CN102421919A - 采用AxI作为上皮-间质转化的生物标志物的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及AxI作为生物标志物用于检测受试者中的上皮-间质转化(EMT)的发生的用途。更具体而言，本发明涉及通过测量AxI的表达和/或活性而检测受试者中的上皮-间质转化(EMT)的发生的各种方法。

Description

采用AxI作为上皮-间质转化的生物标志物的方法
本发明涉及用于检测上皮-间质转化(EMT)(epithelial-to-mesenchymaltransition)的发生的生物标志物以及诊断/预测方法。更具体而言，本发明涉及与AxI的表达和/或活性有关的诊断、预测和疗法。
背景技术
AxI为受体酪氨酸激酶亚家族的成员。尽管与其他受体酪氨酸激酶相似，但是AxI蛋白显示出胞外区的独特结构，该结构中IgL和FNIII重复结构并列，并且还具有含胞内结构域的胞内区(其一部分为激酶结构域)。AxI通过结合生长因子(如维生素K依赖性蛋白生长停滞特异性基因6(Gas6))将信号从细胞外基质传导入细胞质。AxI的胞外结构域可被切割，并且可以释放65kDa的可溶性胞外结构域。切割增强了受体周转并生成部分激活的激酶(O′Bryan JP等(1995)J Biol Chem.270(2)：551-557)。然而，被切割的结构域的功能是未知的。
在专利文献WO 03/068983中描述了与人AxI基因和基因产物有关的结构信息。下列专利文献也涉及AxI或其他受体酪氨酸激酶：US 5,468,634；US 6,087,144；US 5,538,861；US 5,968,508；US6,211,142；US 6,235,769；WO 99/49894；WO 00/76309；WO 01/16181和WO 01/32926。
AxI参与细胞增殖的刺激。具体而言，AxI为慢性粒细胞白血病相关致癌基因，其与结肠癌和黑色素瘤也有关。AxI邻近位于19q13.1-q13.2的bcl3致癌基因。AxI基因在脊椎动物物种之间是进化保守的，并且在间质细胞的发育过程中表达。
与Gas6配体互相作用时，AxI开始自磷酸化，并且发生级联信号转导事件。已知PI3K、AKT、src、Bad、14-3-3、PLC、ERK、S6K(有丝分裂原调节激酶)和STAT均参与该级联反应。Gas6具有富含y-羧基谷氨酸的区域(GLA结构域)，其允许Ca++依赖性结合至膜磷脂。Gas6是弱的有丝分裂原并且在NIH3T3成纤维细胞受到TNF诱导的细胞毒性或去除生长因子的压力时具有抗凋亡的效应。在NIH3T3中，Gas6与AxI的结合可以激活PI3K、AKT、src和Bad。
已有研究表明AxI在肿瘤形成中起了很多不同的作用。AxI在包括内皮细胞迁移、增殖和管生成在内的血管生成行为中是关键的调节子。人乳腺癌细胞在体内形成肿瘤也需要AxI，表明AxI调节的是对新生血管和肿瘤发生而言关键的过程(Holland S.等，Cancer Res2005；65(20)，2005年10月15日)。
AxI受体酪氨酸激酶的活性与肿瘤转移正相关。更具体而言，已有研究表明AxI能增强AxI介导的侵染所需的MMP-9的表达。AxI通过NF-Bκ和Brg-1的活化诱导MMP-9的活性从而促进细胞侵染(Tai，K-Y等，Oncogene  (2008)，27，4044-4055)。
AxI在人胶质瘤细胞中过表达，并且可以用于预测患有多形性成胶质细胞瘤(GBM)患者的不良预后(Vajkoczy P.等，PNAS，April 11，2006，vol 103，no.15，5799-5804；Hutterer M.等，Clinical Cancer Res2008；14(1)Jan 1，2008)。与最小侵染性肺癌细胞株相比，AxI还在高侵染性肺癌细胞株中相对地过表达(Shieh，Y-S等，Neoplasia，vol 7，no.12，Dec 2005，1058-1064)。因此认为AxI在肿瘤侵染和发展中起到极为重要的作用。
类似地，AxI在高侵染性乳腺癌细胞中过表达，而在低侵染性乳腺癌细胞中没有过表达。更具体而言，抑制AxI的信号传导(通过显性失活的AxI突变体、针对AxI的胞外结构域的抗体、或短发夹RNA基因抑制AxI)降低了高侵染性乳腺癌细胞的迁移和侵染性。小分子AxI抑制剂干扰了乳腺癌细胞的迁移和侵染。因此，AxI被认为是控制乳腺癌细胞迁移/侵染的信号传导网络中的关键因素(Zhang，Y-X等，Cancer Res 2008；68(6)，March 15，2008)。
在系膜细胞中发现Gas6具有致有丝分裂效应，指示其可能在肾血管球硬化症中起了一定的作用。已有证据表明Gas6/AxI通路在肾小球肾炎中也起了一定作用(Yanagita M.等，The Journal of ClinicalInvestigation，2002，110(2)239-246)。进一步的研究表明在动脉损伤模型中，Gas6促进内皮细胞的存活。已经表明，在血管平滑肌细胞中，血管紧张肽II通过其AT 1受体增加了AxI的mRNA和蛋白受体(Melaragno M.G.等，Circ Res.，1998，83(7)：697-704)。
已经证实AxI参与免疫系统中细胞粘附、细胞的增殖和动态平衡的调节(Lu Q.，2001，Science 293(5528)：306-311)。AxI活化后，观测到以下现象：凋亡的抑制、成纤维细胞和内皮细胞在“正常”细胞(非转化)存活方面的增多、血管平滑肌细胞(VSMC)的迁移(AxI激酶的失活阻断了迁移)、血管壁中新内膜形成的增强(Melaragno M.G.等，Trends Cardiovasc Med.，1999，(Review)9(8)：250-253)以及参与动脉粥样硬化的病变形成和发展。
本发明旨在提供与AxI有关的新的诊断、预测和治疗应用。特别是，本发明致力于提供检测上皮-间质转化(EMT)发生的方法，其在癌症(更具体为转移性和抗药性癌症)的治疗中具有治疗意义。
发明内容
本发明的第一个方面涉及AxI作为生物标志物用于检测受试者中的上皮-间质转化(EMT)的发生的用途。
本发明基于AxI表达与上皮-间质转化(EMT)的发生相关这一发现。据我们所知，本发明第一次提出了这种相关性。有利的是，这一发现开辟了令人振奋的新机遇，其用于在癌症领域(更特别是转移性和抗药性癌症领域)中提供诊断、预测和治疗方法。
本发明人已经证实了受体酪氨酸激酶AxI在侵染转移级联反应中作为必需的EMT诱导效应物这一以前从未意识到的作用。结果表明EMT过程的激活导致AxI上调，这对恶性乳腺癌细胞的侵染力和自发转移以及抗药性表型而言是关键的。AxI表达与乳腺癌患者的死亡率(包括间期乳腺X光检测的肿瘤和临床鉴定的乳腺肿瘤)密切相关，表明了AxI激活与转移性疾病的发展之间的联系。
本发明的第二个方面涉及检测样品中的上皮-间质转化(EMT)的发生的方法，所述方法包括以下步骤：
(i)从细胞、细胞群、动物模型或人中分离样品；
(ii)与对照样品相比，确定样品中AxI的表达，其中相比于对照样品，AxI表达的上调指示上皮-间质转化(EMT)的发生。
有利的是，AxI表达的确定提供了检测EMT事件发生的“永久性”标志物，而实际上EMT事件发生自身是瞬时的。因此，AxI表达的检测提供了EMT事件是否已经发生的独特而永久的指标。
本申请人的研究已经表明这是因为与EMT相关的激活建立了对恶性细胞有利的自分泌AxI-Gas6信号传导回路。AxI也可通过旁分泌机制激活。
已经发生EMT的肿瘤细胞的检测是复杂的，这是因为其体现在现有的标志物(如波形蛋白、N-钙粘着蛋白、缺乏E-钙粘着蛋白)基于在正常基质细胞中存在的间质细胞骨架和连接蛋白。区分肿瘤细胞与周围的基质细胞是困难的。AxI的表达更可能被限制在实体瘤的肿瘤细胞中，从而为恶性肿瘤细胞提供了显著的区分特征。
EMT的可逆性对于在远端形成转移是重要的。AxI的表达可用于检测转移。
本发明的第三个方面涉及通过检测上皮-间质转化(EMT)的发生来诊断受试者中转移性癌症的方法，包括确定从受试者获取的样品中的AxI受体多肽的水平，其中所述多肽的水平比未患转移性癌症的受试者的水平更高指示上皮-间质转化(EMT)的发生。
本发明的第四个方面涉及AxI或编码AxI的基因在监测能够抑制或逆转上皮-间质转化(EMT)的试剂的活性中的用途。
本发明的第五个方面涉及鉴定能够抑制或逆转上皮-间质转化(EMT)的试剂的方法，所述方法包括将所述试剂施予细胞、细胞群、动物模型或人，并监测AxI的活性和/或表达。
本发明的第六个方面涉及检测抑制或逆转上皮-间质转化(EMT)的试剂的能力的方法，所述方法包括：
(i)将所述试剂施予细胞、细胞群、动物模型或人；
(ii)测量来源于已处理或未处理的细胞、动物或人的样品中AxI的表达；以及
(iii)检测已处理样品中AxI的表达或活性相比于未处理样品的增加或减少，作为抑制或逆转上皮-间质转化(EMT)的能力的指标。
本发明的第七个方面涉及监测AxI抑制剂活性的方法，所述方法包括通过下述步骤检测上皮-间质转化(EMT)的发生：
(i)将所述AxI抑制剂施予细胞、细胞群、动物模型或人；以及
(ii)测量来源于已处理或未处理的细胞、动物或人的样品中AxI的表达；以及
(iii)检测已处理样品中AxI的表达或活性相比于未处理样品的增加或减少，作为AxI抑制活性的指标。
本发明的第八个方面涉及鉴定能够抑制或逆转上皮-间质转化(EMT)的试剂的方法，所述方法包括以下步骤：
(i)将所述试剂与AxI受体或表达所述AxI受体的细胞接触；
(ii)在所述试剂的存在下测量AxI受体的活性；以及
(iii)将步骤(ii)中测得的活性与在对照条件下测得的活性相比较，其中活性降低表明所述试剂能够抑制或逆转上皮-间质转化(EMT)。
本发明的第九个方面涉及通过筛选多种试剂来鉴定能够抑制或逆转上皮-间质转化(EMT)的试剂的方法，所述方法包括以下步骤：
(i)将所述多种试剂与AxI受体或表达所述AxI受体的细胞接触；
(ii)在所述多种试剂的存在下测量AxI受体的活性；
(iii)将步骤(ii)中测得的活性与在对照条件下测得的活性相比较，其中活性降低表明所述多种试剂能抑制或逆转上皮-间质转化(EMT)；以及
(v)分别确定所述多种试剂中的哪种或哪些试剂能够抑制或逆转上皮-间质转化(EMT)。
本发明的第十个方面涉及根据本发明方法鉴定得到的试剂在制备用于治疗转移性癌症的药物中的用途。
本发明的第十一个方面涉及包含根据本发明方法鉴定得到的试剂与可药用的稀释剂、赋形剂或载体的混合物的药物组合物。
本发明的第十二个方面涉及制备组合物的方法，包括：
(i)使用根据本发明的方法鉴定能够抑制或逆转上皮-间质转化(EMT)的试剂；以及
(ii)将所述试剂与可药用的稀释剂、载体或赋形剂混合。
本发明的第十三个方面涉及抑制或逆转需要接受治疗的受试者中的上皮-间质转化(EMT)的方法，所述方法包括将AxI抑制剂施予所述受试者。
本发明的第十四个方面涉及对需要接受治疗的受试者中的转移性癌症进行治疗的方法，所述方法包括通过对所述受试者施予AxI抑制剂，从而抑制或逆转上皮-间质转化(EMT)。
本发明的第十五个方面涉及AxI抑制剂在制备用于抑制或逆转上皮-间质转化(EMT)的药物中的用途。
本发明的第十六个方面涉及AxI抑制剂在制备通过抑制或逆转上皮-间质转化(EMT)来治疗转移性癌症的药物中的应用。
本发明的第十七个方面涉及用于评价抑制或逆转上皮-间质转化(EMT)的试剂能力的试剂盒，所述试剂盒包含抗AxI抗体、针对AxI的核酸探针或针对AxI的QPCR引物。
本发明的第十八个方面涉及如上述限定的试剂盒在本发明的方法中的用途。
发明详述
转移是大多数癌症相关死亡的根本原因。因此，进一步理解能够使肿瘤细胞扩散的分子机制是一个重要的健康问题。上皮-间质转化(EMT)赋予癌细胞增强的迁移和存活特性，其促进恶性发展。EMT效应物的表征可能为转移和治疗的新途径产生新的认识。本申请人已经示出了，在乳腺X光检测的原发性乳腺癌中受体酪氨酸激酶AxI的存在独立地预示了显著降低的总体患者存活率，并且匹配的患者的转移病灶显示出增强的AxI表达。本申请人也证明了AxI受到恶化前乳腺上皮细胞中的上皮-间质转化的强烈诱导，其中AxI与其配体Gas6建立了自分泌信号传导回路。通过在转移性乳腺癌细胞中采用表观等位基因(epi-allelic)RNA干扰分析，本申请人划定了间质细胞类体外细胞侵染以及在体内异体和组织工程微环境中形成肿瘤的AxI表达的不同阈值。重要的是，在两种不同的基于光学成像的实验乳腺癌模型中AxI基因抑制(knockdown)完全防止了高转移性乳腺癌细胞从乳腺到淋巴结和几个主要器官的扩散，并且增加了总体生存率。因而，AxI代表了乳腺癌转移所需的肿瘤细胞EMT的新下游效应物。对表达AxI的肿瘤的检测和针对性的治疗代表了乳腺癌的新的重要治疗策略。
AxI在EMT和转移中的作用
间质细胞的细胞特性的获取赋予上皮癌细胞与转移相关的单细胞侵染细胞能动性(Theirry，2002Weinberg，2007)。
如上所述，本发明人已经证明AxI是侵染-转移级联反应中关键的EMT诱导效应物。结果表明EMT过程激活导致AxI上调，其对恶性乳腺癌细胞侵染和自发转移是关键的。从间期乳腺X光检测的肿瘤来看，AxI的表达与乳腺癌患者死亡率密切相关，表明了AxI激活和转移性疾病的发展之间的联系。
AxI在功能性基因筛选中最初被鉴定为侵染性细胞转移的关键调节子(Holland等，2005)。我们这里证明了响应不同趋化诱导物(血清、SDF-1)，在三维基质中AxI在恶性乳腺癌细胞中的表达是侵染力所需要的。与此形成对比的是，我们观察到在基于平板的2D分析(增殖、刮痕)或细胞粘附中，AxI基因抑制几乎没有效应。对Ax I的抑制也抑制了胶质瘤和肺癌细胞的迁移而不影响增值(Angelillo-Scherrer等，2005；Shieh等，2005)。因此，共同的主旨是AxI信号传导是恶性肿瘤细胞中的间质细胞迁移表型所必需的。
与此一致，我们证明了AxI代表了由多种转录因子(包括Twist、Snail、Slug和ZEP2)诱导的EMT的新标志物。这些转录因子在上皮细胞的表达引起瞬时上调上皮细胞中的间质细胞特征的正常发展程序。恶化前上皮细胞被认为是通过线索信号(如局部基质细胞发出的TGFβ)来激活EMT(Weinberg，2007)。由于EMT相关标志物的表达(如E-钙粘着蛋白)在肿瘤中变化很大，该过程在体内是动态的。事实上在我们的研究中，AxI是独立的预兆指标，并且与E-钙粘着蛋白的变化不相关。EMT的临床证据的缺乏被广泛记载并且受到争议。本申请人已经证明AxI的表达代表更持久的EMT诱导的变化。
为了确定AxI是否对乳腺微环境的转移是必需的，我们将高转移性(体内传代)的乳腺癌细胞系(MDA-231-DH2LN)移植到乳腺中，并通过荧光素酶生物发光的体内光学成像监测扩散。在所有对照小鼠中植入28天内，整体时域光学成像(temporal whole body opticalimaging)显示MDA-231-DH2LN大范围扩散到淋巴结、肺、卵巢和肾脏。在最初4个星期，在所有动物中均检测到自发性淋巴结转移灶。在之后的9周均检测到器官转移灶。处死动物后，将切除的器官分别扫描，显示出包含转移灶，之后经组织学得到证实。相比之下，通过生物发光或组织学，在具有AxI  基因抑制细胞(MDA-231-DHLN-AxIshRNA)的小鼠器官中没有检测到转移灶。这种对原发乳腺部位的扩散强烈的抑制作用表明，AxI是转移所必需的。
综上所述，我们的结果表明对表达AxI的乳腺肿瘤的检测和针对性治疗是乳腺癌治疗发展的重要的新战略。
诊断工具
本发明的一个方面涉及检测上皮-间质转化(EMT)发生的诊断工具。
因此，在第一个方面中，本发明涉及AxI作为生物标志物用于检测受试者中的上皮-间质转化(EMT)的发生的用途。
在一个优选实施方案中，AxI为用于检测上皮-间质转化(EMT)发生的生物标志物。
实体瘤导致的死亡中以转移到远端部位为最主要的诱因(Gupta2006，Sporn 1996)。为实现这一点，肿瘤细胞解除上皮的限制，重新定义连接复合体，并获得侵染性运动以穿过整个基膜界限。这些转移性细胞之后进入淋巴和血行循环，传播到体内的远端部位。这些转移性细胞中的一些成功透出毛细血管壁，并在极少数情况下侵染异源组织基质(Weinberg等)。该恶化过程受到上皮-间质转化(EMT)的促进，其为这样一种发展过程：在原肠胚形成和器官发生期间，上皮细胞瞬时呈现间质细胞表型，从而允许单细胞侵染性运动远离上皮层(Hall，1985；Thierry，2002)。EMT过程由成形素信号传导通路的情况激活所启动，所述成形素信号传导通路诱导转录调节子(包括Twist、Snail、Slug和Zeb2)的表达，并改变连接复合体蛋白的表达(Thiery和SLeeman 2006)。伴随波形蛋白和N-钙粘着蛋白的诱导，EMT基因表达谱反映了表型的转变、E-钙粘着蛋白和细胞角蛋白的抑制(Weinberg等，2007)。
本发明的另一个方面涉及AxI作为生物标志物用于检测和监测恶性肿瘤的用途。
本发明的另一个方面涉及AxI作为生物标志物用于检测肿瘤转移的用途。优选地，所述肿瘤为癌，更优选为乳腺癌。
在一个实施方案中，本发明提供了用于确定受试者是否为接受AxI抑制剂治疗的合适候选者的诊断方法。例如，如果AxI的表达显示出上调，则这可以用作治疗方案和执行的指导(即个性化医疗应用的预测)，从而选择可能对采用AxI抑制剂的治疗易感的受试者。例如，如果原发瘤中AxI的表达显示出上调，则可用于推测转移的概率增加。该信息可用作治疗方案的指导(即在个性化医疗应用的预测)，从而选择可能需要更积极的抗癌手术、化疗或放疗(如根治性乳房切除术)的受试者。
因此，本发明的另一个方面涉及用于确定受试者是否对会采用AxI抑制剂的治疗易感的方法，所述方法包括以下步骤：
(i)从细胞、细胞群、动物模型或人中分离样品；
(ii)与对照样品相比，确定样品中AxI的表达，其中相比于对照组，AxI表达的上调指示对采用AxI抑制剂的治疗易感。
如本文所用，术语“标志物”或“生物标志物”是指其在来源于细胞或哺乳动物的样品中的表达被改变或被调节的基因或蛋白，例如，当上皮-间质转化(EMT)发生时，其被上调或下调。当生物标志物为蛋白质时，表达的调节或改变包括通过不同的翻译后修饰进行的调节。
翻译后修饰为共价处理事件，其通过溶蛋白性裂解或向一个或多个氨基酸添加修饰性基团来改变蛋白质性质。常用的翻译后修饰包括磷酸化、乙酰化、甲基化、酰基化、糖基化、GPI锚定、泛素化等。这样的修饰和检测方法的综述可在文献“Mann等NatureBiotechnology March 2003，Vol.21，pages 255-261”中找到。
在一个优选实施方案中，AxI的上调指示上皮-间质转化(EMT)的发生。
本发明的另一个方面涉及检测样品中的上皮-间质转化(EMT)的发生的方法，所述方法包括以下步骤：
(i)从细胞、细胞群、动物模型或人中分离样品；
(ii)与对照样品相比，确定所述样品中AxI的表达，其中相比于对照样品，AxI表达的上调指示上皮-间质转化(EMT)的发生。
本发明的另一个方面涉及通过检测上皮-间质转化(EMT)的发生来诊断受试者中转移性癌症的方法，所述方法包括确定从受试者获取的样品中AxI受体多肽的水平，其中所述多肽表达水平比未患转移性癌症的受试者中的水平更高指示上皮-间质转化(EMT)的发生。
特别是，所关注的癌症包括任意的癌，更优选为乳腺、肺、胃、头颈部、大肠、肾、胰腺、子宫、肝、膀胱、子宫内膜和前列腺癌以及白血病。更优选为转移性乳腺癌。
优选地，采用抗AxI抗体或亲和性试剂测量AxI基因的表达或AxI受体多肽的水平。
新治疗剂的诊断
本发明的另一个方面涉及用于鉴定能够抑制或逆转上皮-间质转化(EMT)的试剂的诊断分析，从而在增生性疾病(如癌症)的治疗中具有潜在的治疗应用。
因而，本发明的一个方面涉及AxI或编码AxI的基因在监测能够抑制或逆转上皮-间质转化(EMT)的试剂的活性中的用途。
在一个优选实施方案中，将能够抑制或逆转上皮-间质转化(EMT)的试剂施予细胞、细胞群、动物模型或人，然后监测AxI的存在。
本发明的另一个方面涉及用于鉴定能够抑制或逆转上皮-间质转化(EMT)的试剂的方法，所述方法包括将所述试剂施予细胞、细胞群、动物模型或人，并监测AxI的活性和/或表达。
在一个优选实施方案中，所述方法包括将所述试剂施予细胞、细胞群、动物模型或人，并检测已处理的样品相比于未处理对照样品的AxI表达的改变。
“改变的表达”意思是相比于未处理的对照样品，来源于已处理细胞的样品中表达的增加、减少或以其它方式调节的水平或模式。
术语“表达”是指基因的DNA模板的转录以产生相应的mRNA和该mRNA的翻译以产生相应的基因产物(即肽、多肽、或蛋白质)，以及已经发生翻译后修饰的一种或多种形式的蛋白质的“表达”。
改变的表达(包括基因表达)的检测可以通过本领域所知的任意一种方法进行，尤其是通过微阵列分析、Western印迹或PCR技术(如QPCR)进行。改变的表达也可通过采用本文所述的方法(如ELISA、PET或SELDI-TOF MS)和进一步使用分析技术(如2D凝胶电泳)分析样品中蛋白含量而进行检测。诸如这样的技术可特别用于检测处于蛋白质的可选的翻译后修饰形式的改变的表达形式。
本发明的另一个方面涉及用于检测试剂的抑制或逆转上皮-间质转化(EMT)的能力的方法，所述方法包括：
(i)将所述试剂施予细胞、细胞群、动物模型或人；以及
(ii)测量来源于已处理或未处理的细胞、动物或人的样品中的AxI的表达；以及
(iii)检测已处理样品相比于未处理样品的AxI表达的增加或减少，作为抑制或逆转上皮-间质转化(EMT)的能力的指标。
所述抑制可以在任意水平(如在基因表达水平或蛋白质水平)。
本发明的另一个方面涉及监测AxI抑制剂的活性的方法，包括通过下述步骤检测上皮-间质转化(EMT)的发生：
(i)将所述AxI抑制剂施予细胞、细胞群、动物模型或人；以及
(ii)测量来源于已处理或未处理的细胞、动物或人的样品中的AxI表达；以及
(iii)检测已处理样品相比于未处理样品的AxI表达或活性的增加或减少，作为AxI抑制活性的指标。
从该方面来说，样品优选通过蛋白质分析进行分析，更优选通过ELISA、PET、流式细胞术、SELDI-TOF MS或2-D PAGE进行分析。
如本文所用，来源于处理或未处理细胞的样品可以为来源于组织培养物或动物或人的一组细胞的裂解液、提取物或核酸样品。对于蛋白质分析，样品可以为组织培养上清液。细胞可从个体分离(如来自血液、血清或血浆样本的全细胞)，或可以为组织样本的一部分(如活组织检查样品)。
优选的，所述的一组细胞为细胞培养物。
优选的细胞类型选自结肠肿瘤细胞系(如HT29)、肺肿瘤细胞系(如A549)、肾肿瘤细胞系(如A498)、膀胱肿瘤细胞系(如HT 13)、乳腺肿瘤细胞系(如MDA-MB-231)、子宫内膜肿瘤细胞系(如AN3CA)、子宫肿瘤细胞系(如MESSA DH6子宫肉瘤细胞)、肝肿瘤细胞系(如Hep2G)、前列腺肿瘤细胞系(如DU145)、T细胞肿瘤细胞系(如Cem T细胞)、胰肿瘤细胞系(如MiaPaCa2)。或者，细胞可以是肿瘤活检组织学样品(如激光捕获显微手术获得的样品)的形式。在活检样品中检测基因表达的合适的方法包括：使用能识别本文所确定的基因的抗体的FISH或免疫组织化学技术，以及分析样品中蛋白质组成的方法。
另外，所述细胞可为血细胞培养物如PBMC。如本文所用，术语“PBMC”是指外周血单核细胞并且包括PBL(外周血淋巴细胞)。
适宜地，监测取自哺乳动物或人类的样品中的表达改变，包括基因表达的改变。合适的样品包括(但不限于)组织样品，如活检样品、血、尿、口腔擦拭物等。在一个实施方案中，基因表达的检测优选在肿瘤细胞中进行，所述肿瘤细胞特别是源于肿瘤(如乳腺、肺、胃、头颈部、大肠、肾、胰腺、子宫、肝、膀胱、子宫内膜和前列腺癌以及白血病)的细胞或来自血细胞(如淋巴细胞，优选外周血单核细胞，如PBMC)的细胞。
在另一个实施方案中，对改变的蛋白质表达的检测在来自哺乳动物或人的血清或血浆或组织培养上清液中进行。
在检测患者的血清以及尤其是血浆样品中的蛋白质时，样品被取出，并进行本文所述的蛋白质分析技术，如流式细胞术、ELISA、PET和SELDI-TOF MS。
在一个优选实施方案中，所述方法包括从所述样品中提取RNA和通过QPCR检测基因表达。
在另一个实施方案中，基因表达的检测通过检测蛋白质产物(如通过Western印迹法)进行。
本发明的另一个方面涉及用于鉴定能够抑制或逆转上皮-间质转化(EMT)的试剂的方法，所述方法包括以下步骤：
(i)将所述试剂与AxI受体或表达所述AxI受体的细胞接触；
(ii)在所述试剂的存在下测量AxI受体的活性；以及
(iii)将步骤(ii)中测得的活性与在对照条件下测得的活性相比较，其中活性降低表明所述试剂能够抑制或逆转上皮-间质转化(EMT)。
优选地，测定的活性为AxI受体底物的酪氨酸磷酸化程度。
更优选地，测定的活性为AxI受体的自磷酸化程度。
对于这个具体的实施方案，优选接触步骤(i)中的细胞已经预先被AxI基因转染。
更优选地，所述转染的细胞为瞬时或稳定转染的。
在一个优选实施方案中，步骤(iii)中的对照条件包括将试剂与缺乏活性AxI基因的细胞接触。更优选的是，所述细胞具有AxI基因的突变的失活形式。
在另一个优选实施方案中，步骤(iii)中的对照条件包括将活性与试剂不存在时测得的活性相比较。
在一个特别优选的实施方案中，AxI受体包括胞内结构域的生物学活性部分。
在一个优选实施方案中，AxI受体是固定化的，例如通过附着到固相上而固定化。
本发明的另一个方面涉及用于通过筛选多种试剂来鉴定能够抑制或逆转上皮-间质转化(EMT)的试剂的方法，所述方法包括以下步骤：
(i)将所述多种试剂与AxI受体或表达所述AxI受体的细胞接触；
(ii)在所述多种试剂的存在下测量AxI受体的活性；
(iii)将步骤(ii)中测得的活性与在对照条件下测得的活性相比较，其中活性降低表明所述多种试剂能够抑制或逆转上皮-间质转化(EMT)；以及
(v)分别确定所述多种试剂中的哪种或哪些试剂能够抑制或逆转上皮-间质转化(EMT)。
在本发明上述的方法中，所述试剂优选地用于治疗转移性癌症。
通过所述方法鉴定的试剂
另一方面涉及根据上述任意方法鉴定得到的试剂在制备用于治疗转移性癌症的药物中的用途。
优选地，所述癌症选自乳腺、肺、胃、头颈部、大肠、肾、胰腺、子宫、肝、膀胱、子宫内膜和前列腺癌和白血病。更优选地，所述癌症为乳腺癌。
基因/蛋白标志物的表达改变的测量
可采用许多不同的技术确定基因和蛋白质表达水平。
(a)在RNA水平
可在RNA水平下检测基因表达。可采用RNA提取技术从细胞中提取RNA，所述技术包括(例如)使用酚/异硫氰酸胍提取(RNAzolB；Biogenesis公司)、RNeasy RNA制备试剂盒(Qiagen公司)或PAXgene(PreAnalytix公司，瑞士)。利用核糖核酸杂交的典型分析模式包括核运行分析、RT-PCR、RNA酶保护分析(Melton等，Nuc.Acids Res.12：7035)、Northern印迹和原位杂交。还可通过如下所述的微阵列分析来检测基因表达。
对于Northern印迹，首先通过在变性条件下用琼脂糖凝胶电泳根据大小分离RNA样品。然后将RNA转印到膜上，交联并与标记探针杂交。可以使用非同位素或高特异性活性放射标记探针，其包括随机引物的、缺口翻译的或PCR产生的DNA探针，在体外转录的RNA探针和寡核苷酸。此外，只具有部分同源性的序列(例如得自可能含有外显子的不同物种或基因组DNA片段的cDNA)可用作探针。
核酸酶保护分析(包括核糖核酸酶保护分析和S1核酸酶分析)提供了用于检测和定量特定mRNA的高灵敏方法。NPA的基础为反义探针(放射性标记的或非同位素的)与RNA样品的溶液杂交。杂交后，单链未杂交的探针和RNA被核酸酶降解。留下的经保护的片段在丙烯酰胺凝胶上分离。NPA允许同时检测多种RNA种类。
原位杂交(ISH)是用于特定mRNA在细胞或组织中的定位的强大和灵活的工具。探针的杂交发生在细胞或组织内。由于整个过程中细胞结构得到保持，因此ISH提供了mRNA在组织样品中的位置信息。
该过程通过在中性缓冲福尔马林中固定样品，并将组织包埋在石蜡中而开始。然后将样品切成薄片，并放置到显微镜玻片上。或者，可以将组织切片冷冻并且在多聚甲醛中后固定。在将切片经过一系列清洗以脱蜡和再水化后，进行蛋白酶K消化以增加探针的进入度，然后将标记的探针与样品切片杂交。放射性标记探针通过切片上干燥后的液膜而显现，而非同位素标记的探针则采用比色法或荧光试剂来简便地检测。后者的检测方法是荧光原位杂交(FISH)技术的基础。
检测可采用的方法包括放射性标记、酶标记、化学发光标记、荧光标记和其他合适的标记。
通常，RT-PCR用于扩增RNA目标物。在这个过程中，逆转录酶用于将RNA转换为互补的DNA(cDNA)，然后将其扩增以方便检测。相对定量RT-PCR技术包括同时扩增内部对照物以及所关注的基因。内部对照物用于校正样品。一旦进行校正，可在样品之间对特定mRNA的相对丰度进行直接比较。常用的内部对照物包括(例如)GAPDH、HPRT、肌动蛋白和亲环蛋白。
许多DNA扩增方法是已知的，其中大部分都依赖于酶的链式反应(如聚合酶链式反应、连接酶链式反应、或自身持续序列复制)或将全部或部分载体复制进入被克隆的DNA。
许多目标和信号放大(TAS)方法已在文献中记载，例如文献“Landegren，U.等，Science 242：229-237(1988)”和“Lewis，R.，Genetic Engineering News 10：1，54-55(1990)”对这些方法进行了综述。
PCR为在(例如)专利文献US 4,683,195和4,683,202等中描述的核酸扩增方法。PCR在诊断情况中可用于扩增任意已知的核酸(Mok等，1994，Gynaecologic Oncology 52：247-252)。自身持续序列复制(3SR)是TAS的一种变形，其包括借助于逆转录酶(RT)、聚合酶和核酸酶活性的顺次循环(通过多种酶混合液和合适的寡核苷酸引物介导)而等温扩增核酸模板(Guatelli等，1990，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：1874)。连接扩增反应或连接扩增系统使用DNA连接酶和4种寡核苷酸(每种目标链两种)。该技术在文献“Wu，D.Y.和Wallace，R.B.，1989，Genomics 4：560”中有所描述。在Qβ复制酶技术中，复制单链RNA的噬菌体Qβ的RNA复制酶用于扩增目标DNA(如文献“Lizardi等，1988，Bio/Technology 6：1197”所述的那样)。
定量PCR(Q-PCR)为获得待确定的样品中转录物的相对量的技术。本文描述了执行QPCR的合适方法。
在本发明中可以采用其它可供选用的扩增技术。例如，滚环(rolling circle)扩增(Lizardi等，1998，Nat Genet 19：225)是市售可得的扩增技术(RCATTM)，其由DNA聚合酶推动并且可以在等温条件下以线性或几何动力学复制环形寡核苷酸探针。另一项技术-链置换扩增(SDA；Walker等，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.USA80：392)以专属于特定目标物的特别确定的序列开始。
用于检测本文鉴定的AxI表达的合适的探针可处于合适的容器中方便地封装为检测试剂盒的形式。在这种试剂盒中，探针可以结合到到固体载体上，其中试剂盒所针对的设计的分析模式需要这种结合。该试剂盒可以包含用于处理待探测样品、将探针与样品中核酸杂交的合适试剂，对照试剂，用法说明等。合适的试剂盒可包括(例如)QPCR反应的引物或执行FISH的标记探针。
(b)在多肽水平
改变的基因或蛋白质表达也可通过测量由AxI基因编码的多肽检测。这可通过采用能结合AxI基因编码的多肽的分子实现。直接或间接结合多肽以检测蛋白的存在的合适的分子/试剂包括天然形成的分子如肽和蛋白质(例如抗体)，或者其也可以是合成分子。
AxI的基因或蛋白质的抗体可由市售来源得到或通过本领域技术人员熟知的技术获得。在一个实施方案(其中改变的表达通过蛋白生物标志物的翻译后修饰形式的改变的表达自我表征)中，可采用特异性针对这些不同形式的抗体。
抗体的制备方法是本领域技术人员已知的。如果需要多克隆抗体，则用具有多肽表位的免疫原多肽来接种所选的动物(例如，鼠、兔、羊、马等)。收集接种动物的血清，并且根据已知的程序处理。如果含有针对多肽表位的多克隆抗体具有针对其它抗原的抗体，则可采用免疫亲和层析来纯化该多克隆抗体。多克隆抗血清的制备和处理技术为本领域已知。为了产生较大的免疫原性反应，多肽或其片段可经半抗原修饰为另一多肽，以用作动物或人体的免疫原。
针对多肽中表位的单克隆抗体也可由本领域技术人员容易地制备。由杂交瘤细胞制备单克隆抗体的一般方法是众所周知的。可通过细胞融合来构建永久的制备抗体的细胞株，并且也可通过其他技术(如用致癌DNA直接转化B淋巴细胞或用EB病毒传染)制备。针对本发明多肽表位制得的单克隆抗体群可通过各种特性(即同型和抗原表位亲和性)筛选。
另一项可供选用的技术包括筛选噬菌体展示库，其中，(例如)噬菌体在其外壳表面表达scFv片段，其中所述外壳具有一系列互补决定区(CDR)。这种技术是本领域中众所周知的。
根据本发明的目的，除非另外指明，否则术语“抗体”包括全抗体，或全抗体的保留了其靶抗原结合活性的片段。这些片段包括Fv、F(ab′)和F(ab′)2片段，以及单链抗体(scFv)。另外，抗体及其片段可以为在(例如)EP239400A中所述的人源化抗体。本文所用的术语“抗体”还包括类抗体亲和试剂。例如：单克隆和多克隆抗体、重组抗体、抗体的蛋白水解和重组片段(Fab、Fv、scFv、双抗体)、单结构域抗体(VHH、sdAb、纳米抗体、IgNAR、VNAR)以及构建为具有类抗体特异结合性的与抗体无关的蛋白质，具体如下：
Figure BDA0000107618580000181
如上所述，诸如免疫印迹等标准实验技术可用于检测AxI活性相比于相同细胞群的未处理细胞的改变水平。
基因表达也可通过检测多肽的翻译后加工或核酸的转录后修饰的变化来确定。例如，可以测量多肽的差异磷酸化、多肽的断裂或RNA的选择性剪接。可通过采用专门的蛋白质分析法或诸如2D聚丙烯酰胺凝胶电泳等技术来检测基因产物(如多肽)的表达水平以及它们的翻译后修饰的表达水平。
可通过下列方法将抗体用于检测AxI的表达，所述方法包括：(a)提供本发明所述的抗体；(b)在允许形成抗体-抗原复合物的条件下将生物样品与所述抗体孵育；(c)确定是否形成包含所述抗体的抗体-抗原复合物。
合适的样品包括组织提取物，所述组织例如为大脑、乳房、卵巢、肺、结肠、胰腺、睾丸，肝、肌肉和骨组织，或来源于这些组织的赘瘤。其他合适的例子包括血液或尿液样品。
特异性结合AxI蛋白的抗体可用于本领域技术人员众所周知的诊断或预测方法和试剂盒中，以检测或定量体液或组织中AxI蛋白的表达。上述测试的结果可用于诊断或预测癌症和其他细胞运动或细胞存活介导的疾病的发生或复发，或评价药物剂量和治疗的有效性。
可通过本领域已知的任意方法分析抗体的免疫特异性结合。可采用的免疫分析包括(但不限于)竞争性和非竞争性分析系统，其采用的技术例如为western印迹、免疫组织化学、放射性免疫分析、ELISA、夹心免疫分析、免疫沉淀分析、沉淀素反应、凝胶扩散沉淀反应、免疫扩散分析、凝集反应分析、补体固定分析、免疫放射分析、荧光免疫分析和蛋白A免疫分析。
上述分析法为本领域的常规技术(参见(例如)文献“Ausubel等，eds，1994，Current Protocols in Molecular Biology，Vol.1，JohnWiley & Sons，Inc.，New York”，其全文以引用方式并入本文中)。
本发明所用的抗体优选结合到固体载体，并且/或者处于合适的容器中与合适的试剂、对照物、说明等一起封装在试剂盒内。
其它方法包括(但不限于)2D-PAGE，虽然这较为不适合大规模筛选。更新的技术包括基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)。在MALDI-TOF分析中，将复杂混合物中的蛋白质都固定在固态金属基体中，用脉冲激光束解吸附以产生横穿零场飞行管的气态离子，然后根据其质量依赖的速度分离。可通过使用信息工具搜索蛋白质和多肽序列数据库鉴定每种蛋白质和多肽。表面增强激光解吸/电离飞行时间质谱(SELDI-TOF MS)是一种基于亲和性的质谱，其中蛋白质被选择地吸附到化学修饰的固体表面，通过洗涤除去杂质，应用吸收能量的基质，并且通过激光解吸质谱分析鉴定蛋白质。
SELDI-TOF-MS可用于检测完整的蛋白或特定蛋白质片段的存在/缺失。此外SELDI-TOF-MS也可因为由化学基团的添加/去除所导致的质量差异而用于检测蛋白质的翻译后修饰。因此，单个残基的磷酸化由于磷酸酯基团而导致80Da的质量变化。可由翻译后修饰产生的分子量的数据库可在互联网上自由获得(http://www.abrf.org/index. cfm/dm.home？avgmass＝all)。此外，特定的多肽可采用SELDI-TOF-MS通过基于亲和性的方法用抗体捕获，其中所述抗体能特异性识别蛋白质的翻译后修饰形式，或者可同等识别蛋白质的所有形式。
阵列
一般来说，阵列技术和与之相关的各种技术及应用在众多的教科书和文件中均有描述。这些包括文献Lemieux等，1998，MolecularBreeding 4：277-289；Schena和Davis.Parallel Analysis with BiologicalChips，in PCR Methods Manual(eds.M.Innis，D.Gelfand，J.Sninsky)；Schena和Davis，1999，Genes，Genomes and Chips.In DMAMicroarrays：A Practical Approach(ed.M.Schena)，Oxford UniversityPress，Oxford，UK，1999)；The Chipping Forecast(Nature Geneticsspecial issue；January 1999Supplement)；Mark Schena(Ed.)，Microarray Biochip Technology，(Eaton Publishing Company)；Cortes，2000，The Scientist 14(17)：25；Gwynne and Page，Microarray analysis：the next revolution in molecular biology，Science，1999，August 6；Eakins和Chu，1999，Trends in Biotechnology，17：217-218；以及各种万维网。
阵列技术克服了分子生物学传统方法的缺点，其中传统方法一般基于“一个实验一个基因”的方式进行，从而导致低通量以及无法认识基因功能的“全貌”。目前，阵列技术的主要应用包括序列的识别(基因/基因突变)和基因表达水平(丰度)的确定。基因表达分析可以利用阵列技术，可任选地结合蛋白组学技术(Celis等，2000，FEBS Lett，480(1)：2-16；Lockhart和Winzeler，2000，Nature 405(6788)：827-836；Khan等，1999，20(2)：223-9)。阵列技术的其它应用也为本领域所公知；例如基因的发现、癌症研究(Marx，2000，Science 289：1670-1672；Scherf等，2000，Nat Genet 24(3)：236-44；Ross等，2000，Nat Genet 2000，24(3)：227-35)、SNP分析(Wang等，1998，Science 280(5366)：1077-82)、药物发现、药物基因组学、疾病诊断(例如，utilising microfluidics devices：Chemical & Engineering News，February 22，1999，77(8)：27-36)、毒理学(Rockett和Dix  (2000)，Xenobiotica 30(2)：155-77；Afshari等，1999，Cancer Res 59(19)：4759-60)以及毒理基因组学(功能基因组与分子毒理学的杂化)。毒理基因组学的目的在于找到对有毒物质的毒性反应与接触该有毒物质的对象的基因图谱的变化之间的关系(Nuwaysir等，1999，Molecular Carcinogenesis 24：153-159)。
在本发明的情况中可采用阵列技术来(例如)分析AxI蛋白质的表达。在一个实施方案中，阵列技术可用于分析候选化合物对AxI活性的影响。
一般情况下，任何样品库或组可以有序方式布置在阵列中，这通过空间分隔所述库或组中的成员来进行。用于阵列分析的合适的库的例子包括核酸库(包括DNA、cDNA、寡核苷酸等库)、肽、多肽和蛋白质库，以及包含任意分子(如配体库)等的库。因此，如果在本发明中引用“库”时，除非上下文另有规定，否则这种引用应被认为包括阵列形式的库的引用。
样品(例如库的成员)一般是固着或固定到固相上(优选为固体基质)，以限制样品的扩散和掺杂。在优选实施方案中，可制备结合DNA的配体库。特别是，所述的库可以固定在基本平坦的固相上，包括膜和非多孔基质(如塑料和玻璃)。此外，样品优选以有利于索引(即引用或访问特定样品)的方式布置。通常情况下将样品以点的形式施加在网格形式中。常见分析系统可适用于该目的。例如，可将阵列固定在微孔板表面，其中多个样品位于一个孔中，或是每个孔中具有单一样品。此外，固体基质可为膜，如硝酸纤维素或尼龙膜(例如印迹实验中所用的膜)。可选用的其它基质包括玻璃或硅基基质。因此，可通过本领域已知的任意合适的方法(例如通过电荷相互作用或通过化学偶合)将样品固定到孔壁或孔底部、或膜表面。可采用其他布置和固定的手段，例如吸移、滴触(drop-touch)，压电手段、喷墨和气泡喷射技术、静电施加等。在硅基芯片的情况下，可利用光刻法将样品布置和固定在芯片上。
可通过“点”在固体基质上来布置样品；这可通过手工或使用机器人沉积样品来完成。一般情况下，阵列可被描述为巨阵列或微阵列，其区别在于样品点的大小。巨阵列通常包含点大小为约300微米或更大的样品，并且可以容易地通过现有的凝胶和印迹扫描仪成像。微阵列上的样品点大小通常具有小于200微米的直径，并且这些阵列通常包含成千上万个点。因此，微阵列可需要专门的机器人技术和成像设备，这可能需要定制。在文献“Cortese，2000，The Scientist 14(11)：26”的综述中大致描述了该装置。
本领域已经描述了制备固定化的DNA分子库的技术。一般来说，大多数现有技术的方法都描述了如何合成单链核酸分子库，其采用(例如)掩模技术在固体基质的各种离散位置建立各种序列排列。US 5,837,832(其内容以引用方式并入本文)描述了改进的基于超大规模整合技术制备固定到硅基基质的DNA阵列的方法。特别是，US5,837,832描述了被称为“嵌装”的策略以在基质的空间限定的位置合成特定的探针组，所述策略可用于制备本发明的固定化的DNA库。US 5,837,832也提供了可采用的较早技术的文献。
也可按照下述方式在表面上合成肽(或多肽模拟物)阵列：将每个不同的库成员(例如独特的肽序列)设置在阵列中离散的预定的位置。每个库成员的特征是由其在阵列中的空间位置确定的。确定阵列中在预定的分子(例如靶标或探针)与反应性库成员之间发生结合相互作用的位置，从而基于空间位置确定反应性库成员的序列。在文献US 5,143,854；WO 90/15070和WO 92/10092；Fodor等，1991，Science 251：767；Dower和Fodor，1991，Ann.Rep.Med.Chem.26：271中描述了这些方法。
为了有助于检测，靶标和探针可用任意容易检测的报告物标记，例如荧光、生物发光、磷光、放射性等报告物标记。在本文的其它部分讨论了这样的报告物、其检测、其与靶标/探针的偶联等。在文献“Shalon等，1996，Genome Res 6(7)：639-45”中也公开了探针和靶标的标记。
DNA阵列的具体例子包括如下：
模式I：采用机器人点样法将探针cDNA(～500-～5,000碱基长度)固定到固体表面(如玻璃)上，并将其暴露于一组独立地或以混合物的形式存在的靶标。这种方法被广泛认为是在斯坦福大学开发的(Ekins和Chu，1999，Trends in Biotechnology，17：217-218)。
模式II：原位(芯片上)或通过常规合成随后芯片上固定来合成寡核苷酸阵列(～20-～25-mer寡核苷酸)或肽核酸(PNA)探针。将该阵列暴露于已经标记的样品DNA、杂交并确定互补序列的特征/丰度。该DNA芯片由Affymetrix有限公司销售，商标为
Figure BDA0000107618580000231
在(例如)文献“Marshall和Hodgson，1998，Nature Biotechnology16(1)：27-31”中描述了一些市售可得的微阵列模式的例子。
数据分析也是阵列实验的一个重要部分。微阵列实验的原始数据通常为图像，其需要转化为基因表达矩阵-表格，其中行代表(例如)基因，列代表(例如)各种样品(如组织)或实验条件，并在每个单元格中的数字表示(例如)特定样品中特定基因的表达水平。如果需要提取潜在的生物过程有关的知识，这些矩阵必须进一步分析。数据分析方法(包括监督和未监督的数据分析以及生物信息学方法)在Brazma和ViIo J，2000，FEBS Lett 480(1)：17-24中披露。
如上所述，蛋白质、多肽等也可被固定在阵列中。例如，抗体已经被应用于采用蛋白质芯片的蛋白质组的微阵列分析中(Borrebaeck CA，2000，Immunol Today 21(8)：379-82)。例如，在文献“MacBeath和Schreiber，2000，Science，289(5485)：1760-1763”中综述了多肽阵列。
药物组合物
另一个方面涉及包含根据上述方法鉴定得到的试剂与可药用的稀释剂、赋形剂或载体的混合物的药物组合物。
另一个方面涉及制备药物组合物的方法，包括：
(i)根据上述任意方法鉴定能够抑制或逆转上皮-间质转化(EMT)的试剂；以及
(ii)将所述试剂与可药用的稀释剂、赋形剂或载体混合。
本发明的另一个方面涉及通过本发明方法鉴定的试剂在制备用于治疗增殖疾病的药物中的用途，所述增殖疾病更优选为癌症。
根据本发明所述的用途，通过上述方法鉴定的试剂可作为药物制剂，其包含化合物或其生理上可接受的盐、酯或其它生理功能的衍生物，以及一种或多种可药用的载体和可任选的其它治疗和/或预防的成分。载体必须与制剂中的其他成分相容，并且对其接受者无害。该药物组合物可在人类和兽医学中用于人和动物使用。
用于本文所述各种不同形式药物组合物的这样的合适的赋形剂的例子可在文献“Handbook of Pharmaceutical Excipients，2nd Edition，(1994)，由A Wade和PJ Weller编辑”中找到。
用于治疗用途的可接受的载体或稀释剂为制药领域公知，并且在(例如)文献“Remington′s Pharmaceutical Sciences，Mack出版公司(A.R.Gennaro edit.1985)”中有记载。
合适的载体的例子包括乳糖、淀粉、葡萄糖、甲基纤维素、硬脂酸镁、甘露醇、山梨醇等。合适的稀释剂的例子包括乙醇、甘油和水。
可根据施用的期望途径和标准药学实践来选择药物载体、赋形剂或稀释剂。该药物组合物可包含(或除了载体、赋形剂或稀释剂可包含)任何合适的粘结剂、润滑剂、悬浮剂、包衣剂、增溶剂、缓冲剂、调味剂、表面活性剂、增稠剂、防腐剂(包括抗氧化剂)等，以及使制剂与预期接受者的血液等渗的物质。
合适的粘结剂的例子包括：淀粉、明胶、天然糖(如葡萄糖)、无水乳糖、自由流动乳糖、β-乳糖、玉米甜味剂、天然和合成胶(如阿拉伯树胶、黄蓍胶或海藻酸钠)、羧甲基纤维素和聚乙二醇。
合适的润滑剂的例子包括油酸钠、硬脂酸钠、硬脂酸镁、苯甲酸钠、醋酸钠、氯化钠等。
药物组合物中可提供防腐剂、稳定剂、染料、甚至调味剂。防腐剂的例子包括苯甲酸钠、山梨酸和对羟基苯甲酸酯。也可使用抗氧化剂和悬浮剂。
药物制剂包括适合经口施用、局部施用(包括经皮肤、口腔和舌下施用)、经直肠或胃肠外施用(包括经皮下、皮内、肌内和静脉施用)、经鼻腔和肺部施用(例如通过吸入施用)的那些。在适当情况下，所述制剂可方便地以离散剂量单位的形式提供，并且可由药学领域中已知的任意技术制备。所有的方法包括将活性化合物与液体载体和/或细碎的固体载体的步骤，然后如有必要，将产品成形成为所需制剂。
适合于经口施用的药物制剂(其中载体为固体)最优选以单位剂量制剂的形式(如含预定量活性剂的丸药、胶囊或片剂)提供。片剂可通过任选地与一种或多种附加成分一起压缩或模压制得。压缩片可通过如下方式制备：在合适的机器中将自由流动形式(如粉末或颗粒)的活性剂可任选地与粘合剂、润滑剂、惰性稀释剂、润滑剂、表面活性剂或分散剂混合后压缩。模压片可通过将活性剂与惰性液体稀释剂模压得到。可以任选地将片剂包衣，并且如果没有包衣的话，可任选地将其刻痕。胶囊可通过将活性剂单独或与一种或多种附加成分的混合物填入胶囊壳中，然后以通常方式将其密封。扁囊剂类似于胶囊，其中活性剂以及任意附加成分密封在米纸套中。活性剂也可配制为分散性颗粒，其(例如)可在施用前悬浮在水中，或洒在食物中。胶囊可被封装在(例如)小袋中。其中载体为液体的适合于经口施用的制剂可以在水或非水液体中的溶液或悬浮液的形式，或以水包油型乳液的形式提供。
用于经口施用的制剂包括控释剂型(例如片剂)，其中活性剂被配制在适当的控释基质中，或包被有合适的控释膜。这种制剂可特别便于预防性应用。
适合经直肠施用的药物制剂(其中载体为固体)最优选以单位剂量栓剂的形式提供。合适的载体包括本领域常用的可可脂和其他材料。栓剂可以方便地通过混合活性剂与软化或熔化的载体，然后冷却并且在模具中成型来制备。
适合经胃肠外施用的药物制剂包括活性剂在水性或油质载体中的无菌溶液或悬浮液。
注射制剂可适合于弹丸注射或连续输注。该类制剂方便地提供于单位剂量或多剂量容器中，该容器在导入制剂后直到使用时均被密封。或者，活性剂可为粉末形式，其在使用前用合适的载体(如无菌的、无热原水)重构。
活性化合物也可制备为长效储存型制剂(long-acting depotpreparation)，其可通过肌内注射或植入(例如经皮下或肌肉植入)来施用。长效制剂可包括(例如)合适的聚合物或疏水性材料、或离子交换树脂。这种长效制剂特别便于预防性使用。
适合于通过颊间隙经肺部施用的制剂被提供为使得包含活性化合物的颗粒(直径为0.5至7微米)被递送到接受者的支气管树中。
所述制剂的一种可能是精细磨碎的粉末形式，其可便于提供在用在吸入装置中的可穿孔胶囊(例如，明胶的胶囊)内，或者以自推进(self-propelling)制剂的形式提供，其中所述制剂包含活性剂、合适的液态或气态推进剂和可选的其他成分(如表面活性剂和/或固体稀释剂)。适当的液体推进剂包括丙烷和含氯氟烃，并且合适的气体推进剂包括二氧化碳。也可采用这样的自推进制剂，其中活性剂以液滴的形式悬浮在溶液或悬浮液中。
这种自推进制剂类似于本领域已知的那些，并且可通过既定程序制备。合适的是，它们提供于容器中，该容器设置有具有所需的喷雾特性的可手动操作或自动运转的阀门；有利的是，所述阀门为计量型，从而在每次操作后输送固定的体积，例如25至100微升。
另一种可能是，活性剂可为用在喷雾器或雾化器中的溶液或悬浮液形式，由此采用加速气流或超声波搅拌以产生用于吸入的细液滴雾。
适合经鼻腔施用的制剂包括制备大体上类似于上述肺部施用的制剂。当分配所述制剂时，其粒径应当有利地在10到200微米的范围内，以使其能够在鼻腔中停留；这可通过适当地采用合适粒径的粉末或合适的阀门选择来实现。其他合适的制剂包括：粒径在20至500微米范围内的粗颗粒，以从靠近鼻子的容器通过鼻孔快速吸入施用；以及滴鼻剂，其包含0.2至5％w/v的在水性或油性溶液或悬浮液中的活性剂。
可药用的载体是本领域技术人员公知的，包括(但不限于)：0.1M、优选0.05M的磷酸盐缓冲液或0.8％生理盐水。此外，可药用的载体可以为水性或非水性溶液、悬浮液和乳液。非水性溶剂的例子为丙二醇、聚乙二醇、植物油(如橄榄油)以及可注射有机酯(如油酸乙酯)。水性载体包括水、醇/水溶液、乳液或悬浮液，包括盐水和缓冲介质。肠胃外载体包括氯化钠溶液、林格氏葡萄糖、葡萄糖和氯化钠、乳酸钠林格氏注射液或固定油。也可存在防腐剂和其它添加剂，例如抗菌剂、抗氧化剂、螯合剂、惰性气体等等。
适合局部施用的制剂可以(例如)凝胶、乳膏或软膏的形式提供。上述制剂可施加于(例如)伤口或溃疡，其直接涂抹在伤口或溃疡的表面或承载在合适的支持物(如绷带、纱布、网等)上然后施加覆盖在待处理的区域。
也可提供液体或粉末制剂，其可被直接喷洒或撒到待处理的位置，如伤口或溃疡。或者，可将制剂喷洒或撒在诸如绷带、纱布、网等载体上，然后施加到待处理的位置。
根据本发明的另一个方面，提供了制备上述的药物或兽药组合物的方法，所述方法包括将活性化合物与载体结合，例如通过混合来结合。
一般情况下，通过下列方法制备上述制剂：将活性剂与液体载体和/或细碎的固体载体均一且密切的结合，然后如有必要将产品成形。本发明扩展到制备药物组合物的方法，其包括将药剂与药物可接受或兽药可接受的载体或赋形剂结合。
治疗应用
在另一个方面中，本发明涉及抑制需要接受治疗的受试者中已经发生上皮-间质转化(EMT)的癌细胞或其它细胞生长和扩散的方法，所述方法包括将AxI抑制剂施予所述受试者。
如本文所用，“抑制上皮-间质转化”是指受试者体内正在经历或已经经过上皮-间质转化(EMT)的细胞数量的减少。
在一个优选实施方案中，需要接受治疗的受试者患有癌症。
优选的，当受试者患有癌症时，本发明的方法抑制已经发生上皮-间质转化(EMT)的肿瘤细胞至使得癌细胞不能转移的程度，即该抑制使得癌症不能发展为转移性癌症，或者已经转移的细胞不能在体内远端位置生长。
在一个极优选的实施方案中，本发明的方法抑制已经完成上皮-间质转化(EMT)的细胞向体内远端位置扩散，即该抑制使得依赖于上皮-间质转化(EMT)的转移性细胞的扩散消除。
本发明的另一个方面涉及治疗需要接受治疗的受试者中转移性癌症的方法，所述方法包括通过对所述受试者施予AxI抑制剂，从而抑制发生上皮-间质转化(EMT)的肿瘤细胞。
如本文所用，术语“AxI抑制剂”是指能抑制AxI、AxI信号传导通路或AxI信号传导通路中任意一种或多种组分的分子。在一个实施方案中，所述分子能减少或抑制AxI或AxI蛋白质的表达。
在一个特别优选的实施方案中，AxI抑制剂为抗AxI抗体。
在一个特别优选的实施方案中，AxI抑制剂为小分子激酶抑制剂。上述小分子抑制剂的例子为文献“Holland等2010”所述的R428。
在一个特别优选的实施方案中，所述受试者为哺乳动物，更优选为人。
优选的，所述癌症为乳腺癌、前列腺癌、胶质瘤、肺癌、胰腺癌。
转移导致90％的癌症相关的死亡率。了解能够使肿瘤细胞转移的分子机制是一个重大的健康问题。本发明人已经证明，受体酪氨酸激酶AxI是患有原发性乳房X光检测的乳腺癌的患者的低总体生存率的强预测指标。
转移性乳腺癌细胞需要AxI的表达以维持侵染性恶性表型并且在不同微环境中形成乳腺肿瘤。乳腺上皮细胞中的上皮-间质转化(EMT)的诱导上调AxI的表达，从而与其配体Gas6生成自分泌信号传导回路。AxI表达的抑制防止从乳腺的原位向淋巴结和主要器官的转移性扩散。因此在早期恶性转变过程中，AxI的不适当EMT依赖性激活可能会促进转移和对患者总体生存率产生负面影响。因而通过所建立的治疗策略中断AxI信号传导代表了针对细胞增殖性疾病(如乳腺癌)以及细胞运动和细胞生存介导的疾病的治疗发展的一个令人鼓舞的途径。
本发明的另一个方面涉及AxI抑制剂在制备用于抑制上皮-间质转化(EMT)的药物中的用途。
本发明的另一个方面涉及AxI抑制剂在制备用于通过抑制依赖于上皮-间质转化(EMT)的肿瘤细胞来治疗转移性癌症的药物中的用途。
本发明的另一个方面涉及治疗需要接受治疗的受试者中转移性癌症或晚期癌症的方法，所述方法包括将AxI抑制剂施予所述受试者。
本发明的另一个方面涉及AxI抑制剂在制备用于治疗转移性癌症或晚期癌症的药物中的用途。
本发明的另一个方面涉及抑制需要接受治疗的受试者中的转移的方法，所述方法包括将AxI抑制剂施予所述受试者。
另一个方面涉及抑制患癌症受试者中EMT诱导的侵染性疾病的方法，所述方法包括将AxI抑制剂施予所述受试者。
另一个方面涉及AxI抑制剂在制备用于抑制患癌症受试者中EMT诱导的侵染力的药物中的用途。
优选地，AxI抑制剂为抗AxI抗体或小分子抑制剂。
施用方式
本发明的药物组合物可适合于经直肠施用、经鼻施用、经支气管施用、经局部施用(包括经口腔和舌下施用)、经阴道或胃肠外施用(包括经皮下、肌内、静脉内、动脉内和皮内施用)、经腹腔或鞘内施用。优选的制剂为经口服施用的制剂。制剂可方便地以单位剂型(即包含单位剂量的离散部分的形式)提供，或者以多单位或亚单位的单位剂量提供。作为例子，制剂可为片剂和缓释胶囊的形式，并且可通过药学领域中公知的任意方法制备。
本发明的经口施用的制剂可以下列形式提供：含预定量活性剂的离散单位，如胶囊、药丸(gellule)、滴剂、扁囊剂、丸剂或片剂；粉末或颗粒；活性剂在水性液体或非水性液体中的溶液、乳液或悬浮液；或水包油型乳液或油包水型乳液；或丸药等。优选地，组合物每剂量包含1-250mg活性成分，更优选为10-100mg活性成分。
对于经口施用的组合物(例如，片剂或胶囊)，术语“可接受的载体”包括赋形剂，如常见赋形剂，例如粘合剂，例如糖浆、阿拉伯胶、明胶、山梨醇、黄蓍胶、聚乙烯吡咯烷酮(聚维酮)、甲基纤维素、乙基纤维素、羧甲基纤维素钠、羟丙基甲基纤维素、蔗糖和淀粉；填料和载体，例如玉米淀粉、明胶、乳糖、蔗糖、微晶纤维素、高岭土、甘露醇、磷酸二钙、氯化钠和海藻酸；以及润滑剂如硬脂酸镁、硬脂酸钠和其他金属硬脂酸盐、甘油硬脂酸酯硬脂酸、硅酮油，滑石蜡、油和胶体二氧化硅。也可使用调味剂，如薄荷、冬青油、樱桃调味剂等。可能有利的是，添加着色剂使所述剂型易于识别。也可采用本领域已知方法对片剂包衣。
片剂可通过任选地与一种或多种附加成分压缩或模压制得。压缩片可通过如下方式制备：在合适的机器中将自由流动形式(如粉末或颗粒)的活性剂，可选地与粘合剂、润滑剂、惰性稀释剂、防腐剂、表面活性剂或分散剂混合后压缩。模压片可通过在合适的机器中将用惰性液体稀释剂润湿的粉末状化合物的混合物模压制得。片剂可任选地被包衣或刻痕，并且其可被配制为缓释或控释活性剂。
其他适合经口施用的制剂包括：锭剂，其包含在调味基质(通常是蔗糖和阿拉伯胶或黄蓍胶)中的活性剂；软锭剂，其包含在惰性基质(如明胶和甘油，或蔗糖和阿拉伯胶)中的活性剂；以及漱口剂，其包含在合适的液体载体中的活性剂。
其他的施用形式包括可经静脉内、动脉内、鞘内、皮下、皮内、腹腔或肌内注射的溶液或乳剂，其由无菌或可消毒溶液制备。注射形式通常每剂量含10-1000mg、优选为10-250mg的活性成分。
本发明的药物组合物也可为栓剂、阴道栓剂、混悬剂、乳剂、洗剂、软膏、乳膏、凝胶剂、喷雾剂、溶液或粉剂的形式。
透皮施用的替代方法是通过使用皮肤贴剂。例如，可将活性成分掺入到由聚乙二醇或液体石蜡的水性乳液组成的乳膏中。活性成分也可以1-10重量％的浓度掺入由白蜡或白色软石蜡基质组成的软膏中，可根据需要加入稳定剂和防腐剂。
剂量
本领域普通技术人员可以很容易地确定本发明的组合物之一对受试者施用的合适的剂量，而无需过度的试验。通常情况下，医生可确定最适合个别患者的实际用量，而这取决于多种因素，包括采用的具体药剂的活性、所述药剂的代谢稳定性和作用长短、年龄、体重、一般健康状况、性别、饮食、施用方式和时间、排泄率，药物组合、特定病情的严重程度以及接受治疗的个体。本文所披露的剂量是平均情况的示例。当然可以有个别例子，其中应该使用更高或更低的剂量，这些剂量在本发明的范围中。
根据本发明，可以施用有效剂量的药剂来抑制AxI。当然，该剂量可进一步根据药剂的施用类型进行调整。例如，为了达到急性治疗的“有效剂量”，肠胃外施用是优选的。虽然肌内静推注射液是有用的，静脉输注在5％的葡萄糖水或生理盐水中的化合物，或具有合适的赋形剂的类似制剂是最有效的。通常情况下，肠胃外剂量为约0.01至约100mg/kg；优选在0.1至20mg/kg之间，其方式为维持药物在血浆中的能有效地抑制激酶的浓度。药剂以达到每日总剂量为约0.4-约400mg/kg/天的水平每日施用1-4次。本领域普通技术人员可通过比较药剂在血中的水平与具有治疗效果所需的浓度，容易地确定活性剂的治疗有效的精确剂量，以及所述药剂的最佳施用途径。
本发明的药剂也可以按照如下方式经口施用给患者，所述方式使得使药物浓度足以达到本文所述的一个或多个治疗指标。通常情况下，包含药剂的药物组合物的施用的口服剂量为约0.1至约50mg/kg，施用方式需与患者的病情一致。优选的口服剂量为约0.5至约20mg/kg。
本发明的药剂可经一种或几种生物分析检测来确定达到指定药理学效应所需的药剂浓度。
试剂盒部分
本发明的另一个方面涉及用于评价抑制或逆转上皮-间质转化(EMT)的试剂能力的试剂盒，所述试剂盒包含抗AxI抗体。
本发明的另一个方面涉及用于评价抑制或逆转上皮-间质转化(EMT)的试剂能力的试剂盒，所述试剂盒包含针对AxI的核酸探针。
本发明的另一个方面涉及用于评价抑制或逆转上皮-间质转化(EMT)的试剂能力的试剂盒，所述试剂盒包含至少一种针对AxI的QPCR引物。
本发明的另一个方面涉及上述试剂盒在上述任意方法中的用途。
诊断和预测
本发明还涉及AxI作为生物标志物在诊断或预测以增殖活性为特征的疾病中(特别是在用AxI抑制剂治疗的个体中)的用途。
如本文所用，术语“预测方法”是指能够预测已诊断为具有疾病(特别是癌症)的人或动物中的疾病的进展的方法。更具体而言，所关注的癌症包括乳腺癌、肺癌、胃癌、头颈癌、大肠癌、肾癌、胰腺癌、子宫癌、肝癌、膀胱癌、子宫内膜癌和前列腺癌以及白血病。
如本文所用，术语“诊断方法”是指能够确定人或动物中的癌症的存在和类型的方法。合适的是，标志物允许对采用AxI抑制剂的治疗的成功性进行评价。如上所述，合适的诊断包括针对本文确定的任意基因的探针，如QPCR引物、FISH探针等。
如本文所用，术语“预测方法”是指能够确定受试者对特定试剂/方案治疗易感或反应的可能性的方法。这种预测方法提供了特定治疗方案的可能结果的信息，例如受试者对所述治疗反应的可能性，和/或在特定治疗方案中应当以何种程度治疗个体的信息，以及/或采用传统治疗方法(如放疗/化疗)应当以何种程度治疗个体的信息。因此，本文所述预测方法在个性化医疗领域中具有重要的应用。
因此，一个优选实施方案涉及上述生物标志物在个性化医疗应用中的用途。
在一个优选实施方案中，所述个性化医疗应用旨在确定受试者是否会对采用AxI抑制剂的治疗易感或有反应。
在一个优选实施方案中，所述个性化医疗应用旨在确定受试者是否特别可能患有转移性癌症。
本发明的另一个方面涉及用于确定受试者是否会对采用AxI抑制剂的治疗易感的预测方法，所述方法包括检测所述受试者中的上皮-间质转化(EMT)的发生。
本发明的另一个方面涉及AxI作为生物标志物在用于确定受试者是否会对采用AxI抑制剂的治疗易感或有反应的预测试剂中的用途。
本发明的另一个方面涉及确定受试者是否特别可能患有转移性癌症的预测方法，所述方法包括检测所述受试者中的上皮-间质转化(EMT)的发生。
优选的，上述的预测方法包括以下步骤：
(i)从所述受试者获得样品；以及
(ii)与对照样品相比，确定样品中AxI的表达，其中相比于对照样品，AxI表达的上调指示对采用AxI抑制剂的治疗易感以及患有转移性癌症的可能性增大。
在本发明中，优选本文所述的方法在体外进行。
样品优选通过蛋白质分析、更优选通过ELISA、PET、流式细胞术、SELDI-TOF MS或2-D PAGE进行分析。
通过以下非限定的例子并且参照附图对本发明进一步进行阐释，其中：
图1示出了AxI的表达为乳腺癌生存率的负性预测因子。(A)免疫化学分析弱(60％)和强的AxI表达。(B)8年临床追踪的Kaplan-Meier分析。(C)多变量分析。(D)原发和转移性人乳腺癌匹配对(n＝16)中的AxI表达：左为原发肿瘤(上为AxI阴性，下为AxI阳性)，右为转移肿瘤(上为肝，下为骨)。相比于对应的原发肿瘤，转移肿瘤中AxI的表达倾向于更强(p＝0.11，McNemar检验)。
图2示出了AxI为乳腺癌细胞侵染力所需。表观等位基因MB-MDA-231乳腺癌细胞系列中AxI表达的(A)FACS和(B)Western印迹分析。(C)AxI为由血清(D)或SDF-1(E)诱导的基质胶侵染性检测的磷酸化表观等位基因分析。MB-MDA-231/shLuc(上栏)和MB-MDA-231/shAxI2(下栏)的3D基质胶分析(F，G)。
图3示出了乳腺上皮细胞中EMT诱导物上调了AxI的活性。(A)稳定表达Twist的MCF 10a细胞系上的AxI表面水平的流式细胞分析。(B)分析对照(wt)和表达Twist的MCF 10a细胞系的提取物的上皮细胞标志物(E-钙粘着蛋白、β-连环蛋白)和间质细胞标志物(N-钙粘着蛋白)的改变。＊采用抗Gas6的抗体通过SDS-PAGE和免疫印迹法分析经调理的培养基。(C)用流式细胞术分析由编码Twist、Zeb2、Slug、Snail的逆转录病毒载体或对照载体(GFP)转导的MCF 10a细胞的AxI表面表达(左)和几何平均荧光率(右)。(D)通过免疫印迹法分析由Twist、Zeb2、Slug或Snail逆转录病毒载体转导的MCF10a细胞提取物的上皮细胞标志物(E-钙粘着蛋白，β-连环蛋白)和间质细胞标志物(N-钙粘着蛋白，波形蛋白)的改变。(E)用Twist、Zeb2、Slug或Snail逆转录病毒载体传导的MCF10a细胞在接种72小时后的形态。
图4示出了组织工程化乳腺肿瘤需要AxI的表达。(A)NODSCID小鼠内MDA-MB-231/GFP-Luc肿瘤组织工程植入物的体内图像。通过MDA-MB-231/GFP-Luc细胞的荧光素酶生物发光的体内光学成像来监测肿瘤的时域生长(i)。由对照植入物(实线)和表达MDA-MB-231/GFP-Luc-shAxI2的细胞植入物(虚线)测量肿瘤细胞数(总光子)和径向渗透的程度(信号直径)，其显示肿瘤在聚乳酸组织工程支架中的生长和定殖具有AxI依赖性(ii)。切割后的两侧支架的外观(iii)。在植入后28天，组织工程肿瘤的采用抗人AxI的免疫组化分析(左栏，对照载体；右栏，shAxI2)(iv)。通过采用抗人AxI的免疫组化法分析具有野生型对照(左栏)和表达shAxI2的细胞(右栏)的肿瘤组织工程植入物(v)。黑色方块划分了MDA-MB-231/GFP Luc细胞的定殖和放射状扩散。与对照组相比，＊p＜0.05，＊＊p＜0.005(配对t检验)。N＝6小鼠/组。(B)三细胞植入物的体内时域成像，所述植入物包括原生人类微血管细胞(EC)、血管平滑肌细胞(SMC)和MDA-MB-231/GFP Luc细胞(i)。在组织工程血管的存在下分析的对照植入物(实线)和表达shAxI2的MDA-MB-231细胞植入物(虚线)的肿瘤生长(总光子)和径向扩散(直径)测量(ii)。由工程化人微血管使切除的肿瘤(28天时)深度血管化(iii)。免疫组化分析表明，工程化抗人CD31染色血管包含指示出开放和散布的腔内红血细胞(插入物)(iv：左栏，对照载体；右栏，shAxI-2)。与对照组相比，＊p＜0.05，＊＊p＜0.005，＊＊ ＊p＜0.0005(配对t检验)。N＝7小鼠/组。在shAxI2表达抑制的组织工程化MDA-MB-231肿瘤中，支架内血管直径(左)没有受到影响，同时微血管密度(右)轻度增加。
图5示出了体内表观等位基因分析显示乳腺肿瘤形成所需的明显AxI表达阈。(A)由NOD/SCID ！2mnull小鼠内的皮下表观等位基因MDA-MB-231/GFP-Luc异种移植物得到的生物发光的体内时域成像，其包括相比于无效的靶向AxI的shRNAs(shAxI279)对照，靶向AxI的shRNAs shAxI278(i)、shAx280(ii)和shAxI2(iii)的AxI分级表达。(C)条形图示出了基于肿瘤的光学成像分析的光子和肿瘤直径平均变化。表观等位基因MDA-MB-231/GFP-Luc肿瘤生长(总光子)和放射性浸润(信号直径)的测量相对于shAxI279(无效shRNA)进行校正(ii)。(D)针对AxI基因抑制绘制的肿瘤生长(28天测量)揭示了治疗阈值(表达降低80％)。相比于对照组，＊p＜0.05，＊＊p＜0.005(配对t检验)。N＝6小鼠/组。
图6示出了AxI是乳腺癌细胞转移所需的。(A)监测体内的原发性肿瘤和转移，I.随着时间而改变的原位生长(上栏)以及到淋巴结的转移(下栏)。II.通过体内光学成像(GE Explore Optix)监测野生型(实线)和AxI RNAi的植入物(虚线)的原发性肿瘤的生长。(B)不同器官中转移的检测。(C)乳腺癌细胞的体外检测。I.示出了切除器官的图像。II.相同组织的组织学分析证实了向不同器官的转移(箭头)。(D)原位注射对照(载体)和shAxI2的小鼠之间的Mann-Whitney(对数秩)检验表明，荷有MDA-MB-231-D3H2LN/GFP-Luc-shAxI2肿瘤的小鼠的生存率增加(P＝0.013)。
图7示出了AxI是BALB/c小鼠中同源乳腺癌细胞的免疫反应后复发和转移所必需的。(A)采用流式细胞术对表达鼠的靶向AxI的shRNA(mouse AxI-targeting shRNA)(shmAxI2)或人的靶向AxI的shRNA(human AxI-targeting shRNA)(shAxI279)的4T1-GFP-LUC小鼠乳腺癌细胞进行小鼠AxI表面表达或同型对照分析。(B)将表达鼠的靶向AxI的shRNA(4T1-GFP-LucshmAxI2)或人特异性shRNA(4T1-GFP-Luc-shAxI279)阴性对照的4T1-GFP-Luc细胞原位(乳房脂肪垫)注射入BALB/c小鼠，由此得到生物发光的体内时域成像(i)。在8周的时期内，注射对照(4T1-GFP-Luc shAxI279，实线)和AxI基因抑制(4T1-GFP-Luc-shmAxI2，灰线)的BALB/c小鼠的全身生物发光(总光子)的定量(ii)。＊p＜0.05(t检验)，N＝7小鼠/组。(C)从含有对照或AxI基因抑制肿瘤的BALB/c小鼠切除器官，通过切下器官中的4T1-GFP-Luc细胞的体外生物发光检测而监测的向不同器官的自发性转移(原位植入后8周时)的检测结果。
图8示出了载体L383pCSI Puro2AGFP2ALuc2的序列。
图9的A栏示出了用Slug或Ha-Ras(pBABE puro H-Ras V12，Addgene公司)构建体转导的MCF 10a细胞的流式细胞分析，其利用GFP的共表达进行分析；通过嘌呤霉素处理48小时选择Ha-Ras表达。MCF10a细胞中Slug和Ha-Ras的表达导致癌干细胞标志物CD44的表面表达显著增强。
图9的B栏示出了AxI在编码Lsug、Ras的MCF 10a细胞中的表面表达。AxI表面表达与Slug和Ha-Ras诱导的EMT中CD44的存在和间质细胞性状相关。
图9的C栏示出了表达Slug或Ha-Ras的MCF 10a细胞在接种72小时后的间质细胞形态，所述MCF10a细胞为通过FACS分选的CD44高表达(CD44+)和低表达(CD44-)亚群。CD44-细胞表现出上皮细胞形态，而CD44+MCF10细胞表现出伸长的间质细胞形态。
图9的D栏示出了用编码Slug、Ras的逆转录载体转导的CD44-和CD44+MCF10a细胞的Western印迹分析。CD44-MCF10a细胞保持上皮细胞连接和细胞骨架蛋白的表达。与此形成对比的是，CD44+细胞表现出间质细胞标志物(波形蛋白，N-钙粘着蛋白)的强表达和E-钙粘着蛋白的损失，这指示了EMT。
图9的E栏示出了表达Slug和Ha-Ras的CD44+和CD44-MCF10a细胞在3D基质胶上的生长，表达AxI的CD44+MCF10a细胞具有侵染性，与间质细胞表型一致。
图10示出了MCF10a细胞组成型表达(上部，Western印迹法，总裂解物)和分泌(中部，Western印迹法，调理培养基)Gas6，Gas6在Slug诱导的和Snail诱导的AxI表达中变为细胞相关(下部，抗Gas6，流式细胞分析)。
图11示出了MDA-MB-231细胞组成型表达AxI的配体Gas6。(上部，Western印迹法，主要是细胞相关的总裂解物；中部，Western印迹法，调理培养基；下部，抗Gas流式细胞分析)。AxI基因抑制降低了细胞相关Gas6，而增加了调理培养基中的水平(Gas6＊)而不影响整体表达。
实施例
材料和方法
质粒和抗体
所有shRNAs均由逆转录病毒载体RRI-Red/L087(Genbank：EU424173)的LTR中修饰的人U6启动子表达，所述载体用于通过逆转录病毒感染转化MDA-MB-231细胞。RRI-Red也表达Puro2AmRed1，导致转化成功的细胞中的嘌呤霉素抗性和红色荧光。cDNA核苷酸编号如Genbank：BC032229所示。
采用了下列序列：AxI2；(小字母为发夹)
GACATCCTCTTTCTCCTGCGAAGCCCATctggtcATGGGCTTCGCAGGAGAAAGAGGATGTC，shAxI278；
ACGGGTCTCCTTCTTTCGCCGttggatccctggtcggatccaaCGGCGAAAGAAGGAGACCCG，shAxI279；
GCTTCAGGCGATTTCCCCGGCGttggatccctggtcggatccaaCGCCGGGGAAATCGCCTGAAGC，shAxI280；
ATGCACGCCCAGCCGCACAGCGttggatccctggtcggatccaaCGCTGTGCGGCTGGGCGTGCAT shLuc；
GATTATGTCCGGTTATGTAAACAATCCGGctggtcCCGGATTGTTTACATAACCGGACATAATC。
逆转录病毒表达载体L383pCSI Puro2AGFP2ALuc2(见图8)是通过几个阶段将嘌呤霉素-N-乙酰转移酶、EGFP和萤火虫荧光素酶的编码序列克隆到CRU5-逆转录病毒表达载体中制得的(
Figure BDA0000107618580000381
等，2007)。每个开放阅读框与下一个之间通过编码来源于手足口病毒的2A区域(XXSGLRSGQLLNFDLLKLAGDVESNPGP)的接头分开。在共翻译时切割该序列，导致产生大致化学计量的每种蛋白(Lorens2004)。通过将得自构建体BC012910、BC015895和BC060819(OpenBiosystems公司)的合适片段分别克隆到CRU5-I RES-GFP逆转录病毒载体中，从而构建表达hSnail、hSlug和hZEB2的质粒(Lorens等，2000)。采用了2种抗人AxI的抗体；单克隆小鼠抗人AxI(MAB154，R&D systems公司)和山羊抗人AxI(M-20，Santa Cruz公司)。另外，采用了下述抗体：兔抗人pAxI(Y779，R&D公司)、大鼠抗人Snail(SN9H2，Cell Signaling公司)、小鼠抗人Slug(L40Cb，Cell Signaling公司)、兔抗人E-钙粘着蛋白(24E10，Cell Signaling公司)、兔抗人N-钙粘着蛋白(ab 18203，Abcam公司)、肌动蛋白、小鼠抗人b-连环蛋白(L54E2，Cell Signaling公司)、小鼠抗人Gas6(R&D systems公司)、兔抗人Twist(Twist2C1a，Abcam公司)。
细胞培养、逆转录病毒转导和细胞增殖分析
所有细胞在37℃、5％CO2条件下培养。Phoenix A细胞(GaryNolan博士，斯坦福)，MDA-MB-231人乳腺上皮癌细胞(美国典型培养物保藏中心，Rockville，MD)，人真皮微血管内皮细胞(HMVEC)和肺动脉平滑肌细胞(PASMC)(Cambrex公司，Walkersville，MD，美国)的保存如前所述(Holland 2005)。克隆细胞系MDA-MB-231-DH3L2N(Xenogen公司，Alameda，CA，USA)在具有Earl平衡盐溶液MEM/EBSS培养基(补充有10％FBS、1％非必需氨基酸、1％L-谷氨酰胺和1％丙酮酸钠)的最低必需培养基中培养。采用磷酸钙法(Swift，1999)转染Phoenix A细胞。转染后大约30小时，将培养基更换为待感染细胞的生长培养基(补充有10％FBS)。转染48小时后收集感染性上清液。将靶细胞暴露于含有5mg/ml鱼精蛋白硫酸盐的上清液中，过夜。用1μg/ml嘌呤霉素选择感染细胞。进行细胞增殖分析，以采用Promega公司的MTS分析试剂盒来分析不同AxI基因抑制细胞相比于对照细胞系的增殖潜能。将细胞接种在未处理或用20μL胶原蛋白(来源于鼠尾，Roche公司)、纤连蛋白(Sigma公司)或基质胶(BD BIOSCIENCES公司)包被的96孔组织培养板上。将100μL培养基中的2000个细胞一式三份接种于96孔板，并且采用Promega公司的MTS分析试剂盒根据制造商的使用说明每24小时进行分析。
免疫染色、流式细胞分析和细胞分选
采用标准程序使MDA-MB-231细胞胰蛋白酶化，用PBS-0.2％BSA洗涤，然后以在PBS-0.2％BSA中最终浓度为5mg/ml的抗AxI(#MAB154，R&D systems公司)在室温下染色40分钟。在PBS-0.2％BSA中洗涤细胞两次，并用最终浓度为0.2mg/ml的第二抗体(羊抗鼠APC(Allophyocyanin，交联，Molecular Probes公司)在室温下避光孵育30分钟。用PBS-0.2％BSA洗涤细胞两次，并用300ml PBS-0.2％BSA中重悬，然后在FacsCalibur流式细胞仪(BD BIOSCIENCES公司)上分析。使用FlowJo软件(Tree Star公司，Ashland，OR，USA)进行数据分析。通过FACS Aria SORP以488nm、532nm、638nm和407nm的激光波长分离高水平表达GFP、RFP和低水平表达AxI(shRNA)的细胞，从而建立稳定同质的细胞群。
蛋白质提取物、SDS-PAGE、免疫印迹和免疫沉淀
在RIPA缓冲液(含1％(v/v)Nonidet P-40(NP-40)、0.5％(w/v)去氧胆酸钠、0.1％(w/v)SDS的PBS)(补充有蛋白酶抑制剂(Complete Mini，不含EDTA，Roche#13457200)和0.2mM PMSF)中将细胞裂解。根据标准程序进行SDS-PAGE和免疫印迹。对于免疫沉淀，在补充有蛋白酶抑制剂和PhosSTOP磷酸酶抑制剂混合物(Roche公司)的NP-40缓冲液(10％甘油、1％NP-40、50mM TrispH7.4、0.2M NaCl、2.5mM MgCl2)中将细胞裂解。将偶联到protA/G珠子上的抗体与提取物在4℃下孵育1小时，用NP-40缓冲液洗涤4次珠子后，然后洗脱。
侵染性分析和3D基质胶分析
采用Becton Dickinson公司的BDFalcon细胞培养插入物(8μm)、Falcon multiwellTM 24孔板和生长因子减少基质胶(BD公司)进行Boyden小室趋化分析(Albini等，2004年)。插入物内部用无血清培养基稀释基质胶包被到每个插入物具有最终浓度为30μg的基质胶。在4℃下处理基质胶，直到在37℃下凝固30分钟。在无血清细胞培养基中重悬5×105个细胞，并在每个插入物顶部添加0.1％BSA。FBS富集细胞培养基用作趋化物。经过在37℃、5％CO2条件下孵育20小时后，采用棉签除去小室内细胞。将膜的另一侧的细胞固定，然后用DAPI染色。采用荧光显微镜拍摄图像，并采用ImageJ(http://rsb.info.nih.gov/nih-imageJ，Wayne Rasband，National)进行细胞计数。
3D分析为文献“Sandal等2007”的更改；将30000个细胞接种在凝胶上，并且使培养物生长10-12天，然后进行分析。
临床样品
目前的乳腺癌系列选自基于挪威乳腺癌筛查项目(Hordaland郡)的人群，该项目于1996年开始，每24个月进行两视图乳房X光检查。简单而言，95例侵染性间期癌症发生在前两次筛查间期(1996-2001年)，并且将这些与前两轮共317例侵染性肿瘤中95例筛查检测的肿瘤按照大小匹配(平均直径分别为15.6mm和15.7mm)。在匹配后，筛查检测的和间期案例的平均肿瘤大小分别为25.1mm和23.1mm，并且这些群体的相应平均年龄为62岁和59岁。除了年龄和肿瘤直径(通过病理检查)，还记录了诊断的基本特征，如乳腺密度、组织学类型、组织学分级、淋巴结转移和远端转移。从上次乳房X光检查到间期癌症诊断的中位时间为17.1个月。最近的随访日期是2004年11月31日，并且中位随访时间(幸存者)为72个月。在随访期间，31例患者死于乳腺癌。
免疫组化分析
在本研究中使用组织微阵列载玻片。组织微阵列技术是组织保持性的，并已在几项研究中得到证实。在5μm厚的福尔马林固定、石蜡包埋的组织切片上进行免疫组化分析。在TRS(靶修复溶液(Target Retrieval Solution)；DakoCytomation公司，丹麦，AS)缓冲液(pH6.0)中，在微波炉中于750W下煮10min然后在350W下煮20min进行抗原修复。使用DakoCytomation Autostainer染色。
将切片与抗AxI的多克隆抗体((H-124；cat.#20741)，1∶200稀释(Santa Cruz公司，USA))在室温下孵育过夜。采用DakoCytomation Envision试剂盒(DakoCytomation公司，丹麦，AS)以二氨基联苯胺四氯化碳过氧化物酶作为底物进行免疫过氧化物酶染色，然后用Mayer苏木精(DakoCytomation公司，丹麦，AS)复染。
染色评价
染色主要在细胞质中，但是在细胞膜中有一定浓度的染色。考虑染色强度和呈现阳性反应的肿瘤细胞的比例，通过半定量和主观分级系统记录染色。从每种情况的所有三个核进行评价。强度记录为0(无染色)至3(强染色)；膜染色区域的百分比记录为0(无肿瘤细胞阳性)，1(＜10％)，2(10％-50％)和3(＞50％的肿瘤细胞)。以染色强度与面积的乘积形式计算染色指数(SI)。对病人的特点和结果以盲法进行免疫组化登记。
统计
通过Pearsonχ2检验进行各组的比较。在所有统计分析中，染色指数(SI)类别的取舍值基于中间值。采用乘积极限法(Kaplan-Meier法)以主要操作(primary operation)时间为进入日期进行单变量生存率分析(使用由子宫内膜癌引起的死亡作为终点；检查其他原因引起的死亡)。
对数秩(Mantel-Cox)检验用来比较针对每个变量的不同类别的生存曲线。通过双对数曲线图检测在单因素分析中影响生存率的变量(P≤0.15)，从而确定如何将这些变量引入Cox比例风险回归模型。
小鼠品系和动物保护
我们在本研究中使用PrkdcSCID/B2mnull(缩写为NOD/SCID/B2mnull)的雌性小鼠，重症联合免疫缺陷小鼠(GADES研究所，挪威)，其为8-10周龄并且体重在20-25g之间。试验开始前，将它们饲养在12小时的光/暗周期的标准条件下，并且允许其花费至少7天适应新的环境条件。这项研究根据挪威动物实验条例、欧洲保护用于科学目的脊椎动物公约和挪威动物研究局的指南进行，设计为最大限度地减少动物的数量和痛苦。
生物发光成像(BLI)
采用安装在样本盒上的eXplore Optix(GE Healtcare公司)照相机进行B LI。通过eXplore Optix软件进行信号的成像和定量。对于体内成像，通过腹腔内注射(i.p)以150mg/kg的量给动物施用在PBS(磷酸盐缓冲液)中的底物D-荧光素(Biosynth公司)，然后用异氟醚麻醉。将小鼠置于相机盒内预热的台上，并且连续暴露于1-2％的异氟醚中并且根据肿瘤模型从不同视角拍照。确定目标区域并使用eXplore Optix软件(GE Explore Optix)定量为总光子/秒-1。体内生物发光的背景的光子计数范围为2-3×10。对于体外成像，将150mg/kg的D-荧光素注入小鼠，随后立即进行剖检。切割目标组织，放入平板中成像。
体内肿瘤模型
组织工程
将1×106个MDA-MB 231细胞(其表达GFP-Luc生物标志物，以及调节AxI表达的不同RNA干扰)悬浮于F-12Kaighn′s(Invitrogen公司)∶基质胶(BD BIOSCIENCES公司)的1∶1混合物中，并且接种于6×6mm的聚乳酸(PLLA)支架上。
在植入过程以及随后的成像日，将雌性小鼠NOD/SCID/B2mnull暴露于1-2％异氟醚中麻醉(Isoba vet.-Schering-Plough A/S)。根据文献“Nor等，Lab Invest.；81(4)453；2001”，将两个支架经皮下(s.c)植入每个小鼠内，其中具有表达AxI的细胞的支架植入各小鼠的左侧，同时将具有AxI被抑制的细胞的支架植入右侧。外科手术后，将麻醉小鼠放置在成像系统中，经腹腔内注射150mg/kg的D-荧光素(Biosynth公司)10-15min后，对左右两侧均成像。每周1次通过成像监测体内的肿瘤发展，时间为4周。
异种移植分析
将传染有shRNA载体和GFP-Luc的1×106个MDA-MB 231细胞在100μl F12K培养基+10％FBS/基质胶(1∶1比例，BDBIOSCIENCES公司)中悬浮，并用29号胰岛素针经皮下注射到雌性NOD/SCID/B2m的腹部两侧。在左侧腹部注射AxI表达阳性的细胞，而在右侧腹部注射AxI表达阴性的细胞。
对于三细胞植入，将传染有shRNA载体和GFP-Luc的MDA-MB-231细胞与人真皮微血管内皮细胞(HMVEC)、肺动脉平滑肌细胞(PASMC)以1∶2∶2的比例混合。每周通过成像监测体内的肿瘤生长，连续4周。
乳房脂肪垫自发转移模型
将人MDA-MB-231细胞亚系(称为MDA-MB 231DH3L2N-Xenogen)注射到小鼠乳腺垫，其中所述细胞表达GFP-Luc生物标志物以及调节AxI表达的不同RNA干扰。将NOD/SCID/B2mnull小鼠暴露于1-3％异氟醚中麻醉，并且将50μl悬浮于MEM/EBSS培养基/基质胶(1∶1)中的2×106个MDA-MB-231DH3L2N细胞注射到腹部的乳房脂肪垫中。注射D-荧光素(Biosynth公司)10-15min后，将小鼠放置在eXplore Optix成像系统中并从腹面成像。每2周通过生物发光成像监测肿瘤的生长和转移扩散直至9周。在重新成像前将每只动物的下部覆盖，以最大程度地减少原发瘤的生物发光，使得可以观察到体内转移区域的信号。
组织收集
在每次试验最后，从小鼠中取出肿瘤组织植入物和不同器官，并保存在10％多聚甲醛(Sigma-Aldrich公司)中以进行进一步的分析。准备组织进行组织病理学分析(石蜡包埋、切片和染色)，并通过显微镜评价分析。
动物模型的统计分析结果
确定每个试验的平均生物发光(光子数/秒-1)、肿瘤直径和相应的标准误差。采用回归图来描述生物发光、细胞数和肿瘤直径之间的关系。统计分析基于配对t检验。
结果
AxI的表达是乳腺癌患者总体生存率的强预测因子
为了评价AxI在乳腺癌发病机制中的作用，我们研究了在挪威乳腺癌筛查项目中确认的一系列乳腺癌患者的肿瘤中的AxI表达，其中所述项目于1996年开始，每两年进行两视图乳房X光检查(Wang等，2001)。简单而言，95例侵染性间期癌症发生在前两次筛查间期(1996-2001年)，并且将这些与前两轮共317例侵染性肿瘤中95例筛查检测的肿瘤按照大小匹配(平均直径分别为15.6mm和15.7mm)(Collett等，2005)。匹配后，筛查检测和间期情况的平均肿瘤大小分别为25.1mm和23.1mm，并且这些组中的相应平均年龄为62岁和59岁。除了年龄和肿瘤直径(通过病理检查)，还记录了诊断的基本特征，如乳腺密度、组织学类型、组织学分级、淋巴结转移和远端转移。从上次乳房X光检查到间期癌症诊断的中位时间为17.1个月。最近的随访日期是2004年11月31日，并且中位随访时间(生存者)为72个月。在随访期间，31例患者死于乳腺癌。
AxI的表达(通过染色指数中位数划分2组；图1A)和重要临床病理特征(如组织学分级、肿瘤直径、雌激素和孕激素受体表达和腋淋巴结状态)之间没有显著关系。此外，AxI的表达也与HER2、E-钙粘着蛋白、基底分化标志物(细胞角蛋白5/6，P-钙粘着蛋白)、EZH2、或通过Ki-67表达进行的肿瘤细胞增殖不相关。
然而，在单变量生存分析(Kaplan-Meier法，对数秩检验)中，AxI的表达与降低的病人生存率显著相关(p＝0.035；图1B)。在多变量分析(比例风险方法)中，除了组织学分级和淋巴结状态以外，AxI的表达状态仍然在最终模型中作为独立的负性预测因子(p＝0.021)(参见图1C)，其中所述多变量分析除AxI表达以外，还包括基本预测因素，如肿瘤直径、组织学分级和淋巴结状态(步骤一)。因此，AxI的表达是乳腺癌患者临床结果不佳的强预测指标。
然后，我们研究了原发性和转移性乳腺癌患者匹配对(n＝16)的活组织检查中的AxI表达。与相应的原发性人乳腺癌相比，在转移时AxI的表达倾向于进一步提高(p＝0.11，McNemar检验；图1d；右侧为肝(上)和骨(下)的转移)，这表明AxI的表达是乳腺癌患者临床结果不佳的强预测指标，并且与转移性扩散相关。
AxI是乳腺癌细胞侵染性所必需的
早期乳腺癌中AxI的表达与低生存率之间的强相关性指示了AxI在整体疾病的发病机制中的重要作用。由于乳腺癌的相关死亡率总是由转移性疾病的并发症导致，因此我们评价了AxI的表达是否是恶性乳腺癌细胞侵染性所必需的。AxI在一些高转移性人乳腺癌细胞系(包括MB-MDA-231)中表达。AxI的配体(Gas6)往往共表达，导致自分泌激活(Holland等，2005)。为了将MB-MDA-231细胞中AxI的表达水平与特定细胞行为有效地关联，我们开发了以剂量依赖方式降低AxI表达的靶向AxI的shRNA的表观等位基因系列，其使用最近开发的基于FACS的RNAi法，即CellSelectRNAi(图2A；Micklem等，准备中)。将AxI的shRNA集合用于产生AxIMB-MDA-231细胞的表观等位基因系列以及分级的总AxI蛋白水平(图2B)和磷酸化AxI蛋白水平(图2C)。
恶性癌细胞在与体内的转移潜能相关的三维细胞外基质蛋白凝胶(基质胶)中表现出间质细胞侵染力(Bissell)。表观等位基因分析表现出应答血清(图2D)或SDF-1趋化因子(图2E)(乳腺癌转移的重要因子)时，MB-MDA-231细胞侵染对AxI表达的剂量依赖性要求。相比之下，AxI基因抑制对MB-MDA-231细胞增殖没有影响，并且只对二维(外侧上皮伤口愈合)迁移有适度的影响。这表明三维生长和侵染力对AxI的特定要求。因此，我们在3D-基质胶分析中评价了AxI基因抑制对MB-MDA-231细胞的效应。正常乳腺上皮细胞在三维基质胶中自组织成极化球体腺泡结构，而恶性MB-MDA-231细胞增殖形成大的无组织定殖区，其具有反映了迅速蔓延的肿瘤的侵染性、星状的生长物(Bissell)。AxI表达的基因抑制强烈逆转了三维基质胶中MB-MDA-231细胞的恶性表型，从而形成无恶性生长物的圆形小移殖区(图2F，G)。总之，这些数据表明，AxI信号传导是维持转移性乳腺癌细胞的类间质细胞侵染力所必需的。
AxI受到乳腺上皮细胞中EMT-诱导转录因子的上调
EMT的功能标志为间质细胞侵染力(迁移和入侵ECM的能力)的获得。诱导EMT的转录因子Twist是乳腺癌细胞转移所需的(Yang等，2004年)。因此，我们研究了在乳腺上皮细胞中Twist表达是否上调AxI。正常乳腺上皮细胞(MCF10A)中的Twist表达诱导EMT(图3A；Glackin等，准备中)。引人注目的是，在表达Twist的MCF10a细胞中AxI也被较强上调(图3A-B)。此外，由于正常乳腺上皮细胞组成型表达Gas6，因此Twist诱导的AxI表达产生了自分泌激活回路，这被细胞相关Gas6和酪氨酸磷酸化AxI的增加证实(图3A、C)。为了确定其他诱导EMT的转录因子是否类似地上调AxI的表达，我们分析了表达ZEB2、Snail和Slug的MCF10A细胞。每个EMT转录因子在MCF10A细胞中都诱导间质细胞转化并且上调AxI的表达。这些结果表明，EMT的诱导导致AxI的表达，并可产生自分泌信号传导。
在实验性组织工程乳腺肿瘤中AxI的表达是肿瘤形成所必需的
为了评价体内恶性生长对AxI的需求，我们使用了包括MB-MDA-231细胞的组织工程方法，所述细胞表达用于有效的体内光学成像的GFP-荧光素酶构建体(CSI；Tiron等，结果未发表)，与基质胶一起接种于聚乳酸组织工程支架并且经皮下植入免疫功能低下的NOD-SCID小鼠。由于肿瘤细胞定殖于支架上，在工程化肿瘤微环境内的生长与肿瘤细胞间质细胞特征相关(Mooney)。MB-MDA-231细胞容易形成肿瘤的这种仿生微环境，显示出支架的蔓延性移殖(图4A)。AxI基因抑制强烈抑制了肿瘤的形成、侧向扩散和恶性形态(图4A)。
为了确定AxI是否影响乳腺癌细胞吸引并且增选血管的能力，我们开发了三细胞植入法，包括将MB-MDA-231细胞与原生人类微血管内皮细胞(HuMVEC)和血管平滑肌细胞(vSMC)一起接种，以产生肿瘤血管。在2周的时间内，人EC-vSMC细胞的植入物在NOD-SCID小鼠中容易形成散布支架内的人微血管(Hegen等，准备中)。如图4B所示，在三细胞植入模型中，MB-MDA-231细胞形成蔓延性、高度血管化的肿瘤。工程化人肿瘤血管均匀分布并且散布有腔内红血细胞。相比之下，AxI基因抑制阻止了肿瘤的形成，而不影响散布的人微血管发展。这表明，即使在微血管(其有可能避免对经诱导的血管生成的需求)的存在下，AxI也是肿瘤形成所需的。
显著的AxI表达阈值是乳腺肿瘤形成所需的
为了评价形成肿瘤所需的AxI表达水平，我们在皮下MDA-MB-231肿瘤中进行了AxI的体内表观等位基因分析。将AxI表观等位基因MDA-MB-231细胞系列(图1)经皮下注射并且通过生物发光时域扫描监测肿瘤的形成。这种方法揭示肿瘤生长的AxI剂量反应(图5)。与表面AxI水平的相关性显示出了肿瘤形成所需的AxI表达的阈值(图5B、C)。此剂量反应与AxI抑制对侵染力的剂量依赖效应(图2)是一致的。
AxI是乳腺癌细胞转移所必需的
为了评价乳腺癌转移对AxI的要求，我们将MDA-MB-231-D3H2LN(迅速生长和高转移性的体内MDA-231分离物)原位注入乳房脂肪垫中。使用整体时域生物发光成像，我们监测了在9周时间内的自发转移的发展。对照MDA-MB-231-D3H2LN细胞生成了大的原位乳腺肿瘤，其在5-6周之内坏死(图6A)。在MDA-MB-231-D3H2LN中的AxI基因抑制降低了原发性乳腺肿瘤形成的速率，但也生长出大量的原发性乳腺肿瘤(图6A)。在小鼠中注射对照MDA-MB-231-D3H2LN，4周后在其标记胸淋巴结中最初检测到自发转移(图6A)。相比之下，在植入MDA-231DHLA-AxIshRNA的小鼠中没有检测到转移。在第9周处死小鼠，由于存在转移性细胞，对切除器官单独进行生物发光扫描。所有MDA-MB-231-D3H2LN注射小鼠已经形成了广泛的自发转移，包括淋巴结、肺、卵巢和肾脏。相比之下，MDA-MB-231DHLA-AxIshRNA细胞没有形成可检测到的转移(除了一只小鼠肾脏的单发病变)。对MDA-MB-231-D3H2LN注射小鼠器官的组织切片的组织学分析证实，在所有器官中存在多个微观和宏观转移，如同生物发光总光子测量预测的那样(图6C)。在MDA-MB-231DHLN-AxI shRNA注射小鼠的组织切片中没有观测到微观或宏观转移，证实没有观测到生物发光是由于转移形成受到抑制。这些结果表明，AxI是乳腺癌细胞转移所必需的。
我们通过原位注射的MDA-MB-231-D3H2LN/GFP-Luc对照或AxI基因抑制细胞评价了AxI对NOD-SCID小鼠的总生存率的功能性影响。MDA-MB-231-D3H2LN/GFP-Luc-shAxI2荷瘤小鼠的总生存率显著增加(P＝0.013，对数秩检验；图6D)。这些结果与我们的临床观察证实了下述结论，AxI对转移性疾病的发展和整体患者生存率非常重要。
为了在不同的转移性模型中验证我们的研究结果，我们用CSI构建体转导了高转移性小鼠乳腺癌4T1细胞系，并通过FACS筛选了表达GFP荧光素酶的细胞(4T1-GFP-Luc)。4T1细胞的转移依赖于Twist的表达，并表现高水平的AxI表达(图7a)。
我们开发了表达鼠靶向AxI的shRNA(shmAxI2)(可在4T1细胞中有效抑制鼠AxI的表面水平)的逆转录病毒载体(图7a)。不匹配的人靶向AxI的shRNA(shAxI279)对鼠AxI的表达没有影响。与4T 1细胞中Twist基因抑制和MDA-MB-231细胞的结果类似，AxI基因抑制的4T1细胞的组织培养扩张没有受到显著影响(数据未示出)。
当将同源4T 1肿瘤细胞导入到雌性正常BALB/c小鼠的乳腺中时，其表现出双相生长模式，这是由于严格的免疫应答导致与白细胞浸润及坏死相关的肿瘤退化，之后与多脏器广泛转移一致在原位重新生长。4T1-GFPLuc细胞在免疫抑制NOD-SCID小鼠中只表现出单相生长(数据未示出)。我们将表达鼠靶向AxI的shRNA(4T1-GFP-Luc-shmAxI2)或阴性对照人特异性shRNA(4T1-GFP-LucshAxI279)的4T1-GFP-Luc细胞注入雌性BALB/c小鼠的乳房脂肪垫中，并且通过整体时域体内光学成像定量肿瘤的生长和转移(图7B)。对照4T1-GFP-Luc-shmAxI2细胞表现出迅速的原位增长，一周后达到最大。之后是持续五周的陡峭回归(图7B)。在第6周，观察到在原发位点的复发和多个远端转移灶，其随后迅速增长，导致第8周所有小鼠的濒死和致死。表达鼠靶向AxI的shRNA(4T1-GFP-LucshmAxI2)的4T1-GFP-Luc细胞最初遵循了类似的过程：原发瘤迅速增长，由AxI抑制略有减退，之后退化(图7B)。然而，完全没有发生原发瘤随后的复发和快速生长的远端转移灶的出现(图7B)。事实上，所有注射了4T1-GFP-Luc-shmAxI2细胞的小鼠在处死时仍然是健康的(8周)。4T1模型中与白血病反应特性相关的脾肿大在荷有AxI基因抑制肿瘤的小鼠中也降低(数据未示出)。第8周处死时，将单个切除的器官成像并对总光发射进行定量，证实了在所有荷有4T1-GFP-Luc-shAxI279肿瘤的小鼠内常见扩散位点处转移灶的存在(图7C-D)。与此相比，在荷有4T1-GFP-LucshmAxI2肿瘤的小鼠的器官中没有检测到生物发光肿瘤细胞(图7D-E)。这些结果支持了以下结论，AxI是乳腺肿瘤转移所必需的调节子。
Gas6对自分泌的调控
AxI的配体Gas6通常与AxI共表达，这与自分泌激活一致。在MDA-MB-231细胞中AxI的基因抑制后，指示自分泌信号传导的细胞相关Gas6和磷酸化AxI水平降低(图11)。MCF10A细胞组成型表达Gas6，并且在EMT诱导的AxI表达上成为细胞相关(图11)。这些结果表明，EMT过程诱导导致AxI的表达，并在乳腺上皮细胞中建立自分泌的信号传导。由于往往与Gas6共表达的AxI在许多转移性癌症中被检测到，因此自分泌AxI信号传导可能是许多类型的肿瘤中EMT的后果。EMT-诱导转录因子(如Snail、Slug和Twist)有力地诱导AxI的表达，表明AxI可以参与维持肿瘤细胞的恶性间质细胞表型的正反馈回路。这一观念与我们在转移性病变中观察到升高的AxI表达是一致的。
CD44+表型与AxI的表达有关
用Slug或HA-ras基因(pBABE puro H-Ras V12，Addgene公司)构建体转导MCF10a细胞。通过流式细胞术利用GFP的共表达分析Slug转导的细胞；通过嘌呤霉素处理48小时选择HA-Ras表达。如流式细胞术所示(图9，A栏)，MCF10a细胞中Slug和HA-Ras的表达导致癌干细胞标志物CD44的表面表达强增长。经Slug或Ha-Ras转导的MCF10a细胞的流式细胞分析进一步显示了表面AxI表达的强增长。通过FACS从表达Slug和HA-Ras的MCF10a细胞中分选出CD44高(CD44+)和低(CD44-)表达的亚群。CD44-细胞表现出上皮细胞形态，而CD44+MCF10细胞表现出伸长的间质细胞形态(图9，C栏)。这些细胞的Western印迹分析(图9，D栏)表明，CD44-MCF10a细胞保持上皮细胞连接和细胞骨架蛋白的表达。与此相比，CD44+细胞表现出强的间质细胞标志物(波形蛋白，N-钙粘着蛋白)的表达和E-钙粘着蛋白的损失，从而指示了EMT。在Slug和HA-ras诱导的EMT中，AxI的表达与CD44的存在和间质细胞特征相关(图9，B、D栏)。表达Slug和HA-Ras的CD44+和CD44-MCF10a细胞在三维基质胶上的生长(图9，E栏)表明，表达AxI的CD44+MCF10a细胞是侵染性的，其与间质细胞表型一致。这些结果表明，AxI由MCF10a细胞中的Slug和HA-Ras表达上调，并且与间质细胞和癌干细胞特征相关。
在不脱离本发明的范围和主旨的条件下，对本发明所述方面进行的各种修改和变形是本领域技术人员显而易见的。尽管本发明对具体优选的实施方案进行了描述，但是应当理解，请求保护的发明并不过度地限制于具体的实施方案。事实上，对相关领域技术人员显而易见的实施本发明所述方式的各种修改也应在本申请权利要求的范围内。
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Claims (57)

1.AxI作为生物标志物用于检测受试者中的上皮-间质转化(EMT)的发生的用途。
2.根据权利要求1所述的用途，其中AxI为用于检测上皮-间质转化(EMT)的诱导的生物标志物。
3.根据权利要求1或2所述的用途，其中AxI的上调指示上皮-间质转化(EMT)的发生。
4.一种用于检测样品中的上皮-间质转化(EMT)的发生的方法，所述方法包括以下步骤：
(i)从细胞、细胞群、动物模型或人中分离样品；
(ii)与对照样品相比，确定所述样品中AxI的表达，其中相比于所述对照样品，AxI表达的上调指示上皮-间质转化(EMT)的发生。
5.一种通过检测上皮-间质转化(EMT)的发生而诊断受试者中转移性癌症的方法，所述方法包括确定从所述受试者获取的样品中AxI受体多肽的水平，其中所述多肽的水平比未患转移性癌症的受试者的水平更高指示上皮-间质转化(EMT)的发生。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述癌症为乳腺癌。
7.AxI或编码AxI的基因在监测能够抑制或逆转上皮-间质转化(EMT)的试剂的活性中的用途。
8.根据权利要求7所述的用途，其中在对细胞、细胞群、动物模型或人施予所述能够抑制或逆转上皮-间质转化(EMT)的试剂后，监测AxI是否存在。
9.一种鉴定能够抑制或逆转上皮-间质转化(EMT)的试剂的方法，所述方法包括将所述试剂施予细胞、细胞群、动物模型或人，并监测AxI的活性和/或表达。
10.根据权利要求9所述的方法，其中该方法包括将所述试剂施予细胞、细胞群、动物模型或人，并检测所述已处理的样品中AxI表达相比于未处理对照组样品的改变。
11.一种检测抑制或逆转上皮-间质转化(EMT)的试剂的能力的方法，所述方法包括：
(i)将所述试剂施予细胞、细胞群、动物模型或人；以及
(ii)测量来源于已处理或未处理的细胞、动物或人的样品中的AxI表达；以及
(iii)检测所述已处理样品中的AxI表达相比于所述未处理样品的增加或减少，作为抑制或逆转上皮-间质转化(EMT)的能力的指标。
12.一种监测AxI抑制剂活性的方法，该方法包括通过下述步骤检测上皮-间质转化(EMT)的发生：
(i)将所述AxI抑制剂施予细胞、细胞群、动物模型或人；以及
(ii)测量来源于已处理或未处理的细胞、动物或人的样品中的AxI表达；以及
(iii)检测所述已处理样品中的AxI表达或活性相比于未处理样品的增加或减少，作为AxI抑制活性的指标。
13.根据权利要求11或12所述的方法，其中通过蛋白分析对所述样品进行分析。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述蛋白分析通过ELISA、PET、流式细胞术、SELDI-TOF MS或2-D PAGE进行。
15.根据权利要求4或9-14中任意一项所述的方法，或根据权利要求8所述的用途，其中所述细胞群为细胞培养物。
16.根据权利要求4或9-15中任意一项所述的方法，或根据权利要求8所述的用途，其中所述细胞为肿瘤细胞、PBMC或淋巴细胞。
17.根据权利要求4-6或10-16中任意一项所述的方法，其中所述样品为血液。
18.根据权利要求4-6或10-16中任意一项所述的方法，其中所述样品为血清、血浆或组织培养上清液。
19.一种鉴定能够抑制或逆转上皮-间质转化(EMT)的试剂的方法，所述方法包括以下步骤：
(i)将所述试剂与AxI受体或表达所述AxI受体的细胞接触；
(ii)在所述试剂的存在下测量所述AxI受体的活性；以及
(iii)将步骤(ii)中测得的所述活性与在对照条件下测得的活性相比较，其中活性降低表明所述试剂能够抑制或逆转上皮-间质转化(EMT)。
20.根据权利要求19所述的方法，其中测得的所述活性是所述AxI受体的底物的酪氨酸磷酸化程度。
21.根据权利要求19所述的方法，其中测得的所述活性是所述AxI受体的自磷酸化程度。
22.根据权利要求19所述的方法，其中所述接触步骤(i)中的所述细胞已经预先被所述AxI基因转染。
23.根据权利要求22所述的方法，其中所述的转染的细胞是瞬时或稳定转染的。
24.根据权利要求19所述的方法，其中步骤(iii)中的所述对照条件包括将所述试剂与不含活性AxI基因的细胞接触。
25.根据权利要求24所述的方法，其中所述细胞具有所述AxI基因的突变失活形式。
26.根据权利要求19所述的方法，其中所述AxI受体包括胞内结构域的生物学活性部分。
27.根据权利要求19所述的方法，其中所述AxI受体为固定化的。
28.一种通过筛选多种试剂来鉴定能够抑制或逆转上皮-间质转化(EMT)的试剂的方法，所述方法包括以下步骤：
(i)将所述多种试剂与AxI受体或表达所述AxI受体的细胞接触；
(ii)在所述多种试剂的存在下测量所述AxI受体的活性；
(iii)将步骤(ii)中测得的活性与在对照条件下测得的活性相比较，其中活性降低表明所述多种试剂能够抑制或逆转上皮-间质转化(EMT)；以及
(v)分别确定所述多种试剂中的哪种或哪些试剂抑制或逆转上皮-间质转化(EMT)。
29.根据权利要求9-28中任意一项所述的方法，其中所述试剂用于治疗转移性癌症。
30.根据权利要求9-28中任意一项所述的方法鉴定得到的试剂在制备治疗转移性癌症的药物中的用途。
31.一种药物组合物，其包含根据权利要求9-28中任意一项所述的方法鉴定得到的试剂与可药用的稀释剂、赋形剂或载体的混合物。
32.一种制备组合物的方法，该方法包括：
(i)使用权利要求9-28中任意一项所述的方法鉴定能够抑制或逆转上皮-间质转化(EMT)的试剂；以及
(ii)将所述试剂与可药用的稀释剂、赋形剂或载体混合。
33.一种在需要接受治疗的受试者中抑制已经发生上皮-间质转化(EMT)的癌细胞生长和扩散的方法，所述方法包括将AxI抑制剂施予所述受试者。
34.一种在需要接受治疗的受试者中治疗转移性癌症的方法，所述方法包括通过对所述受试者施予AxI抑制剂，从而抑制已经发生上皮-间质转化(EMT)的癌细胞的生长和扩散。
35.根据权利要求33或34所述的方法，其中所述AxI抑制剂为抗AxI抗体或小分子抑制剂。
36.根据权利要求33-35中任意一项所述的方法，其中所述受试者为哺乳动物。
37.根据权利要求33-35中任意一项所述的方法，其中所述受试者为人。
38.AxI抑制剂在制备用于抑制已经发生上皮-间质转化(EMT)的癌细胞的生长和扩散的药物中的用途。
39.AxI抑制剂在制备用于通过抑制已经发生上皮-间质转化(EMT)的癌细胞的生长和扩散来治疗转移性癌症的药物中的用途。
40.一种用于评价试剂抑制或逆转上皮-间质转化(EMT)的能力的试剂盒，所述试剂盒包含抗AxI抗体。
41.一种用于评价试剂抑制或逆转上皮-间质转化(EMT)的能力的试剂盒，所述试剂盒包含针对AxI的核酸探针。
42.一种用于评价试剂抑制或逆转上皮-间质转化(EMT)的能力的试剂盒，所述试剂盒包含至少一种针对AxI的QPCR引物。
43.权利要求40-42中任意一项所述的试剂盒在权利要求1或9-28中任意一项所述的方法中的用途。
44.一种用于确定受试者是否对采用AxI抑制剂的治疗易感的方法，所述方法包括以下步骤：
(i)从细胞、细胞群、动物模型或人中分离样品；
(ii)与对照样品相比，确定所述样品中AxI的表达，其中相比于所述对照样品，AxI表达的上调指示对采用AxI抑制剂的治疗易感。
45.一种对需要接受治疗的受试者中转移性癌症或晚期癌症进行治疗的方法，所述方法包括将AxI抑制剂施予所述受试者。
46.AxI抑制剂在制备用于治疗转移性癌症或晚期癌症的药物中的用途。
47.一种抑制需要接受治疗的受试者中的肿瘤转移的方法，所述方法包括将AxI抑制剂施予所述受试者。
48.AxI抑制剂在制备用于抑制肿瘤转移的药物中的用途。
49.一种抑制患癌症受试者中EMT诱导的侵染力的方法，所述方法包括将AxI抑制剂施予所述受试者。
50.AxI抑制剂在制备用于抑制患癌症受试者中EMT诱导的侵染力的药物中的用途。
51.实质上如本文所述的方法、用途、药物组合物或试剂盒。
52.根据权利要求1所述的生物标志物在个性化医疗应用中的用途。
53.根据权利要求52所述的用途，其中所述个性化医疗应用旨在确定受试者是否对采用AxI抑制剂的治疗易感或有反应。
54.根据权利要求52所述的用途，其中所述个性化医疗应用旨在确定受试者是否特别可能患有转移性癌症。
55.一种用于确定受试者是否会对采用AxI抑制剂的治疗易感的预测方法，所述方法包括检测所述受试者中的上皮-间质转化(EMT)的发生。
56.根据权利要求55所述的预测方法，该方法包括以下步骤：
(i)从所述受试者中获得样品；以及
(ii)与对照样品相比，确定所述样品中AxI的表达，其中相比于所述对照样品，AxI表达的上调指示对采用AxI抑制剂的治疗易感。
57.AxI作为生物标志物在用于确定受试者是否会对采用AxI抑制剂的治疗易感或有反应的预测试剂中的用途。
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