KR101919930B1 - 인 비트로 3차원 세포 배양 모델, 이의 제조 방법 및 이를 이용한 스크리닝 방법 - Google Patents

인 비트로 3차원 세포 배양 모델, 이의 제조 방법 및 이를 이용한 스크리닝 방법 Download PDF

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Abstract

3차원 세포 클러스터를 포함하는 인 비트로 3차원 암 전이 모델, 이의 제조방법 및 이를 이용한 스크리닝 방법은 생체 내 종양 미세 환경과 유사한 환경을 제공하여 암 전이에 대한 연구와 암 치료제 개발에 유용하게 이용될 수 있다.

Description

인 비트로 3차원 세포 배양 모델, 이의 제조 방법 및 이를 이용한 스크리닝 방법{In vitro 3D cell culture model, method for preparing thereof and method for screening using the same}
3차원 세포 클러스터, 이를 포함하는 인 비트로 3차원 암 전이 모델, 이들의 제조방법 및 이들을 이용한 암 치료제 또는 암 전이 억제제를 스크리닝하는 방법에 관한 것이다.
암의 전이는 다른 기관 내의 결합 조직 및 혈관 성분 및 여러 세포들의 상호작용에 의한 매우 복잡한 현상이며, 암세포의 침투 및 전이로 인한 사망이 암으로 인한 사망의 약 90%를 차지한다.
통상적인 세포 배양 시스템은 2차원이지만, 인간 신체 내의 고형 종양을 포함하는 자연적인 환경은 3차원(3D)이며, 암세포는 그 3D 매트릭스에서 성장한다. 또한, 유전적 요인 및 세포외 환경 요인으로 인한 암세포의 물리적 특성들이 다른 조직 및 기관으로의 침투와 전이에 영향을 미친다. 예를 들면, 콜라겐 침착에 의해 강성도가 높게 형성된 매트릭스는 암세포의 증식 및 침투를 증가시킬 수 있다. 또한 전단 흐름(shear flow)은 순환 종양 세포의 혈관 내 주입(intravasation) 및 혈관 외 유출(extravasation) 중에 영향을 미친다. 이처럼 암세포의 양태는 그들의 미세환경 내 기질 세포(stromal cell)에 의존적이고, 종양-미세 환경(tumor microenvironment)은 종양의 발생, 진행 및 치료에 대한 반응성 모두에 영향을 미치는 중요한 요소이다.
그러나 침투성 및 전이성 암을 연구하기 위한 3차원 종양 미세환경 연구 모델 개발은 여전히 미흡한 실정이다.
일 양상은 3차원 세포 클러스터 및 이의 제조방법을 제공한다.
다른 양상은 3차원 세포 클러스터를 포함하는 인 비트로 3차원 세포 배양 모델 및 이의 제조방법을 제공한다.
다른 양상은 3차원 세포 클러스터를 이용한 암 치료제 또는 암 전이 억제제를 스크리닝하는 방법을 제공한다.
일 양상은 암세포 및 혈관 세포로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 세포와 기질 세포를 배양 용기에 접착시켜 배양하는 단계; 상기 세포들이 배양 용기로부터 탈착되어 세포-세포간 상호 작용에 의한 3차원 세포 클러스터(cell cluster)를 형성하는 단계; 및 상기 탈착된 세포 클러스터를 수득하는 단계를 포함하는 3차원 세포 클러스터 및 이를 포함하는 인 비트로 3차원 세포 배양 모델의 제조 방법을 제공한다.
다른 양상은 암세포 및 혈관 세포로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 세포와 기질 세포를 포함하는 3차원 구조의 세포 클러스터 및 이를 포함하는 인 비트로 3차원 세포 배양 모델을 제공한다.
상기 배양 용기는 대한민국 등록 특허 제 1109125호에 기재된 방법에 따라 제조된 것일 수 있으며, 상기 문헌은 그 전체가 참조로서 본 명세서에 포함된다.
용어 "세포 클러스터(cell cluster)" 또는 "3차원 세포 클러스터" ('세포 조직체' 또는 '세포 클러스터'와 호환적으로 사용됨)는 2 이상의 세포가 밀집된 상태를 말하며, 조직 상태일 수도 있고, 단일 세포 상태일 수도 있다. 각각의 세포 클러스터는 조직 자체 또는 일부, 또는 단일 세포의 클러스터로 존재할 수 있으며, 기질 세포로부터 분화된 세포 유사-조직체를 포함할 수 있다. 또한, 용어 "3차원(three-dimension)"은 2차원이 아닌 기하학적인 3개의 파라미터(예를 들면, 깊이, 넓이, 높이 또는 X, Y, Z 축) 모델을 갖는 입체를 의미할 수 있으며, 따라서 일 구체예에 따른 암세포 및 혈관세포로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 세포와 기질 세포로부터 분화된 세포 클러스터는 3차원 배양, 즉 배양 용기에서 탈착되어 부유상태로 배양되어 세포가 증식함에 따라 입체적으로 구형, 시트(sheet) 또는 그와 유사한 3차원의 형태(예를 들면, 유사 조직체)를 갖는 세포 클러스터를 의미할 수 있다. 또한 3차원 세포 클러스터는 일반적인 세포 클러스터와 같이 세포의 단일층으로 형성된 세포 클러스터가 아닌, 세포의 다층 또는 구형 등으로 형성된 것인 세포 클러스터를 의미할 수 있다. 또한 일 구체예에 따른 세포 클러스터는 조직공학기술로 인공적인 3차원 다공성 세포외기질, 예를 들면, 시트, 하이드로겔, 막, 스캐폴드 등과 같은 합성 고분자 혹은 천연 고분자 지지체를 사용할 필요 없이, 그 자체로서 3차원 세포 클러스터가 형성되는 것을 의미할 수 있으며, 상기 조직공학기술은 세포가 아닌 매트릭스가 3차원인 것으로 일 구체예에 따른 3차원 세포 클러스터와는 구별된다. 상기 세포 클러스터는 직경이 300 ㎛ 이상, 예를 들면 300 내지 2000 ㎛, 400 내지 1500 ㎛, 400 내지 1000 ㎛ 일 수 있다.
상기 암세포는 상업적으로 구매 가능한 암 세포주 또는 암 환자로부터 용이하게 얻을 수 있는 세포일 수 있으며, 폐암, 간암, 위암, 대장암, 결장암, 췌장암, 피부암, 방광암, 전립선암, 유방암, 난소암, 자궁경부암, 갑상선암, 신장암, 섬유육종, 흑색종 및 혈액암 세포일 수 있다. 상기 암세포는 전이성 암세포일 수 있다.
상기 기질 세포는 지방 줄기세포 또는 중간엽 줄기세포일 수 있다. 상기 기질 세포는 인간 지방조직으로부터 분리된 것일 수 있다. 적합한 인간 지방조직은 성숙한 지방세포와 이를 둘러싼 결체조직을 포함하는 것을 의미할 수 있다. 개체의 체내 위치에 상관없이 지방을 채취할 때 사용되는 모든 방법에 의하여 수득되는 모든 지방조직을 사용할 수 있으며, 예를 들면, 피하 지방조직, 골수 지방조직, 장간막 지방조직, 위장 지방조직, 또는 후복막 지방조직을 포함할 수 있다.
상기한 인간 지방조직으로부터 지방 줄기세포는 공지의 방법에 의해 분리될 수 있다. 예를 들어, 국제특허공개 제WO2000/53795호 및 제WO2005/04273호에 개시된 바와 같이, 지방조직으로부터 지방흡입(liposuction), 침강, 콜라게나제(collagenase) 등의 효소처리, 원심분리에 의한 적혈구 등의 부유세포 제거 등의 과정을 통하여 획득할 수 있다.
상기와 같이 분리된 지방 줄기세포 또는 중간엽 줄기세포는 수차례의 계대배양에도 계대수(passage number)가 16에 이르기까지 우수한 증식율을 나타낸다. 따라서 인간 지방조직으로부터 분리된 다분화능 지방 줄기세포 또는 중간엽 줄기세포는 이후의 3차원 세포접합체 형성에 1 계대 배양된 세포를 그대로 사용하거나, 60% 조밀도(confluency)에서 10 계대 이상 배양된 세포를 사용할 수 있다.
상기 배양 용기는 용기 표면-세포 접착력이 세포-세포 접착력보다 낮아 상기 세포들의 밀도가 증가함에 따라 상기 세포들이 배양 용기로부터 탈착될 수 있는 것일 수 있다. 상기 배양 용기는 세포와의 비-인테그린(non-integrin) 접착으로 결합할 수 있는 물질을 포함하는 재료로 제조된 것이거나, 또는 상기 물질로 코팅된 것일 수 있다. 상기 배양 용기는 통상적인 세포 배양 용기에 소수성을 부여하는 고분자로 표면 처리되거나 그러한 고분자로 제조된 세포 배양 용기일 수 있다. 이러한 소수성 고분자로는 폴리스티렌(polystyrene: PS), 폴리메틸메타크릴레이트(PMMA), 폴리에틸렌 테레프탈레이트(PET), 폴리비닐클로라이트(PVC), 폴리에틸렌(PE), 폴리프로필렌(PP), 폴리테트라플루오르에틸렌(PTFE), 지방족 폴리에스테르계 고분자로서, 폴리(L-락트산)(PLLA), 폴리(D,L-락트산）(PDLLA), 폴리(글리콜산)(PGA), 폴리(카프로락톤)(PCL), 폴리(하이드록시알카노에이트), 폴리다이옥산온(PDS), 폴리트라이메틸렌카보네이트 중에서 선택된 1종이거나, 또는 이들 단위들의 공중합체인 폴리(락트산-co-글리콜산)(PLGA), 폴리(L-락트산-co-카프로락톤)(PLCL), 폴리(글리콜산-co-카프로락톤)(PGCL), 또는 이들의 유도체 등을 예로 들 수 있다. 또한 배양 용기는 소수성 표면으로 실란화된 표면(silanized surface), 탄소나노튜브(CNT) 표면, 탄화수소 코팅된 표면(hydrocarbon coated surface), 또는 금속(예컨대, 스테인레스 스틸, 티탄, 금, 백금 등) 표면을 갖는 것일 수 있다.
또한, 본 발명의 다른 구체예에 있어서, 기질 세포와 소수성 배양 용기 표면과의 상호작용에 의한 물리적 흡착보다 효과적으로 세포를 배양 용기에 접착시키기 위해, 기질 세포에 접착활성을 갖는 성장인자를 배양 용기 표면에 고정시킨 후 고정된 성장인자와 세포와의 생화학적 상호작용을 이용할 수 있다.
상기 성장인자는 세포에 접착활성을 갖는 것을 포함할 수 있으며, 이러한 성장인자와 세포의 결합은 비-인테그린 접착일 수 있다. 상기 성장인자의 예로는 혈관내피 성장인자(VEGF), 섬유아세포 성장인자(FGF), 표피 성장인자(EGF), 혈소판-유도 내피 성장인자(PDGF), 간세포 성장인자 (HGF), 인슐린 유사 성장인자 (IGF), 또는 헤파린 결합 도메인 (HBD) 또는 이들의 세포 접착 활성을 갖는 단편 등을 포함할 수 있다. 상기 성장인자는 5 내지 100 ㎍/㎖의 농도로 배양 용기 표면에 고정될 수 있다.
상기 용어 "섬유아세포성장인자(Fibroblast growth factor, FGF)"는 성장 인자의 한 종류로, 섬유아세포를 자극하여 증식성을 유도하는 성장인자를 의미할 수 있다. 섬유아세포성장인자는 헤파린 결합(heparin-binding) 단백질로, 상기한 바와 같이 섬유아세포의 헤파란 설페이트 프로테오글리칸과 상호작용을 할 수 있다. FGF는 22개의 종류를 포함할 수 있으며, 예를 들면, FGF 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 또는 22를 포함할 수 있다. 상기 FGF의 종류는 이름이 다를지라도, 통상의 당업자가 동일한 단백질을 의미하는 것으로 인식될 수 있다면 모두 포함할 수 있다. 예를 들면, FGF 11, 12, 13 및 14는 "iFGF" 라고도 알려져 있으며, FGF 15는 "FGF 15/19" 라고도 알려져 있다. 또한, 예를 들면, FGF 1 또는 FGF 2는 "헤파린 결합 성장인자 1(heparin-binding growth factor 1: HBGF-1)" 또는 "헤파린 결합 성장인자 2(heparin-binding growth factor 2: HBGF-2)"를 포함할 수 있다.
배양 용기 표면에 대한 성장인자의 고정화는 폴리펩티드를 고체 기질(matrix) 표면에 고정하는데 이용되는 것으로 당해 기술분야에 공지된 방법에 의해 달성될 수 있는데, 물리적인 흡착, 비선택적인 화학반응에 의한 공유결합 등을 이용할 수 있다. 이러한 고정화 방법의 예로는, 단백질에 비오틴(biotin)을 결합시킨 후, 이 단백질을 스트렙타비딘(streptavidin)이나 아비딘(avidin)으로 처리된 고체 표면에 적용시킴으로써 비오틴-스트렙타비딘/아비딘 결합을 이용하여 단백질을 고정하는 방법; 플라즈마를 이용하여 기판 위에 활성기(화학결합에 의해 단백질을 고정하기 위한 화학적 작용기)를 집적시켜 단백질을 고정하는 방법; 고체 기판 표면에 졸-겔(sol-gel)법을 이용하여 비표면적이 충분히 증가된 다공성 졸-겔 박막을 형성한 후에, 상기 다공성 박막에 물리적인 흡착에 의해 단백질을 고정하는 방법; 플라즈마 반응에 의하여 폴리테트라플루오로에틸렌(PTFE) 표면에 항혈전성 단백질을 고정하는 방법; 양이온성 아미노 잔기가 2개의 효소에 2개 이상 연속적으로 융합된 효소를 결합시켜 단백질을 고정하는 방법; 기질을 이용하여 고체상 지지대에 결합되어 있는 소수성 고분자 층에 단백질을 고정하는 방법; 플라스틱 표면에서 완충성분을 이용하여 단백질을 고정하는 방법; 알코올 용액에서 소수성 표면을 가지는 고체 표면에 단백질을 접촉시켜 단백질을 고정하는 방법 등이 알려져 있다.
일 구체예에 있어서, 재조합적으로 대량 발현 및 용이한 정제가 가능한 폴리펩티드 링커를 사용하여 상기 폴리펩티드 링커의 카르복실 말단에 성장인자의 아미노 말단이 융합되어 있는 폴리펩티드 링커-성장인자 재조합 단백질 형태로 고정화를 수행할 수 있다. 상기 폴리펩티드 링커는 그의 카르복실 말단을 통해 성장인자의 아미노 말단과 결합하고 그의 아미노 말단에 존재하는 소수성 도메인을 통해 소수성 표면을 갖는 배양 용기에 흡착할 수 있는 것으로서, 재조합적으로 대량 발현 및 용이한 정제가 가능하고 줄기세포의 배양에 영향을 미치지 않는 것을 포함할 수 있다. 이러한 폴리펩티드 링커로는 말토스 결합 단백질(maltose-binding protein, MBP), 히드로포빈(hydrophobin), 또는 소수성 세포 투과성 펩티드(hydrophobic cell penetrating peptide, CPP) 등을 포함할 수 있다.
MBP(NCBI GenBank Accession No. AAB59056)는 대장균(Escherichia coli)의 세포막을 가로질러 원형질막공간에 위치하며 세포 내로 말토오스나 말토덱스트린(maltodextrin)과 같은 당류의 이동에 관여하는 막 주변(periplasm) 단백질을 의미할 수 있다. MBP는 유용한 외래 단백질을 재조합 단백질 형태로 생산하기 위해 주로 이용되는데, 세포 내의 유전자 malE로부터 해독되어 만들어지고, 클로닝된 malE 유전자의 하부 (downstream)에 외래 단백질의 유전자를 삽입하여 세포 내에서 발현시키면 2개의 단백질이 결합한 재조합 단백질을 손쉽게 대량으로 생산할 수 있다. 특히, 발현시키고자 하는 단백질의 크기가 작거나 다른 숙주세포 내에서는 그 안정성이 떨어지는 외래 단백질인 경우, 이와 같이 MBP를 이용하여 재조합 단백질 형태로 세포 내에서 발현시키는 것이 유리할 수 있다. 이처럼 malE 유전자가 결합된 유전자로부터 발현되는 외래 단백질은 MBP가 말토오스에 결합 친화력을 갖는다는 특성을 이용하여 분리할 수 있다. 예를 들어, 말토오스가 다중화된 형태인 아밀로스(amylose)가 코팅된 수지와 세포 파쇄액을 반응시키고, 반응시킨 수지를 수차례 세척하여 오염된 다른 단백질을 제거한 후, 고농도의 말토오스를 첨가하여 경쟁시킴으로써 원하는 단백질만을 간단하게 용출시킬 수 있다.
상기 MBP-세포 접착 분자(예를 들면, 성장인자)의 재조합 단백질은 당업계의 통상적인 화학적 합성 또는 유전자 재조합 기술 등을 이용하여 제조하거나, 이를 발현하는 형질전환 세균을 적절한 조건 하에서 배양한 후 배양액으로부터 재조합 단백질을 회수함으로써 수득될 수 있다. 이와 같이 수득된 MBP-세포 접착 분자 재조합 단백질을 소수성 표면을 갖는 배양 용기에 고정시키는 과정은 특별한 처리를 요구하지 않고 재조합 단백질에서 폴리펩티드 링커의 아미노 말단에 위치한 소수성 도메인을 이용한 소수성 표면과의 물리적 흡착에 의해 자발적으로 이루어질 수 있다.
상기 기질 세포는 1× 104 내지 1× 105 세포/㎠의 농도로 배양 용기에 파종될 수 있다. 또한 상기 배양 온도는 35 ℃내지 38.5 ℃일 수 있으며, 배양 기간은 1 내지 7일일 수 있다. 상기 배양에 적합한 배지는 기질 세포의 배양 및/또는 분화에 통상적으로 사용되는 배지로서 혈청 혹은 무혈청을 함유한 것이면 어느 것이나 제한 없이 사용될 수 있으며, 예를 들면 DMEM(Dulbeco's modified eagle medium), Ham's F12, 이들의 혼합물 등에 혈청을 첨가한 배지를 사용할 수 있다.
상기와 같이 준비된 기질 세포를 표면이 소수성을 띠는 배양 용기에 접종하여 배양하면, 배양 용기의 소수성 표면으로 인해 기질 세포와 배양 용기 사이에 세포-매트릭스(cell-matrix)간 상호작용이 이루어져 물리적 흡착에 의해 기질 세포가 배양 용기 표면에 접착된 상태로 증식하게 된다. 이후 높은 세포 밀도에서 세포-세포간 상호작용이 세포-매트릭스간 상호작용보다 더 강해지게 되면, 증식된 기질 세포가 배양 용기 표면으로부터 탈착되어 3차원 세포 클러스터를 형성할 수 있다. 이때 암세포 및/또는 혈관 세포를 상기 기질 세포와 함께 배양하면, 암세포 및 혈관 세포의 소수성 표면에 대한 낮은 부착성에도 불구하고 기질 세포와의 세포-세포 상호작용에 의해 기질 세포와 함께 3차원 세포 클러스터를 형성할 수 있다. 도 1은 상기 3차원 세포 클러스터의 형성을 나타내는 도식도이다.
또한, 상기 세포-세포 사이의 접착, 상호작용 또는 결합보다 세포-접착 분자(예를 들면, 섬유아세포에 결합하는 활성을 가진 단백질) 사이의 접착, 상호작용 또는 결합이 더 약하게 유도될 수 있도록 하는 방법은 섬유아세포와 매트릭스(예를 들면, 배양 용기의 표면) 사이의 접착, 상호작용 또는 결합을 약화시키는 물질을 처리함으로써 유도될 수 있다.
일 구체예에 있어서, 표면이 소수성을 띠어 이에 대한 세포접착이 상대적으로 약하게 일어나는 배양 용기로서 폴리스티렌으로 제조된 비-조직세포 배양용 플레이트(non-tissue culture plate; NTCP)에 기질 세포를 접종하여 3차원 세포클러스터의 형성을 유도할 수 있다. 폴리스티렌 NTCP에 접종된 기질 세포는 초기에 세포-매트릭스간 상호작용에 의해 플레이트 표면에서 약한 세포접착이 유도되어 접착된 상태로 2차원 단층으로 증식하다가 배양시간이 경과함에 따라 세포의 밀도가 높아지면 세포-매트릭스간 상호작용보다 세포-세포간 상호작용이 더 강하게 작용하여 2차원 단층 배양된 세포들이 배양 용기 표면에서 탈착된다. 이때 초기에는 기질 세포가 배양 용기 표면에 접착된 상태로 배양될 수 있으며, 초기부터 세포접착이 일어나지 않고 부유된 상태로 배양되면 형성되는 3차원 세포클러스터의 크기가 작고 대부분의 세포가 사멸되는 현상을 나타낼 수 있다. 배양 용기로부터 탈착된 세포를 배양액 내에 부유된 상태로 더 배양하게 되면 세포-세포간 상호작용에 의해 세포들이 서로 응집되면서 3차원 세포클러스터가 형성될 수 있다. 이렇게 형성되는 3차원 세포클러스터는 초기에는 세포들이 약하게 결합되어 있으나 배양시간이 경과함에 따라 세포-세포간 상호작용에 의해 세포 클러스터를 형성하고 있는 세포들 사이의 접착력이 강화되어 조밀한(compact) 3차원 세포 클러스터를 형성하게 된다.
상기와 같이 배양 용기 표면에 줄기세포를 접착시켜 배양하여 형성된 3차원 세포 클러스터는 육안으로 검출가능한 크기, 예를 들면, 300 ㎛ 내지 2000 ㎛의 직경을 가지고 있어 여과 또는 원심분리 등의 방법에 의해 용이하게 회수할 수 있다. 이렇게 회수된 3차원 세포 클러스터는 콜라게나제, 트립신 또는 디스파제(dispase)를 이용한 효소학적 처리, 압력을 이용한 기계적인 처리, 또는 이들의 병용 처리에 의해 클러스터 형태를 와해시켜 단일 세포 형태로 사용하거나, 3차원 세포 클러스터 형태 그대로 사용할 수 있다.
상기 암세포 또는 혈관 세포와, 기질 세포의 비율은 3차원 세포클러스터 형태를 형성할 수 있는 임의의 비율일 수 있다. 상기 상기 암세포 또는 혈관 세포와, 기질 세포의 비율은 1:0.5 내지 1:4, 1:1 내지 1:3, 1:1 내지 1:2 또는 이들 비율 사이의 모든 값일 수 있다.
또한, 상기 세포 클러스터는 지지체로 캡슐화되어(encapsulated) 있는 것일 수 있다. 상기 지지체는 생체 내에서 일정 기간 후 자발적으로 서서히 분해되는 것일 수 있다. 상기 지지체는 생체적합성, 혈액친화성, 항석회화 특성, 세포의 영양성분 및 세포간 기질 형성능 중에서 하나 이상의 특성을 갖춘 고분자를 포함할 수 있다. 이러한 지지체는 피브린, 콜라겐, 젤라틴, 키토산, 알지네이트, 히알루론산, 덱스트란, 폴리락트산, 폴리글리콜산(poly(glycolic acid), PGA), 폴리(락트산-co-글리콜산)(poly(lactic-co-glycolic acid), PLGA), 폴리-ε-(카프로락톤), 폴리안하이드리드, 폴리오르토에스테르, 폴리비닐알코올, 폴리에틸렌글리콜, 폴리우레탄, 폴리아크릴산, 폴리-N-이소프로필아크릴아마이드, 폴리(에틸렌옥사이드)-폴리(프로필렌옥사이드)-폴리(에틸렌옥사이드) 공중합체, 이들의 공중합체, 이들의 혼합물 등이 사용될 수 있다. 이때 복합 지지체 중의 상기 고분자의 함량은 지지체의 성형의 관점 또는 세포클러스터의 적재의 관점에서 5 내지 99 중량%인 것일 수 있다. 상기 복합 지지체는 기존의 공지된 방법, 예를 들어, 염 침출법(solvent-casting and particle-leaching technique), 가스발포법(gas forming technique), 고분자 섬유를 부직포로 만들어 고분자 메쉬(mesh)로 제조하는 방법(fiber extrusion and fabric forming process), 상분리법(thermally induced phase separation technique), 유화 동결 건조법(emulsion freeze drying method), 고압 기체 팽창법(high pressure gas expansion) 등에 따라 고분자를 성형하여 제조할 수 있다.
상기 지지체의 전단 계수(shear modulus)는 종양의 전단 계수와 유사한 값을 가질 수 있다. 상기 지지체의 전단 계수는 1200 내지 6000 Pa, 1800 내지 5400 Pa 및 2400 내지 4800 Pa일 수 있다.
체내의 3D 매트릭스의 강성도는 세포의 성장 또는 분화에 있어서 매우 중요한 요소이다. 게다가, 암세포 주변 미세환경에 따라 세포-세포 및 세포-매트릭스 부착에서의 이동 및 변화를 포함하는 세포 기능 및 조직의 온전성이 조절된다. 특히, 암 주변 조직의 탄성도 및 강성도는 암의 생물학적 특성에 관계가 있다. 따라서, 상기 세포 클러스터를 캡슐화하는 지지체의 강성도 또는 탄성도에 따라서, 다양한 암 미세 환경 내의 암의 진행 속도에 대한 3차원 세포 배양 모델을 제공할 수 있다.
상기 지지체는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 및 8 mg/mL 이상의 농도이거나 12, 11, 10, 9, 8, 7 및 6 mg/mL 이하의 농도일 수 있다. 상기 지지체의 농도에 따라 지지체의 강성도 또는 탄성도가 변화하므로, 이를 조절하여 다양한 강성도 또는 탄성도의 생체 유사 미세환경을 갖는 3차원 세포 배양 모델을 제공할 수 있다.
상기 지지체는 생체 유사 미세환경을 제공하기 위해 지지체 내에 인공 혈관 등이 형성되어 있는 것일 수 있다.
상기 3차원 세포 배양 모델이 암세포를 포함하는 경우 체내와 매우 유사한 3D 환경에서의 암 세포의 증식 양상을 관찰할 수 있으므로, 3차원 암 세포 배양 또는 3차원 암 전이 모델로서 유용하게 이용될 수 있다.
다른 양상은 암세포 및 기질 세포를 포함하는 3차원 구조의 세포 클러스터에 피검 물질을 접촉시키는 단계; 상기 피검 물질과 접촉한 세포 클러스터에서 세포의 이동성을 측정하는 단계; 상기 측정된 세포의 이동성을 피검 물질을 접촉시키지 않은 대조군의 이동성과 비교하는 단계; 및 상기 대조군의 이동성과 비교하여 피검 물질이 상기 세포 클러스터의 암세포의 이동성 또는 증식을 저해시킨 물질을 선별하는 단계를 포함하는 암 치료제 또는 암 전이 억제제를 스크리닝하는 방법을 제공한다.
상기 스크리닝하는 방법에 있어서, 상기 피검 물질은 저분자 화합물, 항체, 안티센스 뉴클레오티드, 작은 간섭 RNA(short interfering RNA), 짧은 헤어핀 RNA(short hairpin RNA), 핵산, 단백질, 펩티드, 기타 추출물 및 천연물로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.
상기 피검 물질을 처리하는 단계는 상기 암세포 및 기질 세포를 포함하는 3차원 구조의 세포 클러스터와 피검 물질을 접촉시키는 단계를 포함할 수 있다. 상기 접촉은 예를 들면, 하나 이상의 상기 3차원 구조의 세포 클러스터가 포함되어 있는 각 웰에, 일정 농도의 피검 물질을 포함하는 용액을 주입하는 단계를 포함할 수 있다.
용어 "이동성"은 세포 클러스터의 세포가 클러스터로부터 주변 조직, 매트릭스 또는 지지체를 향해 이동하는 이동 활성을 의미할 수 있다. 세포의 이동성은 세포들의 최초 위치와 일정한 시간이 지난 뒤의 상대적 영역 또는 거리를 현미경으로 측정함으로써 측정할 수 있다. 또는 세포 클러스터의 전체적인 형태(morphology)의 변화를 관찰함으로써 세포의 이동성을 측정할 수 있다. 상기 세포의 이동성을 측정하기 위해 세포 염색이 가능하고, 살아있는 세포 또는 죽은 세포 모두 염색할 수 있다. 세포 염색은 당업계에 알려진 방법에 따라 투과화(permeabilization), 고정(fixation) 또는 봉입(mounting) 단계를 더 포함할 수 있다. 세포 염색에 사용되는 시약은 비스마르크 브라운, 카르민, 쿠마시 블루, 크리스탈 바이올렛, DAPI, 에오신, 에티디움 브로마이드, 푹신(fuchsin), 헤마톡실린, 호크스트 염색, 이오딘, 말라키트 그린, 메틸렌 블루, 뉴트럴/톨루일렌 레드, 나일 블루, 나일 레드/나일 블로 옥사존, 오스미움 테트록시드, 로다민, 사프라닌을 포함한다.
세포 염색은 당업계에 알려진 방법에 따라 세포 표면에 알려진 항원에 대한 항체를 이용하는 면역적 분석 방법을 이용하여 수행할 수 있다. 상기 면역적 분석 방법은 웨스턴블랏팅, ELISA (enzyme linked immunosorbent assay), 방사선 면역분석 (Radioimmunoassay, RIA), 방사 면역 확산법 (radioimmunodiffusion), 오우크테로니 (Ouchterlony) 면역 확산법, 로케트 (rocket) 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법 (Immunoprecipitation Assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), FACS, 질량분석, 자석비드-항체 면역 침강법, 단백질 칩 (protein chip), 또는 그 조합을 포함한다.
상기 측정된 세포의 이동성을 피검물질 무처리 대조군의 수준과 비교하여, 대조군에 비하여 증식 또는 이동성을 감소시킨 물질을 세포 증식 또는 이동성 억제제 물질 또는 후보 물질로 선별할 수 있다. 상기 세포의 증식 또는 이동성을 감소시키는 물질 또는 후보 물질은 암 치료제 또는 암 전이 억제제일 수 있다.
다른 양상은 암세포 및 기질 세포를 포함하는 3차원 구조의 세포 클러스터에 피검 물질을 접촉시키는 단계; 상기 피검 물질과 접촉한 세포 클러스터에서 세포의 CD44, 피브로넥틴 및 CXCR4로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계; 상기 측정된 유전자의 발현 수준을 피검 물질을 접촉시키지 않은 대조군의 동일한 유전자의 발현 수준과 비교하는 단계; 및 상기 대조군의 동일한 유전자의 발현 수준과 비교하여 피검 물질이 처리된 세포 클러스터의 세포의 상기 유전자의 발현 수준을 변화시킨 물질을 선별하는 단계를 포함하는 암 치료제 또는 암 전이 억제제를 스크리닝하는 방법을 제공한다.
상기 CD44, 피브로넥틴 또는 CXCR4의 발현 또는 활성 수준의 측정은 역전사 중합효소 연쇄반응(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction, RT-PCR), 효소면역분석법(ELISA), 면역조직화학, 웨스턴 블롯(Western Blotting) 면역침강(immunoprecipitation), 면역형광법(immunofluorescence) 및 유세포 분석법(FACS)으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나로 측정하는 것일 수 있다. 또한 상기 CD44, 피브로넥틴 또는 CXCR4의 발현 또는 활성 수준의 측정은 배양액 중 분비된 CD44, 피브로넥틴 또는 CXCR4의 함량을 측정하는 것을 포함할 수 있다.
상기 측정된 CD44, 피브로넥틴 또는 CXCR4의 발현 또는 활성의 수준을 무처리 대조군의 수준과 비교하여, 대조군에 비하여 CD44, 피브로넥틴 또는 CXCR4의 발현 또는 활성을 변경시킨 물질을 CD44, 피브로넥틴 또는 CXCR4의 발현 또는 활성 억제제 물질 또는 후보 물질로 선별할 수 있다. 상기 CD44, 피브로넥틴 또는 CXCR4의 발현을 변경시키는 물질 또는 후보 물질은 암 치료제 또는 암 전이 억제제일 수 있다.
상기 스크리닝하는 방법의 상기 3차원 구조의 세포 클러스터는 생체 내 3D 환경을 유사하게 재현하기 위해 혈관 세포 등의 다른 세포를 더 포함하는 것일 수 있으며, 지지체로 캡슐화되어(encapsulated) 있는 것일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 콜라겐 겔 내의 hASC 및 암세포 클러스터의 발현 양상을 콜라겐 겔 내의 hASC 클러스터와 비교한 결과, 세포의 이동, 침투 및 전이에 관련된 마커들이 다른 발현 양상을 나타냈다. 따라서 hASC 및 암세포를 함께 배양한 3차원 암 전이 모델은 종양의 특정 미세환경에 따른 침투 및 전이 특성 연구 또는 항암제 및 암 전이 억제제 스크리닝에 유용하게 이용될 수 있다.
상기 스크리닝하는 방법에 대한 설명에서 언급된 용어 또는 요소 중 이미 3차원 구조의 세포 클러스터, 이를 포함하는 세포 배양 모델 및 이의 제조 방법에 대한 설명에서 언급된 것과 같은 것은 상기한 바와 같다.
일 양상에 따른 3차원 세포 클러스터 및 이를 포함하는 인 비트로 3차원 세포 배양 모델, 암 전이 모델, 이들의 제조방법 및 이를 이용한 스크리닝 방법은 생체 내 미세 환경과 유사한 환경을 제공하여 생체 내 세포에 대한 연구와 질병의 치료제 개발에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 고정화 MBP-FGF2를 기질로 하는 세포-매트릭스 또는 세포-세포 상호작용의 조절을 통한 A 및 AC 클러스터의 형성에 대한 도식도이다.
도 2a는 MBP-FGF2 코팅 PS-플레이트상의 1, 6 및 24시간 후의 hASC 또는 암세포의 이미지이다. 도 2b는 MBP-FGF2 코팅 PS-플레이트상에서 클러스터가 형성되는 동안 hASC 및 암세포의 양태를 나타낸다. hASC 및 암세포의 세포 밀도는 384-웰 PS-플레이트의 각 웰 당 10,000세포이다. 스케일바는 200 μm이다. 도 2c는 MBP-FGF2 코팅 PS-플레이트에 세포 분주 24시간 후 형성된 다양한 밀도 및 세포 비율의 A 및 AC 클러스터의 형태를 나타낸다. 스케일바는 500 μm이다. 도 2d는 MBP-FGF2 코팅 PS-플레이트에 세포 분주 24시간 후 형성된 다양한 밀도 및 세포 비율의 A 및 AC 클러스터의 생존력을 나타낸다. 스케일바는 200 μm 이다.
도 3a는 48시간 후 콜라겐 겔(2, 4 및 6 mg/mL)의 농도에 따른 A 및 AC 클러스터의 형태 변화를 나타낸다. 도 3b는 48시간 후 콜라겐 겔(2, 4 및 6 mg/mL) 내 A 및 AC 클러스터의 형광 이미지를 나타낸다. 특정 부분의 확대도가 포함되어 있다. hASC(초록색 화살표) 및 암세포(빨간색 화살표)는 각각 PKH2 및 PKH67로 염색되었다. 스케일바는 500 μm이다. 도 3c는 48시간 후 콜라겐 겔(2, 4 및 6 mg/mL) 내 A 및 AC 클러스터의 상대 영역 비교(%)를 나타낸다. 도 3d는 48시간 후 콜라겐 겔(2, 4 및 6 mg/mL) 내 A 및 AC 클러스터의 이동 거리(μm)를 나타낸다.
도 4a는 0, 6, 12, 24 및 48시간에서의 콜라겐 겔(6 mg/mL) 내 A 및 AC 클러스터의 형태 변화를 나타낸다. 도 4b는 콜라겐 겔(6 mg/mL) 내 A 및 AC 클러스터의 형광 이미지를 나타낸다. 특정 부분의 확대도가 포함되어 있다. hASC(초록색 화살표) 및 암세포(빨간색 화살표)는 각각 PKH2 및 PKH67로 염색되었다. 스케일바는 500 μm이다. 도 4c는 콜라겐 겔(6 mg/mL) 내 A 및 AC 클러스터의 시간에 따른 상대 영역 비교(%)를 나타낸다. 도 4d는 콜라겐 겔(6 mg/mL) 내 A 및 AC 클러스터의 시간에 따른 이동 거리(μm)를 나타낸다.
도 5a는 48시간 후 콜라겐 겔(6 mg/mL) 내 A 및 AC 클러스터의 CD44 발현을 나타내는 형광 이미지이다. 도 5b는 48시간 후 콜라겐 겔(6 mg/mL) 내 A 및 AC 클러스터의 피브로넥틴 발현을 나타내는 형광 이미지이다. 도 5c는 48시간 후 콜라겐 겔(6 mg/mL) 내 A 및 AC 클러스터의 CXCR4 발현을 나타내는 형광 이미지이다. 스케일바는 200 μm(저배율; 10X) 및 50 μm(고배율; 40X)이다.
도 6a는 MBP-FGF 코팅 플레이트에서 hASC, MCF10A 및 HUVEC의 혼합 비율에 따른 세포 클러스터가 형성되는 것을 나타내는 도이다. 도 6b는 hASC, MCF10A 및 HUVEC의 클러스터 형성과 비교하기 위해 AC 클러스터의 형성을 나타낸 도이다.
도 7은 MBP-FGF 코팅 플레이트에서 hASC 및 HUVEC의 혼합 비율에 따른 세포 클러스터가 형성되는 것을 나타내는 도이다.
도 8은 세포를 파종한 뒤 3일 후 콜라겐 겔 내에서 인공 혈관이 형성되는 것을 나타내는 도이다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. MBP - FGF2 코팅 PS-플레이트에서 hASC 클러스터(A 클러스터) 및 hASC 및 암세포 클러스터(AC 클러스터)의 형성 확인
1. MBP - FGF2 재조합 단백질 및 이를 고정화시킨 배양 용기의 제조
세포의 3차원 세포 클러스터 형태로의 배양을 더욱 효과적으로 유도하기 위해, 소수성 표면을 갖는 배양 용기에 인간 지방 조직 유래 중간엽 줄기세포(human adipose tissue derived mesenchymal stem cell: hASC)에 접착활성을 갖는 성장인자를 고정시켰다. 고정화(immobilized) 염기성 섬유모세포 성장인자(basic fibroblast growth factor: bFGF2)를 기질로서 이용하기 위해, 폴리스티렌 표면(PS)에 대한 고정화를 위한 물리적 링커로서 말토스-결합 단백질(maltose-binding protein: MBP)과 융합시켜, MBP-FGF 재조합 단백질을 제조하였다. 상기 기질은 헤파린에 대한 높은 친화도를 갖고 있으며, HSPG-매게 줄기 세포 부착을 유도하기 위한 것이다.
구체적으로, MBP의 카르복실 말단에 FGF의 아미노 말단이 융합되어 줄기세포에 대한 접착활성을 갖는 MBP-FGF 재조합 단백질을 대장균 형질전환체 K12 TB1(pMAL-bFGF)(KCTC-11505BP)로부터 발현시킨 후 분리 및 정제하였다. 이와 같이 수득된 MBP-FGF 재조합 단백질은 FGF가 MBP와의 재조합 단백질 형태로 발현되어 정제되더라도 본연의 FGF 활성을 그대로 유지하고 있어 줄기세포와의 생화학적 상호작용에 사용될 수 있다. 정제된 MBP-FGF 재조합 단백질을 무균작업대(Sanyo)에서 0.22 ㎛ 주사기 필터(Millex GV, Millipore)를 이용해 여과한 후 10 ㎍/㎖의 농도로 100 ㎕씩 비-조직세포 배양용 96- 또는 384-웰 PS-플레이트(Cefobio, 대한민국)에 첨가하고 재조합 단백질이 플레이트 표면에 고정되도록 무균작업대 안에서 4시간 동안 방치하였다. 그 후 상기 웰 플레이트를 PBS 200 ㎕로 3회 세척하고, MBP-FGF 재조합 단백질이 고정된 웰 표면과 세포와의 비특이적 결합을 방지하기 위해 일부 웰에는 1% BSA(bovine serum albumin, Sigma) 200 ㎕를 첨가하고 무균작업대 안에서 2시간 동안 더 처리한 후 PBS 200 ㎕로 3회 세척하여 MBP-FGF 재조합 단백질이 고정된 웰 플레이트를 준비하였다.
2. A 및 AC 클러스터의 형성 확인
(1) 실험 방법
hASC(Cefobio, 대한민국) 또는 hASC 및 암세포(전이성 유방암 세포주 MDA-MB-231)(ATCC, USA) 현탁액을 보충물을 첨가한 hASC 배양 배지(Cefobio, 대한민국) 내의 MBP-FGF2 코팅된 96- 또는 384-웰 PS-플레이트에 분주하였고, 37℃ 인큐베이터에서 1일간 배양하였다. 배양 24시간 후, hASC 클러스터(A 클러스터) 및 hASC 및 암세포 클러스터(AC 클러스터)의 형성을 Axio Vert.A1 도립 현미경(inverted microscope)(Zeiss, 독일)을 이용하여 관찰하였다.
(2) hASC 또는 암세포의 MBP - FGF2 코팅 PS-플레이트에 대한 부착성 확인
상기 hASC 및 암세포를 MBP-FGF2 코팅 PS-플레이트 상에 분주하고 1시간 후부터 상기 세포들의 부착성을 확인하였다. hASC 세포는 분주 1시간 후부터 MBP-FGF2 코팅 PS-플레이트에 부착성을 나타내었으나(도 2a 상단), 유방암 세포는 표면에 부착성을 나타내지 않았다(도 2a 하단). 이는 상피 세포인 유방암 세포가 MSC와는 달리 상기 기질에 낮은 친화도를 갖는다는 것을 나타낸다.
(3) 세포-세포 상호작용 및 세포-기질 상호작용에 의한 A 및 AC 클러스터의 형성 확인
도 2b는 시간에 따라 형성되는 A 및 AC 클러스터의 양태를 나타낸다. 도 2c는 96- 및 384-웰 PS-플레이트에서 웰의 크기 또는 세포의 밀도에 따라 형성된 다양한 크기, 강도 및 세포 비율의 A 및 AC 클러스터를 나타낸다. 또한, 도 2d는 공초점 현미경을 이용한 생사 판별 분석을 나타낸다. 이를 통해 A 및 AC 클러스터 내의 세포들이 살아있는 세포임을 확인하였다. 살아있는 세포는 초록색, 죽은 세포는 붉은색으로 표시된다.
실시예 2. 콜라겐 겔 내 A 및 AC 클러스터의 이동성 확인
1. 2, 4 및 6 mg /mL 콜라겐 겔 내의 A 및 AC 클러스터의 이동성 확인
여러 매트릭스 강성도를 갖는 인 비보 환경을 유사하게 재현하기 위해, 2, 4 및 6 mg/mL의 농도의 콜라겐을 이용하여 다양한 미세 환경에서의 A 및 AC 클러스터의 양태를 관찰하였다. 구체적으로, 세포 분주 및 배양 24시간 후, 생사 판별 분석을 위해 A 및 AC 클러스터를 생-사 염색 키트(BioVision, 대한민국)로 염색하였다. 이후 랫(rat) 꼬리로부터 수득한 고농도의 콜라겐 Ⅰ 겔(Corning, USA)(2, 4 및 6 mg/mL)로 캡슐화된 A 및 AC 클러스터를 포름알데히드 용액으로 고정시켰다. 상기 고정된 겔은 O.C.T.TM 화합물(SAKURA Tissue-Tek, USA)에 12시간 동안 넣어둔 후 동결시켰다. 동결된 겔 시료는 -20℃에서 10 μm 로 절단 후 슬라이드 글래스에 부착시켰다. 콜라겐 겔 내의 A 및 AC 클러스터의 양태는 배양 중 살아있는 세포를 위상차 현미경 및 공초점 현미경(Zeiss, 독일)으로 관찰하여 측정하였다. 세포 이동은 ImageJ 소프트웨어를 이용하여 각각의 콜라겐 겔의 농도 또는 시각에서 측정하였고, 클러스터의 중심을 기준으로 하였다.
도 3a는 배양 24시간 후 2, 4 및 6 mg/mL 콜라겐 겔 내의 A 및 AC 클러스터의 형태적 변화를 생 세포 현미경 관찰로 모니터링한 것을 나타낸다. 추가적으로, 도 3b는 세포들을 형광 염색한 후의 hASC(초록색) 및 암세포(빨간색)의 이동을 형광 검출한 것을 나타낸다. 도 3c 및 3d는 클러스터의 중심으로부터 세포 분주 48시간 후의 이동한 세포의 상대적 영역 및 거리를 20개의 점에서 측정한 것을 나타낸다. 이러한 데이터는 콜라겐 겔의 농도에 따른 강성도가 세포 이동에 영향을 미침을 나타낸다. 결론적으로, 강성도가 증가할수록 A 및 AC 클러스터로부터 탈출한 암세포의 침투 및 전이를 현저하게 증가됨을 확인하였다.
2. 시간에 따른 A 및 AC 클러스터의 이동성 분석
정상 유방 세포는 약 1200 Pa의 전단 계수(shear modulus)를 갖는 반면, 종양 세포의 강성도는 2400 내지 4800 Pa이다. 이러한 종양 미세 환경을 유사하게 구축하기 위해, 본 발명자들은 콜라겐 겔(6 mg/mL) 내 A 및 AC 클러스터의 양태를 0, 6, 12, 24 및 48시간에서 관찰하였다. 0시간은 클러스터가 콜라겐 겔에 주입된 시간을 나타낸다. 생 세포 이미지(도 4a) 및 형광 이미지(도 4b)는 시간 의존적으로 변화하는 A 및 AC 클러스터의 양태를 나타낸다. A 및 AC 클러스터는 주입 후 6시간 동안은 유사한 움직임을 나타내고, 주입 12시간 후부터 세포의 상대적 영역 및 이동 거리가 급격하게 증가하였다(도 4c 및 4d).
실시예 3. 면역형광 염색을 이용한 A 및 AC 클러스터의 암 관련 마커의 발현 양상 비교
1. 실험 방법
암의 진행과 관련된 마커인 CD44, 피브로넥틴 및 CXCR4의 면역형광 연구를 위해 콜라겐 겔로 캡슐화된 A 및 AC 클러스터의 절편을 4℃에서 일차 항체(Abcam, UK)와 함께 배양하였다. 상기 절편의 세척 후, 항체 염색 여부는 2차 항체(Abcam, UK)를 이용하여 제조사의 프로토콜에 따라 검출하였다. 이후, 상기 절편들을 핵 염색을 위한 4',6'-디아미노-2-페닐 인돌(4',6'-diamidino-2-phenyl indole: DAPI)(Molecular Probes, USA) 및 액틴 염색을 위한 팔로이딘(phalloidin)(Molecular Probes, USA)과 함께 배양하였다. 라벨링된 세포들은 이후 LSM 700 레이저 스캐닝 공초점 현미경(Zeiss, 독일)으로 관찰하였다.
2. CD44의 발현 확인
CD44+/CD24- 양성 유방암 세포는 더 높은 침투 특성을 나타내고, 이는 전이에 필요한 초기 특성 중 하나이다.
도 5a는 CD44가 콜라겐 내 A 및 AC 클러스터 모두에서 배양 48시간 이후 발현되지만, AC 클러스터에서 더 높은 수준으로 발현되는 것을 나타낸다.
3. 피브로넥틴의 발현 확인
프로테오글리칸, 피브로넥틴, 콜라겐, 라미닌 및 히알루론산 등의 ECM 분자들은 세포 부착 및 이동에서 주요한 역할을 가지고 있다. 암세포가 침투 및 전이 중일 때, 이들 단백질은 표적 조직의 매트릭스를 관통하고 이에 부착된다. 또한, MSC의 이동은 피브로넥틴에 의해 조절된다. 도 5b는 A 및 AC 클러스터 모두에서 피브로넥틴이 발현됨을 나타낸다. 이는 피브로넥틴이 hASC의 효율적인 이동 및 암세포의 A 및 AC 클러스터로부터 매트릭스로의 탈출에 필요함을 확인시켜 준다.
4. CXCR4의 발현 확인
유방암 세포는 특히 IL6, IL8, CDCR4, CXCR7 및 SDF-1α와 같은 사이토카인 네트워크를 통하여 MSC에 의해 조절된다. 유방암 세포는 높은 수준의 CXCR4 수용체를 발현하는 반면, 이 수용체의 리간드는 유방암이 주로 전이되는 장기에서 발현된다. CXCR4은 기관 형성, 조혈 작용 및 면역 반응과 관련이 있으며, ASC 상에 위치할 수 있다. 도 5c는 A 및 AC 클러스터의 CXCR4의 발현을 나타낸다. AC 클러스터와는 달리, A 클러스터에서 상당한 수준의 CXCR4 발현이 관찰되었다.
실시예 4. MBP - FGF 코팅 플레이트에서 기질 세포( hASC ), 암세포 및 혈관 세포의 클러스터 형성 확인
384 웰 플레이트에 MBP-FGF(20 μg/ml)로 50 μL씩 로딩 후 4시간 동안 상온에서 인큐베이션하였다. 이후 hASC, 암세포(MDA-MB-231, SK-Br-3, MCF-7 또는 MCF10A) 및 HUVEC을 각각 배양하고 이들 세포를 혼합하여 클러스터 형성을 관찰하였다. hASC 및 HUVEC은 6 계대의 것을 이용하였다. 하나의 웰 당 총 10,000개의 세포를 분주하였다.
그 결과, 도 6a와 같이 hASC와 MCF10A 및 HUVEC의 클러스터가 형성되는 것을 관찰하였다. 다만 hASC, MCF10A 및 HUVEC의 비율이 1:1:0.5 내지 1:1:1인 경우에는 세포클러스터가 잘 형성되었으나, 그 비율이 1:1:2인 경우는 세포 클러스터의 모양이 다소 불안정하게 형성되었다. 도 6b는 7500 세포/웰의 AC 클러스터의 형성을 나타내는 도이며, 이와 비교해도 hASC, MCF10A 및 HUVEC 클러스터의 형성이 정상적으로 이루어 졌음을 확인할 수 있었다.
실시예 5. MBP - FGF 코팅 플레이트에서 기질 세포( hASC ) 및 혈관 세포의 클러스터 형성 확인
384 웰 플레이트에 MBP-FGF(20 μg/ml)로 50 μL씩 로딩 후 4시간 동안 상온에서 인큐베이션하였다. 이후 hASC, 및 HUVEC을 각각 배양하고 6 계대의 것을 이용하여 클러스터 형성을 관찰하였다. 한 웰당 총 10,000개의 세포를 분주하였다.
그 결과, 도 7과 같이 hASC 및 HUVEC의 클러스터가 형성되는 것을 관찰하였다. 다만 hASC 및 HUVEC의 비율이 2:1 내지 1:1인 경우에는 세포 클러스터가 잘 형성되었으나, 그 비율이 1:2인 경우는 클러스터의 모양이 다소 불안정하게 형성되었다.
실시예 6. F- 액틴을 통한 콜라겐 겔 내 인공 혈관 형성 확인
폴리디메틸실록산(polydimethylsiloxane: PDMS) 몰드에 스테인리스 튜브를 삽입하였다. 그 후 몰드 중간 열린 부분에 트롬빈(1 유닛/ml) 1 μL를 로딩하였다. 콜라겐(corning, rat tail, 2 mg/ml)에 1N NaOH를 첨가하여 pH를 조정하고 여기에 피브린(sigma, 6 mg/ml)을 1:1 비율로 섞어준 후(최종 농도 콜라겐 1 mg/ml, 피브린 3 mg/ml), 이 용액을 몰드 중간에 로딩하고, PDMS 막으로 덮어 놓았다. 이후 1시간 이상 37℃ 인큐베이터에서 보관하였다. 인큐베이션 후에 상기 용액을 겔화(gelation)시키고 스테인리스 튜브를 제거하였다. 이후 1/200으로 희석된 로다민 팔로이딘(rhodamine phalloidin)을 채널과 막 위에 로딩하고, 한시간 뒤 공초점 현미경으로 F-액틴을 확인하였다.
그 결과, 도 8과 같이 파종 3일 후 콜라겐 내에서 인공 혈관이 형성된 것을 관찰할 수 있었다.

Claims (17)

  1. 기질 세포(stromal cell)를 암세포 및 혈관 세포와 배양 용기에 접착시켜 배양하는 단계;
    상기 세포들이 배양 용기로부터 탈착되어 직접적인 세포-세포간 상호 작용에 의한 3차원 세포 클러스터(cell cluster)를 형성하는 단계; 및
    상기 탈착된 세포 클러스터를 수득하는 단계를 포함하는 3차원 세포 클러스터를 제조하는 방법으로서,
    상기 배양 용기는 그 표면이 세포와 비-인테그린(non-integrin) 접착을 유도하는 물질을 포함하는 재료로 제조된 것 또는 상기 물질로 코팅되어 있는 것이고,
    상기 배양 용기는 혈관내피 성장인자(VEGF), 섬유아세포 성장인자(FGF), 표피 성장인자(EGF), 혈소판-유도 내피 성장인자(PDGF), 간세포 성장인자(HGF), 인슐린 유사 성장인자(IGF) 또는 헤파린 결합 도메인(HBD) 또는 이들의 세포 접착 활성을 갖는 단편으로 구성된 군으로부터 선택된 물질로 코팅된 것이고,
    상기 기질 세포는 지방 줄기세포 또는 중간엽 줄기세포이고,
    상기 혈관 세포와 기질 세포의 비율은 1:1 내지 1:2인 것인 방법.
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  3. 청구항 1에 있어서, 상기 배양 용기는 소수성 표면을 갖는 것이고, 상기 물질은 상기 소수성 표면에 흡착할 수 있는 폴리펩티드 링커와 연결된 것인 방법.
  4. 삭제
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  6. 청구항 1에 있어서, 상기 방법은 상기 수득된 세포 클러스터를 지지체로 캡슐화하는 단계를 더 포함하는 방법.
  7. 청구항 6에 있어서, 상기 지지체의 전단 계수는 2400 내지 4800 Pa인 것인 방법.
  8. 청구항 6에 있어서, 상기 지지체는 1 mg/mL 내지 10 mg/mL 농도인 것인 방법.
  9. 청구항 6에 있어서, 상기 지지체는 1 mg/mL 내지 10 mg/mL 농도의 콜라겐 겔인 것인 방법.
  10. 청구항 6에 있어서, 상기 방법은 상기 지지체 내에 인공 혈관을 형성시키는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
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