KR102240824B1 - 암 세포주 스페로이드를 이용한 약물 스크리닝 동물모델 제조방법 및 이의 이용 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 암 세포주 스페로이드를 이용한 동물 모델에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 암 세포주 스페로이드 및 CAF가 이식된 동물 모델 및 상기 동물 모델을 이용한 항암제 스크리닝 방법 등에 관한 것이다. 본 발명에 따른 동물 모델은 종양 혈관이 잘 형성되고, 종양 괴사가 없는 것을 특징으로 하며, 따라서, 본 발명의 상기 동물 모델은 생체 내(in vivo) 항암제 약효평가, 종양에 대한 발병기전 연구, 및 암 치료법 개발에 유용하게 사용할 수 있을 것으로 기대된다.
Description
본 발명은 암 세포주 스페로이드를 이용한 동물 모델에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 본 발명에 따른 동물 모델을 이용하여 항암제를 스크리닝하는 방법 등에 관한 것이다.
암에 대한 연구가 30년 이상 심도 있게 이루어진 현재에도 환경오염, 잘못된 식생활습관 등으로 인하여 암 발생률은 계속 증가하여 전 세계적으로 매년 1,000만 명이 넘는 환자가 발생하고 있으며, 세계보건기구(WHO)는 사망의 주요원인 중 하나로 암을 꼽고 있다. 한편, 암 중에 구강암은 전체 암 발생률 중에 약 2%로 매우 적은 비중을 차지하는 것으로 알려져 있으나, 구강암은 치료 후에도 저작 또는 발음 등의 구강 내 기능의 저하로 정상적인 음식물 섭취가 어렵고, 말하는 기능이 떨어지며 얼굴외형의 변형 등 만성적인 후유증을 유발하여 환자의 삶에 치명적인 영향을 주는 것으로 보고되고 있다. 구강암의 생존율은 대략 50% 정도로서 악성종양으로 알려져 있으며, 편평상피암이 가장 흔하게 발병하고, 이외에도 구강점막의 작은 침샘에서 발생하는 타액선암, 턱뼈나 안면부의 근육 등의 연조직에서 발생하는 육종, 구강점막의 입천장, 볼점막, 잇몸 등에서 발생하는 악성흑색종, 드물게는 림프종 등의 형태로 발병하며, 최근 들어 과거에 비해 젊은 층의 환자가 증가하는 것으로 보고되고 있는데, 이는 서구화된 식습관과 흡연 및 음주의 증가가 그 원인으로 보고되고 있다.
이에 따라, 구강암을 포함한 새로운 암 치료법이 꾸준히 개발되고 있고, 항암요법과 함께 외과적 수술요법, 방사선 요법, 화학요법 등과 같은 일반적인 암의 치료법이 있으나, 심각한 부작용과 더불어 재발의 위험도 있는 것으로 알려져 있다. 또한, 일반적인 항암제의 경우, 특정 암에 작용하나 그 외 암에는 작용하지 않는 경향이 많고, 내성이 생기는 경우가 많으므로, 암 치료 효과를 높이기 위해서는 다양한 신규 항암제의 개발이 필수적이며, 이에, 맞추어 신규 항암제를 간편하게 스크리닝하는 방법의 개발 역시 요구되는 바, 이에 효율적으로 스크리닝을 위한 종양 모델이 요구되는 실정이었다.
이에, 일반적으로 항암제의 스크리닝은 2차원(2-D) 단일 층으로 배양된 종양 세포에서 수행되어 왔다. 그러나, 2-D 단일 층으로 성장하는 종양 세포는 생체 내에서 종양 형성에 깊이 영향을 주는 종양 미세 환경(세포-기질, 세포-세포의 생체환경)이 잘 조성되지 않는다.
이에 반해, 생체 내 환경에선 시험관 내 2차원적 환경에서와는 다른 길쭉한 세포형태를 가지기도 하므로, 3차원으로 배양된 세포를 통해 실제로의 세포 형태 및 기능연구, 그리고 나아가 미세환경과의 상호작용 연구에 있어서 좋은 대안책이 될 수 있다. 즉, 3차원 배양세포는 일반적인 단일 세포(single cell) 형태의 세포보다 체내에 이식 후 세포 생존율이 높고, 약물스크리닝 또한 임상효율을 높일 수 있는 결과를 줄 수 있는 바, 이에 따른 3차원 세포배양 연구가 활발히 진행되고 있다. 그러나, 3-D 스페로이드로 실험 동물 모델을 만들려는 노력이 많이 행해지고 있지만 이 경우 종양이 형성되지 않는 경우가 많았다.
한편, 암세포를 3-D으로 배양한 스페로이드(spheroid)가 여러 가지 측면에서 생체 내 환경(in vivo)를 흉내 낼 수 있다는 상기와 같은 장점에 의해 약물 스크리닝(screening)에 응용되는 경우가 늘어났지만, 여전히 시험관 내 분석(in vitro assay)의 한계를 극복하기는 어려운 실정이다. 특히, 마우스 동물 모델에서는 종양 내에서 표현형 이질성에 기여하는 다양한 물리적 및 화학적 구배의 발생을 야기하게 되며, 산소화 구배(oxygenation gradient) 및 영양소에 대한 차별적인 접근이 이루어지게 된다. 이로 인해, 생체 내 종양 내부에서 괴사가 생기는 경우가 많은데 이는 실제 in vivo 종양과 차이가 있을 뿐 아니라, 이 괴사로 인해 약물내성이 나타나므로 정확한 약효 평가에는 어렵다는 문제가 있었다.
따라서, 종양이 잘 형성되고 더 정확한 항암제 약효를 확인하기 위하여, 종양 미세환경이 잘 형성되고 종양 내부에 괴사가 없는 동물 모델이 필요한 실정이었다.
본 발명은 약물 스크리닝용 동물 모델 제조 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 동물 모델을 이용하여 항암제를 스크리닝하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
그러나, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a) 암 세포주 스페로이드를 제조하는 단계; 및 (b) 상기 (a)단계의 암 세포주 스페로이드와 암 관련 섬유아세포(cancer-associated fibroblast; CAF)(이하, CAF)를 함께 동물에 이식하는 단계를 포함하는 약물 스크리닝용 동물 모델 제조 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현 예로, 상기 약물은 항암제일 수 있다.
또한, 본 발명은 항암제 스크리닝 방법으로, 상기 방법은 암 세포주 스페로이드 및 CAF를 함께 주입하여 제조된 동물 모델을 이용하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현 예로, 상기 방법은 (a) 암 세포주 스페로이드를 제조하는 단계; (b) 상기 (a)단계의 암 세포주 스페로이드와 CAF를 함께 동물에 이식하여 종양을 형성시키는 단계; (c) 상기 (b)단계에 의해 종양이 형성된 동물모델에 후보약물을 처리하는 단계; (d) 상기 (c)단계의 후보약물을 처리한 후, 종양의 크기 또는 전이를 확인하는 단계; 및 (e) 상기 (d)단계의 확인 결과 종양의 크기가 감소되거나 전이가 억제되는 경우, 상기 후보약물을 항암제로 판정하는 단계를 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 항암제 스크리닝 동물 모델로서, 상기 동물 모델은 암 세포주 스페로이드 및 암 관련 섬유아세포(cancer-associated fibroblast; CAF)를 함께 동물에 이식하여 제조되며, 또한 상기 동물 모델은 종양 내부로 혈관이 형성되고, 종양 괴사가 없는 것을 특징으로 하는, 항암제 스크리닝 동물 모델을 제공한다.
본 발명의 일 구현 예로, 상기 동물은 마우스일 수 있다.
본 발명의 다른 구현 예로, 상기 CAF는 구강암 환자 유래일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현 예로, 상기 암은 구강암일 수 있다.
본 발명에 따른 동물 모델은 암 세포주 스페로이드 및 암 관련 섬유아세포(Cancer-associated fibroblast; CAF)를 함께 이식하여 제조한 동물 모델로서, 상기 동물 모델에서는 종양 내부로 혈관이 잘 형성되고, 종양 괴사가 없다는 것을 확인하였다. 괴사가 생겨 실제 in vivo 종양과 차이가 있을 뿐만 아니라, 이 괴사로 인해 약물내성이 나타나므로 정확한 약효 평가에는 어려운 기존 의 동물 모델과는 달리, 본 발명의 동물 모델은 종양 내부로 혈관이 잘 형성되고 괴사가 일어나지 않는바, 항암제의 효율적 약효 평가를 가능하게 한다. 이에 더하여, 종양에 대한 발병기전 연구, 및 항암제 개발 등에도 유용하게 사용할 수 있을 것으로 기대된다.
도 1은 구강암 세포주 FaDu 분리세포(dissociated 2-D cell)를 주입한 마우스에서 종양이 형성됨을 확인한 결과, FaDu 2-D 세포를 주입한 경우, 종양이 형성되었으나, FaDu 3-D 스페로이드만을 주입한 경우 종양이 형성되지 않은 것을 확인한 도이다.
도 2는 FaDu 2-D 세포와 구강암 환자로부터 분리한 CAF를 함께 이식한 후, 종양만 적출한 것을 나타낸 것이다.
도 3a 및 3b는 FaDu 2-D 세포와 CAF를 함께 이식한 동물 모델에서 종양에 혈관 분포가 미비하고, 종양 성장에 따라 종양 중심부에서 괴사가 일어난 것을 확인한 도이다.
도 4는 FaDu 3-D 스페로이드와 구강암 환자로부터 분리한 CAF를 함께 이식한 후, 종양만 적출한 것을 나타낸 것이다.
도 5a 및 5b는 FaDu 3-D 스페로이드와 CAF를 함께 이식한 동물 모델에서 종양 주위뿐만 아니라 종양 내부까지 혈관 분포가 되어 있고, 종양 괴사는 일어나지 않은 것을 확인한 도이다.
도 2는 FaDu 2-D 세포와 구강암 환자로부터 분리한 CAF를 함께 이식한 후, 종양만 적출한 것을 나타낸 것이다.
도 3a 및 3b는 FaDu 2-D 세포와 CAF를 함께 이식한 동물 모델에서 종양에 혈관 분포가 미비하고, 종양 성장에 따라 종양 중심부에서 괴사가 일어난 것을 확인한 도이다.
도 4는 FaDu 3-D 스페로이드와 구강암 환자로부터 분리한 CAF를 함께 이식한 후, 종양만 적출한 것을 나타낸 것이다.
도 5a 및 5b는 FaDu 3-D 스페로이드와 CAF를 함께 이식한 동물 모델에서 종양 주위뿐만 아니라 종양 내부까지 혈관 분포가 되어 있고, 종양 괴사는 일어나지 않은 것을 확인한 도이다.
본 발명자들은 약물 스크리닝을 위한 동물 모델을 제작하기 위해 예의 연구한 결과, 암 세포주(3-D) 스페로이드(spheroid) 및 CAF가 이식된 동물 모델을 제작하고, 상기 동물 모델에서 종양 내부로 혈관이 잘 형성되고, 종양 괴사가 없다는 것을 확인하고, 이에 기초하여 본 발명을 완성하였다.
이하, 본 발명을 자세히 설명한다.
본 발명의 일 실시 예에서는, FaDu 3-D 스페로이드에서 종양에 잘 형성되는 지 알아보기 위해, 마우스의 왼쪽 뺨에는 실시예 1-1에 따른 FaDu 분리세포(dissociated cell) 1X106 개 주사하고, 마우스의 오른쪽 뺨에는 직경 400 마이크로미터 정도의 실시예 1-3에 따른 FaDu 스페로이드 50개 주사하여, FaDu 스페로이드에서 종양이 잘 형성되는 지 확인하였다(실시예 2 참조).
본 발명의 다른 실시 예에서는, 실시예 1-1에 따른 FaDu 분리세포와 실시예 1-2에 따른 CAF가 같이 이식된 마우스에서 종양 형성, 종양 혈관형성, 및 괴사 발생 여부를 알아보기 위해, FaDu 분리세포와 CAF가 같이 이식된 마우스에서 종양을 적출한 뒤, 실시예 1-6에 따른 면역조직화학 분석(Immunohistochemical analysis) 및 실시예 1-5에 따른 혈관 이미징(Blood vessel imaging)을 통하여, 종양에서 종양 혈관이 형성되는지, 괴사가 발생하는 지 확인하였다(실시예 3 참조).
본 발명의 또 다른 실시 예에서는, 실시예 1-3에 따른 FaDu 스페로이드와 실시예 1-2에 따른 CAF가 같이 이식된 마우스에서 종양 형성, 종양 혈관형성, 및 괴사 발생 여부를 알아보기 위해, FaDu 스페로이드와 CAF가 같이 이식된 마우스에서 종양을 적출한 뒤, 실시예 1-6에 따른 면역조직화학 분석(Immunohistochemical analysis) 및 실시예 1-5에 따른 혈관 이미징(Blood vessel imaging)을 통하여, 종양에서 종양 혈관이 형성되는지, 괴사가 발생하는 지 확인하였다(실시예 4 참조).
따라서, 본 발명은 (a) 암 세포주 스페로이드를 제조하는 단계; 및 (b) 상기 (a)단계의 암 세포주 스페로이드와 암 관련 섬유아세포(cancer-associated fibroblast; CAF)를 함께 동물에 이식하는 단계를 포함하는, 약물 스크리닝용 동물 모델 제조 방법을 제공한다.
본 발명에서, 상기 약물은 스크리닝에서 사용되는 미지의 물질을 의미하고, 상기 약물은 예를 들어, 화합물, 미생물 배양액 또는 추출물, 천연물 추출물 등일 수 있으며, 바람직하게는 항암제이나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 항암제 스크리닝 방법으로, 상기 방법은 암 세포주 스페로이드 및 암 관련 섬유아세포(cancer-associated fibroblast; CAF)를 함께 주입하여 제조된 동물 모델을 이용하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법을 제공한다.
본 발명에서, 상기 방법은 (a) 암 세포주 스페로이드를 제조하는 단계; (b) 상기 (a)단계의 암 세포주 스페로이드와 CAF를 함께 동물에 이식하여 종양을 형성시키는 단계; (c) 상기 (b)단계에 의해 종양이 형성된 동물모델에 후보약물을 처리하는 단계; (d) 상기 (c)단계의 후보약물을 처리한 후, 종양의 크기 또는 전이를 확인하는 단계; 및 (e) 상기 (d)단계의 확인 결과 종양의 크기가 감소되거나 전이가 억제되는 경우, 상기 후보약물을 항암제로 판정하는 단계를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기 후보약물은 종양 크기 또는 전이를 측정하기 위하여 스크리닝에서 사용되는 미지의 물질을 의미하며, 바람직하게는 화합물, 미생물 배양액 또는 추출물, 천연물 추출물 등일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기 (d) 단계는 크기 또는 전이를 확인 및 측정할 수 있는 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 실시될 수 있다. 바람직하게는, 종양의 무게측정법, 혈관이미징(Blood vessel imaging), 면역조직화학 분석법(Immunohistochemical analysis), 중합효소연쇄반응(PCR), 마이크로어레이(microarray), 노던 블롯팅(northern blotting), 웨스턴 블롯팅(western blotting), 효소면역분석법(ELISA), 면역침전법(immunoprecipitation), 또는 면역형광염색법(immunofluorescence) 등을 이용하여 측정할 수 있으며, 당업자에 의해 매우 간단하고 용이하게 실시될 수 있으나, 이것으로 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 항암제 스크리닝 동물 모델로서, 상기 동물 모델은 암 세포주 스페로이드 및 암 관련 섬유아세포(cancer-associated fibroblast; CAF)를 함께 동물에 이식하여 제조되며, 또한 상기 동물 모델은 종양 내부로 혈관이 형성되고, 종양 괴사가 없는 것을 특징으로 하는, 항암제 스크리닝 동물 모델을 제공한다.
본 발명에 사용되는 용어, '스페로이드(spheroid)'란, 1천개 이상의 단일 세포들이 모여 3차원의 구형태를 이루는 집합체를 의미하며, 본 발명에 있어서, 상기 스페로이드는 당업자에게 공지된 방법에 따라 스페로이드를 제작할 수 있고, 바람직하게는 실시예 1-3에 따라 암 세포주를 3-D로 제작할 수 있다. 예를 들어, 구강암, 유방암, 전립선암, 폐암, 간암, 난소암, 또는 갑상선암 세포주를 제작할 수 있으며, 바람직하게는 구강암 세포주를 3-D로 제작한 Fadu 3-D 스페로이드일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기 스페로이드는 다양한 직경의 스페로이드일 수 있으며, 직경이 200μm미만인 작은 스페로이드는 대부분 증식세포 및 정상 산소(노목식) 세포를 포함할 수 있고, 직경이 약 500 μm인 회전 타원체는 괴사 부위를 보일 수 있다. 따라서, 스페로이드의 직경은 200~500㎛일 수 있고, 바람직하게는 약 400㎛일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 사용되는 용어, '암 관련 섬유아세포(Cancer-associated fibroblast; CAF)'란, 암 관련 섬유아세포, 종양 관련 섬유아세포, 발암성 관련 섬유아세포, 활성화된 섬유아세포라고도 불리운다. 종양 미세 환경은 종양 세포의 신생(종양) 세포 상호 작용 또는 종양 형성, 진행 및 전이성 확산에 중추적인 역할을 하게 된다. 이때, CAF는 종양 미세 환경 내에서 세포 외 기질이 재형성 과정을 시작하거나 사이토카인을 분비될 때 종양적 특징을 촉진시키는 복잡하고 풍부한 세포 유형 중 하나이다. 또한, CAF는 침입 및 전이를 비롯한 종양 진행에 참여하고, 환자의 예후의 지표 역할 및 종양 세포와 동시 주입되거나 종양 부위에 모집 될 때 생체 내에서 암 진행을 촉진하는 역할을 한다. CAF는 세포 사멸을 겪지 못하기 때문에 그 숫자는 감소되지 않고, 종양 기질에 풍부하며, 근섬유아세포 및 섬유아세포로 구성되어 있다.
본 발명에 있어서, 실시예 1-2에 따라 CAF는 암환자로부터 분리 및 배양할 수 있고, 바람직하게는, 실시예 1-2에 따라 CAF를 배양할 수 있다. 또한, 당업계에 공지된 다양한 CAF를 분리하여 사용할 수 있으며, 예컨데, 구강암, 유방암, 전립선암, 폐암, 간암, 난소암, 또는 갑상선암 환자로부터 유래한 CAF일 수 있고, 바람직하게는, 구강암 환자로부터 분리한 구강암-연관 섬유아세포일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 구강암 환자로부터 분리한 구강암-연관 섬유아세포는 구강암 환자의 조직 등에서 분리할 수 있고, 상기 구강암 조직 등은 구강암 상피조직, 구강암 림프조직 등에서 얻어질 수 있으며, 상기 구강암 상피조직은 구강점막 표면을 덮고 있는 상피로, 치은(잇몸), 경구개(단단입천장), 연구개(물렁입천장), 순(입술)점막, 협(볼)점막, 설(혀)점막 등으로 이루어 질 수 있으며, 기저층, 가시층 과립층, 및 각질층 총 4 층으로 이루어 질 수 있다. 구강암 상피조직 등을 기원으로 가진 조직 등 이라면 종류가 제한되지 않고, 예를 들어, 마우스의 구강 상피 등에서 얻어진 구강암 조직 등을 이용할 수 있으며, 당업자가 적절히 선택하여 사용할 수 있다.
본 발명에 있어서, 암 세포주 스페로이드와 CAF를 각각 이식할 때, 당업계에 공지된 이식방법을 사용할 수 있고, 바람직하게는 주사 주입으로 이식할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명에 있어서 암 세포주 스페로이드와 CAF를 각각 이식하는 것 대신, 상기 세포들을 공동 배양(co-culture) 후에 이식할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 암은 구강암, 유방암, 전립선암, 폐암, 간암, 난소암, 또는 갑상선암 등일 수 있고, 바람직하게는 구강암이나, 이에 제한되지 않는다.
상기 동물 모델은 인간을 제외한 포유동물을 이용하여 제조될 수 있으며, 상기 인간을 제외한 포유동물은 원숭이, 랫트, 생쥐, 토끼, 개, 영장류 등일 수 있으며, 바람직하게는 쥣과(Muridae) 동물일 수 있으나 이에 제한되지는 않는다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
실시예 1. 실험준비 및 실험방법
1-1. 환자, 조직 표본 및 세포주
표본은 경북 대학교 기관 연구 윤리위원회의 승인을 받은 후 환자의 사전 서면 동의를 얻은 후에 사용하였으며, 경북대학교 병원에서 수술적 절제술을 통하여 2개의 주 OSCC 조직을 채취하였다. 수술 전에 환자 중 어느 누구도 보조 치료를 받지 않았다. FaDu는 ATCC으로부터 얻었고, 10% FBS(Fetal bovine serum) 및 1% 페니실린/스트렙토 마이신 용액을 함유하는 DMEM(Dulbecco's modified eagle medium) 배지에서 유지시켰다. 5% CO2 습도 환경에서 37℃에서 세포를 성장시켰다.
1-2. 환자의 조직에서 얻은 섬유아세포의 일차 배양
암 조직 및 그 쌍을 이루는 정상적인 구강 조직을 무균 DMEM 배지에서 가능한 가장 작은 조각으로 절단하고, 이어서 10% FBS을 보충한 DMEM 10mL에서 10-cm조직 배양 접시에 플레이팅 하였다 37℃에서 30분간 배양한 후, 비부착성 세포(주로 종양 세포)를 제거하고, 부착성 섬유아세포를 추가 연구를 위해 배양하였다.
1-3. 스페로이드 배양 및 마우스 주사
FaDu 스페로이드는 웰 당 하나의 스페로이드를 갖는 96-웰 플레이트 포맷에서 배양하였다. 구체적으로, FaDu 세포를 96-웰 U-바닥 초 저부착 플레이트(96-well U-bottom ultra-low attachment plate)(웰 당 4000 세포)에 분주하고, 3일 동안 배양하여 스페로이드(직경 약 400㎛)를 형성시켰다. 또한, 생체 내 FaDu 종양 형성에 대한 환자-유래 CAF의 영향을 조사하기 위해, 동일한 실험 조건에서 분리된 FaDu 세포 또는 FaDu 스페로이드와 함께 106개의 CAF가 주입되었다. 구체적으로, 분리된 106개의 FaDu 세포와 50개의 FaDu 스페로이드가 누드 마우스의 오른쪽 및 왼쪽 볼에 각각 주입되었다. 6주 후, 마우스를 희생시키고 종양 형성 정도를 비교하였다.
1-4. 혈관 염색 및 조직 클리어링(Blood vessel staining and tissue clearing)
이소플라우란용 증발기가 장착된 설치류 흡입 마취 장치(rodent inhalation anaesthesia apparatus)(VETEQUIP, USA)를 사용하여 동물을 깊게 마취시켰다. 캐리어 가스로서, 100% 산소가 사용되었다. 혈관 염색을 위해, 마우스에 100ul Lycopersicon Esculentum Lectin(Lection 488)으로 심장 내 주사를 한 다음, 좌심실 대동맥을 통해 헹굼 및 고정 용액으로 관류하였다. 3-5분 동안 약 30mL의 PBS로 헹구고, 각 마우스를 20-30분 동안 4% 파라포름 알데히드 30-50mL로 고정시켰다. 종양 조직을 제거하고 4% 파라 포름 알데히드에 12시간 동안 두었다. 종양 조직은 Binaree 조직 클리어링 키트(the Binaree Tissue Clearing kit)(Cat. SHBC-001, TiBinaree, Korea)를 사용하여 클리어링하였다. 구체적으로, 고정된 조직을 고정 용액에 24시간 동안 담그고, 35℃에서 18시간 동안 진탕 배양기에서 조직 클리어링 용액(Tissue clearing solution)으로 항온 배양 하였다. 세척 용액(Washing solution)을 3번 헹군 후, 추가로 클리어링하기 위해, 조직에 Mounting and Storage 용액에서 24시간 동안 두었다(Cat. SHMS-050, Binaree, Korea). 클리어된 샘플의 광-시트 이미징은 mounting 배지로서 Mounting and Storage solution(Cat. SHMS-050, Binaree, Korea)을 사용하여 수행되었다.
1-5. 광-시트(Light-sheet) 현미경을 이용한 혈관 이미징(Blood vessel imaging)
종양 조직의 혈관 구조는 5x / 0.1 이중면 조명 광학계(5x/0.1 dual side illumination optic) 및 Plan-neofluar 5x / 0.16 대물렌즈(Zeiss)가 있는 광-시트 Z.1 형광 현미경(Lightsheet Z.1 fluorescence microscope)(Zeiss Corporation, Jena, Germany)을 사용하여 이미지화했다. 형광은 488nm 및 561nm 레이저로 여기되었고(exited), 방출(emission)은 505-545nm 및 575-615nm 밴드-패스 필터(band-pass filters)로 감지되었다. LSFM의 모든 이미지 데이터는 zen 소프트웨어(Zeiss)의 czi 파일 유형으로 저장되었으며, 이미지는 Arivis vison 4D 소프트웨어(arivis-AG, Rostock, Germany) 및 Imaris 소프트웨어(Bitplane, 미국)를 사용하여 재구성되고 및 3-D 렌더링되었다. Brain Research Institute의 BRCF(Brain Research Core Facility)에서 전체 LSFM 이미지 및 이미지 렌더링 데이터를 수집했다.
1-6. 면역조직화학 분석(Immunohistochemical analysis)
파라핀-삽입(embedded) 조직 블록을 누드 마우스로부터 제조하였다. 이 연구는 경북대학교 병원 윤리위원회의 승인을 받았다. 구체적으로, 왁스 제거 후, 절편(5μm)을 5분간 블로킹한 후, EGR1 항체(1:50)로 실온에서 2시간 동안 배양하였다. IHC염색은 UltraTek HRP Anti-Polyvalent 키트(ScyTek Laboratories, Logan, UT, USA)를 사용하여 수행하였다. 사용된 색소원은 3,3-디아미노벤지딘(Dako, Carpinteria, CA, USA)이었다.
실시예 2. 3-D 스페로이드(spheroid)에서의 종양 형성 여부 확인
실시예 1-1에 따른 분리세포(dissociated cell) 및 실시예 1-3에 따른 FaDu 3-D 스페로이드를 동일한 마우스의 오른쪽 및 왼쪽 뺨에 각각 이식한 후 6주간 배양하였을 때, FaDu 3-D 스페로이드를 이식한 왼쪽 빰에는 종양이 형성되지 않았으며, 도 1에 나타난 바와 같이, FaDu 2-D 분리세포에서는 종양이 형성된 것을 확인 할 수 있었다.
실시예 3. 분리세포(dissociated cell)와 CAF를 이식한 마우스에서의 괴사여부 확인
실시예 1-1에 따른 FaDu 분리세포와 실시예 1-2에 따른 CAF를 함께 이식한 마우스에서 종양을 적출한 뒤(도 2 참조), 실시예 1-5에 따른 혈관 이미징(Blood vessel imaging) 및 실시예 1-6에 따른 면역조직화학 분석(Immunohistochemical analysis을 확인하였다. 그 결과, 종양 혈관이 종양 주위에 나타났으나, 종양에 혈관 분포가 거의 없었는 바, 분리세포로부터 유래된 마우스 종양은 종양 성장에 따라 종양 중심부에서 괴사가 일어났음을 확인할 수 있었다(도 3a 및 도 3b 참조).
구체적으로, 도 2에 나타난 바와 같이 FaDu 분리세포와 CAF를 함께 이식한 마우스 5마리에서 종양을 각각 적출한 뒤 그 중 2마리에서 적출한 종양을 도 3a 및 도 3b에 나타내었다. 즉, 도 3a 및 도 3b에 나타난 바와 같이, 왼쪽 혈관 이미징에서는 점선부분 안에 녹색 부분이 잘 나타나지 않았는 바, 종양 중심부에서 혈관이 잘 형성되지 않은 것을 확인할 수 있고, 오른쪽 면역조직화학 분석에서는 40배율 부분의 네모영역 부분을 100배율로 확대하여 살펴본 결과, 하얀색 혹은 옅은 분홍색 부분이 많이 나타나 있는 바, 종양 중심부에서 괴사가 많이 일어났다는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 4. 3-D 스페로이드(spheroid)와 CAF를 이식한 마우스에서의 괴사여부 확인
실시예 1-3에 따른 FaDu 스페로이드와 실시예 1-2에 따른 CAF를 함께 이식한 마우스에서 종양을 적출한 뒤(도 4 참조), 실시예 1-5에 따른 혈관 이미징(Blood vessel imaging) 및 실시예 1-6에 따른 면역조직화학 분석(Immunohistochemical analysis)을 확인하였다. 그 결과, 종양 주위의 혈관 분포로 종양 세포질(tumor cellularity)이 증가했고, 종양 주위뿐만 아니라 종양 내부의 혈관 분포를 보여주었는 바, 종양 괴사는 일어나지 않았음을 확인할 수 있었다(도 5a 및 도 5b 참조).
구체적으로, 도 4에 나타난 바와 같이 FaDu 스페로이드와 CAF를 함께 이식한 마우스 5마리에서 종양을 각각 적출한 뒤 그 중 2마리에서 적출한 종양을 도 5a 및 도 5b에 나타내었다. 즉, 도 5a 및 도 5b에 나타난 바와 같이, 왼쪽 혈관 이미징에서는 점선부분 안에 녹색 부분이 도 3a 및 도3b에 비하여 잘 나타나 있는 바, 종양 중심부에서 혈관이 잘 형성되어 있는 것을 확인할 수 있고, 오른쪽 면역조직화학 분석에서는 40배율 부분의 네모영역 부분을 100배율로 확대하여 살펴본 결과, 도 3a 및 도3b에 비하여 적고, 오히려 짙은 분홍색 부분이 잘 나타나 있는바, 종양 중심부에서 괴사가 일어나지 않았다는 것을 확인할 수 있었다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다름 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 아닌 것으로 이해해야 한다.
Claims (14)
- 하기 단계를 포함하는 구강암에 대한 항암제 스크리닝용 동물 모델 제조 방법:
(a) 구강암 세포주 스페로이드를 제조하는 단계; 및
(b) 상기 (a)단계의 구강암 세포주 스페로이드와 구강암 환자 유래의 암 관련 섬유아세포(cancer-associated fibroblast; CAF)를 함께 동물에 이식하는 단계,
단, 상기 구강암 세포주 스페로이드의 직경은 200 내지 500㎛임.
- 제1항에 있어서,
상기 동물은 마우스인 것을 특징으로 하는, 제조방법.
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 구강암에 대한 항암제 스크리닝 방법으로, 상기 방법은 구강암 세포주 스페로이드 및 구강암 환자 유래의 암 관련 섬유아세포(cancer-associated fibroblast; CAF)를 함께 주입하여 제조된 동물 모델을 이용하는 단계를 포함하고, 이 때 상기 구강암 세포주 스페로이드의 직경은 200 내지 500㎛인 것을 특징으로 하는, 방법.
- 제6항에 있어서,
상기 방법은 하기 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 구강암에 대한 항암제 스크리닝 방법으로서:
(a) 구강암 세포주 스페로이드를 제조하는 단계;
(b) 상기 (a)단계의 구강암 세포주 스페로이드와 구강암 환자 유래의 CAF를 함께 동물에 이식하여 종양을 형성시키는 단계;
(c) 상기 (b)단계에 의해 종양이 형성된 동물모델에 후보약물을 처리하는 단계;
(d) 상기 (c)단계의 후보약물을 처리한 후, 종양의 크기 또는 전이를 확인하는 단계; 및
(e) 상기 (d)단계의 확인 결과 종양의 크기가 감소되거나 전이가 억제되는 경우, 상기 후보약물을 구강암에 대한 항암제로 판정하는 단계,
여기서, 상기 구강암 세포주 스페로이드의 직경은 200 내지 500㎛인, 방법.
- 제6항에 있어서,
상기 동물은 마우스인 것을 특징으로 하는, 구강암에 대한 항암제 스크리닝 방법.
- 삭제
- 삭제
- 구강암에 대한 항암제 스크리닝 동물 모델로서, 상기 동물 모델은 구강암 세포주 스페로이드 및 구강암 환자 유래의 암 관련 섬유아세포(cancer-associated fibroblast; CAF)를 함께 동물에 이식하여 제조되며, 이 때 상기 구강암 세포주 스페로이드의 직경은 200 내지 500㎛이고, 또한 상기 동물 모델은 종양 내부로 혈관이 형성되고, 종양 괴사가 없는 것을 특징으로 하는, 구강암에 대한 항암제 스크리닝 동물 모델.
- 제11항에 있어서,
상기 동물은 마우스인 것을 특징으로 하는, 구강암에 대한 항암제 스크리닝 동물 모델.
- 삭제
- 삭제
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