KR102066670B1 - 인 비트로 3ｄ 피부 진피 모델 및 그를 사용하여 약물을 스크리닝하는 방법 - Google Patents
인 비트로 3ｄ 피부 진피 모델 및 그를 사용하여 약물을 스크리닝하는 방법 Download PDFInfo
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Abstract
섬유아세포로부터 배양된 섬유아세포집합체를 포함하는 인 비트로(In vitro) 3차원 피부 진피 모델 및 그를 사용하여 약물을 스크리닝하는 방법에 관한 것이다. 일 양상에 따른 인 비트로 3차원 피부 진피 모델 및 그를 사용하여 약물을 스크리닝하는 방법은 3차원 세포 집합체로 이루어져 있어 구조적, 기능적인 복잡성을 갖는 피부의 생체 내 환경을 잘 모방할 수 있을 뿐만 아니라, MMP 또는 콜라겐을 포함하는 세포외기질과 관련된 물질을 고속(high-throughput)으로 스크리닝할 수 있는 효과가 있다.
Description
인 비트로 3D 피부 진피 모델 및 그를 사용하여 약물을 스크리닝하는 방법에 관한 것이다.
인체의 피부조직은 크게 세 부분으로 나뉘어지는데, 피부의 가장 바깥쪽을 이루는 표피층과 그 아래층의 진피층, 그리고 피하조직으로 이루어진다. 이 중 표피층은 표피층과 진피층이 단단하게 결합할 수 있도록 하는 기저막(basement membrane)으로부터 여러 층으로 분화된 상피세포와 그 밖에 멜라닌세포, 면역세포로 이루어지며, 표피층 아래의 진피층은 주로 섬유아세포와 이 세포가 분비한 여러 세포외기질(extracellular matrix)로 이루어진다. 진피층은 피부 건강 및 노화와 밀접하게 연관되어 있음이 알려져 있다.
콜라겐은 진피층의 90%를 차지하는 주요 단백질로서 피부 결합 조직을 유지하고, 피부에 탄력을 제공한다. 일반적으로 외부 요인 및 나이 증가에 따라 섬유아세포의 수 및 기능이 감소하고, 이것이 노화의 주요 원인으로 알려져 있다. 세포의 감소는 피부 조직에의 섬유질 성분 합성 및 수분의 손실, 및 각질층의 변화를 일으킨다. 또한, 콜라게나아제의 증가는 가교 형태의 콜라겐을 감소시키고, 이것은 피부의 매끄러움, 수분, 및 탄력을 감소시킨다. 콜라겐 함량 및 합성 증가는 피부의 수분 및 탄력의 증가를 의미한다.
피부 매트릭스 내의 콜라겐의 분해 및 합성은 프로테아제인 MMP(matrix metalloproteinase)에 의해 조절된다. 구조 및 기능적 특성에 따라, MMP는 다수의 종류로 나뉜다. 타입 I 콜라겐은 피부의 전형적인 콜라겐으로 MMP-1의 작용에 의해 분해된다. MMP-1 활성은 피부의 항상성을 유지하기 위해 분비되는 TIMP-1과 같은 억제제에 의해 조절된다. MMPs 및 TIMPs와 같은 생분자는 섬유아세포를 포함하는 세포에 의해 분비된다. 또한, MMP-1은 세포외기질을 분해하고, 그에 의해 종양 전이 및 진행을 촉진한다. MMP-1에 의한 콜라겐 합성 및 분해는 암 전이에서 중요한 역할을 한다. 따라서, MMP-1/콜라겐을 표적으로 하는 약물 및 물질은 암 치료제 또는 화장료 조성물의 목적으로 개발되고 있다.
또한, MMP는 염증성 질환, 예를 들면, 관절염, 또는 암, 예를 들면 암 전이 등과 같은 병리학적 조건에서 과발현되는 것으로 알려져 있으며, MMP를 타겟으로 하는 MMP 억제제는 상기와 같은 질환의 치료제로서 개발되고 있다.
이러한, MMP 또는 콜라겐을 표적으로 하는 약물을 스크리닝하기 위한 2D 세포-기반 어세이가 개발되어 있으나, 2D 세포-기반 어세이는 약물의 민감도, 세포 및 조직에 대한 약물 침투의 문제로 인해 제한적이고, 살아있는 생명체의 반응을 정확하게 예측하는데 부적절하다. 또한, 이와 같은 피부의 구조적, 기능적인 복잡성 때문에 한 종류의 피부세포를 이용한 피부 연구는 한계를 가지게 되며 이를 극복하고자 개발한 3차원적 구조의 피부 모델이 인공 피부이나, 기존의 인공 피부는 고속으로 약물을 스크리닝하기 어려운 제한점이 있다. 따라서, 고속으로 약물을 스크리닝(high-throughput)할 수 있으면, 피부의 환경을 모사할 수 있는 새로운 피부 모델 시스템의 개발이 요구된다.
일 양상은 섬유아세포로부터 배양된 섬유아세포집합체를 포함하는 인 비트로(In vitro) 3차원 피부 진피 모델을 제공한다.
다른 양상은 섬유아세포를 섬유아세포에 결합하는 활성을 가진 단백질이 코팅된 표면을 갖는 배양 용기 중의 액체 배지 중에서 배양하여, 상기 표면으로부터 섬유아세포가 이탈되어 형성된 섬유아세포집합체(fibroblast cluster)를 포함하는 배양물을 얻는 단계로서, 상기 섬유아세포에 결합하는 활성을 가진 단백질은 섬유아세포와 섬유아세포 사이의 결합보다 더 약하게 섬유아세포와 결합하는 것인 단계; 및 상기 배양물로부터의 섬유아세포집합체를 적어도 12시간 동안 추가적으로 배양하는 단계를 포함하는 인 비트로 3차원 인공 피부 모델을 제조하는 방법을 제공한다.
다른 양상은 상기 섬유아세포집합체 또는 인 비트로 3차원 피부 진피 모델에 피검 물질을 처리하는 단계; 상기 피검 물질이 처리됨 섬유아세포집합체 또는 피부 진피 모델의 MMP의 발현 또는 활성의 수준을 측정하는 단계; 측정된 MMP의 발현 또는 활성의 수준을 무처리 대조군의 수준과 비교하는 단계; 및 대조군에 비하여 MMP의 발현 또는 활성을 감소시킨 물질을 선별하는 단계를 포함하는 MMP의 발현 또는 활성을 감소시키는 물질을 스크리닝하는 방법을 제공한다.
또 다른 양상은 상기 섬유아세포집합체 또는 인 비트로 3차원 피부 진피 모델에 피검 물질을 처리하는 단계; 상기 피검 물질이 처리됨 섬유아세포집합체 또는 피부 진피 모델의 콜라겐의 발현 또는 활성의 수준을 측정하는 단계; 측정된 콜라겐의 발현 또는 활성의 수준을 무처리 대조군의 수준과 비교하는 단계; 및 대조군에 비하여 콜라겐의 발현 또는 활성을 증가시킨 물질을 선별하는 단계를 포함하는 콜라겐의 발현 또는 활성을 증가시키는 물질을 스크리닝하는 방법을 제공한다.
일 양상은 섬유아세포로부터 배양된 섬유아세포집합체를 포함하는 인 비트로(In vitro) 3차원 피부 진피 모델을 제공하는 것이다.
다른 양상은 섬유아세포로부터 배양된 섬유아세포집합체를 포함하는 약물, 예를 들면, MMP 저해제 또는 세포 내 콜라겐의 발현 또는 활성 증가제를 스크리닝하기 위한 인 비트로(In vitro) 모델을 제공하는 것이다.
다른 양상은 섬유아세포를 섬유아세포에 결합하는 활성을 가진 단백질이 코팅된 표면을 갖는 배양 용기 중의 액체 배지 중에서 배양하여, 상기 표면으로부터 섬유아세포가 이탈되어 형성된 섬유아세포집합체(fibroblast cluster)를 포함하는 배양물을 얻는 단계로서, 상기 섬유아세포에 결합하는 활성을 가진 단백질은 섬유아세포와 섬유아세포 사이의 결합보다 더 약하게 섬유아세포와 결합하는 것인 단계; 및 상기 배양물로부터의 섬유아세포집합체를 적어도 12시간 동안 추가적으로 배양하는 단계를 포함하는 인 비트로 3차원 피부 피부 모델, 또는 MMP 저해제 또는 세포 내 콜라겐의 발현 또는 활성 증가제를 스크리닝하기 위한 인 비트로(In vitro) 모델을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
본 명세서에서 용어 "섬유아세포(fibroblast)"('섬유세포'와 호환적으로 사용됨)는 섬유성 결합조직의 성분을 이루는 세포로 포유류의 결합조직의 세포를 의미할 수 있다.
용어 "섬유아세포집합체(fibroblast cluster or fibroblast cell mass)" 또는 "3차원 섬유아세포집합체" ('섬유아세포조직체'와 호환적으로 사용됨)는 2 이상의 세포가 밀집된 상태를 말하며, 조직 상태일 수도 있고, 단일 세포 상태일 수도 있다. 각각의 세포 집합체는 조직 자체 또는 일부, 또는 단일 세포의 집합체로 존재할 수 있으며, 섬유아세포 유사-조직체를 포함할 수 있다. 또한, 용어 "3차원(three-dimension)"은 2차원이 아닌 기하학적인 3개의 파라미터(예를 들면, 깊이, 넓이, 높이 또는 X, Y, Z 축) 모델을 갖는 입체를 의미할 수 있으며, 따라서 일 구체예에 따른 섬유아세포집합체는 3차원 배양, 즉 배양 용기에서 탈착되어 부유상태로 배양되어 세포가 증식함에 따라 입체적으로 구형, 시트(sheet) 또는 그와 유사한 3차원의 형태(예를 들면, 유사 조직체)를 갖는 섬유아세포집합체를 의미할 수 있다. 또한 일 구체예에 따른 섬유아세포집합체는 조직공학기술로 인공적인 3차원 다공성 세포외기질, 예를 들면, 시트, 하이드로겔, 막, 스캐폴드 등과 같은 생분해성 합성 고분자 혹은 천연 고분자 지지체를 사용할 필요 없이, 그 자체로서 3차원 섬유아세포집합체가 형성되는 것을 의미할 수 있으며, 상기 조직공학기술은 세포가 아닌 매트릭스가 3차원인 것으로 일 구체예에 따른 3차원 섬유아세포집합체와는 구별된다. 상기 섬유아세포집합체는 구형 또는 시트의 형상일 수 있다. 또한, 상기 섬유아세포집합체는 육안으로 식별가능한 크기일 수 있으며, 예를 들면, 직경이 300 내지 2000 ㎛인 구형의 섬유아세포집합체일 수 있고, 일 구체예에 있어서, 300 내지 1000 ㎛ 일 수 있다. 상기 구형의 섬유아세포집합체의 직경은 일 구체예에 따른 배양 방법에 의해 통상의 당업자가 육안으로 식별가능한 크기로 조절할 수 있다. 또한 일 구체예에 따른 구형의 섬유아세포집합체는, 예를 들면, 하나의 섬유아세포집합체 또는 하나의 섬유아세포집합체의 직경 400 ㎛ 내에 3.0×105 내지 1.0×106 개의 섬유세포를 포함할 수 있다.
일 구체예에 있어서, 본 명세서는 섬유아세포로부터 배양된 섬유아세포집합체를 포함하는 약물 스크리닝을 위한 조성물 또는 모델을 제공할 수 있다. 상기 약물은 피부 노화 개선제, 염증성 질환, 관절염 또는 암 치료제일 수 있다. 따라서, 예를 들면, 섬유아세포로부터 배양된 섬유아세포집합체를 포함하는 인 비트로 3차원 피부 진피 모델은 피부 노화 개선제, 염증성 질환, 관절염, 또는 암 치료제의 스크리닝을 위한 것일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 섬유아세포 집합체는 피부의 노화에 따른 병리학적 특성을 타나내는 것일 수 있다. 예를 들면, 상기 섬유아세포집합체는 콜라겐의 발현 또는 활성이 감소되어 있거나, 또는 매트릭스 메탈로프로테아제(matrix metalloproteinase: MMP)의 발현 또는 활성이 증가되어 있는 것일 수 있다. 상기 섬유아세포집합체는 추가적으로 피브로넥틴의 발현 또는 활성이 감소되어 있거나, 또는 엘라스틴의 발현 또는 활성이 증가되어 있는 것일 수 있다. 본 명세서에서 상기 발현 또는 활성의 감소 또는 증가는 정상세포에 비해 또는 2차원적으로 배양된 섬유아세포에 비해 상기 언급된 단백질 또는 유전자의 발현 또는 활성이 감소 또는 증가되어 있는 것을 의미할 수 있다. 상기 콜라겐은 콜라겐 타입 I, II, III, IV, V, VI, VII, VIII, IX, X, XI, XII, XIII, 또는 XIV를 포함할 수 있다. 또한, 상기 MMP는 MMP 1 내지 28 중 어느 하나 이상을 포함할 수 있다.
상기 배경기술에 언급되었듯이, 상기 콜라겐의 감소는 피부 조직에의 섬유질 성분 합성 및 수분의 손실, 및 각질층의 변화를 일으킬 수 있다. 또한 상기 콜라겐은 MMP에 의해 분해될 수 있다. 따라서 콜라겐의 발현 또는 활성이 감소된, 또는 MMP의 발현 또는 활성이 증가된 일 구체예에 따른 섬유아세포집합체는 피부의 노화를 개선하기 위한 약물을 스크리닝하는데 유용하게 사용될 수 있다. 예를 들면, 상기 피부의 노화를 개선하기 위한 약물은 피부의 보습 효과, 탄력의 증가, 주름의 감소, 및 항산화 활성을 갖는 약물을 포함할 수 있다. 또한, 상기 MMP는 세포외기질을 분해하고, 그에 의해 종양 전이 및 진행을 촉진할 수 있고, 그에 의한 콜라겐 합성 및 분해는 암 전이에서 역할을 할 수 있다. 또한, MMP는 염증성 질환, 예를 들면, 관절염, 또는 암, 예를 들면 암 전이 등과 같은 병리학적 조건에서 과발현되는 것으로 알려져 있으며, MMP를 타겟으로 하는 MMP 억제제는 상기와 같은 질환의 치료제로서 개발되고 있다. 따라서, 따라서 콜라겐의 발현 또는 활성이 감소된, 또는 MMP의 발현 또는 활성이 증가된 일 구체예에 따른 섬유아세포집합체는 염증성 질환, 관절염, 또는 암 치료제를 스크리닝하는데 유용하게 사용될 수 있다. 상기 염증성 질환은 피부염, 결막염, 복막염, 치주염, 비염, 중이염, 인후염, 편도염, 폐렴, 위궤양, 위염, 크론병, 대장염, 치질, 통풍, 강직성 척추염, 류마티스 열, 루푸스, 섬유근통 (fibromyalgia), 건선관절염, 골관절염, 류마티스 관절염, 견관절주위염, 건염, 건초염, 건주위염, 근육염, 간염, 방광염, 신장염, 쇼그렌 증후군(sjogren's syndrome), 다발성 경화증, 및 급성 및 만성 염증 질환으로 이루어진 군으로부터 선택된 것일 수 있다. 또한 상기 관절염은 골관절염, 또는 류마티스 관절염일 수 있다. 상기 암 치료제는 암 자체의 세포의 증식을 억제하는 물질을 포함할 뿐만 아니라, 암의 전이를 억제하는 물질도 포함할 수 있다.
상기 섬유아세포로부터 섬유아세포집합체로의 배양은 상기 섬유아세포를 표면이 소수성을 띠는 배양용기에 접착시켜 배양함으로써 분화시킬 수 있다. 상세하게는 상기 섬유아세포를 표면이 소수성을 띠는 배양용기에 접착시켜 배양하면 상기 접착된 섬유아세포의 밀도가 증가함에 따라 섬유아세포가 배양용기로부터 탈착되어 섬유아세포집합체를 형성하게 된다. 또한, 상기 배양은 섬유아세포집합체로 배양된 후, 또는 섬유아세포집합체가 형성된 후, 추가적으로 적어도 12시간 이상, 또는 적어도 1일 이상, 예를 들면 12시간 내지 15일, 1일 내지 15일, 3일 내지 10일, 3일 내지 7일, 또는 5일 내지 7일 더 배양된 것일 수 있다. 상기 배양에 적합한 배지는 섬유아세포의 배양 및/또는 분화에 통상적으로 사용되는 배지로서 혈청 혹은 무혈청을 함유한 것이면 어느 것이나 제한 없이 사용될 수 있으며, 예를 들면 DMEM(Dulbeco's modified eagle medium), Ham's F12, 이들의 혼합물 등에 혈청을 첨가한 배지를 사용할 수 있다. 상기 배양하여 세포집합체를 형성하는 방법의 상세한 설명은 후술한다.
일 구체예에 따른 섬유아세포로부터 배양된 섬유아세포집합체는 3차원적으로 배양된 것이기 때문에 생체 내 환경을 잘 모사할 수 있으며, 세포외기질을 포함하고 있어, 인 비트로 피부 진피 모델로 유용하게 사용될 수 있다. 본 명세서에서 용어 "피부 진피 모델(skin dermis model)"('인공 진피(dermal equivalent)'와 호환적으로 사용됨)은 진피 조직 또는 진피의 구조나 형상을 모식화한 것을 의미할 수 있으며, 진피 내 세포간의 상호작용, 구조나 형태와의 관련성을 밝히기 위해 고려된 모형을 의미할 수 있다.
일 구체예에 따른 인 비트로 피부 진피 모델의 제조 방법에 있어서, 용어 "세포의 접착 또는 세포의 결합"은 세포와 세포 사이의 접착 또는 결합 및 세포와 배양 용기 또는 생체재료의 표면 사이의 접착 또는 결합을 포함하는 의미로 사용될 수 있다. 배양 용기 또는 생체재료의 표면에서 일어나는 세포의 접착 또는 결합은 다양한 메카니즘을 가질 수 있다. 예를 들면, 생물학적 인식을 매개로 하는 특이적 세포접착 및 정전기적 혹은 표면에너지에 의해 좌우되는 비특이적 세포접착이 있다. 특이적인 세포접착은 세포외기질(extracellular matrix;ECM) 단백질인 콜라겐, 피브로넥틴, 라미닌 등에 존재하는 특정의 펩타이드(예, arginine-glycine-aspartid acid;RGD)를 세포막에 존재하는 수용체에 의해 결합시켜 일어나는 접착을 의미할 수 있다. 비특이적인 세포접착은 전기적으로 음성을 띠는 인지질을 갖는 세포막이 접착하는 표면을 전기적으로 양성을 띠게하여 세포의 접착이 유도되는 접착을 의미할 수 있다.
배양 용기는 소수성을 띠는 표면, 예를 들면 물 접촉각이 90 내지 150˚인 표면을 포함할 수 있으며, 섬유아세포에 접착 또는 결합 활성을 갖는 단백질이 표면에 코팅된 것일 수 있다. 상기 개질된 표면을 갖는 배양 용기는 세포-세포 사이의 결합보다 세포-접착 기질(예를 들면, 배양 용기의 표면에 코팅된 세포와 결합하는 활성을 갖는 단백질 또는 성장 인자) 사이의 결합이 더 약하게 유도되는 표면을 포함할 수 있다. 상기 섬유아세포는 혈액세포와는 달린 세포외기질에 접착하여 생육하는 상피세포 혹은 중간엽세포와 같은 접착의존성 세포로서, 접착 기질에 세포가 접착하지 않으면 세포사가 유도되며, 이러한 세포사를 아노이키스(anokis)라고 한다. 일 구체예에 따른 배양 방법은 세포-접착 기질 사이의 접착 또는 결합에 있어, 세포사가 유도되지 않으면서, 세포-접착 기질 사이의 접착 또는 결합을 세포-세포 사이의 접착 또는 결합에 비해 약하게 유도함으로써, 2 차원 단층으로 배양이 되지 않는다. 즉, 상기 섬유아세포는 배양 초기에는 약한 세포-접착 기질 사이의 접착 또는 결합이 유도되고, 세포-세포 사이의 접착 또는 결합이 유도되어 이러한 세포 사이의 결합에 의해 2차원 섬유아세포집합체가 형성되고, 배양 시간이 길어짐에 따라 2차원 섬유아세포집합체는 배양 용기 표면에서 탈착 또는 이탈이 되고, 탈착 또는 이탈된 2차원 섬유아세포집합체가 배양 용기에서 부유된 상태로 계속해서 배양되어 3차원의 섬유아세포 집합체를 형성할 수 있다.
상기 세포-세포 사이의 접착 또는 결합보다 세포-접착 기질(예를 들면, 배양 용기의 표면에 코팅된 세포와 결합하는 활성을 갖는 단백질 또는 성장 인자) 사이의 접착 또는 결합이 더 약하게 유도될 수 있도록 배양 용기의 표면을 개질하는 방법은 섬유아세포와 결합하는 활성을 가진 단백질을 사용함으로써 유도될 수 있다.
상기 세포-접착 기질 사이의 접착 또는 결합은 섬유아세포의 세포막에 존재하는 인테그린(integrin)과 결합하는 단백질, 예를 들면, 콜라겐, 피브로넥틴, 라미닌 등을 사용할 경우 강하게 유도된다. 용어 "인테그린(integrin)"은 세포막에 존재하여 피브로넥틴, 콜라겐등의 세포외기질에 세포가 접착할 때 작용하는 수용체분자를 의미할 수 있으며, α 또는 β 두 개의 소단위 헤테로 2 합체로 구성되는 막관통형 당단백질로, 모든 유형의 인테그린을 포함할 수 있다. 따라서, 상기 섬유아세포에 결합하는 활성을 가진 단백질은 배지 중에서 섬유아세포와 피브로넥틴이 결합하는 것보다 상기 섬유아세포와 더 약하게 결합되는 것일 수 있다. 또한, 상기 섬유아세포에 결합하는 활성을 가진 단백질은 배지 중에서 섬유아세포와 피브로넥틴이 결합하는 것보다 상기 섬유아세포와 60 내지 95%의 활성으로 결합되는 것일 수 있으며, 예를 들면, 60, 70, 80, 90, 또는 95% 일 수 있다. 따라서, 상기 섬유아세포에 결합하는 활성을 가진 단백질은 인테그린과 결합하지 않는 단백질을 포함할 수 있다. 또한, 일 구체예에 있어서, 상기 인테그린과 결합하지 않는 단백질은 섬유아세포의 세포막에 존재하는 헤파란 설페이트 프로테오글리칸(heparan sulfate proteoglycan)에 결합하는 단백질을 포함할 수 있다. 일 구체예에 있어서, 상기 헤파란 설페이트 프로테오글리칸과 결합하는 단백질은 섬유아세포성장인자(FGF)일 수 있다. 또한, 상기 단백질은 5 내지 100 ㎍/ml의 농도로 배양 용기 표면에 고정되는 것일 수 있다.
상기 용어 "섬유아세포성장인자(Fibroblast growth factor, FGF)"는 성장 인자의 한 종류로, 섬유아세포를 자극하여 증식성을 유도하는 성장인자를 의미할 수 있다. 섬유아세포성장인자는 헤파린 결합(heparin-binding) 단백질로, 상기한 바와 같이 섬유아세포의 헤파란 설페이트 프로테오글리칸과 상호작용을 할 수 있다. FGF는 22개의 종류를 포함할 수 있으며, 예를 들면, FGF 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 또는 22를 포함할 수 있다. 상기 FGF의 종류는 이름이 다를지라도, 통상의 당업자가 동일한 단백질을 의미하는 것으로 인식될 수 있다면 모두 포함할 수 있다. 예를 들면, FGF 11, 12, 13 및 14는 "iFGF" 라고도 알려져 있으며, FGF 15는 "FGF 15/19" 라고도 알려져 있다. 또한, 예를 들면, FGF 1 또는 FGF 2는 "헤파린 결합 성장인자 1(heparin-binding growth factor 1, HBGF-1" 또는 "헤파린 결합 성장인자 2(heparin-binding growth factor 2, HBGF-2"를 포함할 수 있다.
배양 용기 표면에 대한 상기 섬유아세포에 결합하는 활성을 가진 단백질의 고정화는 폴리펩티드를 고체 기질 표면에 고정하는데 이용되는 것으로 당해 기술분야에 공지된 모든 방법에 의해 달성될 수 있는데, 예를 들면, 물리적인 흡착, 비선택적인 화학반응에 의한 공유결합 등을 이용할 수 있다. 이러한 고정화 방법의 예로는, 단백질에 바이오틴(biotin)을 결합시킨 후, 이 단백질을 스트렙타비딘(streptavidin)이나 아비딘(avidin)으로 처리된 고체 표면에 적용시킴으로써 바이오틴-스트렙타비딘/아비딘 결합을 이용하여 단백질을 고정하는 방법; 플라즈마를 이용하여 기판 위에 활성기(화학결합에 의해 단백질을 고정하기 위한 화학적 작용기)를 집적시켜 단백질을 고정하는 방법; 고체 기판 표면에 졸-겔(sol-gel)법을 이용하여 비표면적이 충분히 증가된 다공성 졸-겔 박막을 형성한 후에, 상기 다공성 박막에 물리적인 흡착에 의해 단백질을 고정하는 방법; 플라즈마 반응에 의하여 폴리테트라플루오로에틸렌(PTFE) 표면에 항혈전성 단백질을 고정하는 방법; 양이온성 아미노 잔기가 2개의 효소에 2개 이상 연속적으로 융합된 효소를 결합시켜 단백질을 고정하는 방법; 기질을 이용하여 고체상 지지대에 결합되어 있는 소수성 고분자 층에 단백질을 고정하는 방법; 플라스틱 표면에서 완충성분을 이용하여 단백질을 고정하는 방법; 알코올 용액에서 소수성 표면을 가지는 고체 표면에 단백질을 접촉시켜 단백질을 고정하는 방법 등을 포함할 수 있다.
또한, 재조합적으로 대량 발현 및 용이한 정제가 가능한 폴리펩티드 링커를 사용하여 상기 폴리펩티드 링커의 카르복실 말단에 성장인자(예를 들면, FGF)의 아미노 말단이 융합되어 있는 폴리펩티드 링커-성장인자(예를 들면, FGF) 재조합 단백질 형태로 고정화를 수행할 수 있다. 상기 성장인자를 폴리펩티드 링커를 이용하여 성장인자 본래의 생물학적 활성을 유지하면서 재조합 단백질 형태로 소수성 표면에 고정시킨 후 고정된 성장인자의 섬유아세포에 대한 접착활성을 이용하여 상기 표면에 섬유아세포를 접착시킴으로써 섬유아세포의 효율적인 배양을 도모할 수 있다.
본 발명에 적합한 폴리펩티드 링커는 그의 카르복실 말단을 통해 성장인자의 아미노 말단과 결합하고 그의 아미노 말단에 존재하는 소수성 도메인을 통해 소수성 표면을 갖는 배양 용기에 흡착할 수 있는 것으로서, 재조합적으로 대량 발현 및 용이한 정제가 가능하고 섬유아세포의 배양에 영향을 미치지 않는 것이면 어느 것이든 사용할 수 있다. 폴리펩티드 링커로는 에를 들면, 말토오스 결합 단백질(maltose-binding protein, MBP), 하이드로포빈 (hydrophobin), 소수성 세포 투과성 펩티드(hydrophobic cell penetrating peptides, CPPs) 등을 포함할 수 있다.
MBP(NCBI GenBank Accession No. AAB59056)는 대장균(Escherichia coli)의 세포막을 가로질러 원형질막공간에 위치하며 세포 내로 말토오스나 말토덱스트린(maltodextrin)과 같은 당류의 이동에 관여하는 막 주변(periplasm) 단백질을 의미할 수 있다. MBP는 유용한 외래 단백질을 재조합 단백질 형태로 생산하기 위해 주로 이용되는데, 세포 내의 유전자 malE로부터 해독되어 만들어지고, 클로닝된 malE 유전자의 하부 (downstream)에 외래 단백질의 유전자를 삽입하여 세포 내에서 발현시키면 2개의 단백질이 결합한 재조합 단백질을 손쉽게 대량으로 생산할 수 있다. 특히, 발현시키고자 하는 단백질의 크기가 작거나 다른 숙주세포 내에서는 그 안정성이 떨어지는 외래 단백질인 경우, 이와 같이 MBP를 이용하여 재조합 단백질 형태로 세포 내에서 발현시키는 것이 유리할 수 있다. 이처럼 malE 유전자가 결합된 유전자로부터 발현되는 외래 단백질은 MBP가 말토오스에 결합 친화력을 갖는다는 특성을 이용하여 분리할 수 있다. 예를 들어, 말토오스가 다중화된 형태인 아밀로스(amylose)가 코팅된 수지와 세포 파쇄액을 반응시키고, 반응시킨 수지를 수차례 세척하여 오염된 다른 단백질을 제거한 후, 고농도의 말토오스를 첨가하여 경쟁시킴으로써 원하는 단백질만을 간단하게 용출시킬 수 있다.
상기 MBP-세포 접착 기질(예를 들면, 성장인자) 재조합 단백질은 당업계의 통상적인 화학적 합성 또는 유전자 재조합 기술 등을 이용하여 제조하거나, 이를 발현하는 형질전환 세균을 적절한 조건 하에서 배양한 후 배양액으로부터 재조합 단백질을 회수함으로써 수득될 수 있다. 이와 같이 수득된 MBP-세포 접착 기질 재조합 단백질을 소수성 표면을 갖는 배양 용기에 고정시키는 과정은 특별한 처리를 요구하지 않고 재조합 단백질에서 폴리펩티드 링커의 아미노 말단에 위치한 소수성 도메인을 이용한 소수성 표면과의 물리적 흡착에 의해 자발적으로 이루어질 수 있다.
또한, 상기 세포-세포 사이의 접착 또는 결합보다 세포-접착 기질(예를 들면, 섬유아세포에 결합하는 활성을 가진 단백질) 사이의 접착 또는 결합이 더 약하게 유도될 수 있도록 하는 방법은 섬유아세포와 기질(예를 들면, 배양 용기의 표면) 사이의 접착 또는 결합을 약화시키는 물질을 처리함으로써 유도될 수 있다.
상기 표면이 소수성을 띠는 배양 용기, 예를 들면 물 접촉각이 90 내지 150˚인 표면을 갖는 배양 용기는 통상적인 세포 배양 용기에 소수성을 부여하는 고분자로 표면 처리되거나 그러한 고분자로 제조된 세포 배양 용기일 수 있다. 이러한 소수성 고분자로는, 이에 한정되는 것은 아니지만, 폴리스티렌(polystyrene), 폴리메틸메타크릴레이트(PMMA), 폴리에틸렌 테레프탈레이트(PET), 폴리비닐클로라이트(PVC), 폴리에틸렌(PE), 폴리프로필렌(PP), 폴리테트라플루오르에틸렌(PTFE), 지방족 폴리에스테르계 고분자로서, 폴리(L-락트산)(PLLA), 폴리(D,L-락트산）(PDLLA), 폴리(글리콜산)(PGA), 폴리(카프로락톤)(PCL), 폴리(하이드록시알카노에이트), 폴리다이옥산온(PDS), 폴리트라이메틸렌카보네이트 중에서 선택된 1 종이거나, 또는 이들 단위들의 공중합체인 폴리(락트산-co-글리콜산)(PLGA), 폴리(L-락트산-co-카프로락톤)(PLCL), 폴리(글리콜산-co-카프로락톤)(PGCL), 이들의 유도체 등을 예로 들 수 있다. 또한 일 구체예에 따른 적합한 배양 용기는 소수성 표면으로 실란화된 표면(silanized surface), 탄소나노튜브(CNT) 표면, 탄화수소 코팅된 표면(hydrocarbon coated surface), 금속(예컨대, 스테인레스 스틸, 티탄, 금, 백금 등) 표면을 갖는 것일 수 있다.
상기 섬유아세포를 배양 용기에 파종하기 전에, 상기 섬유아세포는 계대 증식된 배양된 세포를 사용할 수 있다. 상기 계대 증식하는 방법은 공지의 방법에 의해 분리된 섬유아세포를 공지의 방법으로 계대 증식한 것일 수 있다. 예를 들면, 상기 분리된 섬유아세포는 이후의 3차원 섬유아세포접합체 형성에 1 계대 배양된 세포를 그대로 사용하거나, 10 계대 이상 배양된 세포를 사용할 수 있다.
상기 섬유아세포를 파종하는 농도는 1.0×104 내지 2.0×105 세포/cm2의 세포농도로 파종한 것일 수 있다. 또한, 예를 들면, 상기 세포 농도는 7.5×104 내지 1.5×105 세포/cm2, 또는 1.25×105 세포/cm2 일 수 있다.
또한, 상기 배양 기간은 1일 내지 1주일 일 수 있다. 상기 배양에 적합한 배지는 섬유아세포의 배양 및/또는 분화에 통상적으로 사용되는 배지로서 혈청 혹은 무혈청을 함유한 것이면 어느 것이나 제한 없이 사용될 수 있으며, 예를 들면 DMEM(Dulbeco's modified eagle medium), Ham's F12, 이들의 혼합물 등에 혈청을 첨가한 배지를 사용할 수 있다.
상기한 바와 같이, 섬유아세포가 3차원 섬유아세포집합체를 형성하는 단계는 세포-접착 기질 사이의 결합에 의해 초기에 형성된 2차원 섬유아세포집합체가 배양 용기 표면에서 탈착이 되고, 탈착된 2차원 섬유아세포집합체가 배양 용기에서 부유된 상태로 계속해서 배양됨으로써, 3차원 세포 집합체를 형성할 수 있다.
배양 용기 표면에 섬유아세포를 접착시켜 배양하여 형성된 섬유아세포집합체는 육안으로 검출가능한 크기의 직경을 가지고 있어 피펫을 사용하여 분리하거나, 여과 또는 원심분리 등의 방법에 의해 용이하게 수득할 수 있다. 즉, 상기 배양 용기로부터 형성된 섬유아세포집합체를 수득하는 단계는 효소의 처리 없이 이루어질 수 있다. 이렇게 수득된 3차원 세포집합체는 콜라게나제, 트립신 또는 디스파제(dispase)를 이용한 효소학적 처리, 압력을 이용한 기계적인 처리, 또는 이들의 병용 처리에 의해 집합체 형태를 와해시켜 단일 세포 형태로 사용하거나, 3차원 세포집합체 형태 그대로 사용할 수 있다.
다른 양상은 상기 섬유아세포집합체 또는 인 비트로 3차원 피부 진피 모델에 피검 물질을 처리하는 단계; 상기 피검 물질이 처리됨 섬유아세포집합체 또는 피부 진피 모델의 MMP의 발현 또는 활성의 수준을 측정하는 단계; 측정된 MMP의 발현 또는 활성의 수준을 무처리 대조군의 수준과 비교하는 단계; 및 대조군에 비하여 MMP의 발현 또는 활성을 감소시킨 물질을 선별하는 단계를 포함하는 MMP의 발현 또는 활성을 감소시키는 물질을 스크리닝하는 방법을 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 상기 섬유아세포집합체 또는 인 비트로 3차원 피부 진피 모델에 피검 물질을 처리하는 단계; 상기 피검 물질이 처리됨 섬유아세포집합체 또는 피부 진피 모델의 콜라겐의 발현 또는 활성의 수준을 측정하는 단계; 측정된 콜라겐의 발현 또는 활성의 수준을 무처리 대조군의 수준과 비교하는 단계; 및 대조군에 비하여 콜라겐의 발현 또는 활성을 증가시킨 물질을 선별하는 단계를 포함하는 콜라겐의 발현 또는 활성을 증가시키는 물질을 스크리닝하는 방법을 제공하는 것이다.
상기 스크리닝 방법에 있어서, 피검 물질은 저분자 화합물, 항체, 안티센스 뉴클레오티드, 작은 간섭 RNA(short interfering RNA), 짧은 헤어핀 RNA(short hairpin RNA), 핵산, 단백질, 펩티드, 기타 추출물 및 천연물로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.
상기 피검 물질을 처리하는 단계는 상기 섬유아세포집합체 또는 인 비트로 3차원 피부 진피 모델과 피검 물질을 접촉시키는 단계를 포함할 수 있다. 상기 접촉은 예를 들면, 하나 이상의 섬유아세포집합체 또는 인 비트로 3차원 피부 진피 모델이 포함되어 있는 각 웰에, 일정 농도의 피검 물질을 포함하는 용액을 주입하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 MMP 또는 콜라겐의 발현 또는 활성 수준의 측정은 역전사 중합효소 연쇄반응(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction, RT-PCR), 효소면역분석법(ELISA), 면역조직화학, 웨스턴 블롯(Western Blotting) 면역침강(immunoprecipitation), 면역형광법(immunofluorescence) 및 유세포 분석법(FACS)으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나로 측정하는 것일 수 있다. 또한 상기 MMP 또는 콜라겐의 발현 또는 활성 수준의 측정은 배양액 중 분비된 MMP 또는 콜라겐의 함량을 측정하는 것을 포함할 수 있다. 상기 배양액 중 콜라겐의 함량의 측정은 히드록시프롤린 어세이를 통해 측정하는 것일 수 있다.
상기 측정된 MMP의 발현 또는 활성의 수준을 무처리 대조군의 수준과 비교하여, 대조군에 비하여 MMP의 발현 또는 활성을 감소시킨 물질을 MMP의 발현 또는 활성 억제제 물질 또는 후보 물질로 선별할 수 있다. 상기 MMP의 발현 또는 활성을 감소기키는 물질 또는 후보 물질은 피부 노화 개선제 또는 암 치료제일 수 있다. 또한, 상기 측정된 콜라겐의 발현 또는 활성의 수준을 무처리 대조군의 수준과 비교하여, 대조군에 비하여 콜라겐의 발현 또는 활성을 증가시킨 물질을 콜라겐의 발현 또는 활성 억제제 물질 또는 후보 물질로 선별할 수 있다. 상기 콜라겐의 발현 또는 활성을 감소시키는 물질 또는 후보 물질은 피부 노화 개선제 또는 암치료제 일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 섬유아세포로부터 배양된 섬유아세포집합체는 콜라겐의 발현 또는 활성이 감소되어 있거나, 또는 MMP의 발현 또는 활성이 증가되어 있어, 일 구체예에 따른 섬유아세포집합체는 콜라겐 또는 MMP의 발현 또는 활성과 관련된 물질을 스크리닝하는데 유용하게 사용될 수 있다.
다른 구체예에 있어서, 본 명세서는 하나 이상의 웰을 갖는 웰 플레이트를 포함하고, 상기 웰에 하나 이상의 상기 섬유아세포집합체가 파종된 약물 스크리닝 장치가 제공된다. 상기 섬유아세포집합체에 대해서는 상기한 바와 같다.
또한, 상기 약물 스크리닝 장치의 각 웰에 후보 물질을 포함하는 용액을 주입하는 단계; 상기 후보 물질이 주입된 웰을 포함하는 웰 플레이트를 배양하는 단계; 상기 웰 플레이트로부터 상기 섬유아세포집합체를 수집하거나 또는 상기 웰 플레이트로부터 배양액을 회수하는 단계; 및 상기 수집된 섬유아세포로부터 어세이를 수행하거나 또는 상기 배양액으로부터 어세이를 수행하는 단계를 포함하는 약물 스크리닝하는 방법이 제공된다. 상기 후보 물질은 동일하거나 상이한 후보 물질일 수 있다. 상기 배양은 통상의 기술자가 임의로 배양 시간 및 온도를 결정할 수 있다. 상기 어세이는 예를 들면, 상기 배양액으로부터 ELISA를 사용하는 MMP 분비 어세이, 또는 상기 섬유아세포집합체로부터 웨스턴블랏팅, 또는 면역조직화학염색을 사용하는 ECM 분비 어세이를 포함할 수 있다.
일 양상에 따른 인 비트로 3차원 피부 진피 모델 및 그를 사용하여 약물을 스크리닝 하는 방법은 3차원 세포 집합체로 이루어져 있어 구조적, 기능적인 복잡성을 갖는 피부의 생체 내 환경을 잘 모방할 수 있을 뿐만 아니라, MMP 또는 콜라겐을 포함하는 세포외기질과 관련된 물질을 고속(high-throughput)으로 스크리닝할 수 있는 효과가 있다.
도 1은 일 구체예에 따른 3차원 섬유아세포집합체의 형성 과정을 현미경으로 관찰한 사진이다.
도 2는 일 구체예에 따른 3차원 섬유아세포집합체의 세포외기질 관련 유전자의 상대적 발현량을 나타낸 그래프이다.
도 3은 일 구체예에 따른 3차원 섬유아세포집합체의 콜라겐 함량을 히드록시프롤린 어세이로 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 4는 일 구체예에 따른 3차원 섬유아세포집합체의 콜라겐 타입 I 발현량을 면역 염색으로 측정한 결과를 나타낸 도면이다.
도 5는 일 구체예에 따른 3차원 섬유아세포집합체의 콜라겐 타입 I 발현량을 웨스턴 블랏팅으로 측정한 결과를 나타낸 도면이다.
도 6은 일 구체예에 따른 3차원 섬유아세포집합체의 MMP 1 발현량 및 분비량을 나타낸 그래프이다.
도 7은 일 구체예에 따른 3차원 섬유아세포집합체에 MMP1 저해제를 처리한 후의 세포의 MMP1 분비량을 나타낸 도면이다.
도 8은 MMP1 과발현을 유도하기 위해 자외선 조사된, 2차원에서 배양된 섬유아세포에 MMP1 저해제를 처리한 후의 세포의 MMP1 분비량을 나타낸 도면이다.
도 9는 일 구체예에 따른 3차원 섬유아세포집합체를 포함하는 약물 스크리닝 장치 및 그를 사용하여 약물을 스크리닝하는 방법을 도식화하여 나타낸 도면이다.
도 2는 일 구체예에 따른 3차원 섬유아세포집합체의 세포외기질 관련 유전자의 상대적 발현량을 나타낸 그래프이다.
도 3은 일 구체예에 따른 3차원 섬유아세포집합체의 콜라겐 함량을 히드록시프롤린 어세이로 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 4는 일 구체예에 따른 3차원 섬유아세포집합체의 콜라겐 타입 I 발현량을 면역 염색으로 측정한 결과를 나타낸 도면이다.
도 5는 일 구체예에 따른 3차원 섬유아세포집합체의 콜라겐 타입 I 발현량을 웨스턴 블랏팅으로 측정한 결과를 나타낸 도면이다.
도 6은 일 구체예에 따른 3차원 섬유아세포집합체의 MMP 1 발현량 및 분비량을 나타낸 그래프이다.
도 7은 일 구체예에 따른 3차원 섬유아세포집합체에 MMP1 저해제를 처리한 후의 세포의 MMP1 분비량을 나타낸 도면이다.
도 8은 MMP1 과발현을 유도하기 위해 자외선 조사된, 2차원에서 배양된 섬유아세포에 MMP1 저해제를 처리한 후의 세포의 MMP1 분비량을 나타낸 도면이다.
도 9는 일 구체예에 따른 3차원 섬유아세포집합체를 포함하는 약물 스크리닝 장치 및 그를 사용하여 약물을 스크리닝하는 방법을 도식화하여 나타낸 도면이다.
이하 본 발명을 실시예에 의해 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.
실시예 1: 인 비트로( In vitro ) 3차원 인공 진피 모델의 제조 및 그의 특성 분석
(1) 인 비트로 3차원 인공 진피 모델의 제조
인 비트로 3차원 인공 진피 모델을 제조하기 위해, 우선 섬유아세포를 배양하였다. 구체적으로, 인간 진피 섬유아세포를 조직 배양 플라스크를 사용하여 37 ℃, 5% CO2, 및 95% O2의 대기 조건에서 고 글루코오스 돌베코 변형 이글 배지(high glucose Dulbecco's modified Eagle's medium) (DMEM, 웰젠, 대구, 대한민국)로 배양하였다. 계대수 5의 인간 진피 섬유아세포를 모든 실험에 대하여 사용하였다.
이후, 섬유아세포의 3차원 배양을 위한 배양 용기는 하기와 같이 제작하였다. 비-조직세포 배양용 96-웰 플레이트(Non-Tissue Culture Treated 96-well Plate, "NTCP", 폴리스티렌 재질로 표면이 소수성을 띰, Falcon사)에 MBP(말토오즈 결합 단백질)-FGF(섬유아세포 성장인자) (20 ㎍/ml)를 상온에서 4시간 동안 코팅하였다. 다음으로, PBS로 3번 세척하여 결합하지 않은 MBP-FGF를 제거하였다. 상기 배양 용기에 대한 상세한 제조방법은 대한민국 공개특허 제10-2010-0122778호에 기재되어 있으며, 상기 문헌은 그 전체가 참조로서 본 명세서에 포함된다.
상기 배양 용기에 상기 섬유아세포를 파종하여 3차원 섬유아세포집합체를 제조하였다. 구체적으로, 1 웰 당 1.25x105cells/cm2의 농도로 섬유아세포를 섬유아세포성장 배지(FGM, Lonza) 중 상기 96 웰 플레이트에 파종하여 37℃에서 배양하였다. 섬유아세포가 배양 용기 표면에서 2차원적으로 배양되면서 탈착되고, 탈착 또는 이탈된 2차원 섬유아세포집합체가 배양 용기에서 부유된 상태로 계속해서 배양되어 24시간 이내에 3차원 섬유아세포집합체가 자발적으로 형성되었다. 형성된 3차원 섬유아세포집합체를 배양 1일째(1 day), 3일째(3 day) 및 5일째(5 day)에 각각 수집하였고, 접착성 섬유아세포의 3차원 섬유아세포집합체의 형성 과정을 위상차 현미경(Carl Zeiss, 독일)으로 관찰하였고, 그 결과를 도 1에 나타내었다. 이하에서 상기 3차원 섬유아세포집합체를 '3DCM'이라 표시한다.
또한, 비교예로서 상기 섬유아세포를 2차원적으로 배양하였다. 구체적으로, 조직세포 배양용 96-웰 플레이트(TCP)에 웰당 1.25x105cells/cm2의 지방줄기세포를 접종한 후 섬유아세포성장 배지(FGM, Lonza)에서 배양하였고, 상기 3차원 세포집합체와 동일하게 인공 진피 모델 특성 분석을 위해 배양 1일째(1 day), 3일째(3 day) 및 5일째(5 day)의 세포를 수집하였다. 이하에서 상기 2차원적으로 배양된 세포를 '2D'라 표시한다.
도 1은 일 구체예에 따른 3차원 섬유아세포집합체의 형성 과정을 현미경으로 관찰한 사진이다.
도 1에 나타낸 바와 같이, 육안으로 검출되는 400 내지 1000 ㎛ 이상 크기의 3차원 구형 세포집합체가 형성되었음을 확인할 수 있다.
(2) 인 비트로 3차원 인공 진피 모델의 특성 분석
상기에서 제작한 3차원 섬유아세포집합체의 인공 진피 모델로서의 특성을 분석하기 위해 하기의 실험을 수행하였다.
(2.1) 3차원 섬유아세포 집합체의
세포외기질
(
ECM
) 유전자 발현 분석
세포외기질 관련 유전자인 콜라겐, 피브로넥틴, 및 엘라스틴의 유전자 발현량을 분석하기 위해 qRT-PCR(Quantitative Real-Time Polymerase Chain Reaction)을 사용하였다.
구체적으로, 3DCM 및 2D로부터 총 RNA를 상이한 시간(1일째, 3일째, 및 5일째)에 Qiagen miniprep 키트(Qiagen Inc., 미국)를 사용하여 제조사의 지시에 따라 추출하였다. 추출된 RNA를 뉴클리아제-무첨가 물에 용해시키고, RNA 농도를 NanoDrop ND1000 분광광도계(Thermo Fisher Scientific)을 사용하여 정량화하였다. 상보적 DNA 합성은 Maxime RT PreMix(iNtRon, 대한민국)을 사용하여 제조사의 지시에 따라 수행하였다. 모든 타겟 프라이머 서열은 바이오니어(대한민국)으로부터 구입하였다. 모든 중합연쇄 반응은 ABI Prism 7500(Applied Biosystems)를 사용하여 수행하였고, 유전자 발현 수준은 SYBR Premix Ex Taq(TaKaRa, 일본)을 사용하여 정량화하였다. 상대적 유전자 발현 수준은 상대적 Ct 방법(comparative Ct method)을 사용하여 계산하였고, 그 결과를 도 2에 나타내었다.
도 2는 일 구체예에 따른 3차원 섬유아세포집합체의 세포외기질 관련 유전자의 상대적 발현량을 나타낸 그래프이다.
도 2에 나타낸 바와 같이, 콜라겐 타입 1 및 피브로넥틴은 2D에 비해 3DCM에서 발현량이 거의 3배 정도 낮음을 확인할 수 있고, 엘라스틴의 경우, 발현량이 2D에 비해 3DCM에서 증가되어 있는 것을 확인할 수 있다. 특히 엘라스틴의 경우, 배양 1일째에는 2D와 3DCM의 발현량이 유사하나, 배양 3일부터는 현저하게 증가되어 있는 것을 확인할 수 있다. 상기의 결과로, 일 구체예에 따른 3차원 섬유아세포집합체는 콜라겐 및 피브로넥틴의 발현이 감소되고, 엘라스틴의 발현 증가된 피부 진피의 환경을 모사하여 이들을 타겟으로 하는 물질의 개발에 유용하게 사용될 수 있음을 알 수 있다.
(2.2) 3차원 섬유아세포집합체의 콜라겐 발현량 분석
3차원 섬유아세포집합체의 콜라겐 분석하기 위해 히드록시프롤린 어세이(hydroxyproline assay), 면역 염색 및 웨스턴 블랏팅을 수행하였다.
구체적으로, 히드록시프롤린 어세이를 위해 RIPA 버퍼(Sigma-Aldrich)를 사용하여 상이한 시간(1일째, 3일째 및 5일째)에 2D, 및 3DCM(3 X 106 세포)를 수집하여, 120 ℃에서 3시간 동안 12 N HCl 용액으로 가수분해 하였다. 어세이는 히드록시프롤린 키트(Sigma-Aldrich)를 사용하여 제조사의 지시에 따라 수행하였다. 흡광도는 Multisakn(Thermo)를 사용하여 560 nm에서 측정하였고, 그 결과를 도 3에 나타내었다.
면역 염색을 위해 상이한 시간에 수집한 상기 3DCM 및 2D를 PBS로 세 번 세척하고, 30분 동안 4% PFA로 고정화하였다. 이후, OCT 화합물(optimal cutting temperature compound)(TISSUE-TEK￠c 4583; Sakura Finetek USA, Inc.)에 포매하고, -28 ℃에서 동결하고 6 ㎛ 두께로 잘라내었다. 비특이적인 결합을 피하기 위해, 절편을 상온에서 1시간 동안 BSA(4%)에서 인큐베이션하였다. 이후에, 4 ℃에서 콜라겐 I에 대한 1차 항체(Rabit, Abicam)로 하룻밤 동안 인큐베이션하였다. 이후에, 시료를 PBS로 세척하고, 1% BSA 내의 상응하는 형광 컨쥬게이트 2차 항체(Donkey anti-rabbit)(Life Technologies)로 1시간 동안 상온에 인큐베이션하였다. 또한, DAPI(4,5-디아미디노-2-페닐인돌)(Vector Laboratories)를 핵 염색을 위해 사용하였다. 대조군은 동일한 조건 하에서 1차 항체 없이 수행하였으며, 공초점 현미경(Carl Zeiss)으로 관찰하였고, 그 결과를 도 4에 나타내었다.
웨스턴 블랏팅을 위해 상기와 동일한 배양된 세포를 프로테아제 억제제 칵테일(protease inhibitor cocktail)과 함께 RIPA버퍼(Sigma-Aldrich)로 가용화하였다. 이후에 상기 용해물을 4 ℃에서 30분 동안 15,000 g에서 원심분리하였고, 2% SDS 및 5%(v/v) 2-머캅토에탄올을 함유하는 Laemmli 시료에 희석하였으며, 90 ℃에서 5분동안 가열하였다. 단백질을 10% 리졸빙 겔(resolving gel)의 사용과함께 SCD-폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE)로 분리하였고, 니트로셀룰로오스 막(Bio-Rad, 미국)에 옮겨 두었다. 상기 막을 콜라겐 타입 I(Colla1, Boster Bio CO. Ltd) 및 β-액틴(Santan Cruz Biotechnology)에 대한 1차 항체와 함께 4 ℃에서 하룻밤동안 인큐베이션하였다. 검출을 위해 상기 막을 상온에서 1시간동안 퍼옥시다아제-컨쥬게이트 항체(Santa Cruz Biotechnology)와 함께 인큐베이션하였다. 이미지 분석기(LSA3000, Fujifilm)로 화학발광 이미지를 형성하여 스캐닝을 수행하였고, 그 결과를 도 5에 나타내었다.
도 3은 일 구체예에 따른 3차원 섬유아세포집합체의 콜라겐 함량을 히드록시프롤린 어세이로 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 4는 일 구체예에 따른 3차원 섬유아세포집합체의 콜라겐 발현량을 면역 염색으로 측정한 결과를 나타낸 도면이다.
도 5는 일 구체예에 따른 3차원 섬유아세포집합체의 콜라겐 발현량을 웨스턴 블랏팅으로 측정한 결과를 나타낸 도면이다.
도 3 에 나타낸 바와 같이, 3DCM으로부터 분비된 총 콜라겐의 양은 배양 시간이 길어짐에 따라 증가함을 확인할 수 있고, 2D에 비해 감소되어 있는 것을 확인할 수 있다. 상기의 결과는 상기 실시예 (2.1)의 결과와 일치함을 알 수 있다.
또한, 도 4에 나타낸 바와 같이, 3DCM에서 배양 동안 콜라겐 타입 I 염색이 감소한 반면, 2D에서는 감소되지 않음을 확인할 수 있다. 상기의 결과는 콜라겐 타입 I이 3차원 배양 시스템 내에서 배양 동안 분해된 것을 나타낸다.
또한, 도 5에 나타낸 바와 같이, 도 3의 결과와 일치하게 3DCM에서 배양 동안 콜라겐 타입 I이 단편화 되는 반면, 2D에서는 그렇지 않음을 확인할 수 있다.
상기의 결과로 일 구체예에 따른 3차원 섬유아세포집합체는 콜라겐의 발현이 감소되어 있어, 콜라겐의 함량을 증가시키는 후보 물질의 스크리닝에 유용하게 사용될 수 있음을 알 수 있다.
(2.3) 3차원 섬유아세포집합체의
MMP
발현 분석
3차원 섬유아세포집합체의 매트릭스 메탈로프로테이나제(matrix metalloproteinase: MMP) 1의 발현 분석을 위해 RT-PCR을 수행하였다. RT-PCR은 상기 실시예 (2.1)과 동일한 방법으로 수행하였고, 그 결과를 도 6a에 나타내었다.
또한, 총 MMP-1의 분비량을 분석하기 위해, ELISA를 수행하였다. 구체적으로, 배양 배지를 정상 2D, 3DCM로부터 각 상이한 시간(1일째, 3일째, 및 5일째)에 제조하였다. 어세이는 Quantikine ELISA 인간 총 MMP 1 키트(R&D System)를 사용하여 제조사의 지시에 따라 수행하였다. 흡광도는 Multisakn(Thermo)를 사용하여 560 nm에서 측정하였고, 그 결과를 도 6b에 나타내었다.
도 6은 일 구체예에 따른 3차원 섬유아세포집합체의 MMP1 발현량 및 분비량을 나타낸 그래프이다.
도 6에 나타낸 바와 같이, 3DCM에서 MMP1 유전자의 발현량은 2D에 비해 현저하게 발현량이 증가되어 있음을 확인할 수 있다. 또한, ELISA 분석에서와 같이 MMP1의 분비량도 3DCM에서 2D에 비해 현저하게 증가되어 있음을 확인할 수 있다. 상기의 결과로, 일 구체예에 따른 3차원 섬유아세포집합체는 MMP의 발현이 현저하게 증가되어 있어 이를 타겟으로 하는 물질의 개발에 유용하게 사용될 수 있음을 알 수 있다.
(3) 3차원 섬유아세포집합체를 이용한
MMP
저해제의
저해능
평가
본 실시예에서는 상기 3차원 섬유아세포집합체가 MMP 저해제의 스크리닝에 사용가능한지 추가적으로 확인하기 위해, 기존에 알려진 MMP 저해제를 처리하여 MMP의 분비량을 확인하였다.
구체적으로, 상기 실시예 (1)에서 제작한 배양 1일째의 3차원 섬유아세포집합체에 섬유아세포 성장 배지 (Fibroblast Growth Media, FGM, Lonza사)에 희석된 레티노산 (retinoic acid) (10 mM), 아비에틴산 (Abietic acid) (100 mM), 변형성장인자-베타 1 (Transforming Growth Factor-b1, TGF-b1) (5 ng/ml)을 접종하였다. 이후에, 추가로, 2일, 및 4일간 37 ℃한 후, 정치배양기에서 배양한 뒤 배양액을 회수하여 기질금속단백분해효소-1 (matrix metalloproteinase-1, MMP1) 분비량을 측정하였다. 측정은 ELISA 키트 (R&D사)를 이용하여 정량하였고, 사용법은 공급사의 프로토콜을 따라 진행하였고, 그 결과를 도 7에 나타내었다.
3차원 섬유아세포집합체의 대조군으로, 2차원에서 배양된 섬유아세포를 이용한 MMP 저해제의 저해능 비교를 위해 자외선 B를 조사한 섬유아세포를 사용하였다. 구체적으로, 조직세포 배양용 6-웰 플레이트 (Tissue culture treated 6-well plate)에 2.5 X 105 세포/cm2 세포농도로 고농도 글루코즈 DMEM 배지에 현탁된 섬유아세포를 파종한 후, 37 ℃ 정치배양기에서 1일간 배양하였다. 그 후 PBS로 3회 반복 세척하고 무혈청 MEM배지를 넣어주고 37 ℃ 정치배양기에서 1 시간 동안 배양하였다. 그리고 PBS를 이용하여 3회 반복 세척한 뒤, MMP1 과발현을 유도하기 위해 자외선 B (20 mJ/cm2)를 조사하였다. 자외선 조사 후 섬유아세포성장배지(Fibroblast Growth Media, FGM, Lonza사)에 희석된 여러 농도의 레티노산 (2, 10, 40 mM), 아비에틴산 (20, 100, 400 mM), TGF-b1 (1, 5, 20, ng/ml)을 접종한 후, 추가로 2일간 37 ℃ 정치배양기에서 배양한 뒤 배양액을 회수하여 MMP1 분비량을 측정하였다. 측정은 ELISA 키트 (R&D사)를 이용하여 정량하였고, 사용법은 공급사의 프로토콜을 따라 진행하였고 그 결과를 도 8에 나타내었다.
도 7은 일 구체예에 따른 3차원 섬유아세포집합체에 MMP1 저해제를 처리한 후의 세포의 MMP1 분비량을 나타낸 도면이다.
도 8은 MMP1 과발현을 유도하기 위해 자외선 조사된, 2차원에서 배양된 섬유아세포에 MMP1 저해제를 처리한 후의 세포의 MMP1 분비량을 나타낸 도면이다.
도 7에 나타난 바와 같이, MMP1 저해제가 처리되지 않은 섬유아세포집합체의 경우, 배양 시간이 2, 4일 경과함에 따라 MMP1의 분비량이 각각 2.1배 2.4배 가량 증가하였다. 반면, 레티노산 및 아비에틴산을 처리한 섬유아세포집합체의 경우 대조군 대비 각각 80%, 81% 가량의 분비량을 보였으며, TGF-b1을 처리한 군의 분비량은 약 60% 가량으로 나타났다.
도 8에 나타난 바와 같이, 2차원에서 배양된 자외선B를 조사한 섬유아세포는 조사하지 않은 섬유아세포 대비 약 1.3배 가량 높은 MMP1 분비량을 보였다. 그러나 레티노산을 처리한 섬유아세포는 MMP1 분비량이 대조군 대비 약 30%로 감소되었고, TGF-b1 처리군과의 비교 시 처리량에 따라 25~35%로 감소됨을 보였다. 특히 아비에틴산을 처리한 섬유아세포는 20 mM 처리 시 약 절반 가량 분비량이 감소하였으나 100 mM 이상을 처리하였을 경우 대조군 대비 약 2%의 분비량을 보였다. 3DCM을 이용하여 평가한 결과와 비교하여 저해제 처리시 분비량이 감소하는 경향은 동일하다. 그러나, 2D의 MMP 저해제의 대조군 대비 감소폭은 3DCM과 비교하여, 레티노산 처리군은 2.7배, TGF-b1은 1.7 내지 2.4배, 아비에틴산은 1.7 내지 40배 높은 것으로 나타났다.
상기의 결과로 2D의 경우 약물에 대한 세포의 감도가 현저하게 높아 약물 스크리닝에는 적합하지 않음을 알 수 있고, MMP 저해제를 포함한 약물의 스크리닝에 3DCM이 유용하게 사용될 수 있음을 알 수 있다.
도 9는 일 구체예에 따른 3차원 섬유아세포집합체를 포함하는 약물 스크리닝 장치 및 그를 사용하여 약물을 스크리닝하는 방법을 도식화하여 나타낸 도면이다. 도 9를 참조하여 설명하면, 하나 이상의 웰을 갖는 웰 플레이트를 포함하고, 상기 웰에 하나 이상의 일 구체예에 따른 3차원 섬유아세포집합체가 파종된 약물 스크리닝 장치가 제공된다. 상기 3차원 섬유아세포집합체는 각 세포집합체당 3.0×105 내지 1.0×106 개의 세포를 포함할 수 있다. 또한 세포집합체의 직경은 300 내지 2000 ㎛일 수 있으며, 형상은 구형(스페로이드 포함), 또는 시트일 수 있다. 상기 약물, 즉 후보 물질에 대해서는 상기한 바와 같다. 상기 약물 스크리닝 장치의 각 웰에 후보 물질을 포함하는 용액을 주입하는 단계; 상기 후보 물질이 주입된 웰을 포함하는 웰 플레이트를 배양하는 단계; 상기 웰 플레이트로부터 상기 3차원 섬유아세포집합체를 수집하거나 또는 상기 웰 플레이트로부터 배양액을 회수하는 단계; 및 상기 수집된 섬유아세포로부터 어세이를 수행하거나 또는 상기 배양액으로부터 어세이를 수행하는 단계를 포함하는 약물 스크리닝 하는 방법이 제공된다. 상기 후보 물질은 동일하거나 상이한 후보 물질일 수 있다. 상기 배양은 통상의 기술자가 임의로 배양 시간 및 온도를 결정할 수 있다. 상기 어세이는 예를 들면, 상기 배양액으로부터 ELISA를 사용하는 MMP 분비 어세이, 또는 상기 3차원 섬유아세포집합체로부터 웨스턴블랏팅, 또는 면역조직화학염색을 사용하는 ECM 분비 어세이를 포함할 수 있다.
Claims (9)
- 소수성 표면을 갖고, 상기 소수성 표면에 섬유아세포와 결합하는 활성을 지닌 단백질이 코팅된 배양 용기 중의 액체 배지에서 섬유아세포를 배양하여, 상기 소수성 표면으로부터 섬유아세포가 이탈되어 형성된 섬유아세포집합체(fibroblast cluster)를 포함하는 배양물을 얻는 단계로서, 상기 섬유아세포에 결합하는 활성을 지닌 단백질은 섬유아세포와 섬유아세포 사이의 결합보다 더 약하게 섬유아세포와 결합하는 것인 단계; 및
상기 배양물로부터의 섬유아세포집합체를 적어도 12시간 동안 추가적으로 배양하는 단계를 포함하는 인 비트로 3차원 피부 진피 모델을 제조하는 방법으로서,
상기 적어도 12시간 동안 추가적으로 배양한 섬유아세포집합체는, 매트릭스 메탈로프로테아제(matrix metalloproteinase: MMP)의 발현 또는 활성이 증가되어 있는 것이고,
상기 MMP의 발현 또는 활성을 변화시키는 물질을 스크리닝 하기 위한 것인, 방법. - 청구항 1에 있어서, 상기 섬유아세포에 결합하는 활성을 가진 단백질은 섬유아세포의 세포막에 존재하는 인테그린(integrin)과 결합하지 않는 것인 방법.
- 청구항 1에 있어서, 상기 적어도 12시간 동안 추가적으로 배양한 섬유아세포집합체는 추가적으로,
콜라겐 또는 피브로넥틴의 발현 또는 활성이 감소되어 있거나, 또는 엘라스틴의 발현 또는 활성이 증가되어 있는 것이고, 상기 콜라겐, 피브로넥틴, 또는 엘라스틴, 및 MMP의 발현 또는 활성을 변화시키는 물질을 스크리닝하기 위한 것인, 방법. - 청구항 1에 있어서, 상기 배양물로부터의 섬유아세포 집합체를 추가적으로 배양하는 단계는 1일 내지 5일간 배양하는 것인, 방법.
- 삭제
- 삭제
- 청구항 1의 방법에 의해 제조된 인 비트로 3차원 피부 진피 모델에 피검 물질을 처리하는 단계;
상기 피검 물질이 처리된 인 비트로 3차원 피부 진피 모델의 MMP의 발현 또는 활성의 수준을 측정하는 단계;
측정된 MMP의 발현 또는 활성의 수준을 무처리 대조군의 수준과 비교하는 단계; 및
대조군에 비하여 MMP의 발현 또는 활성을 감소시킨 물질을 선별하는 단계를 포함하는 MMP의 발현 또는 활성을 감소시키는 물질을 스크리닝하는 방법. - 청구항 7에 있어서, 상기 MMP의 발현 또는 활성을 감소시키는 물질은 피부 섬유아세포 수 또는 기능의 감소, 피부 콜라겐 감소, 또는 수분 손실에 의한 피부 노화 개선제, 염증성 질환, 관절염, 또는 암 치료제인 것인 방법.
- 청구항 7에 있어서, 상기 MMP의 발현 또는 활성 수준의 측정은 역전사 중합효소 연쇄반응(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction, RT-PCR), 효소면역분석법(ELISA), 면역조직화학, 웨스턴 블롯(Western Blotting) 면역침강(immunoprecipitation), 면역형광법(immunofluorescence) 및 유세포 분석법(FACS)으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나로 측정하는 것인 방법.
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