合がある。

本発明は、前記ＯＬＦＭＬ２Ａ及び／又はＣＲＬＦ１の遺伝子産物の発現量を決定するための試薬を含む、本発明の評価方法を実施するためのキットを提供する。

本発明のキットにおいて、前記試薬は、前記ＯＬＦＭＬ２Ａ及び／又はＣＲＬＦ１のｍＲＮＡに特異的なプライマー対及び／又はプローブか、前記ＯＬＦＭＬ２Ａ及び／又はＣＲＬＦ１のタンパク質に特異的な抗体かの場合がある。

本発明は、線維芽細胞の細胞老化を抑制する化合物のスクリーニング方法を提供する。本発明のスクリーニング方法は、（１）前記線維芽細胞の細胞老化を抑制する候補化合物を用意するステップと、（２）細胞老化処理と、前記候補化合物の投与とが実施される前に、前記線維芽細胞のＯＬＦＭＬ２Ａ及び／又はＣＲＬＦ１の遺伝子産物の発現量Ｅ’’_０を決定するステップと、（３）前記細胞老化処理だけが実施された後に、前記線維芽細胞のＯＬＦＭＬ２Ａ及び／又はＣＲＬＦ１の遺伝子産物の発現量Ｅ’’_１を決定するステップと、（４）前記細胞老化処理と、前記候補化合物の投与とが実施された後に、前記線維芽細胞のＯＬＦＭＬ２Ａ及び／又はＣＲＬＦ１の遺伝子産物の発現量Ｅ’’_２を決定するステップと、（５）Ｅ’’_２がＥ’’_１よりも低い値を示す候補化合物を、線維芽細胞の細胞老化を抑制する化合物として選択するステップとを含む。

本発明のスクリーニング方法において、前記ＯＬＦＭＬ２Ａ及び／又はＣＲＬＦ１の遺伝子産物の発現量は、ＯＬＦＭＬ２Ａ及び／又はＣＲＬＦ１のｍＲＮＡ及び／又はタンパク質の存在量に基づいて決定される場合がある。

本発明は、被験者から採取された生物学的試料中のＯＬＦＭＬ２Ａ及び／又はＣＲＬＦ１の遺伝子産物の発現量を決定するステップを含む、老化の診断方法を提供する。本発明の診断方法において、前記生物学的試料は、採取された血液か、生検により採取された線維芽細胞かの場合がある。本発明の診断方法において、前記ＯＬＦＭＬ２Ａ及び／又はＣＲＬＦ１の遺伝子産物の発現量は、ＯＬＦＭＬ２Ａ及び／又はＣＲＬＦ１のｍＲＮＡ及び／又はタンパク質の存在量に基づいて決定される場合がある。

本明細書におけるＯＬＦＭＬ２Ａ及び／又はＣＲＬＦ１の遺伝子産物の発現量とは、生物学的試料におけるＯＬＦＭＬ２Ａ及び／又はＣＲＬＦ１のｍＲＮＡ及び／又はタンパク質の存在量をいう。前記生物学的試料は、血液、生体内から採取された細胞及び組織と、培養線維芽細胞とを含むが、これらに限定されない。前記生物学的試料は、当業者に標準的な方法で調製することができる。前記生物学的試料の生物種は、ヒト、サル、マウス及びラットを含むが、これらに限定されない。前記ＯＬＦＭＬ２Ａ及び／又はＣＲＬＦ１のｍＲＮＡは、成熟ｍＲＮＡ、スプライシング・バリアント及び未成熟ｍＲＮＡを含むが、これらに限定されない。

本明細書における「ＯＬＦＭＬ２Ａ」及び「ＣＲＬＦ１」は、本発明の評価方法に用いられる線維芽細胞と同じ動物種のオルファクトメジン様２Ａ及びサイトカイン受容体様因子１の相同遺伝子の場合がある。

ＯＬＦＭＬ２ＡはＯＬＦＡＣＴＯＭＥＤＩＮ様のドメインを有する分泌性糖タンパク質である（Ｔｏｍａｒｅｖ，Ｓ．Ｉ．及びＮａｋａｙａ，Ｎ．、Ｍｏｌ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．、４０：１２２（２００９））。ＣＲＬＦ１は、１型サイトカイン受容体と相同性を有する可溶性サイトカイン受容体である（Ｅｌｓｏｎ，Ｇ．Ｃ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１６１：１３７１（１９９８））。しかし、ＯＬＦＭＬ２Ａ及びＣＲＬＦ１の生理作用、特に細胞老化におけるＯＬＦＭＬ２Ａ及びＣＲＬＦ１の生理作用は明らかにされていない。

以下の実施例に示すとおり、線維芽細胞の細胞老化にともなってＯＬＦＭＬ２Ａ及びＣＲＬＦ１の遺伝子産物の発現量が顕著に増大することはこれまで知られていなかった。したがって、本発明のＯＬＦＭＬ２Ａ及びＣＲＬＦ１の遺伝子産物の発現量を指標とする線維芽細胞の細胞老化状態の評価方法は新規発明である。

本明細書における「細胞老化処理」とは、細胞分裂の不可逆的な停止又は顕著な減少を生じさせるいずれかの処理をいい、培養線維芽細胞の継代を繰り返すこと、ノックアウト動物及びトランスジェニック動物を含む実験動物を長期間飼育することを含むが、これに限定されない。

本発明における培養線維芽細胞とは、生体内から採取された線維芽細胞の初代培養と、継代培養された線維芽細胞と、ｉＰＳ細胞、間葉系幹細胞その他の多分化能を有する幹細胞から分化された線維芽細胞と、線維芽細胞株とを含み、細胞老化処理で細胞老化可能な細胞をいう。前記線維芽細胞株はＴＩＧ−１細胞の場合がある。

本発明におけるＯＬＦＭＬ２Ａ及びＣＲＬＦ１の遺伝子産物の発現量は、線維芽細胞内に存在するＯＬＦＭＬ２Ａ及びＣＲＬＦ１のｍＲＮＡの存在量の他、前記線維芽細胞におけるＯＬＦＭＬ２Ａ及びＣＲＬＦ１の遺伝子の転写活性を含む。前記線維芽細胞内に存在するＯＬＦＭＬ２Ａ及びＣＲＬＦ１のｍＲＮＡの存在量は、ＲＴ−ＰＣＲ法、ノザンブロット法その他の固相雑種形成法を含むがこれらに限定されない方法によって決定される。前記線維芽細胞におけるＯＬＦＭＬ２Ａ及びＣＲＬＦ１の遺伝子の転写活性は、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、β−ガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）、ルシフェラーゼ（Ｌｕｃ）、緑蛍光タンパク質（ＧＦＰ）その他のレポータータンパク質が、ＯＬＦＭＬ２Ａ及びＣＲＬＦ１の遺伝子の発現制御領域によって駆動されるコンストラクトを培養線維芽細胞に一時的又は永続的に導入することによって測定されるのが典型的である。前記培養線維芽細胞がヒト由来のとき、前記細胞内に存在するＯＬＦＭＬ２ＡのｍＲＮＡの存在量をＲＴ−ＰＣＲ法によって決定するためには、配列番号１及び２に列挙されるヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドが、プライマーの対として用いられる場合がある。前記培養線維芽細胞がヒト由来のとき、前記細胞内に存在するＣＲＬＦ１のｍＲＮＡの存在量をＲＴ−ＰＣＲ法によって決定するためには、配列番号３及び４に列挙されるヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドが、プライマーの対として用いられる場合がある。

本発明におけるＯＬＦＭＬ２Ａ及びＣＲＬＦ１のｍＲＮＡの存在量は、決定するときの細胞の数又は全タンパク質の存在量によって標準化された絶対値として決定される場合がある。あるいは、同じ数の細胞が複数の同一容器、例えば、ウェル、ディッシュ、フラスコ等に播種される場合には、細胞老化処理及び被験処理条件における培養後の容器１つあたりのＯＬＦＭＬ２Ａ及びＣＲＬＦ１のｍＲＮＡの存在量は、細胞老化処理前の前記線維芽細胞のＯＬＦＭＬ２Ａ及びＣＲＬＦ１のｍＲＮＡの存在量を基準とする相対値で表される場合がある。さらに、本発明におけるＯＬＦＭＬ２Ａ及びＣＲＬＦ１のｍＲＮＡの存在量は、同じ数の細胞が複数の同一容器、例えば、ウェル、ディッシュ、フラスコ等に播種される場合には、同一条件で処理された容器１つあたりの対照遺伝子のｍＲＮＡの存在量で標準化される場合がある。前記対照遺伝子は、いわゆるハウスキーピング遺伝子を含むが、これらに限定されず、例えば遺伝子発現アレイチップ等の手段で見つけることができる。本発明におけるハウスキーピング遺伝子は、２８ＳｒＲＮＡ、１８ＳｒＲＮＡ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ６ＰＤ）、グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）、βアクチン等を含むが、これらに限定されない。前記対照遺伝子がＧＡＰＤＨの場合には、本明細書における「対照遺伝子のｍＲＮＡの存在量」という文言は、ＧＡＰＤＨのｍＲＮＡの存在量を意味するものとする。前記培養線維芽細胞がヒト由来のとき、前記細胞内に存在するＧＡＰＤＨのｍＲＮＡの存在量をＲＴ−ＰＣＲ法によって決定するためには、配列番号５及び６に列挙されるヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドが、プライマーの対として用いられる場合がある。

本発明における固相雑種形成法には、いわゆるノザンブロット法の他、遺伝子発現アレイチップへの雑種形成法を含むが、これらに限定されない。

本発明におけるＯＬＦＭＬ２Ａ及びＣＲＬＦ１の遺伝子産物の発現量を決定するための試薬には、前記線維芽細胞内に存在するＯＬＦＭＬ２Ａ及びＣＲＬＦ１のｍＲＮＡの存在量を決定するための試薬の他、前記線維芽細胞におけるＯＬＦＭＬ２Ａ及びＣＲＬＦ１の転写活性を測定するための試薬が含まれるが、これらに限定されない。前記線維芽細胞内に存在するＯＬＦＭＬ２Ａ及びＣＲＬＦ１のｍＲＮＡの存在量を決定するための試薬には、ＯＬＦＭＬ２Ａ及びＣＲＬＦ１に特異的なプライマー対と、ＯＬＦＭＬ２Ａ及びＣＲＬＦ１に特異的なプローブとが含まれるが、これらに限定されない。前記線維芽細胞がヒト由来のとき、前記ＯＬＦＭＬ２Ａ及びＣＲＬＦ１に特異的なプライマー対は、配列番号１及び２と、配列番号３及び４とに列挙されるヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドの場合がある。本発明のキットには、測定する細胞の数、細胞の全タンパク質の存在量等を決定するための試薬と、本発明の対照遺伝子のｍＲＮＡの存在量を決定するための試薬とを含むが、これらに限定されない、他の試薬が少なくとも１つ含まれる場合がある。

本発明におけるＯＬＦＭＬ２Ａ及びＣＲＬＦ１の遺伝子産物の発現量は、線維芽細胞により産生されたＯＬＦＭＬ２Ａ及びＣＲＬＦ１のタンパク質の存在量の他、生検により採取された生物学的試料中に存在するＯＬＦＭＬ２Ａ及びＣＲＬＦ１のタンパク質の存在量を含む。ＯＬＦＭＬ２Ａ及びＣＲＬＦ１のタンパク質の存在量は、ＥＬＩＳＡ法、ウエスタンブロット法、免疫沈降法及び免疫比濁法を含むがこれらに限定されない方法によって決定される。前記方法において、ＯＬＦＭＬ２Ａ及びＣＲＬＦ１のタンパク質を特異的に認識する抗体が用いられる場合がある。前記抗体は、当業者に標準的な方法で調製されてもよく、商業的に入手可能な抗体であってもかまわない。

本発明におけるＯＬＦＭＬ２Ａ及びＣＲＬＦ１のタンパク質の存在量は、決定するときの細胞の数又は全タンパク質の存在量によって標準化された絶対値として決定される場合がある。あるいは、同じ数の細胞が複数の同一容器、例えば、ウェル、ディッシュ、フラスコ等に播種される場合には、細胞老化処理後及び被験処理条件における培養後の容器１つあたりのＯＬＦＭＬ２Ａ及びＣＲＬＦ１のタンパク質の存在量は、細胞老化処理前の前記線維芽細胞のＯＬＦＭＬ２Ａ及びＣＲＬＦ１のタンパク質の存在量を基準とする相対値で表される場合がある。さらに、本発明におけるＯＬＦＭＬ２Ａ及びＣＲＬＦ１のタンパク質の存在量は、同じ数の細胞が複数の同一容器、例えば、ウェル、ディッシュ、フラスコ等に播種される場合には、同一条件で処理された容器１つあたりの対照タンパク質の存在量で標準化される場合がある。前記対照タンパク質は、いわゆるハウスキーピング遺伝子のタンパク質、例えば、βアクチン、γチューブリン等を含むが、これらに限定されない。ハウスキーピング遺伝子のタンパク質の存在量をＥＬＩＳＡ法等によって決定するためには、前記タンパク質を特異的に認識する抗体が用いられる場合がある。

本発明におけるＯＬＦＭＬ２Ａ及びＣＲＬＦ１のタンパク質の存在量を決定するための試薬には、前記線維芽細胞により産生されたタンパク質の存在量の他、生検により採取された生物学的試料中に存在するＯＬＦＭＬ２Ａ及びＣＲＬＦ１のタンパク質の存在量を決定するための試薬が含まれるが、これらに限定されない。前記ＯＬＦＭＬ２Ａ及びＣＲＬＦ１のタンパク質の存在量を決定するための試薬には、ＯＬＦＭＬ２Ａ及びＣＲＬＦ１のタンパク質に特異的な抗体が含まれるが、これらに限定されない。本発明のキットには、測定する細胞の数、細胞の全タンパク質の存在量等を決定するための試薬と、本発明の対照タンパク質の存在量を決定するための試薬とを含むが、これらに限定されない、他の試薬が少なくとも１つ含まれる場合がある。

線維芽細胞の細胞老化阻害効果が評価されるとき、本発明の被験処理条件は、線維芽細胞の細胞老化を抑制する候補化合物の投与のような化学的処理を含むが、これに限定されない。培養線維芽細胞の細胞老化阻害効果が評価されるとき、本発明の被験処理条件は、試験化合物が添加された培地中で前記培養線維芽細胞に前記細胞老化処理を施すことを含むが、その他に、培養の際の温度、ガス組成、ガス分圧その他の物理的条件が操作される場合がある。線維芽細胞の細胞老化阻害効果が評価されるとき、本発明の被験処理条件は、試験化合物が投与された実験動物に前記細胞老化処理を施すことを含むが、その他に、飼育の際の温度、給餌、明暗時間その他の飼育環境条件が操作される場合がある。

本発明のスクリーニング方法において、線維芽細胞の細胞老化を抑制する候補化合物は、微生物、菌類、植物及び動物から調製される化合物と、化学的に合成される化合物とを含むが、これらに限定されない。前記候補化合物は、通常培養線維芽細胞に投与されるが、医療用化合物についてはマウス、ラット、ノックアウト動物及びトランスジェニック動物等を含む実験動物とに投与される場合もある。本発明のスクリーニング方法において、細胞老化処理は、培養線維芽細胞の継代を繰り返すこと、前記実験動物を長期間飼育することを含むが、これらに限定されない。

本発明の診断方法において、被験者のＯＬＦＭＬ２Ａ及びＣＲＬＦ１の遺伝子産物の発現量が決定されるとき、前記発現量が基準値よりも高い値を示す場合に、前記被験者は細胞老化状態であると判断される。前記基準値は、当業者に周知な統計処理によって算出することができる。前記基準値は、健康な被験者の母集団から採取された生物学的試料中におけるＯＬＦＭＬ２Ａ及びＣＲＬＦ１の遺伝子産物の発現量の平均値として決定される場合がある。前記母集団の被験者と、診断される被験者とは、生物種、年齢及び性別が同じであることが好ましい。

本明細書において言及される全ての文献はその全体が引用により本明細書に取り込まれる。

正常細胞及び老化細胞のＯＬＦＭＬ２ＡのｍＲＮＡの存在量を調べた実験結果を示すグラフ。正常細胞及び老化細胞のＣＲＬＦ１のｍＲＮＡの存在量を調べた実験結果を示すグラフ。

以下に説明する本発明の実施例は例示のみを目的とし、本発明の技術的範囲を限定するものではない。本発明の技術的範囲は請求の範囲の記載によってのみ限定される。本発明の趣旨を逸脱しないことを条件として、本発明の変更、例えば、本発明の構成要件の追加、削除及び置換を行うことができる。

以下の実験は、アメリカ国立衛生研究所（ＮａｔｉｏｎａｌＩｎｓｔｉｔｕｔｅｓｏｆＨｅａｌｔｈ（ＮＩＨ））のガイドラインに従って資生堂リサーチセンターの倫理委員会によって承認された後に実施された。

ヒト線維芽細胞の細胞老化にともなうＯＬＦＭＬ２Ａ及びＣＲＬＦ１の遺伝子産物の発現量の変化
１．材料及び方法
１．１細胞の調製
試験内容が事前に説明され、同意が書面により生物学的試料の提供者から得られた。線維芽細胞は、生検で採取した前記提供者の皮膚から調製された。前記生検は当業者に周知の標準的な方法で行われた。

１．２細胞培養
前記線維芽細胞（以下、「正常細胞」という。）は、市販の培養容器に播種され、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ、１６０１０１５９、ＧＩＢＣＯ、ライフテクノロジーズジャパン株式会社）を含む細胞培養用培地（ＤＭＥＭ、１１８８５０８４、ＧＩＢＣＯ、ライフテクノロジーズジャパン株式会社）を用いて３７°Ｃ、５％ＣＯ_２及び飽和水蒸気雰囲気下で培養された。

１．３細胞老化処理
細胞老化処理は、前記正常細胞が７５ｃｍ^２の培養フラスコ１個あたり１．０×１０^５個播種してコンフルエントになる前に継代する作業を約４ヵ月間繰り返すことによって実施された。前記細胞老化処理で細胞分裂能をほとんど消失した細胞が老化細胞として用いられた。

１．４ＯＬＦＭＬ２Ａ及びＣＲＬＦ１の遺伝子産物の発現量の定量
前記細胞培養用培地はアスピレーターで除去され、前記正常細胞及び前記老化細胞はＰＢＳ２ｍＬで２回洗浄された。ＲＮＡがＲＮｅａｓｙＰｒｏｔｅｃｔＫｉｔ（７４１０４、株式会社キアゲン）を用いて前記正常細胞及び前記老化細胞から製造者の指示に従って抽出された。ｃＤＮＡが定法に従って作製され、定量リアルタイムＰＣＲで用いられた。前記定量リアルタイムＰＣＲには、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）ＦａｓｔＳｔａｒｔＤＮＡＭａｓｔｅｒ^ＰＬＵＳＳＹＢＲＧｒｅｅｎＩ（カタログ番号０３５１５８８５００１、ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社）が用いられた。ヒトＯＬＦＭＬ２Ａ遺伝子から転写したｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡの断片を増幅するために、配列番号１及び２に列挙されるヌクレオチド配列からなる順方向及び逆方向プライマーの対が用いられた。ヒトＣＲＬＦ１遺伝子から転写したｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡの断片を増幅するために、配列番号３及び４に列挙されるヌクレオチド配列からなる順方向及び逆方向プライマーの対が用いられた。ヒトＧＡＰＤＨ遺伝子から転写したｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡの断片を増幅するために、配列番号５及び６に列挙されるヌクレオチド配列からなる順方向及び逆方向プライマーの対が用いられた。ＰＣＲの反応条件は、９５°Ｃ、１０分間を１回と、９５°Ｃ、１０秒間、６０°Ｃ、５秒間及び７２°Ｃ、６秒間を４０回とであった。ＯＬＦＭＬ２Ａ及びＣＲＬＦ１のｍＲＮＡの存在量は、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒＳｏｆｔｗａｒｅＶｅｒ．３．５（ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社）で解析され、ＧＡＰＤＨのｍＲＮＡの存在量で標準化された。

２．結果
図１は、正常細胞及び老化細胞のＯＬＦＭＬ２ＡのｍＲＮＡの存在量を調べた実験結果を示すグラフである。図２は、正常細胞及び老化細胞のＣＲＬＦ１のｍＲＮＡの存在量を調べた実験結果を示すグラフである。図１では、老化細胞におけるＯＬＦＭＬ２ＡのｍＲＮＡの存在量が、正常細胞におけるＯＬＦＭＬ２ＡのｍＲＮＡの存在量を１００％とする場合の相対値として記載される。図２では、老化細胞におけるＣＲＬＦ１のｍＲＮＡの存在量が、正常細胞におけるＣＲＬＦ１のｍＲＮＡの存在量を１００％とする場合の相対値として記載される。図１及び図２の誤差棒それぞれは、同一条件のウェル３個のｍＲＮＡの存在量を決定した測定値の標準誤差を示す。ＯＬＦＭＬ２Ａ及びＣＲＬＦ１のｍＲＮＡの存在量は正常細胞と比較して老化細胞で顕著に増大した。

３．結論
前記ＯＬＦＭＬ２Ａ及びＣＲＬＦ１のｍＲＮＡの存在量は細胞老化の前後で大きく変化する。したがって、本発明の評価方法は線維芽細胞の細胞老化を評価できる。また、前記ＯＬＦＭＬ２Ａ及びＣＲＬＦ１の遺伝子産物は、被験処理条件による線維芽細胞の細胞老化阻害効果を適切に検出することができるので、多数の被験処理条件、例えば、多数の試験化合物が添加された培地における培養線維芽細胞の細胞老化阻害効果をハイスループットに評価することができる。これは、細胞老化の予防及び／又は軽減に有効な化合物をスクリーニングするうえで非常に有用である。

Claims

生物学的試料中のＯＬＦＭＬ２Ａ及び／又はＣＲＬＦ１の遺伝子産物の発現量ｅを決定するステップを含むことを特徴とする、線維芽細胞の細胞老化状態の評価方法。
被験処理条件による線維芽細胞の細胞老化阻害効果の評価方法であって、
（１）被験処理前の生物学的試料中のＯＬＦＭＬ２Ａ及び／又はＣＲＬＦ１の遺伝子産物の発現量Ｅ_０を決定するステップと、
（２）被験処理後の生物学的試料中のＯＬＦＭＬ２Ａ及び／又はＣＲＬＦ１の遺伝子産物の発現量Ｅ_１を決定するステップと、
（３）Ｅ_０及びＥ_１に基づいて、前記被験処理条件の細胞老化阻害効果を評価するステップとを含むことを特徴とする、評価方法。
前記生物学的試料は、被験者から採取された血液、細胞及び組織からなるグループから選択される少なくとも１種類から調製されることを特徴とする、請求項２に記載の評価方法。
被験処理条件による培養線維芽細胞の細胞老化阻害効果の評価方法であって、
（１）前記培養線維芽細胞の細胞老化処理前のＯＬＦＭＬ２Ａ及び／又はＣＲＬＦ１の遺伝子産物の発現量Ｅ’_０を決定するステップと、
（２）前記培養線維芽細胞の細胞老化処理後のＯＬＦＭＬ２Ａ及び／又はＣＲＬＦ１の遺伝子産物の発現量Ｅ’_１を決定するステップと、
（３）Ｅ’_０及びＥ’_１に基づいて、前記被験処理条件の細胞老化阻害効果を評価するステップとを含むことを特徴とする、評価方法。
前記被験処理条件は、試験化合物が添加された培地中での前記培養線維芽細胞の細胞老化処理であることを特徴とする、請求項４に記載の評価方法。
前記線維芽細胞は哺乳類由来の線維芽細胞株であることを特徴とする、請求項４又は５に記載の評価方法。
前記ＯＬＦＭＬ２Ａ及び／又はＣＲＬＦ１の遺伝子産物の発現量は、ＯＬＦＭＬ２Ａ及び／又はＣＲＬＦ１のｍＲＮＡ及び／又はタンパク質の存在量に基づいて決定されることを特徴とする、請求項１ないし６のいずれか１つに記載の評価方法。
前記ＯＬＦＭＬ２Ａ及び／又はＣＲＬＦ１のｍＲＮＡは、ＲＴ−ＰＣＲ法又は固相雑種形成法で検出されることを特徴とする、請求項７に記載の評価方法。
前記ＯＬＦＭＬ２Ａ及び／又はＣＲＬＦ１のタンパク質は、ＥＬＩＳＡ法、ウエスタンブロット法、免疫沈降法及び免疫比濁法からなるグループから選択される少なくとも１つの方法で検出されることを特徴とする、請求項７に記載の評価方法。
前記ＯＬＦＭＬ２Ａ及び／又はＣＲＬＦ１の遺伝子産物の発現量を決定するための試薬を含む、請求項１ないし９のいずれか１つに記載の評価方法を実施するためのキット。
前記試薬は、前記ＯＬＦＭＬ２Ａ及び／又はＣＲＬＦ１のｍＲＮＡに特異的なプライマー対及び／又はプローブか、前記ＯＬＦＭＬ２Ａ及び／又はＣＲＬＦ１のタンパク質に特異的な抗体かであることを特徴とする、請求項１０に記載のキット。
線維芽細胞の細胞老化を抑制する化合物のスクリーニング方法であって、
（１）前記線維芽細胞の細胞老化を抑制する候補化合物を用意するステップと、
（２）細胞老化処理と、前記候補化合物の投与とが実施される前に、前記線維芽細胞のＯＬＦＭＬ２Ａ及び／又はＣＲＬＦ１の遺伝子産物の発現量Ｅ’’_０を決定するステップと、
（３）前記細胞老化処理だけが実施された後に、前記線維芽細胞のＯＬＦＭＬ２Ａ及び／又はＣＲＬＦ１の遺伝子産物の発現量Ｅ’’_１を決定するステップと、
（４）前記細胞老化処理と、前記候補化合物の投与とが実施された後に、前記線維芽細胞のＯＬＦＭＬ２Ａ及び／又はＣＲＬＦ１の遺伝子産物の発現量Ｅ’’_２を決定するステップと、
（５）Ｅ’’_２がＥ’’_１よりも低い値を示す候補化合物を、線維芽細胞の細胞老化を抑制する化合物として選択するステップとを含むことを特徴とする、スクリーニング方法。