KR101623189B1

KR101623189B1 - 중간엽 줄기세포 유래 단백질을 함유하는 조직 재생용 조성물

Info

Publication number: KR101623189B1
Application number: KR1020140030455A
Authority: KR
Inventors: 박현숙; 이순례; 모현정; 고은진
Original assignee: (주)세포바이오
Priority date: 2014-03-14
Filing date: 2014-03-14
Publication date: 2016-05-20
Also published as: KR20150107465A

Abstract

본 발명은 중간엽 줄기세포로부터 추출된 100 kDa 이상의 크기를 갖는 단백질을 유효성분으로 함유하는 조직 재생을 위한 약제학적 조성물에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 중간엽 줄기세포로부터 추출된 100 kDa 이상의 크기를 갖는 단백질을 유효성분으로 함유하는 조직 재생을 위한 건강기능식품에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 중간엽 줄기세포로부터 추출된 100 kDa 이상의 크기를 갖는 단백질을 유효성분으로 함유하는 조직 재생을 위한 화장료 조성물에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 a) 중간엽 줄기세포로부터 단백질을 추출하는 단계; 및 b) 추출된 단백질을 크기별로 분리하여 100 kDa 이상의 크기를 갖는 단백질을 수득하는 단계를 포함하는 조직 재생 활성을 갖는 중간엽 줄기세포 유래 단백질을 제조하는 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따라 중간엽 줄기세포로부터 추출된 100 kDa 이상의 크기를 갖는 단백질은 조직 재생을 크게 촉진함으로써 이와 연관된 다양한 용도로 이용될 수 있다.

Description

중간엽 줄기세포 유래 단백질을 함유하는 조직 재생용 조성물{COMPOSITION FOR TISSUE REGENERATION CONTAINING PROTEINS DERIVED FROM MESENCHYMAL STEM CELL}

본 발명은 중간엽 줄기세포로부터 추출된 100 kDa 이상의 크기를 갖는 단백질을 유효성분으로 함유하는 조직 재생을 위한 약제학적 조성물에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 중간엽 줄기세포로부터 추출된 100 kDa 이상의 크기를 갖는 단백질을 유효성분으로 함유하는 조직 재생을 위한 건강기능식품에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 중간엽 줄기세포로부터 추출된 100 kDa 이상의 크기를 갖는 단백질을 유효성분으로 함유하는 조직 재생을 위한 화장료 조성물에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 a) 중간엽 줄기세포로부터 단백질을 추출하는 단계; 및 b) 추출된 단백질을 크기별로 분리하여 100 kDa 이상의 크기를 갖는 단백질을 수득하는 단계를 포함하는 조직 재생 활성을 갖는 중간엽 줄기세포 유래 단백질을 제조하는 방법에 관한 것이다.

피부의 가장 중요한 역할은 외부의 세균 침입과 손상으로부터 피부를 보호하는 방어 장벽의 역할과 내부로부터의 열과 수분 손실을 방지하는 것이다. 피부는 여러 개의 층으로 구성되어 있는데, 이 가운데 가장 바깥에 위치하는 것이 표피이다. 표피에서 재생 능력을 보이는 것으로 알려진 것은, 기저층에 존재하는 피부의 각질 줄기세포이다. 피부조직은 표피와 진피 그리고 피하로 이루어져 있으며, 표피는 외부로부터 직접적이고 잦은 손상을 받으며 그 회복은 매우 중요하다. 표피는 각질세포의 층으로 이루어져 있으며, 피부 각질세포들은 분화하면서 케라틴을 합성하고 분화를 하여 층을 이루며 표피 쪽으로 이동한다. 표피의 가장 안쪽에 위치한 세포층은 기저층이며 이 층을 이루는 세포들을 기저세포라 한다. 이러한 기저층의 세포들이 증식과 분열을 거치며 각질층으로 분화되어 나가고, 표피세포들은 케라틴의 교차연결로 내부 강화를 꾀하면서 데스모솜과도 케라틴으로 연결되어 전체적인 층 구조를 유지하게 된다. 또한, 표피세포들은 바깥 표피 쪽으로 분화되어 나가면서 지질을 생산하고 분비하여 단백질로 각질화된 원형질막에 이중 층으로 된 조직을 형성함으로써 피부 표면을 외부의 유해 환경으로부터 보호한다. 피부를 구성하는 가장 바깥 부분인 표피세포는 끊임없이 벗겨져 제거되고, 그 밑에 자라나는 다른 세포들이 그 자리를 대신하는 과정이 계속 일어난다. 따라서 외부에 의한 피부 손상이 일어났을 때 상처 치유가 곧바로 일어나게 된다.

새로운 결체 조직을 형성하는 것으로 새로운 혈관 생성과 콜라겐 합성 과정이 있다. 콜라겐 합성 과정에서 섬유아세포가 콜라겐 합성 및 기타 결체 조직 형성에서 핵심 세포이며, 상처 복구 과정에서도 중요한 역할을 한다. 섬유아세포는 혈소판, 대식세포 등에 의해 염증기에 생성된 산물과 성장 인자 등에 반응하여 움직이고 증식하며 염증기 후반부의 상처에 나타나기 시작한다. 그러나 노화에 따라 피부 손상을 회복시키는 섬유아세포의 증식이 줄어들고 결체 조직인 콜라겐 등의 합성이 줄어들게 되어 재생 능력이 저하되며 이로 인해 상처 부위의 회복이 어려워지게 된다.

상처는 피부 표면의 파괴 유무에 따라, 피부나 점막이 손상되어 내부의 조직이 공기 중에 노출된 절상, 열상, 관통상, 찰과상 등의 개방성 상처, 및 피부나 점막의 파열은 없으나 둔기로 인한 타박이나 비꼬임, 충격 당겨지거나, 꺾였을 때 발생할 수 있는 폐쇄성 상처로 분류될 수 있다. 이와 같은 상처의 치유 과정은 전술한 바와 같이 세포 내 인자에 의해 섬유아세포, 혈관 내피세포, 각질세포와 같은 표피세포가 증식을 개시하고, 상처 부위로 세포가 이동하여 육아조직형성, 신생혈관형성, 재상피화 등의 과정을 거쳐 조직 재생이 이루어진다.

최근에는 조직 재생 효능에 대해 골수 또는 지방 조직 유래 다분화성 세포 또는 줄기세포를 조직공학적으로 이용하려는 연구가 활발하게 이루어지고 있다.

한편, 줄기세포는 미분화 세포로서 자기 재생을 통해 오랫동안 분열을 할 수 있으며, 특정 환경 하에서는 다양한 종류의 세포로 분화할 수 있는 세포를 말한다. 줄기세포는 기원이 되는 조직에 따라 배아 줄기세포(embryonic stem cell)와 성체 줄기세포(adult stem cell)로 나누어진다. 이를 이용한 연구적인 측면에서 성체 줄기세포의 잠재 능력은 배아 줄기세포보다 제한적인 단점이 있으나, 윤리적인 문제가 적어 성체 줄기세포를 대상으로 많은 연구가 진행되고 있다.

중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cells, MSCs)는 중간엽 기질세포(mesenchymal stromal cells)로도 불리는 다능성 세포(multipotent cell)이다. 중간엽 줄기세포는 골모세포, 연골모세포, 지방세포 등을 포함하는 다양한 형태의 세포로 분화될 수 있다.

줄기세포를 이용한 많은 연구가 진행되어 오고 있으며, 이 중 한국 공개특허공보 제10-2009-0122415호에는 동물에게 효과적인 양으로 중간엽 줄기세포를 투여하여 동물에서 자가 면역 질환, 알레르기 반응, 암, 염증 질환, 또는 섬유증을 치료하고, 상처 치유를 촉진시키고, 상피 손상을 수복시키고, 동물의 기관과 조직에서 혈관형성을 촉진시키는 방법이 제시되어 있다.

또한, 한국 공개특허공보 제10-2012-0105948호에는 인간 지방 유래 줄기세포를 혈청 배지에서 계대 배양한 다음 무혈청 배지에서 연속배양한 후, 여과를 하여 얻은 줄기세포 배양액 또는 그 농축액을 유효성분으로 함유하는 외배엽 기원 세포의 재생 촉진용 조성물, 상기 조성물을 손상 조직에 국소적으로 도포 또는 주사하는 것을 특징으로 하는 외배엽 기원 세포의 재생을 촉진하는 방법 및 상기 조성물을 유효성분으로 포함하는 신경질환 치료제에 대해 기재되어 있다.

본 발명은 줄기세포 유래, 특히 중간엽 줄기세포로부터 추출한 단백질을 이용하여 최적의 조직 재생 효과를 발휘하는 혁신적인 기술을 제공하는 것을 목적으로 한다.

이에 본 발명에서는 상기와 같은 목적을 위해 예의 연구를 거듭한 결과, 놀랍게도 중간엽 줄기세포로부터 추출된 특정 크기 범위를 갖는 단백질이 현저히 우수한 조직 재생 효과를 갖는다는 점을 발견하여 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

본 발명에 따라 중간엽 줄기세포로부터 추출된 100 kDa 이상의 크기를 갖는 단백질은 조직 재생을 크게 촉진함으로써 이와 연관된 다양한 용도로 이용될 수 있다.

도 1은 지방 유래 중간엽 줄기세포를 배양한 조건화 배지로부터 추출된 단백질 처리에 따른 인간 피부 섬유아세포의 5 일간의 성장을 나타낸 그래프이다.
도 2는 지방 유래 중간엽 줄기세포를 배양한 조건화 배지로부터 추출된 단백질 처리에 따른 배양 3 일째의 피부 섬유아세포의 위상차 현미경 이미지이다.
도 3은 다양한 중간엽 줄기세포로부터 추출된 100 kDa 이상의 단백질 처리에 따른 인간 피부 섬유아세포의 120 시간 후의 성장을 나타낸 그래프이다.
도 4는 다양한 중간엽 줄기세포로부터 추출된 100 kDa 이상의 단백질 처리에 따른 배양 3 일째의 피부 섬유아세포의 위상차 현미경 이미지이다.
도 5는 지방 유래 중간엽 줄기세포로부터 추출한 100 kDa 이상의 단백질 처리에 따른 인간 피부 섬유아세포 상처 모델의 48 시간 경과 후 이미지이다.
도 6은 지방 유래 중간엽 줄기세포로부터 추출한 100 kDa 이상의 단백질 처리에 따른 마우스 상처 모델의 7 일 경과 후 이미지이다.
도 7은 코끝 부분에 괴사가 발생한 환자의 병변 부위의 모습과, 지방 유래 중간엽 줄기세포로부터 추출한 100 kDa 이상의 단백질을 처리 후 14 일 경과한 모습을 나타낸다.

이하, 본 발명을 상세히 설명하기로 한다. 다만, 본 발명은 다양한 형태로 변경되어 구현될 수 있으며, 여기에서 설명하는 구현예에 한정되는 것은 아니다.

일 측면에서, 본 발명은 중간엽 줄기세포로부터 추출된 100 kDa 이상의 크기를 갖는 단백질을 유효성분으로 함유하는 조직 재생을 위한 약제학적 조성물에 관한 것이다.

다른 측면에서, 본 발명은 중간엽 줄기세포로부터 추출된 100 kDa 이상의 크기를 갖는 단백질을 유효성분으로 함유하는 조직 재생을 위한 건강기능식품에 관한 것이다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 중간엽 줄기세포로부터 추출된 100 kDa 이상의 크기를 갖는 단백질을 유효성분으로 함유하는 조직 재생을 위한 화장료 조성물에 관한 것이다.

바람직한 구현예에서, 중간엽 줄기세포로부터 추출된 100 kDa 이상의 크기를 갖는 단백질은 중간엽 줄기세포로부터 추출된 100 kDa 이상 10,000 kDa 미만의 크기를 갖는 단백질이다.

범위의 상한을 10,000 kDa 이하로 설정한 것은 많은 단백질이 폴리머(polymer) 또는 멀티머(multimer) 상태로 존재하고 있어, 조직 재생과 관련된 단백질도 이 범주 안에 속할 것이기 때문이다. 예를 들어, 피부의 주된 성분 중 하나이며 조직 재생에 관여하는 인자인 히알루로난(hyaluronan)과 같은 단백질의 경우, 100 kDa에서 5,000 kDa까지 다양한 크기를 가지며, 인간의 활액(synovial fluid)에 존재하는 물질은 3,000 kDa 내지 4,000 kDa의 크기를 가짐에 반해, 인간 탯줄에서는 3,140 kDa의 크기를 갖는다. 또한, vWF 단백질의 경우는 혈관 내피조직의 재생과 관련된 단백질이긴 하지만 500 kDa 내지 20,000 kDa의 다양한 크기를 갖는 것으로 알려져 있다.

더 바람직한 구현예에서, 중간엽 줄기세포로부터 추출된 100 kDa 이상의 크기를 갖는 단백질은 중간엽 줄기세포로부터 추출된 100 kDa 이상 5,000 kDa 이하의 크기를 갖는 단백질이다.

본 발명의 용도는 중간엽 줄기세포로부터 추출된 특정 크기 범위의 분자량을 갖는 단백질이 조직 재생을 크게 촉진한다는 사실을 발견하였다는 점에 기인한다.

본 발명의 용도인 조직 재생은 특히 피부 조직 재생이다. 본 발명에서 사용되는 용어 "피부 재생" 또는 "피부 조직 재생"은, 피부 조직 세포 재생, 상처 치유 또는 호전, 괴사 치유 또는 개선, 주름 제거 또는 개선, 자외선 등에 의한 피부 손상 개선 또는 치유, 피부 탄력 개선 또는 회복, 모공 축소, 피부 흉터 개선 또는 치유 등 다양한 용도를 아우를 수 있는 개념이다.

본 발명의 조성물에서 중간엽 줄기세포로부터 추출된 100 kDa 이상의 크기를 갖는 단백질은 조성물 총 중량에 대하여 0.01 % 내지 100 %로 함유될 수 있으며, 바람직하게는 1 % 내지 50 %로 함유될 수 있다. 함량은 제형 또는 조성물에 함유되는 기타 성분의 함량에 따라 적절히 조절할 수 있다. 하지만, 조성물 내 중간엽 줄기세포로부터 추출된 100 kDa 이상의 크기를 갖는 단백질의 함량이 0.01 % 미만인 경우 실질적인 효과를 기대하기 어려울 수 있으며, 50 %를 초과하는 경우에는 기대 효능 대비 비경제적일 수 있기 때문에, 조성물 총 중량에 대하여 0.01% 내지 50 %로 함유되는 것이 바람직하다.

본 발명의 일 구현예에서, 본 발명의 조성물은 유효 성분인 중간엽 줄기세포로부터 추출된 100 kDa 이상의 크기를 갖는 단백질 이외에, 조직 재생에 대한 효과를 상승 또는 보강시킬수 있도록 조직 재생에 효과가 있다고 이미 알려졌거나 앞으로 알려질 여타의 공지된 화합물이나 천연 추출물을 함께 포함할 수 있다.

본 발명의 일 구현예에서, 본 발명의 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 하나 이상의 담체를 추가로 함유할 수 있다. 약제학적으로 허용되는 담체는 특별히 제한되지 않으며 제형화에 통상적으로 사용되는 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 소르비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알지네이트, 젤라틴, 규산칼슘, 미세결정성 셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로오스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로오스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 스테아르산 마그네슘, 미네랄 오일 등일 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 담체 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 함유할 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물의 적절한 투여량은 제형화 방법, 투여 방식, 환자의 상태, 증상의 정도 등의 다양한 요인에 따라 달라질 수 있으나, 하루 0.01 mg/kg 내지 2,000 mg/kg 투여하는 것이 바람직하다. 본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 비경구로 투여되는 경우, 도포, 정맥 내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 경피 투여 등으로 투여할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 약제학적 조성물이 창상 치료에 사용되는 경우 창상이 있는 피부에 국소적으로 도포되는 방식으로 투여되는 것이 바람직할 수 있다.

본 발명의 일 구현예에서, 본 발명의 건강기능식품은 식품용으로 허용되는 하나 이상의 첨가제를 추가로 함유할 수 있다. 식품용으로 허용되는 하나 이상의 첨가제는 특별히 제한되지 않으며 식품에 배합될 수 있는 통상적인 성분, 예를 들어 물, 풍미제, 향미제, 착색제, 안정화제, 방부제, 알코올, 탄산화제, 과육, 증점제, 비타민, 식물 추출물, 유기산, 미네랄, 영양제 등일 수 있다.

본 발명의 건강기능식품의 형태는 특별히 제한되지 않으나, 음료, 껌, 차, 과자, 비타민 복합체 및 건강 보조식품으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나의 형태일 수 있다.

본 발명의 일 구현예에서, 본 발명의 화장료 조성물은 화장용으로 허용되는 하나 이상의 첨가제를 추가로 함유할 수 있다. 화장용으로 허용되는 하나 이상의 첨가제는 특별히 제한되지 않으며 일반 화장료에 배합되는 통상적인 성분, 예를 들어 유분, 물, 계면활성제, 보습제, 알코올, 증점제, 색소, 방부제, 향료, 킬레이트제, 부형제, 희석제, 자외선 차단제, 지방산 등일 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물은, 특별한 제한 없이, 스킨, 로션, 크림, 젤, 에센스, 파운데이션, 화장수, 패치, 팩, 비누, 세안제 및 세정제로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나의 제형일 수 있다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 a) 중간엽 줄기세포로부터 단백질을 추출하는 단계; 및 b) 추출된 단백질을 크기별로 분리하여 100 kDa 이상의 크기를 갖는 단백질을 수득하는 단계를 포함하는 조직 재생 활성을 갖는 중간엽 줄기세포 유래 단백질을 제조하는 방법에 관한 것이다.

바람직한 구현예에서, b) 단계는 추출된 단백질을 크기별로 분리하여 100 kDa 이상 10,000 kDa 미만의 크기를 갖는 단백질을 수득하는 단계이다.

본 발명의 중간엽 줄기세포는 인간의 지방, 태반, 제대혈(탯줄) 또는 골수에서 추출된 인간 중간엽 줄기세포인 것이 바람직하다. 또한, 인간 배아 줄기세포를 분화시켜 중간엽 세포로 유도한 후 추출된 것을 중간엽 줄기세포로 사용할 수 있다. 일례로서, 본 발명의 중간엽 줄기세포는 성인의 지방 조직으로부터 분리한 중간엽 줄기세포와 골수 유래의 중간엽 줄기세포를 이용하며, 이중 지방 유래 중간엽 줄기세포는 지방 조직 내에 존재하는 세포에 대해 몇 단계의 정제 과정을 거쳐서 수득할 수 있고, 골수 유래 중간엽 줄기세포도 지방 유래 세포와는 다른 방식의 정제 과정을 거쳐 수득 가능하다.

본 발명에서는 항노화 연구에 이용되는 물질로 세포 성장을 촉진하는 것으로 알려져 있는 아데노신을 양성 대조군으로 이용하여, 특정 분자량의 중간엽 줄기세포 유래 단백질이 인간 피부 섬유아세포의 성장에 미치는 영향과 상처 치유 효과를 확인하고자 하였다. 그 결과 중간엽 줄기세포로부터 추출된 100 kDa 이상의 크기를 갖는 단백질이 현저한 피부 조직 재생 효과를 발휘하며, 뛰어난 상처 치유 효과를 낼 수 있음을 확인하였다.

하기의 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 그러나 하기 실시예는 본 발명의 내용을 구체화하기 위한 것일 뿐 실시예에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아니다.

[ 실시예 ]

세포의 배양 및 배지의 준비

인간 섬유아세포는 CEFOgro HDF(CB-HDF-GM; 한국 CEFO Co. 제조) 배지를 사용하여 37℃, CO₂ 배양기에서 배양하였다.

지방 유래 중간엽 줄기세포는 CEFOgro ADMSC(CB-ADMSC-GM; 한국 CEFO Co. 제조) 배지로, 골수 유래 중간엽 줄기세포는 CEFOgro BMMSC(CB-BMMSC-GM; 한국 CEFO Co. 제조) 배지로, 배아 줄기세포 유래 중간엽 줄기세포(인간 배아 줄기세포를 분화시켜 중간엽 줄기세포로 유도함)는 CEFOgro ESMSC(CB-ESMSC-GM; 한국 CEFO Co. 제조) 배지로, 탯줄 유래 중간엽 줄기세포는 CEFOgro UCMSC(CB-UCMSC-GM; 한국 CEFO Co. 제조) 배지로 배양하였고, 이들 모두 인간 섬유아세포와 마찬가지로 37℃, CO₂ 배양기에서 배양하였다.

조건화 배지(CM; conditioned medium)는 T75 플라스크에 중간엽 줄기세포를 1×10⁶세포가 되도록 배양한 후 무이종성/무혈청 배지(CEFO-XF-GM)에 넣어 24 시간 동안 배양한 후 배양액만 모아서 3,500 g에서 10 분간 원심분리한 후 펠렛은 제거하고 상등액만 취하여 0.45 ㎛ 포어(pore)로 필터링하여 준비하였다.

중간엽 줄기세포로부터 단백질 추출

1×10⁶ 개의 중간엽 줄기세포를 포집하여 4℃ 조건 하에서 초음파 파쇄기(VCX500; 미국 SONICS&MATERIALS. INC 제조)를 이용하여 15 초간 초음파를 적용한(Pulse On) 후, 5 초간 휴지기(Pulse Off)를 갖도록 조정하고 진폭 파워를 20 %로 하여 초음파를 1 분 이내에 총 3 회 반복 처리하였다.

초음파 파쇄된 샘플을 15,000 g에서 5 분 동안 원심분리하여 상등액만 취하고 펠렛은 제거하였다.

또한, 추출된 단백질과 조건화 배지는 단백질 양을 정량한 후에 동결건조하여 보관하였다.

추출된 단백질의 크기별 분리

1,000 kDa, 500 kDa, 100 kDa, 5 kDa 분획 분자량(MWCO)의 포어 크기를 포함하는 폴리에테르술폰 멤브레인이 구비된 20 ㎖ 용량의 Vivaspin-20 한외여과 튜브(영국 Vivascience사 제조)를 사용하였으며, 4℃ 조건 하에서 3,500 g에서 30 분 동안 원심분리하여 추출된 단백질을 크기별로 분리하였다.

크기별로 분리된 단백질은 정량한 후에 동결건조기에서 24 시간 동안 동결건조하여 보관하였다.

인간 피부 섬유아세포 성장 측정

인간 피부 섬유아세포를 12 웰 플레이트(미국 Corning사 제조)에 19,000 cells/well을 접종하고 CEFOgro HDF(CB-HDF-GM; 한국 CEFO Co. 제조) 배지로 배양하였다. 조건화 배지의 경우는 10 ㎍/㎖, 30 ㎍/㎖, 50 ㎍/㎖ 비율로 처리하고 세포 성장을 관찰하였으며, 각 중간엽 줄기세포로부터 추출된 각 단백질은 30 ㎍/㎖로 처리하여 인간 피부 섬유아세포의 성장을 관찰하였다. 관찰하면서 지정된 날짜에 세포수를 계수하고 세포 성장 이미지를 관찰하여 도 1 내지 도 4에 나타내었다.

도 1 내지 도 4 중 Control은 인간 피부 섬유아세포를 CB-HDF-GM 배지를 이용하여 정상적인 방법으로 배양한 대조군 샘플이고, Adenosin은 아데노신(0.04 %)을 처리한 양성 대조군 샘플이다. Whole은 지방 유래 중간엽 줄기세포를 배양한 조건화 배지의 전체 분자량의 단백질을 처리한 샘플이다(즉, 크기별 분리하지 않음). 또한, 100kD above와 100kD under는 지방 유래 중간엽 줄기세포를 배양한 조건화 배지로부터 추출된 단백질을 100 kDa 이상과 100 kDa 미만으로 나눈 것을 처리한 실험군이며, ADMSC, BMMSC, UCMSC, ESMSC는 각각 지방, 골수, 탯줄, 배아 줄기 세포 유래 중간엽 줄기세포로부터 추출한 100 kDa 이상의 단백질을 처리한 실험군이다.

구체적으로, 도 1은 인간 피부 섬유아세포의 5 일간의 성장을 나타낸 그래프이고, 도 3은 인간 피부 섬유아세포의 120 시간 후의 성장을 나타낸 그래프이고, 도 2 및 도 4는 배양 3 일째의 피부 섬유아세포의 위상차 현미경 이미지를 나타낸 것이다. 도 1 내지 도 4에 나타난 바와 같이, 중간엽 줄기세포 유래 100kD above와 ADMSC, BMMSC, UCMSC 및 ESMSC의 경우 인간 피부 유래 섬유아세포의 성장률이 현저히 높았으며, 이를 통해 중간엽 줄기세포로부터 추출된 100 kDa 이상의 크기를 갖는 단백질이 피부 유래 세포의 성장을 크게 촉진함을 확인할 수 있었다.

상처 치유 효과 확인

실험예 1 : 생체 외( in vitro ) 실험

인간 피부 섬유아세포를 배양 플레이트에 가득 차도록(confluent) 충분히 배양한 후 200 ㎕ 피펫 팁(pipette tip)을 이용하여 상처를 만들어 인간 피부 섬유아세포 상처 모델을 제작하였다. 상처 부위를 표시한 후 지방 유래 중간엽 줄기세포로부터 추출한 100 kDa 이상의 단백질을 처리하여 상처 부위가 회복되는 속도를 관찰하였다.

도 5는 지방 유래 중간엽 줄기세포로부터 추출한 100 kDa 이상의 단백질을 처리(ADMSC)하고 48 시간 경과한 이미지를 나타낸다. 도 5에 나타난 바와 같이, 중간엽 줄기세포로부터 추출된 100 kDa 이상의 크기를 갖는 단백질을 처리한 경우 무처리 Control에 비해 상처 회복 속도가 빠름을 확인할 수 있었다.

실험예 2 : 동물 실험

생후 6 주된 CF1 마우스의 등 부위 피부에 8 mm 펀치를 이용한 상처를 만들어 마우스 상처 모델을 제작하였다. 상처에 지방 유래 중간엽 줄기세포로부터 추출한 100 kDa 이상의 단백질을 처리하고 드레싱 한 후 7 일 동안 상처의 경과를 확인하였다.

도 6 중 Control은 합성 하이드로젤 100 ㎕만을 처리한 대조군이고, ADMSC는 합성 하이드로젤 100 ㎕에 지방 유래 중간엽 줄기세포로부터 추출한 100 kDa 이상의 단백질 30 ㎕를 혼합하여 처리한 실험군이다. 도 6에 나타난 바와 같이, 중간엽 줄기세포로부터 추출된 100 kDa 이상의 크기를 갖는 단백질을 처리한 경우 Control에 비해 상처 회복 속도가 빠름을 확인할 수 있었다.

실험예 3 : 임상 시험

코끝 부분에 괴사가 발생한 환자의 병변 부위에 1 ㎖의 지방 유래 중간엽 줄기세포로부터 추출한 100 kDa 이상의 단백질을 처리(도포)하고 14 일 동안 경과를 확인하였다.

도 7에 나타난 바와 같이, 중간엽 줄기세포로부터 추출된 100 kDa 이상의 크기를 갖는 단백질을 처리한 경우 상태가 호전되는 모습을 육안으로 확인할 수 있었다.

Claims

파쇄한 중간엽 줄기세포로부터 추출된 추출물을 유효성분으로 함유하는 약제학적 조성물로서,
상기 중간엽 줄기세포로부터 추출된 추출물에서 100 kDa 미만의 크기를 갖는 물질을 제거한, 상처 치료용 또는 상처 호전용 약제학적 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 중간엽 줄기세포로부터 추출된 추출물에서 100 kDa 이상 10,000 kDa 미만의 크기를 갖는 단백질을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는, 상처 치료용 또는 상처 호전용 약제학적 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 중간엽 줄기세포가 인간의 지방, 태반, 제대혈, 배아 줄기세포 또는 골수 유래 중간엽 줄기세포인 것을 특징으로 하는, 상처 치료용 또는 상처 호전용 약제학적 조성물.
제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서,
피부 조직 재생을 위한, 상처 치료용 또는 상처 호전용 약제학적 조성물.
파쇄한 중간엽 줄기세포로부터 추출된 추출물을 유효성분으로 함유하는 건강기능식품으로서,
상기 중간엽 줄기세포로부터 추출된 추출물에서 100 kDa 미만의 크기를 갖는 물질을 제거한, 상처 개선용 건강기능식품.
제 5항에 있어서,
상기 중간엽 줄기세포로부터 추출된 추출물에서 100 kDa 이상 10,000 kDa 미만의 크기를 갖는 단백질을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는, 상처 개선용 건강기능식품.
제 5항에 있어서,
상기 중간엽 줄기세포가 인간의 지방, 태반, 제대혈, 배아 줄기세포 또는 골수 유래 중간엽 줄기세포인 것을 특징으로 하는, 상처 개선용 건강기능식품.
제 5항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 있어서,
피부 조직 재생을 위한, 상처 개선용 건강기능식품.
파쇄한 중간엽 줄기세포로부터 추출된 추출물을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물로서,
상기 중간엽 줄기세포로부터 추출된 추출물에서 100 kDa 미만의 크기를 갖는 물질을 제거한, 상처 개선용 화장료 조성물.
제 9항에 있어서,
상기 중간엽 줄기세포로부터 추출된 추출물에서 100 kDa 이상 10,000 kDa 미만의 크기를 갖는 단백질을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는, 상처 개선용 화장료 조성물.
제 9항에 있어서,
상기 중간엽 줄기세포가 인간의 지방, 태반, 제대혈, 배아 줄기세포 또는 골수 유래 중간엽 줄기세포인 것을 특징으로 하는, 상처 개선용 화장료 조성물.
제 9항 내지 제 11항 중 어느 한 항에 있어서,
피부 조직 재생을 위한, 상처 개선용 화장료 조성물.
하기 단계를 포함하는 상처 치료 활성을 갖는 중간엽 줄기세포 추출물을 제조하는 방법:
a) 중간엽 줄기세포를 파쇄하는 단계;
b) 중간엽 줄기세포 파쇄물을 원심분리하여 상등액을 수득하는 단계; 및
c) 상기 상등액에서 100kDa 미만의 크기를 갖는 물질을 제거하는 단계.
제 13항에 있어서,
c) 단계 이후, 추출물에 포함된 단백질을 크기별로 분리하여 100 kDa 이상 10,000 kDa 미만의 크기를 갖는 단백질을 수득하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 중간엽 줄기세포 추출물을 제조하는 방법.
제 13항 또는 제 14항에 있어서,
상기 중간엽 줄기세포가 인간의 지방, 태반, 제대혈, 배아 줄기세포 또는 골수 유래 중간엽 줄기세포인 것을 특징으로 하는, 중간엽 줄기세포 추출물을 제조하는 방법.