KR102365125B1 - 인공 피부 모델을 사용한 피부 탄성 측정 방법 및 피부 첨가제의 스크리닝 혹은 선별 방법 - Google Patents

인공 피부 모델을 사용한 피부 탄성 측정 방법 및 피부 첨가제의 스크리닝 혹은 선별 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 dECM(탈세포화된 세포외기질) 바이오 잉크를 사용한 인공 피부를 제조하는 방법과 이를 사용한 피부 탄성 측정 방법에 관한 것으로, 본 발명에 따른 인공 피부를 제조하는 방법은, 탈세포화된 세포외기질(dECM)과 섬유아세포(primary fibroblast)를 혼합하여 dECM 바이오 잉크를 제조하는 혼합 단계; 지지체 위로 상기 dECM 바이오 잉크를 도포 혹은 인쇄하여 인공 진피(dermis)층을 제조하는 진피층 형성 단계; 상기 인공 진피층에 포함된 섬유아세포를 증식시키는 증식 단계; 및 상기 인공 진피층의 위로 각질형성세포를 추가한 후, 증식시켜 표피층을 형성하는 표피층 형성 단계;를 포함한다. 이에 따라 제작된 인공 피부 모델은 인간의 피부조직과 유사도가 높으며, 이를 이용하면 피부 탄성과 관련된 첨가제의 효능을 체외에서 확인할 수 있고, 첨가제의 효능을 정량적으로 측정할 수 있는 장점이 있다.

Description

인공 피부 모델을 사용한 피부 탄성 측정 방법 및 피부 첨가제의 스크리닝 혹은 선별 방법{A measuring method of skin elasticity for an artificial skin model and screening method of skin additive therewith}
본 발명은 dECM(탈세포화된 세포외기질) 바이오 잉크를 사용하여 인공 피부를 제조하는 방법과 이를 사용한 피부 탄성 측정 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 탈세포화, 액상화, 여과, 멸균 처리된 피부조직이 섬유아세포와 혼합된 바이오 잉크를 사용하여 인공 진피층을 제작하고, 그 위로 각질형성세포를 추가하여 표피층이 형성된 인공 피부 모델을 제공한다. 또한, 이렇게 제조된 인공 피부 모델의 표면에 감압 과정을 통해 강제 변형을 유도하고, 이를 해제하는 과정을 모니터링함으로써 인공 피부 모델의 탄성을 측정하는 방법을 제공한다.
피부는 신체의 외부를 덮고 있는 기관으로 바깥쪽에서부터 표피, 진피 및 피하지방층의 세 개의 층으로 구성된다. 표피는 중층 편평상피의 각질형성세포가 대부분을 차지하고 있고, 콜라겐 섬유와 탄성 섬유와 같은 기질 단백질로 이루어진 진피가 표피의 아래에 위치한다. 또한, 상기 진피에는 혈관, 신경, 땀샘 등이 있고, 피하지방층은 지방세포로 구성되어 있다. 피부는 상기와 같은 다양한 세포들과 구성물질들이 상호작용하여 그 형태를 유지하며 체온 조절과 외부 환경에 대한 장벽으로서의 역할 등 다양한 기능을 갖는다.
인공 피부(artificial skin)는 피부 세포와 피부 구성물질인 콜라겐, 엘라스틴 등을 포함하는 매트릭스 단백질을 이용하여 3차원적으로 상기와 같은 피부를 재구성한 것으로서, 살아있는 섬유아세포(fibroblast)와 각질형성세포(keratinocyte)로 구성되어 실제 피부와 유사한 구조적, 기능적 특성을 나타내기 때문에 피부 모사체(skin equivalent 또는 reconstructed skin)라고도 불린다. 인공 피부는 주로 피부와 탄성, 강도, 물질 투과 등에 있어 비슷한 물성을 나타내는 고분자 복합체이나, 피부에서 일어나는 생명현상이 나타나지 않는다는 점에서 차이가 있다. 인공 피부는 화상, 외상 등 손상을 입은 피부의 대체(영구생착형) 또는 재생(일시 피복형)을 위해 이용될 뿐만 아니라, 피부 생리연구, 피부 자극 평가, 피부 탄성 증진 여부 평가 등 다양한 영역에서 이용되고 있다.
특히, 생명체로부터 직접 피부 탄성을 측정하는 경우, 사람은 개체별로 차이가 크고, 동물은 측정하는 피부 영역의 특성에 따라 탄성이 다를 수 있다. 이에 따라 탄성 측정값에 영향을 주는 요소들이, 물질의 효능 외에, 개체의 선천적인 피부 탄성, 특정 영역 고유의 피부 특성, 환경, 개체의 성향 또는 습관 등과 같이 다수 존재하여, 그 상관관계를 명확하게 밝히기 어렵다는 문제가 있다.
한편, 현재 인공 피부는 주로 콜라겐 혼합물과 세포를 혼합하는 방법으로 제작된다. 그러나 콜라겐 혼합물을 이용하여 만든 인공 피부는 그 물성이 약하여 잘 부서지기 때문에 실질적으로 사람이 다루기 어렵다는 단점이 있다.
또한, 섬유아세포를 콜라겐 혼합물 내에서 배양할 경우, 섬유아세포에 의해 합성된 콜라겐이 세포막 주위에 침적되고, 침적된 콜라겐은 섬유아세포의 활성을 저해하여 생화학적으로 새로운 콜라겐의 합성이 감소된다.
아울러, 콜라겐 혼합물을 이용한 인공 피부를 오랜 기간 배양하면 그 부피가 상당히 줄어들 뿐만 아니라 세포들도 죽게 되므로, 일정 시간이 지나면 사용할 수 없다는 단점이 있다.
상기와 같이 콜라겐을 기반으로 한 인공 피부의 제조방법으로는, 인간의 피부 조직이 생성하는 물질과 유사한 환경의 인공 피부를 제조할 수 없다는 문제점이 발생한다.
등록특허 제10-1964053호
앞서 살펴본 종래 기술의 문제점들을 효과적으로 해결하기 위해, 본 발명은 콜라겐이 아닌 물질을 활용하여 인공 피부를 제조하고, 이렇게 제조된 인공 피부 모델에 첨가된 물질의 효능을 정량적으로 측정하는 방법을 제공하고자 한다.
이를 위해 본 발명은, dECM 바이오 잉크를 사용하여 인간의 피부조직과 유사한 인공 피부 모델을 제조하는 방법과 상기 인공 피부 모델의 표면에 감압 조건의 유도와 해제를 통해 변형 정도를 측정함으로써, 실제 사람의 피부와 유사한 인공 피부 모델의 탄성을 측정하는 방법을 제공하고자 한다.
상술한 바와 같은 목적을 달성하기 위한 본 발명의 일 실시 형태에 따른 인공 피부 모델의 제조방법은, 탈세포화된 세포외기질(dECM)과 섬유아세포(primary fibroblast)를 혼합하여 dECM 바이오 잉크를 제조하는 혼합 단계; 지지체 위로 상기 dECM 바이오 잉크를 도포 혹은 인쇄하여 인공 진피(dermis)층을 제조하는 진피층 형성 단계; 상기 인공 진피층에 포함된 섬유아세포를 약 5일간 증식시키는 증식 단계; 및 상기 인공 진피층의 위로 각질형성세포를 추가한 후, 약 7일간 분화시켜 표피층을 형성하는 표피층 형성 단계;를 포함한다.
상기 탈세포화된 세포외기질(dECM)은, 조직에서 세포를 제거하는 탈세포 단계; 산성 프로테아제를 사용하여, 탈세포화된 조직의 세포외기질을 액상화시키는 액상화 단계; 상기 액상화 단계를 통해 얻어진 탈세포화된 세포외기질 용액을 여과하는 여과 단계; 및 여과 단계를 통해 얻어진 혼합물을 살균하는 멸균 단계;를 거쳐 제조될 수 있다.
상기 혼합 단계에서, 1.5wt% 농도의 탈세포화된 세포외기질(dECM)과 1x106cell/㎖ 농도의 섬유아세포(primary fibroblast)이 혼합되는 것이 바람직하다.
상기 표피층 형성 단계 이후에, 첨가제를 사용하여 인공 피부 모델을 처리하는 단계가 더 포함될 수 있으며, 상기 첨가제로 레티놀 혹은 아데노신이 사용될 수 있다.
본 발명의 다른 실시 형태로, 인공 피부 모델을 사용한 탄성 측정 방법을 들 수 있으며, 앞서 설명된 본 발명의 일 실시 형태에 따른 제조방법으로 제조된 인공 피부 모델을 준비하는 단계; 및 인공 피부 모델의 표면에 일정 시간 동안 감압 조건을 유지하여 변형(deformation)을 유도한 후, 감압 조건을 해제하여 피부 모델의 변형 회복을 모니터링 하는 단계;를 포함한다.
감압 조건이 유지되는 시간은 약 2~4초이고, 감압 조건의 압력은 약 20mbar 이상 450mbar 이하인 것이 바람직하다.
본 발명의 또 다른 실시 형태는, 인공 피부 모델을 사용한 피부 첨가제를 스크리닝 혹은 선별하는 방법이며, 상기 일 실시 형태에 따른 제조방법으로 인공 피부 모델을 제조하되, 표피층 형성 단계 이후 첨가제를 사용하여 처리된 인공 피부 모델을 준비하는 단계; 및 인공 피부 모델의 표면에 일정 시간 동안 감압 조건을 유지하여 변형(deformation)을 유도한 후, 감압 조건을 해제하여 피부 모델의 변형 회복을 측정하는 단계;를 포함한다.
본 발명에 따라 제작된 인공 피부 모델은 인간의 피부조직과 유사도가 높으며, 이를 이용하여 피부 탄성과 관련된 첨가제의 효능을 체외에서 직접 확인할 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 인공 피부 모델의 탄성 측정 방법에 따르면, 피부 탄성과 관련된 첨가제의 효능을 정량적으로 정확하게 측정할 수 있는 장점이 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시 형태에 따른 인공 피부 모델의 제조과정을 나타낸 순서도이다.
도 2는 dECM(a)과 콜라겐(b)을 사용하여 각각 제조된 인공 피부 모델을 비교한 사진이다.
도 3은 본 발명에 따라 제조된 인공 피부 모델을 관찰한 결과이다.
도 4는 비교예 및 실시예 1에 따라 제조된 인공 피부 모델에 감압 조건을 일정 시간 유지한 후, 해제하여 표면 변형(탄성)을 모니터링한 결과이다.
도 5는 실시예 1 내지 3에 따라 제조된 인공 피부 모델에 감압 조건을 유지 및 해제하는 과정을 9회 실시하여, 표면 변형(탄성)을 측정한 결과이다.
도 6은 실시예 1 내지 3에 따라 제조된 인공 피부 모델에 감압 조건을 유지 및 해제하는 과정을 3회 반복하면서, 표면 변형(탄성)을 모니터링한 결과이다.
도 7은 실시예 1 내지 3에 따라 제조된 인공 피부 모델의 elastic modulus를 시간에 따라 측정한 결과이다.
이하 본 발명의 바람직한 실시예를 통해 상세히 설명하기에 앞서, 본 명세서의 청구범위에 사용된 용어나 단어는 통상적이거나 사전적인 의미로 한정하여 해석되어서는 아니 되며, 본 발명의 기술적 사상에 부합하는 의미와 개념으로 해석되어야 함을 밝혀둔다.
본 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.
본 발명의 일 실시 형태는 인공 피부 모델의 제조방법으로, 도 1에 일 실시 형태인 인공 피부 모델의 제조 과정이 순서도로 제시되어 있다. 상기 도 1을 참조하면, 본 발명에 따른 인공 피부 모델의 제조방법은 탈세포화된 세포외기질(dECM)과 섬유아세포(primary fibroblast)를 혼합하여 dECM 바이오 잉크를 제조하는 혼합 단계; 지지체 위로 상기 dECM 바이오 잉크를 도포 혹은 인쇄하여 인공 진피(dermis)층을 제조하는 진피층 형성 단계; 상기 인공 진피층에 포함된 섬유아세포를 약 5일간 증식시키는 증식 단계; 및 상기 인공 진피층의 위로 각질형성세포를 추가한 후, 약 7일간 분화시켜 표피층을 형성하는 표피층 형성 단계;를 포함한다.
상기 혼합 단계는 탈세포화된 세포외기질(dECM)과 섬유아세포(primary fibroblast)를 혼합하여 dECM 바이오 잉크를 제조하는 단계이다. 이때, 상기 탈세포화된 세포외기질(dECM)은, 조직에서 세포를 제거하는 탈세포 단계; 산성 프로테아제를 사용하여, 탈세포화된 조직의 세포외기질을 액상화시키는 액상화 단계; 상기 액상화 단계를 통해 얻어진 탈세포화된 세포외기질 용액을 여과하는 여과 단계; 및 여과 단계를 통해 얻어진 혼합물을 살균하는 멸균 단계;를 거쳐 제조된다.
세포외기질(ECM, Extracellualar Matrix)은, 세포 밖에 존재하지만 세포와 밀접하게 연관된 고분자들(콜라겐, 엘라스틴, 당단백질, 성장 인자 등)을 포함하는 삼차원적 망상 구조체(network structure)를 의미하며, 세포의　각종 구성물질이 외부의 충격으로부터　보호되도록 물리적인 골격을 제공해주는 것뿐만 아니라, 생화학적 신호를 전달함으로써 세포 발생의 기초적인 역할을 한다.
상기 탈세포 단계는 계면활성제와 고장용액이 포함된 탈세포용액을 이용하여 조직에서 세포를 제거함으로써 탈세포화된 세포외기질(dECM)만을 획득하는 단계로, 탈세포화된 세포외기질에는 콜라겐, 엘라스틴, 라미닌, 글리코사미노글리칸(glycosaminoglycan, GAG), 프로테오글리칸, 항균제, 화학유인물질, 사이토카인, 성장인자 등의 성분이 포함되어 있다.
본 발명에서 탈세포화된 세포외기질(dECM)을 획득하기 위해 사용되는 조직으로 인간, 원숭이, 돼지, 소, 토끼, 개, 염소, 양, 닭, 말 등의 포유동물로부터 유래된 피부조직이 사용될 수 있으나, 반드시 이러한 동물들로만 한정되는 것은 아니다.
탈세포용액에 포함되는 계면활성제로는, 트리톤 X-100(Triton X-100), Tween 80, SDS(sodium dodecyl sulfate), 소듐 데옥시콜레이트 또는 트리톤 X-200(Triton X-200) 등을 포함하는 군에서 선택되는 어느 하나 이상이 사용될 수 있으며, 고장용액으로는 NaCl, KCl, CaCl2, MgCl2, BaCl2 또는 NaHCO3 등을 포함하는 군 중에서 선택되는 어느 하나 이상의 염을 포함하는 약 0.03 내지 1.0M의 수용액이 사용될 수 있으나, 반드시 이러한 종류로만 제한되는 것은 아니다.
계면활성제로 트리톤 X-100이 사용되는 경우에는, 세포외기질에 포함된 다양한 단백질과 당단백질 및 글리코사미노글리칸(glycosaminoglycan, GAG) 등의 손상을 최소화하면서 세포에 포함되어 있는 DNA를 효과적으로 파괴시킬 수 있으므로, 비이온성 계면활성제인 트리톤 X-100이 사용되는 것이 바람직하다.
또한, 상기 탈세포 단계와 액상화 단계 사이에, 탈세포화된 세포외기질과 HCl, CH3COOH, H3PO4, HNO3, H2SO4 등과 같은 고농도의 산성 수용액이 혼합된 후, 용액 상태에서 습식으로 분쇄되는 분쇄 단계가 추가로 더 수행될 수 있는데, 이러한 분쇄 단계를 통해 탈세포화된 세포외기질의 표면적이 증가하므로 이후 산성 프로테아제를 이용한 액상화 단계에서의 콜라겐 등과 같은 유용 성분의 추출 효과가 향상될 수 있다.
액상화 단계는, 제조되는 바이오 잉크가 적절한 점도로 형성되기 위해 탈세포 단계를 거친 탈세포화된 세포외기질을 액상화하여 탈세포화된 세포외기질 용액을 제조하는 과정이다.
액상화 단계에서 탈세포화된 세포외기질은 산성 프로테아제(protease)에 의해 분해되어 액상화되는데, 산성 프로테아제는 pH 및 온도 조건에 따라 반응성이 변화되므로, 산성 프로테아제의 적절한 활성을 구현하기 위해 상기 액상화 단계는 약 pH 1~5, 15~25℃의 온도 조건에서 수행되는 것이 바람직하다.
이때, 산성 프로테아제로는 펩신이 사용될 수 있으며, 앞서 분쇄 단계에서 고농도의 산성 수용액이 첨가되어 탈세포화된 세포외기질이 포함된 용액은 이미 약 pH 1~4의 강한 산성을 나타내므로, 산성 프로테아제를 활성화시키기 위해 이 단계에서 일정량의 물을 첨가하여 희석시켜 용액의 pH를 약 1~5로 조절하는 것이 바람직하다.
여과 단계는, 액상화 단계를 통해 얻어진 탈세포화된 세포외기질 용액을 여과시킴으로써, 조직 재생을 촉진하는 성장인자나 사이토카인과 같은 성분은 그대로 유지하면서 동시에 산성 프로테아제나 텔로펩타이드와 같이 세포 독성 등을 유발하는 물질을 선택적으로 제거하는 단계이다.
이러한 여과 단계는, 상기 탈세포화된 세포외기질 용액을 한외여과하여 농축액과 여과액으로 분리하는 분리 단계; 상기 분리 단계를 통해 얻어진 농축액을 한외여과를 통해 다시 농축하여 1차 용액을 제조하는 1차 용액 제조 단계; 상기 분리 단계를 통해 얻어진 여과액에 포함된 산성 프로테아제를 제거한 뒤 농축하여 2차 용액을 제조하는 2차 용액 제조 단계; 및 상기 1차 용액과 2차 용액을 혼합하는 혼합 단계;를 포함하는 다단계 여과 과정으로 수행되는 것이 바람직하다.
상기 분리 단계는, 70~100kDa의 한외여과막으로 탈세포화된 세포외기질 용액을 여과하여 막을 통과한 여과액과 막을 통과하지 못한 농축액을 서로 분리하는 단계로, 바람직하게는 70kDa의 한외여과막이 사용될 수 있다.
이 단계에서 얻어진 농축액에는 콜라겐, 엘라스틴, 글리코사미노글리칸과 같은 상대적으로 분자량이 큰 성분들이 포함되어 있으며, 이 농축액은 1차 용액 제조단계에서 추가로 한외여과를 통해 다시 농축되어 1차 용액으로 이용된다. 이때 사용되는 한외여과막의 크기는 0.1~5kDa일 수 있으며, 바람직하게는 0.5~2kDa, 더욱바람직하게는 1kDa일 수 있다.
상기 분리 단계에서 얻어진 여과액에는 성장인자, 사이토카인, 산성프로테아제 및 기타 저분자량의 탈세포화된 세포외기질 성분이 포함되어 있다.
상기 2차 용액 제조 단계는, 이온필터를 이용하여 여과액에 포함된 산성 프로테아제를 제거하는 제1 처리 단계; 및 상기 제1 처리 단계를 통해 얻어진 처리액을 한외여과하여 농축하는 제2 처리 단계;를 포함하며, 제1 처리 단계에서 산성 프로테아제가 제거되고, 제2 처리 단계에서 텔로펩타이드가 제거될 수 있다.
제1 처리 단계는, 산성 프로테아제의 등전점을 이용하여 산성 프로테아제만을 선택적으로 제거하는 단계이다. 산성 프로테아제로는 펩신이 사용될 수 있으며, 펩신의 등전점은 약 pH 1이기 때문에 펩신이 포함된 용액의 pH가 1보다 높은 경우에는 펩신이 음이온으로 대전된다. 따라서, 앞서 희석을 통해 pH가 1보다 높아진 여과액을 양이온으로 대전된 이온필터에 통과시키면, 정전기적 인력에 의해 산성 프로테아제는 이온필터에 흡착 혹은 이온 교환되어 제거되고, 산성 프로테아제를 제외한 나머지 성분은 이온필터를 통과하여 배출된다. 이러한 이온필터로 예를 들어, Sartobind® Q타입 필터가 사용될 수 있다.
제2 처리 단계는, 상기 처리액을 한외여과하여 농축하는 단계로, 1~10kDa의 한외여과막, 바람직하게는 4~6kDa의 한외여과막, 더욱 바람직하게는 5kDa의 한외여과막을 이용하여 처리액을 여과시킨 뒤 농축물을 획득하는 단계일 수 있다.
앞서 액상화 단계에서 텔로펩타이드는 산성 프로테아제에 의해 콜라겐으로부터 분리되며, 분리된 텔로펩타이드는 약 0.5~4.5kDa의 낮은 분자량을 갖는다. 반면, 처리액에 포함되어 있는 성장인자, 사이토카인 등의 유용 성분은 약 5kDa 이상의 분자량을 가지므로, 제2 처리 단계에서 위와 같은 크기의 한외여과막을 이용하여 처리액을 농축하면, 텔로펩타이드는 물과 함께 여과액으로 분리되고, 한외여과막에 의해 분리된 성장인자, 사이토카인 및 기타 저분자량의 탈세포화된 세포외기질 성분만이 농축액으로 분리될 수 있다.
이후 이어지는 혼합 단계에서 상기 1차 용액과 2차 용액을 다시 혼합하면 최종적으로 펩신과 같은 산성 프로테아제 및 텔로펩타이드가 제거되어 세포독성 등 유발되는 부작용이 제거될 수 있다.
여과 단계가 완료되면 멸균 단계가 수행되며, 멸균 방식으로는 방사선, 에틸렌옥사이드, 초임계 이산화탄소 중 적어도 어느 하나 이상을 이용한 멸균 방식이 이용될 수 있다. 멸균이 완료된 탈세포화된 세포외기질(dECM) 용액은 멸균 완료 후의 상(phase) 그대로 이용되거나 저장될 수 있고, 필요에 따라 추가적인 건조 단계가 수행되어 건조된 분말 상태 또는 sponge type으로 제조될 수 있으며, 이때 건조 단계는 동결 건조 방식이 사용될 수 있다.
상기와 같이 제조된 탈세포화된 세포외기질(dECM)은 약 1.0~2.0wt%의 농도로 사용되는 것이 바람직하며, 더 바람직하게는 1.5wt%의 농도로 섬유아세포(primary fibroblast)와 혼합된 dECM 바이오 잉크가 제조될 수 있다. 이때, 섬유아세포(primary fibroblast)는 적절한 농도(예를 들어, 약 1x106cell/㎖)를 갖도록, NaHCO3, HEPES 또는 NaOH 등이 포함된 중성화 버퍼 용액, 세포 현탁 용액 혹은 세포 배양액 등이 함께 사용될 수 있으며, dECM 바이오 잉크의 농도 조절이나 섬유아세포의 원활한 배양 등과 같은 목적을 수행하기 위해 필요한 물질들이 적절히 추가될 수 있다.
상기 dECM 바이오 잉크 내에 포함되는 탈세포화된 세포외기질(dECM)의 농도가 2.0wt%를 초과하는 경우에는 인간 피부와의 유사도가 감소하고, 1.0wt% 미만인 경우에는 탈세포화된 세포외기질(dECM)에 포함된 콜라겐의 함량이 부족하여 콜라겐 수축이 빠르게 일어날 뿐만 아니라 수축 정도도 크기 때문에 균일한 인공 피부 모델이 제조되지 않는다는 문제가 생길 수 있다.
진피층 형성 단계는, 지지체 위로 상기 dECM 바이오 잉크를 도포 혹은 인쇄하여 인공 진피(dermis)층을 제조하는 단계이다. 이때, dECM 바이오 잉크는 점도파이펫을 이용하여 약 700~850㎕/well의 부피로 트랜스웰 세포 배양 플레이트(Trans-well cell culture plate)에 분주될 수 있고, dECM 바이오 잉크를 약 30~40℃로 가열하여 약 1~2시간 동안 가교결합을 시킬 수 있다.
상기 중성화 버퍼 용액을 추가함으로써 dECM 바이오 잉크의 pH가 중성 영역인 약 6.5~7.5로 조절되면, 혼합된 섬유아세포가 파괴될 가능성이 낮아진다. 또한, 다른 화학적 처리 없이 열을 가함으로써 가교가 되므로, 화학물질에 의해 세포의 활성이 저해되는 것을 방지할 수 있다.
상기 dECM 바이오 잉크의 온도가 30~40℃의 범위를 벗어나는 경우에는, 바이오 잉크로 사용되기에 적절한 점도가 형성되지 않을 뿐만 아니라, 가교결합이 불충분하게 일어날 수 있다.
한편, 상기 가교결합이 진행되면 진피층에 3차원 망 구조(매트릭스)가 형성되어 피부의 탄력에 영향을 미치며, 특히 엘라스틴이 가교결합을 형성하는데 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 1시간 미만으로 가교결합을 시키면, 망 구조가 불충분하게 형성되어 인간 피부조직과의 유사도가 감소하고, 2시간을 초과하여 가교결합이 진행되면 섬유아세포의 생존율이 낮아질 수 있다는 문제가 있다.
상기 증식 단계는, 상기 인공 진피층에 포함된 섬유아세포를 약 5일간 증식시키는 단계이다. 이때, 진피층 형성 단계를 거친 dECM 바이오 잉크를 deep well에 옮기고, well이 완전히 잠기도록 FGM(Fibroblast Growth Medium) 등과 같은 진피층 배양액을 첨가하여 섬유아세포를 배양하는 것이 바람직하다.
상기 증식 단계를 통해, 섬유아세포를 인위적으로 증식시킴과 동시에 인공 진피층의 3차원 망 구조(매트릭스)가 수축되어, 인공 진피층에 탄력이 발생할 수 있다.
섬유아세포를 6일 이상 증식시키면, 형성되는 인공 진피층이 진피층 배양액에 지속적으로 수몰됨에 따라 상기 인공 진피층의 강도가 약해질 수 있다. 또한, 이후에 상기 인공 진피층 위로 형성된 표피층 내의 각질형성세포가 약해진 인공 진피층의 매트릭스에 침입할 수 있고, 이에 따라 인간 피부와의 유사도가 감소할 수 있다.
반면, 섬유아세포를 5일보다 짧은 기간 증식시키면 섬유아세포로부터 분비되는 매트릭스 단백질이 인공 진피층의 탄력을 유발하기에 불충분하다는 문제가 생길 수 있다.
한편, 인간 피부의 진피층은 크게 유두층과 망상층으로 나뉠 수 있고, 세포외기질(ECM)이 표피의 15~40배 정도로 두꺼운 층(약 1500㎛)으로 형성되어 있으며 혈관, 신경과 같은 다양한 구조물들을 포함하고 있다. 본 발명에서 인공 진피층의 두께는 약 0.05~2.5mm가 바람직하며, 더 바람직하게는 약 1 내지 1.5mm가 되도록 제조되나, 이는 모사하고자 하는 피부 영역의 특성에 따라 적절히 조절될 수 있다.
상기 표피층 형성 단계는, 상기 인공 진피층 위로 각질형성세포를 분주한 후, 약 7일간 분화시켜 표피층을 형성하는 단계이다. 본 발명에 따라 제조된 인공 피부 모델을 관찰한 결과는 도 2 (a) 및 도 3에 나타내었다.
피부의 표피층은, 표피층과 진피층이 단단하게 결합될 수 있도록 하는 기저막(basement membrane)으로부터 여러 층으로 분화된 상피세포와 그 밖에 멜라닌세포, 면역세포 등으로 이루어진다. 또한, 표피층은 피부의 바깥쪽을 구성하고 있는 얇은 층으로서(약 90 ㎛), 신체 외부와 맞닿는 각질층부터 투명층, 과립층, 유극층 및 기저층으로 구성되어 있다. 본 발명에서 표피층의 두께는 약 0.01~1mm가 바람직하며, 더 바람직하게는 약 0.1 내지 0.2mm가 되도록 제조되나, 모사하고자 하는 피부 영역의 표피 등에 따라 적절히 조절될 수 있다.
각질형성세포(keratinocyte)는 표피층 세포의 약 80% 내지 90%를 구성하고, 표피층의 가장 깊은 층인 기저층에서 유사분열을 통해 형성된 후 피부 표면을 향해 상층으로 올라오며, 외부 환경으로부터 피부를 보호하기 위해 세포들을 계속 새로운 세포로 교체해준다. 이를 피부재생주기(turn over)라고 하며, 기저층에서 형성된 각질세포가 투명층에 위치하기까지 약 14일, 각질세포가 투명층에서 각질층에 위치하기까지 다시 약 14일이 걸려, 피부재생주기는 일반적으로 약 28일로 알려져 있다.
상기 표피층 형성 단계에서, 각질형성세포는 3x106cell/㎖ 농도로, KBM(Keratinocyte Basal Medium), KGM(Keratinocyte Growth Medium) 등과 같은 표피층 배양액에 포함되어 점도파이펫을 통해 상기 인공 진피층 위에 분주되는 것이 바람직하다.
이때, 각질형성세포가 분주되면, 각질형성세포로부터 인공 진피층과 표피층을 단단하게 결합시키는 결합단백질 또는 calcium, vitamin D, retinoic acid, TPA(12-o-tetradecanoylphor-bol-13-acetate) 등과 같이 각질형성세포를 분화시키는 인자들이 분비될 수 있어 실제 인간 피부와 더 유사할 수 있다. 각질형성세포가 분주되고, 인공 진피층과 약 1일 동안 부착되는 것이 바람직하나, 이러한 부착 기간은 표피층의 두께나 각질형성세포 배양 정도 등 여러 필요에 따라 적절히 달라질 수 있다.
상기 부착이 2일 이상 진행되는 경우에는 well 내에서의 배양으로 인해 각질형성세포가 고농도로 존재할 수 있다. 반면, 1일보다 짧은 경우에는 인공 진피층과 표피층의 결합이 충분하지 않아 인간 피부와의 유사도가 감소할 수 있다.
상기 각질형성세포로는 인간으로부터 유래한 각질형성세포가 사용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 직접 분리 또는 분리된 후 배양된 각질형성세포뿐만 아니라 다른 세포로부터 유도된 각질형성세포 혹은 상업적으로 널리 사용되는 각질형성세포도 사용 가능하다.
한편, 피부 조직의 경우, 각질형성세포는 배양액에 잠기지 않고 공기 중에 노출시켜야 분화가 되는 특성이 있기 때문에 공기 중에 노출시키는 과정(air liquid interface, ALI)이 필요하고, 약 7~14일 동안, 바람직하게는 7일 동안 공기 중에 노출시킬 수 있다.
이때, ALI 배양과 동시에 상기 표피층 배양액에 분화유도인자인 CaCl2를 첨가하여 이온채널을 통해 칼슘이온을 각질형성세포 내로 유입시킴으로써 각질형성세포를 분화시킬 수 있다. 이러한 각질형성세포의 분화를 약 7일간 유도하면서 3일에 한 번, 하나의 well당 약 20㎖씩의 배양액이 교체되는 것이 바람직하다. 세포 분화를 통해 가시층, 과립층, 각질층 등 대표적인 피부층으로 계층적 분화가 진행된 인공 피부 모델이 제조될 수 있다.
상기 표피층 형성 단계 이후에, 첨가제를 사용하여 상기 인공 피부 모델을 처리하는 단계가 더 포함될 수 있고, 상기 첨가제로 레티놀 또는 아데노신이 사용될 수 있으며 각각 약 1㎍/㎖의 농도로 사용되는 것이 바람직하다. 상기 처리는 약 3일간 수행되는 것이 바람직하나, 첨가제의 특성 등에 따라 기간은 적절히 조절될 수 있다.
레티놀은 인체에 자연적으로 존재하는 내인성 화합물로서, 상피 조직의 분화와 성장에 필수적인 지용성 비타민이며, 영양학적으로는 성장을 촉진하고, 야맹증(Blindness) 등에 효과가 있는 것으로 알려져 있다. 또한, 화장료 성분으로 사용될 경우에는 콜라겐 합성 촉진에 따른 피부주름개선 효과 외에도 피부 세포의 신진대사 및 재생 촉진, 피부 분화의 촉진, 피부저항력의 강화 또는 피지 분비 억제 등의 효과가 있는 것으로 알려져 있다.
아데노신은 유전자인 DNA를 구성하고 있는 요소 중 하나이다. 아데닌(Adenine)이라는 염기와 라이보즈(ribose)라는 당이 결합한 화합물로, 식품의약품안전청에서 피부의 주름 개선에 도움을 주는 화장품 원료로 규정하고 있다. 또한, 당에 세 개의 인산(phosphate)이 붙으면 세포 내 에너지의 주 근원인 ATP(adenosine 5'-triphosphate)가 된다. 이러한 아데노신은 신체를 구성하고, 세포의 성장, 분화 및 항상성에 직접적으로 관여하면서 각종 대사를 조절하는 중요한 요소로 알려져 있다.
한편, 본 발명의 다른 실시형태로, 인공 피부 모델을 사용한 탄성 측정 방법을 들 수 있으며, 앞서 설명된 본 발명의 일 실시 형태에 따른 제조방법으로 제조된 인공 피부 모델을 준비하는 단계; 및 인공 피부 모델의 표면에 일정 시간 동안 감압 조건을 유지하여 변형(deformation)을 유도한 후, 감압 조건을 해제하여 피부 모델의 변형 회복을 모니터링 하는 단계;를 포함한다. 이때, 상기 일정 시간은 약 2초~4초이고, 감압 조건은 약 20mbar 이상 450mbar 이하인 것이 바람직하다.
이와 달리, 인공 피부 모델 표면에 전단력과 같이 서로 반대되는 방향으로 물리적인 힘을 가하고, 전단응력과 같이 이에 저항하여 생기는 힘을 분석함으로써 elastic modulus를 측정하는 경우, 인공 피부 모델 자체에 포함된 수분으로 인해 물리적으로 가하는 힘이 온전히 인공 피부 모델에 전해지기 어려울 수 있다. 이에 따라 피부 탄성 측정값에 처리된 첨가제의 효능이 반영되지 않을 수 있고, 측정 결과의 정확도 감소 등의 문제점들이 생긴다.
본 발명의 일 실시에 따르면, 상기 elastic modulus를 측정하는 경우, 측정된 결과와 처리된 첨가제의 효능 사이의 인과관계가 명확히 분석되지 않았고, 그 결과는 도 7에 나타내었다.
한편, 상기와 같이 레티놀 또는 아데노신이 처리된 인공 피부 모델 표면에 감압을 유지 및 해제하여 피부 변형을 모니터링한 결과, 첨가제를 처리하지 않은 인공 피부 모델보다 피부 변형이 적게 나타나 레티놀과 아데노신이 피부 탄성을 증진시키는 효과가 뛰어남을 확인하였다.
본 발명의 또 다른 실시 형태는, 인공 피부 모델을 사용한 피부 첨가제를 스크리닝 혹은 선별하는 방법이며, 상기 일 실시 형태에 따른 제조방법으로 인공 피부 모델을 제조하되, 표피층 형성 단계 이후 첨가제를 사용하여 처리된 인공 피부 모델을 준비하는 단계; 및 인공 피부 모델의 표면에 일정 시간 동안 감압 조건을 유지하여 변형(deformation)을 유도한 후, 감압 조건을 해제하여 피부 모델의 변형 회복을 측정하는 단계;를 포함한다.
이하에서는, 본 발명의 구체적인 실시예를 중심으로 설명하고자 한다. 그러나 본 발명의 범위가 이하의 실시예에만 한정되는 것은 아니며, 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위해 예시적으로 제시된 것일 뿐, 통상의 기술자라면 본 발명의 권리범위 내에서 본 명세서에 기재된 내용의 여러 가지 변형된 형태를 실시할 수 있음을 밝혀두고자 한다.
[제조예]
돼지의 피부를 1mm 크기로 잘라 여러 개의 절편으로 준비한 뒤, 상기 절편들을 증류수에 투입하여 상온에서 2시간 동안 세척하고, 0.5%의 트리톤 X-100, 0.5M의 NaCl 수용액을 포함한 탈세포용액을 사용하여 10℃에서 8시간 동안 탈세포시켰으며, 탈세포 용액은 매 3시간마다 새 용액으로 교환하였다. 이후, 증류수를 이용하여 탈세포된 절편들을 세척하고, PBS(Phosphate Buffered Saline)버퍼, 0.1% 과초산(Peracetic acid)이 포함된 소독액으로 상온에서 1시간 동안 소독한 뒤, 다시 증류수를 이용하여 1시간 동안 세척하여 탈세포된 조직 절편들을 제조하였다.
탈세포된 조직 절편 40g을 10N의 HCl 용액 160㎖와 혼합하여 교반한 뒤 호모게나이저를 이용하여 1분씩 20회 반복 분쇄하였다. 이어서, 분쇄된 혼합물에 물 1,440㎖와 0.8g의 펩신을 혼합하고 20℃의 온도에서 72시간 동안 교반하여 액상화하였다.
다음으로, 70kDa의 한외여과막을 이용하여 상기 액상화된 용액을 여과하고, 여과막을 통과하여 나온 용액인 여과액을 Sartobind® Q타입 이온필터를 이용하여 다시 여과시켰다.
상기와 같은 과정을 거친 탈세포화된 세포외기질(dECM)용액을 동결 건조하고, 저온의 진공 환경에서 얼음 결정을 승화시킴으로써 sponge type으로 바꾸었다.
[비교예]
sponge type의 1.5wt%의 콜라겐을 0.001N HCl에 3일 동안 4℃의 온도에서 재수화시켰다. 이때 콜라겐으로는 Alpha-gal(돼지 특이적 면역반응인자)이 제거된 atelocollagen(MS collagen)이 사용되었다.
NaHCO3(2.2g), HEPES(Hydroxyethyl piperazine Ethane Sulfonicacid) 200mM (4.77g), 0.05M NaOH(0.2g)를 100㎖의 멸균된 물에 넣어 중성화 용액을 제조하였다. 재수화시킨 용액, 중성화 용액 및 10X MEM(Minimum Essential Medium)을 8:1:1의 중량비로 혼합하여 콜라겐 혼합물을 제조한 후, pH 7.4로 적정하였다. pH가 조절된 콜라겐 혼합물과 1x106cells/㎖ 농도의 섬유아세포(fibroblast)를 포함하는 콜라겐 바이오 잉크 10㎖를 제조하고, 점도파이펫을 사용하여 상기 콜라겐 바이오 잉크를 Trans-well cell culture plate(6 well)에 800ul/well의 부피로 분주하였다.
분주된 콜라겐 바이오 잉크를 37℃ 인큐베이터에서 1시간 동안 가교결합시키고, 6 deep well(Corning®)에 옮긴 후, FGM(Fibroblast Growth Medium) 20㎖를 첨가하였다. 각각의 well이 완전히 잠긴 채로 5일간 섬유아세포를 배양시킴으로써 인공 진피층을 제조하였다.
점도파이펫을 사용하여 상기 인공 진피층 위에 3x106 cell/㎖의 각질형성세포(keratinocyte)를 포함하는 표피층 배양액(KBM-Gold™(LONZA), KGM-Gold™(LONZA) 및 SingleQuots™(LONZA)) 250㎕를 분주하고 1일간 각질형성세포를 인공 진피층에 부착시켰다.
이후, 상기 표피층 배양액에 1.8mM의 CaCl2를 넣고 3일에 한 번 1 well당 20㎖씩 표피층 배양액을 교체하며 7일간 각질형성세포의 분화를 유도하여 인공 피부 모델을 제조하였다.
[실시예 1]
제조예에 따른 sponge type의 dECM을 0.5M의 Acitic acid와 혼합하여 3wt%의 dECM 혼합물을 제조한다. NaHCO3(2.2g), 200mM HEPES(4.77g) 및 0.05M NaOH(0.2g)가 포함된 중성화 버퍼 용액, 10X MEM(Minimum Essential Medium), 1x106cell/㎖의 섬유아세포를 포함하는 세포현탁용액 및 FGM(Fibroblast Growth Medium)을 1:1:1:2의 부피비로 혼합하여 희석액을 제조한다. 상기 dECM 혼합물과 희석액을 혼합하여 1.5wt% 농도의 dECM 바이오 잉크 10㎖를 제조한다.
점도파이펫을 사용하여 상기 dECM 바이오 잉크를 Trans-well cell culture plate(6 well)에 800㎕/well의 부피로 분주하였다.
분주된 dECM 바이오 잉크를 37℃ 온도의 인큐베이터에서 1시간 동안 가교결합시키고, 6 deep well(Corning®)에 옮긴 후, FGM(Fibroblast Growth Medium) 20㎖를 첨가하였다. 각각의 well이 완전히 잠긴 채로 5일간 섬유아세포를 배양시킴으로써 인공 진피층을 제조하였다.
점도파이펫을 사용하여 상기 인공 진피층 위에 3x106 cell/㎖의 각질형성세포(keratinocyte)를 포함하는 표피층 배양액(KBM-Gold™(LONZA), KGM-Gold™(LONZA) 및 SingleQuots™(LONZA)) 250㎕를 분주하고 1일간 인공 진피층과 결합시켰다.
이후, 상기 표피층 배양액에 1.8mM의 CaCl2를 넣고 3일에 한 번 1 well당 20㎖씩 표피층 배양액을 교체하며 7일간 각질형성세포의 분화시켜 인공 피부 모델을 제조하였다.
[실시예 2]
실시예 1에 따라 제조된 인공 피부 모델을 제조하되, 7일간 각질형성세포를 분화시킨 후 1㎍/㎖ 농도의 레티놀과 1.8mM의 CaCl2가 포함된 표피층 배양액 10㎖를 첨가하고 ALI 배양법을 통해 3일간 추가로 분화시켰다(총 10일).
[실시예 3]
실시예 1에 따라 제조된 인공 피부 모델을 제조하되, 7일간 각질형성세포를 분화시킨 후 레티놀 대신에, 1㎍/㎖ 농도의 아데노신과 1.8mM의 CaCl2가 포함된 표피층 배양액 10㎖를 첨가하고 ALI 배양법을 통해 3일간 추가로 분화시켰다(총 10일).
[실험예 1]
비교예 및 실시예 1에 따라 제조된 인공 피부 모델의 표면에 각각 2초 동안 일정하게 압력 450mbar을 유지하여 변형을 유도한 후, 다시 2초 동안 감압 조건을 해제함으로써 피부가 회복되게 하는 과정을 3회 반복하였다. 이에 따라 발생하는 피부 모델의 변형을 정량적으로 측정하기 위해 본 발명에서는 2㎜ 직경의 큐토미터 장비를 사용하였으며, 구체적인 결과는 하기의 표 1에, 그래프는 도 4에 나타내었다. 또한, 비교예 및 실시예 1에 따라 제조된 인공 피부 모델을 관찰한 결과는 도 2에 나타내었다.
단위 시간당 피부 변형률(mm/초)
1회 2회 3회
인간 피부
(Clinical skin)		 0.35 0.36 0.37
비교예 0.81 0.94 1.50
실시예 1 0.74 0.73 0.74
상기 표 1에서 확인되듯이, 콜라겐 바이오 잉크가 사용된 비교예의 경우 감압을 유지 및 해제하는 과정이 반복될수록 단위 시간당 피부 변형률이 증가하는 반면, dECM 바이오 잉크가 사용된 실시예 1의 경우, 상기 과정이 반복되어도 단위 시간당 피부 변형률이 일정하게 유지되었다.
또한, 도 2에서 확인되듯이, 비교예(도 2의 (b))에 비해 실시예 1(도 2의 (a))에 따른 인공 피부 모델에서 표피층의 수축이 더 적게 일어나 그 크기가 일정하게 유지될 수 있으므로, 피부 탄성이 더 안정적으로 측정될 수 있음을 확인하였다.
따라서, 실시예 1과 같이, dECM 바이오 잉크를 사용하여 제조된 인공 피부 모델이 인간의 피부와 더 유사하였다.
[실험예 2]
실시예 1에 따라 제조하되, 각질형성세포를 총 10일간 분화시킨 인공피부모델과 실시예 2 내지 3에 따라 제조된 인공 피부 모델의 피부 탄성을 측정하였다. 인공 피부 모델 표면에 각각 2초 동안 일정하게 압력 450mbar을 유지하여 변형을 유도한 후, 다시 2초 동안 감압 조건을 해제함으로써 피부가 회복되게 하였다. 상기 변형 및 회복을 주기로 하여 이를 9회 반복 관찰한 결과의 평균값을 표 2에, 3회 반복한 결과는 표 3에 나타내었다. 상기와 같은 피부 모델의 변형을 정량적으로 측정하기 위해 본 발명에서는 2㎜ 직경의 큐토미터 장비를 사용하였다.
도 5에는 실시예 1 내지 3의 피부 모델에 대해서 큐토미터를 사용하여 측정된 정량적인 변형값들을 측정한 결과가 제시되어 있으며, 이러한 결과를 토대로 실시예 1 내지 3의 피부 모델 각각에 대해 단위 시간당 피부 변형률의 평균값(mm)을 계산된 결과를 표 2에 정리하였다.
단위 시간당 피부 변형률의 평균값(mm)
실시예 1 0.35
실시예 2 0.64
실시예 3 0.63
상기 표 2에서 확인되듯이, 첨가제를 처리하지 않은 실시예 1에 비해 레티놀이 처리된 실시예 2와 아데노신이 처리된 실시예 3에 따라 제조된 인공 피부 모델의 단위 시간당 피부 변형률의 평균값이 더 크므로, 레티놀과 아데노신을 처리하면 피부 탄성이 증진됨을 알 수 있다.
또한, 실시예 3의 평균 변형률이 실시예 2에 비해 낮으므로, 레티놀에 의한 피부 탄성의 증진 효능이 아데노신에 비해 뛰어남을 확인할 수 있다.
아울러, 실시예 2와 3에 따라 제조된 인공 피부 모델을 사용하면 체외에서 첨가제의 효능을 정량적으로 파악할 수 있다.
도 6에서 확인되듯이, 첨가제가 처리되지 않은 인공 피부 모델(negative control, 실시예 1)의 경우에는 시간이 지남에 따라 감압 유지 및 해제에 상응하는 피부 변형 및 회복이 원활하지 않음을 확인할 수 있으며, 단위 시간당 피부 변형 정도는 측정 횟수가 증가함에 따라 감소하였다. 이는 피부의 항상성이 유지되지 않아 피부가 탄성을 잃고 늘어짐을 의미한다.
레티놀이 포함된 실시예 2와 아데노신이 포함된 실시예 3의 경우에는 단위 시간당 피부 변형률은 비교적 일정하였으나, 변형 유도 횟수가 증가함에 따라 실시예 2(레티놀)의 그래프 패턴의 변화 정도가 실시예 3(아데노신)에 비해 더 적은 것을 확인하였다.
즉, 레티놀의 항노화 작용으로 인해, 최초 세포 분화로부터 10일이 지났음에도 불구하고 피부의 탄성이 지속적으로 유지됨을 알 수 있으며, 이러한 비교실험 결과로부터 본 발명에 따른 인공 피부 모델의 경우, 다양한 첨가제의 효과를 체외 배양을 통해 정량적으로 파악하고 적절한 첨가제를 스크리닝 혹은 선별하는데 효과적으로 활용될 수 있음을 알 수 있다.

Claims (8)

  1. 인공 피부 모델을 사용하여 피부 탄성을 측정하는 방법에 있어서,
    인공 피부 모델을 준비하는 단계; 및
    인공 피부 모델의 표면에 일정 시간 동안 감압 조건을 유지하여 변형(deformation)을 유도하는 단계; 및
    상기 감압 조건을 해제하여 피부 모델의 변형 회복을 모니터링 하는 단계;를 포함하고,
    상기 인공 피부 모델은,
    탈세포화된 세포외기질(dECM)과 섬유아세포(primary fibroblast)를 혼합하여 dECM 바이오 잉크를 제조하는 혼합 단계;
    지지체 위로 상기 dECM 바이오 잉크를 도포 혹은 인쇄하여 인공 진피(dermis)층을 제조하는 진피층 형성 단계;
    상기 인공 진피층에 포함된 섬유아세포를 5일간 증식시키는 증식 단계;
    상기 인공 진피층의 위로 각질형성세포를 추가한 후, 7일간 분화시켜 표피층을 형성하는 표피층 형성 단계; 및
    아데노신 혹은 레티놀을 사용하여 상기 인공 피부 모델을 처리하는 단계;를 거쳐 제조되며,
    상기 일정 시간은 2초~4초이고, 감압 조건은 20mbar 이상 450mbar 이하인 것을 특징으로 하는, 인공 피부 모델을 사용하여 피부 탄성을 측정하는 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 탈세포화된 세포외기질(dECM)은,
    조직에서 세포를 제거하는 탈세포 단계;
    산성 프로테아제를 사용하여, 탈세포화된 조직의 세포외기질을 액상화시키는 액상화 단계;
    상기 액상화 단계를 통해 얻어진 탈세포화된 세포외기질 용액을 여과하는 여과 단계; 및
    여과 단계를 통해 얻어진 혼합물을 살균하는 멸균 단계;를 거쳐 제조되는 것을 특징으로 하는, 인공 피부 모델을 사용하여 피부 탄성을 측정하는 방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 혼합 단계에서, 1.5wt% 농도의 탈세포화된 세포외기질(dECM)과 1x106cell/㎖ 농도의 섬유아세포(primary fibroblast)가 혼합되는 것을 특징으로 하는, 인공 피부 모델을 사용하여 피부 탄성을 측정하는 방법.
  4. 삭제
  5. 인공 피부 모델을 사용하여 피부 첨가제를 스크리닝 혹은 선별하는 방법에 있어서,
    인공 피부 모델을 준비하는 단계; 및
    인공 피부 모델의 표면에 일정 시간 동안 감압 조건을 유지하여 변형(deformation)을 유도한 후, 감압 조건을 해제하여 피부 모델의 변형 회복을 측정하는 단계;를 포함하고,
    상기 인공 피부 모델은,
    탈세포화된 세포외기질(dECM)과 섬유아세포(primary fibroblast)를 혼합하여 dECM 바이오 잉크를 제조하는 혼합 단계;
    지지체 위로 상기 dECM 바이오 잉크를 도포 혹은 인쇄하여 인공 진피(dermis)층을 제조하는 진피층 형성 단계;
    상기 인공 진피층에 포함된 섬유아세포를 5일간 증식시키는 증식 단계;
    상기 인공 진피층의 위로 각질형성세포를 추가한 후, 7일간 분화시켜 표피층을 형성하는 표피층 형성 단계; 및
    피부 첨가제를 사용하여 상기 인공 피부 모델을 처리하는 단계;를 거쳐 제조되며,
    상기 일정 시간은 2초~4초이고, 감압 조건은 20mbar 이상 450mbar 이하인 것을 특징으로 하는, 인공 피부 모델을 사용하여 피부 첨가제를 스크리닝 혹은 선별하는 방법.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 탈세포화된 세포외기질(dECM)은,
    조직에서 세포를 제거하는 탈세포 단계;
    산성 프로테아제를 사용하여, 탈세포화된 조직의 세포외기질을 액상화시키는 액상화 단계;
    상기 액상화 단계를 통해 얻어진 탈세포화된 세포외기질 용액을 여과하는 여과 단계; 및
    여과 단계를 통해 얻어진 혼합물을 살균하는 멸균 단계;를 거쳐 제조되는 것을 특징으로 하는, 인공 피부 모델을 사용하여 피부 첨가제를 스크리닝 혹은 선별하는 방법.
  7. 제5항에 있어서,
    상기 혼합 단계에서, 1.5wt% 농도의 탈세포화된 세포외기질(dECM)과 1x106cell/㎖ 농도의 섬유아세포(primary fibroblast)가 혼합되는 것을 특징으로 하는, 인공 피부 모델을 사용하여 피부 첨가제를 스크리닝 혹은 선별하는 방법.
  8. 삭제
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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KR20170055791A (ko) * 2015-11-12 2017-05-22 한국과학기술연구원 인 비트로 3ｄ 피부 진피 모델 및 그를 사용하여 약물을 스크리닝하는 방법
KR20180131721A (ko) * 2017-05-31 2018-12-11 포항공과대학교 산학협력단 피부 조직의 탈세포화 방법, 인공 피부 제작 방법, 탈세포화된 피부 조직의 하이드로젤 제조 방법, 동결 건조한 탈세화된 피부 조직 및 바이오 잉크
KR101964053B1 (ko) 2016-08-01 2019-08-01 주식회사 티앤알바이오팹 통합형 3차원 세포 프린팅 기술을 이용한 세포 배양체 및 이의 제조방법

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