WO2023128697A1 - 유방암 세포주를 이용한 3차원 스페로이드 배양방법 및 이의 용도 - Google Patents

유방암 세포주를 이용한 3차원 스페로이드 배양방법 및 이의 용도 Download PDF

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WO2023128697A1
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cancer
spheroid
cell line
spheroids
breast cancer
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유한석
박수영
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서울대학교산학협력단
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Definitions

  • the present invention relates to a three-dimensional spheroid culture method using a breast cancer cell line and its use.
  • the two-dimensional cell culture method has been standardized and commercialized since the stable cultivation of animal cells in vitro, it is known to show significant differences in gene expression as well as morphology from animal cells that proliferate in three dimensions.
  • the 3-dimensional cell culture method has higher biological response than the 2-dimensional cell culture method of animal cells, and shows a large difference in reactivity to drugs.
  • a three-dimensional cell culture method with excellent biomimetic ability is required, which has led to a change in the paradigm of new drug development.
  • Spheroid-shaped spheroids are formed by performing three-dimensional cell culture in vitro from already differentiated cells, which is a relatively easily accessible method and can use traditionally widely used cell lines.
  • the three-dimensional cell culture method is a method in which cells are aggregated to form a spheroid that forms a uniform single shape, and cells isolated from patient-derived tissues, appropriate extracellular matrix, and differentiation and growth factors are added and cultured for a long time.
  • organoids which are called artificial mini-organs, which have some similar functions to human organs.
  • drug reactivity evaluation using organoids is evaluated as the most biocompatible model that can be performed in vitro, but the supply and demand of patient tissue is limited and there are many difficulties in generating organoids. no. In particular, it is known that organoid culture of breast cancer is not easy.
  • the present invention relates to a three-dimensional spheroid culture method using a breast cancer cell line and its use, characterized in that for establishing an optimal standardized culture method for a breast cancer cell line using a low attachment surface method. Lloyd culture method and use thereof.
  • the present invention comprises the steps of (a) preparing a cell line from a subject; (b) dispensing the prepared cells into low cell adhesion plates; And (c) culturing and amplifying the seeded cells; provides a method for producing spheroids using cancer cells containing.
  • the present invention provides a spheroid prepared by the above method.
  • the present invention comprises the steps of processing a candidate drug for the prevention or treatment of cancer in the spheroid prepared by the spheroid manufacturing method; And it provides a drug evaluation method comprising the step of evaluating the efficacy of the candidate drug in the spheroid.
  • the 3D spheroid culture method using a cell line according to the present invention can standardize and culture breast cancer cell lines using a cell low attachment surface method, and according to this 3D spheroid culture method, drugs for each molecular subtype of cancer Because the response is different, it has the advantage of classifying cell lines by molecular subtype and standardizing the three-dimensional cell culture method, and can be used in various fields such as drug efficacy evaluation.
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing a procedure for evaluating the drug efficacy of a new drug substance against breast cancer.
  • Figure 2 shows the results of spheroid culture of estrogen-positive breast cancer cell line (T47D).
  • Figure 3 shows the results of spheroid culture of estrogen-positive breast cancer cell line (MCF7).
  • Figure 4 shows the results of spheroid culture of the HER2-positive breast cancer cell line (BT474).
  • FIG. 5 shows the results of spheroid culture of a HER2-positive breast cancer cell line (JIMT-1).
  • FIG. 6 shows the results of spheroid culture of a HER2-positive breast cancer cell line (HCC1954).
  • FIG. 7 shows the results of spheroid culture of a HER2-positive breast cancer cell line (MDA-MB-453).
  • Figure 9 shows the results of spheroid culture of a triple negative breast cancer cell line (BT20).
  • HCC70 triple negative breast cancer cell line
  • Figure 11 shows the results of spheroid culture of triple negative breast cancer cell line (Hs578T).
  • Figure 12 shows the results of spheroid culture of a triple negative breast cancer cell line (HCC1395).
  • Figure 13 shows the results of spheroid culture of a triple negative breast cancer cell line (MDA-MB-157).
  • Figure 16 shows the results of optimized spheroid culture of a triple-negative breast cancer cell line (MDA-MB-468).
  • Figure 17 shows the results of spheroid culture in an estrogen-positive breast cancer cell line (MCF7) in which expression of a target gene is suppressed.
  • Figure 19a shows the results of comparative analysis of spheroid size in an estrogen-positive breast cancer cell line (MCF7) in which expression of a target gene is suppressed.
  • Figure 19b shows the results of comparative analysis of spheroid size in an estrogen-positive breast cancer cell line (T47D) in which expression of a target gene is suppressed.
  • Figure 19c shows the results of comparative analysis of spheroid size in an estrogen-positive breast cancer cell line (BT474) in which expression of a target gene is suppressed.
  • FIG. 20 shows the results of spheroid culture of a triple negative breast cancer cell line (MDA-MB-468) using a V-shaped bottom plate.
  • 21 shows the results of spheroid culture of a triple-negative breast cancer cell line (MDA-MB-468) using a spindle-type bottom plate.
  • FIG. 22 shows the results of optimized spheroid culture of a triple-negative breast cancer cell line (MDA-MB-468) using a specially coated bottom plate.
  • the present inventors classified cell lines for each molecular subtype by taking advantage of the fact that drug response is different for each molecular subtype of cancer, and standardized a 3-dimensional cell culture method to evaluate drug efficacy. Therefore, when a substance (therapeutic agent) showing an effective effect is selected in the three-dimensional spheroid cell culture method using cell lines for each molecular subtype, the efficacy and efficacy of the drug is verified by applying the three-dimensional organoid cell culture method from the patient-derived tissue. can be derived by doing
  • a new drug substance to be verified for cancer drug efficacy evaluation is spheroidized into cell lines for each subtype of breast cancer at the cell level by applying a three-dimensional cell culture method.
  • An effective drug can be effectively and easily selected by cell culture and screening.
  • effective drugs for each subtype can be derived by classifying drugs showing effects for each subtype of breast cancer and final verification using an organoid using a final patient-derived specimen.
  • breast cancer is largely classified into three subtypes: hormone receptor-positive breast cancer, HER2-positive breast cancer, and triple-negative breast cancer. It is known that the treatment method and applied anticancer agent are different for each subtype, and the individual response is also different. Therefore, in order to apply a patient-specific effective drug, it is necessary to evaluate and select which drug or combination with which drug is appropriate. Therefore, it is possible to finally derive an effective drug for the selected drug by screening the drug according to the spheroid culture method using the cell line of the present invention.
  • the present invention comprises (a) preparing a cell line; (b) dispensing the prepared cells into low cell adhesion plates; It provides a method for producing spheroids using cancer cells, including; and (c) generating spheroids by culturing the seeded cells.
  • the cell line in the present invention may be a cancer cell line.
  • the cancer cell line may be a breast cancer cell line, but is not limited thereto.
  • the breast cancer cell line can be classified by molecular subtype, and preferably, the breast cancer cell line can be an estrogen-positive breast cancer cell line, a HER2-positive breast cancer cell line, or a triple-negative breast cancer cell line.
  • the estrogen-positive breast cancer cell line may be any one selected from the group consisting of T47D, MCF7, ZR75-1 and HCC1428.
  • the HER2-positive breast cancer cell line may be any one selected from the group consisting of SK-BR-3, MDA-MB-453, HCC1954, HCC1419 and JIMT-1.
  • the triple negative breast cancer cell line is any one selected from the group consisting of MDA-MB-468, HCC1143, HCC1937, HCC70, BT549, MDA-MB-231, HCC38, Hs578T, MDA-MB-157 and HCC1395, including BT20 can be According to one embodiment of the present invention, procedures for establishing and standardizing the optimal spheroid culture method were performed using breast cancer cell lines belonging to each group.
  • Cancer in the present invention generally refers to a mammalian physiological condition characterized by uncontrolled cell proliferation.
  • cancer include: breast cancer, glioma, thyroid cancer, lung cancer, liver cancer, pancreatic cancer, head and neck cancer, stomach cancer, colon cancer, urothelial cancer, kidney cancer, prostate cancer, testicular cancer, cervical cancer, ovarian cancer, endometrial cancer, melanoma, and fallopian tube cancer.
  • cancer of the uterus blood, bone, skin, brain, vagina, endocrine, parathyroid, ureter, urethra, bronchus, bladder, bone marrow, acute lymphocytic or lymphocytic leukemia, acute or chronic lymphocytic leukemia, Acute nonlymphocytic leukemia, brain tumor, cervical cancer, chronic myelogenous leukemia, bowel cancer, T-zone lymphoma, esophageal cancer, gallbladder cancer, Ewing's sarcoma, tongue cancer, Hopkins lymphoma, Kaposis sarcoma, mesothelioma, multiple myeloma, neuroblastoma , non-Hopkin's lymphoma, osteosarcoma, neuroblastoma, mammary gland cancer, cervical cancer, penile cancer, retinoblastoma, skin cancer, and uterine cancer.
  • breast cancer in the present invention is a condition classified as a malignant pathological state by, for example, biopsy.
  • the clinical technique of breast cancer diagnosis is well known in the medical field.
  • breast cancer refers to all malignancies of the "breast” tissue, including, for example, malignancies and sarcomas.
  • the breast cancer is ductal carcinoma in situ (DCIS), lobular carcinoma in situ (LCIS), or mucinous carcinoma.
  • Breast cancer is invasive ductal carcinoma (IDC) or invasive lobular carcinoma (ILC).
  • the target subject is a human patient who has been presumed or actually diagnosed with breast cancer.
  • the cell line in the present invention can be prepared from a subject.
  • a subject in the present invention is a patient who has developed or is suspected of having breast cancer, and may mean a patient who needs or is expected to receive appropriate treatment for breast cancer, but is not limited thereto.
  • a cell low attachment surface plate in the present invention means a plate composed of 96 wells. According to one embodiment of the present invention, it refers to a plate capable of generating spheroids from the cell division after dividing the number of cells using the cell low adhesion plate in the present invention. According to one embodiment of the present invention, it is possible to generate spheroids in an average of 12 hours to 1 day, preferably within 1 to 2 days, by the low cell adhesion plate of the present invention. According to one embodiment of the present invention, the number of cells per well may be divided to 3x10 3 to 1x10 4 , but is not limited thereto. In addition, the number of cells per well may be dispensed in a range of at least 5x10 2 to 1x10 3 according to the characteristics of the cells in the low cell adhesion plate.
  • the plate with low cell adhesion is particularly advantageous in that the bottom of the well is round, and has advantages in observing and photographing spheroids.
  • Initiation of cell aggregation can be promoted by centrifugation, which plays a decisive role in how quickly spheroids are generated.
  • the step of generating spheroids in the present invention may be preferably performed for 12 hours to 1 day, more preferably for 1 to 2 days. Although the above incubation period is preferable, it is possible to prepare desired spheroids by adjusting the incubation period according to the degree of generation of spheroids.
  • This spheroid generation step does not have any disadvantages in terms of time compared to conventionally known two-dimensional culture methods.
  • when the attachment of cells to the culture vessel is confirmed in the two-dimensional culture method it proceeds to the procedure of applying the drug evaluation or other evaluation method, and similarly, it is confirmed that spheroids are generated by the three-dimensional culture method. If so, it is desirable to proceed to the next procedure or the next step immediately.
  • the culture medium in the present invention can use a conventional medium that can be used for the production of spheroids.
  • the culture medium may be selected and used according to the characteristics of the cell line.
  • the culture medium may be, for example, DMEM (Dulbecco's modified Eagle medium), Keratinocyte-SFM (Keratinocyte serum free medium), RPMI-1640, etc., but is not limited thereto.
  • the diameter of the cell aggregate decreases and is maintained at a certain level, and the uneven shapes on the surface of the cell aggregate gradually change to a relatively smooth state to have a spheroid three-dimensional shape.
  • the spheroid may be of a size capable of maintaining a three-dimensional shape while maintaining the activity of cells in the spheroid, for example, may have a diameter of 250 ⁇ m or less, preferably 80 to 250 ⁇ m.
  • the number of cells dispensed on the plate affects the size of the spheroid, and as time goes on, the cells tend to be dense, so morphologically hard and smooth.
  • the step of generating spheroids in the present invention may further include any one or more of an extracellular matrix, drug particles, and growth factor polymer beads for promoting proliferation and differentiation of cells.
  • the step of generating spheroids in the present invention may commonly proceed using a U-shaped 96-well plate, but is not limited thereto.
  • spheroid generation can proceed successfully only when at least an extracellular matrix is included.
  • the extracellular matrix in the present invention may be a human-derived extracellular matrix or a non-human animal-derived extracellular matrix.
  • the extracellular matrix according to an embodiment of the present invention may be any one selected from the group consisting of matrigel, collagen, vitronectin, and laminin, and preferably matrigel ( matrigel) and collagen (collagen), but may be any one or more selected from the group consisting of, but is not limited thereto.
  • an appropriate concentration of the extracellular matrix plays an important role in generating spheroids.
  • the method for producing spheroids of the present invention can be applied to a cell line that expresses or inhibits a target gene. Therefore, the number of living cells when 3-dimensional spheroids are formed by reacting with reagents capable of measuring the size of spheroids or measuring living cells by checking whether or not spheroids are generated from cell lines expressing or inhibiting the target gene over time. was quantified and measured.
  • the present invention provides a spheroid prepared by the above spheroid manufacturing method.
  • Spheroids prepared by the above production method can be applied to a method for confirming cancer metastasis, which can also be evaluated by measuring the diameter of the outgoing cells.
  • the present invention comprises the steps of processing a candidate drug for the prevention or treatment of cancer in the spheroid prepared by the spheroid manufacturing method; And it provides a drug evaluation method comprising the step of evaluating the efficacy of the candidate drug in the spheroid.
  • the spheroid according to one embodiment of the present invention can be used to evaluate the effectiveness of a drug for cancer or disease, it can be usefully used to evaluate the performance of a candidate drug for preventing / treating cancer or disease.
  • the spheroid may be prepared according to the production method of the present invention.
  • the drug evaluation method of the present invention may further include the step of evaluating the efficacy of the candidate drug in organoids using patient-derived specimens after the step of evaluating the efficacy of the candidate drug in spheroids.
  • the efficacy of the candidate drug can be evaluated by selecting the most effective drug through a sequential screening method by first screening in spheroids, which is a three-dimensional cell culture method, and finally verifying in organoids cultured from patient tissues.
  • Breast cancer cell lines can be classified into estrogen-positive breast cancer cell lines, HER2-positive breast cancer cell lines, and triple-negative breast cancer cell lines by molecular subtype. An experiment was designed to establish and standardize the optimal spheroid culture method using breast cancer cell lines belonging to each group.
  • Luminal A type cell lines T47D, MCF7, ZR75-1, and HCC1428 were used for spheroid culture as estrogen-positive breast cancer cell lines, and SK-BR-3, MDA-MB-453, HCC1954, and HCC1419 as HER2-positive breast cancer cell lines.
  • JIMT-1 was used for spheroid culture
  • triple negative breast cancer cell lines include BT20, MDA-MB-468, HCC1143, HCC1937, HCC70, BT549, MDA-MB-231, HCC38, Hs578T, MDA-MB- A total of 11 cell lines, such as 157 and HCC1395, were used for spheroid culture.
  • the number of living cells when forming 3-dimensional spheroids by reacting with reagents capable of measuring the size of spheroids or measuring living cells by checking the presence or absence of spheroid generation from cell lines expressing or inhibiting the target gene over time. was quantified and measured, and the effect of the target gene on cancer cell proliferation was evaluated.
  • a cell low attachment surface plate composed of 96 wells
  • 100 ⁇ l of the culture medium containing cells was dispensed by 100 ⁇ l of the cell culture medium from 5x10 2 to 1x10 4 according to the characteristics of the cells per well, and then 3 at 1000 rpm.
  • the cells were settled to the bottom of the well with a centrifuge for 12 minutes, and then cultured in a 37°C incubator supplied with 5% CO 2 for 12 to 1 day, and then the presence or absence of spheroids was determined under a microscope. As a result, it was confirmed that spheroids were generated on average from the cell division date (confirmed within 1-2 days on average).
  • MDA-MB-453 as a HER2-positive breast cancer cell line
  • MDA-MB-468 and MDA-MB-231 as triple-negative breast cancer cell lines did not generate spheroids only by using low-adhesion plates. Therefore, Matrigel and collagen were added simultaneously or separately to these cell lines and prepared in the following manner.
  • a cell low attachment surface plate composed of 96 wells
  • 50 ⁇ l of the culture medium containing the cells was dispensed by 50 ⁇ l of the cell culture medium from 5x10 2 to 1x10 4 according to the characteristics of the cells per well, and then 3 at 1000 rpm.
  • the cells were settled to the bottom of the well with a centrifuge for 1 minute, and then 50 ⁇ l of the culture medium containing Matrigel and collagen, which were appropriate concentrations for each cell line, was added to the low-adhesion plate where the cells were settled.
  • Cell lines in which the target gene is expressed or suppressed are cultured by standard culture methods after confirming the expression of the target gene when establishing the cell line. Thereafter, by using a cell low attachment surface plate composed of 96 wells in the same manner as applied to breast cancer cell lines, the number of cells is usually 3x10 3 to 5x10 3 to suit the characteristics of the cells per well.
  • Culture medium containing cells 100 After dispensing each ⁇ l, centrifuge at 1000 rpm for 3 minutes to collect cells at the bottom of the well, then incubate in a 37°C incubator supplied with 5% CO 2 for 12 to 1 day, and then observe spheroids under a microscope. The presence or absence of production was determined. As a result, it was confirmed that spheroids were generated on average from the cell division date (confirmed within 1-2 days on average).
  • Example 2 Cell low adhesion spheroid morphology analysis using breast cancer cell line
  • Example 1 The morphological change of each cell spheroid of the three-dimensional structure prepared in Example 1 was confirmed with Leica's DMI6000B Fully Automated Inverted Research Microscope. The morphological changes of spheroids were observed and photographed every day. Cell culture was additionally added every 2-3 days, and the changes were observed over 1 week, analyzed using the Leica Application Suite X program, and the best spheroid culture using each cell line. conditions were established.
  • Luminal A type cell lines T47D, MCF7, ZR75-1, and HCC1428 corresponding to estrogen-positive breast cancer cell lines were used for spheroid culture (FIGS. 2 to 3). While there are cell lines that form typical spheroids within 1 day, it was confirmed that there are cell lines that require up to 2-5 days.
  • the cells sink to the bottom of the plate and begin to form spheroids from the first day (day 0) of cell division. It was easy to observe in wells in which 5x10 2 to 5x10 3 cells were dispensed, and the diameter of the spheroid was 30-100 ⁇ m, and the diameter of the spheroid depended on the number of cells. In the case of wells in which the number of cells was dispensed with 1 ⁇ 10 4 cells, spheroids were generated one day after the dispensing and measured to have a diameter of 180-200 ⁇ m.
  • the diameter slightly increased from 30 ⁇ m after spheroid generation to 100 ⁇ m after 5 days of culture, but in wells in which 1x10 3 cells were dispensed, the diameter increased to 1978 ⁇ m. It was observed that it was confirmed that it was closer to a radial rather than a typical spherical shape. Instead, in the wells in which 2x10 3 cells were dispensed, spherical spheroids were observed on day 5 of culture, and their diameter was measured to be 750 ⁇ m (see FIG. 3).
  • the BT474 cell line it was confirmed that a typical spherical spheroid was formed within 1 day, and it was also confirmed that these spheroids showed more robust spheroid formation over time. It was observed that other cell lines took 2-5 days to form spheroids. Specifically, the diameter of the measured spheroids was measured from 30 ⁇ m to a maximum of 300 ⁇ m in the case of BT474, and it was confirmed that this also depended on the number of divided cells. The shape of the spheroids was observed to have a typical spherical shape after up to 1 day after culture (see FIG. 4).
  • the cell line JIMT-1 took 3-4 days to produce spherical spheroids, and it was confirmed that spheroids were produced only when a certain amount of cells were dispensed, and it was confirmed that 5x10 3 cell lines per well were optimal. The diameter of the spheroid was confirmed to grow up to 320 ⁇ m when 1x10 4 cells were dispensed (see FIG. 5).
  • MDA-MB-453 had difficulty in forming spherical spheroids even when sufficient culture time was given.
  • the optimal conditions for forming spherical spheroids within one day were confirmed by additionally supplying Matrigel and collagen, which are extracellular matrices.
  • a total of 11 cell lines including BT20, MDA-MB-468, HCC1143, HCC1937, HCC70, BT549, MDA-MB-231, HCC38, Hs578T, MDA-MB-157, HCC1395, were used for spheroid culture. used
  • spherical spheroids were formed on day 1 after seeding, and their diameters varied depending on the number of seeded cells.
  • the diameter of spheroids ranged from 30 ⁇ m to 80 ⁇ m, and the diameter of spheroids in wells in which 1x10 3 cells were dispensed ranged from 300 ⁇ m to 450 ⁇ m. (See Fig. 9).
  • the size of the spheroids was determined according to the number of divided cells.
  • the spheroid diameter was 20 ⁇ m in the well in which 5x10 2 cells were dispensed, and the spheroid diameter in the well in which 1x10 3 cells were dispensed was measured to be 280 ⁇ m.
  • the spheroid diameter was measured to be 50 ⁇ m for wells in which 5x10 2 cells were dispensed and 500 ⁇ m in the wells for which 1x10 3 cells were dispensed.
  • the shape of the solid spheroids could be observed, and the size of the spheroids was slightly smaller than that of the initial culture (see FIG. 11).
  • the cell line HCC1395 also had different diameters of spheroids depending on the number of cells dispensed, ranging from 30 ⁇ m to 550 ⁇ m (see FIG. 12 ).
  • Spheroid formation was confirmed within 1 day after cell division of the cell line MDA-MB-157, and it was confirmed that the diameter was proportional to the number of cells dispensed. Diameters from a minimum of 20 ⁇ m to a maximum of 450 ⁇ m were measured (see FIG. 13).
  • the cell line HCC1937 formed spherical spheroids within 12 hours of dividing the cells, and it was observed that spheroids were successfully generated even with at least 5x10 2 cells. It was also confirmed that the size of the spheroids produced in this cell line was dependent on the number of cells dispensed. It was confirmed that spheroids with a diameter of 30 ⁇ m were generated in the wells in which 2 cells of 5x10 were dispensed and grown into spheroids with a diameter of 80 ⁇ m when cultured for 5 days. It was measured that spheroids were generated and cultured as spheroids with a diameter of 150 ⁇ m for 5 days. It showed a typical spherical shape in terms of morphology, and it was observed that individual cells were somewhat scattered in wells with a large number of cells dispensed (see FIG. 14).
  • spheroids were not formed even after dividing 3x10 3 cells and culturing for 3-4 days.
  • matrigel and collagen were added at various magnifications and cultured, and at least 10 ⁇ g/ml matrigel and 18 ⁇ g/ml collagen were dispensed. When added, it was confirmed that spheroids were successfully formed within 1 day of culture (see FIG. 15).
  • the cell line MDA-MB-468 it was confirmed that spheroids were successfully formed when matrigel and collagen were added under the same conditions as the cell line MDA-MB-231.
  • the diameter of the spheroids generated by dispensing 3 ⁇ 10 3 cells was measured to be 320 ⁇ m for MDA-MB-231 and 350 ⁇ m for MDA-MB-468 (see FIG. 16).
  • Example 3 Analysis of the morphology of low cell adhesion spheroids using breast cancer cell lines suppressing target genes
  • MCF7, T47D, BT474 cell lines 3x10 3 cells established to suppress the expression of the target gene were divided and observed to confirm that the three-dimensional spheroid culture was well performed (FIGS. 17 to 23).
  • a cell line in which the expression of the target gene is suppressed was established by using a lentivirus system for each cell line.
  • the cell line into which the vector without expression of the target gene was inserted was indicated as shcon, and the cell line expressing vector candidates #1-#3 expressing shRNA (short hairpin RNA) that inhibits the target gene ALDOA was shALDOA#1. , shALDOA#2, shALDOA#3.
  • the cell line containing the control vector in the cell line MCF is MCF7/shcon
  • the cell lines containing the vector expressing the candidate shRNA that inhibits ALDOA are MCF7/shALDOA#1, MCF7/shALDOA#2, and MCF7/shALDOA#3, respectively. marked as
  • the effect of the target gene on 3-dimensional spheroid growth can be evaluated.
  • the average spheroid diameter of the control group (MCF7/shcon) was measured to be 575 ⁇ m, and the average spheroid diameter of the cell line in which the target gene ALDOA was suppressed was 512 (MCF7/shALDOA#1) and 468 (MCF7/shALDOA#1), respectively. shALDOA#2), 564 (MCF7/shALDOA#3) ⁇ m.
  • the average spheroid diameter of the control group (T47D/shcon) was measured to be 512 ⁇ m, and the average spheroid diameter of the cell line in which the target gene ALDOA was suppressed was 534 (T47D/shALDOA#1) and 505 (T47D/shcon), respectively.
  • shALDOA#2, 504 (T47D /shALDOA#3) ⁇ m (see FIGS. 18 and 19B).
  • the average spheroid diameter of the control group (BT474/ shcon) was measured to be 530 ⁇ m, and the average spheroid diameter of the cell line in which the target gene ALDOA was suppressed was 620 (BT474/shALDOA#1) and 580 (BT474/ shALDOA#1), respectively.
  • the cell line Hs578T/shSLC1A4, in which the expression of the target gene SLC1A4 was suppressed was also confirmed to form spheroids well without additional matrigel and collagen when cultured on V-shaped, spindle-type low-adhesive plates, and the control group (Hs578T/shcon)
  • the spheroid diameters in the cell line (Hs578T/shSLC1A4) in which expression of the target gene SLC1A4 was suppressed were 150 ⁇ m and 160 ⁇ m, respectively, on the second day of culture.
  • similar results were confirmed when cultured on a spindle-type low-adhesive plate.
  • It can be used to treat the cultured spheroid with a drug to confirm drug resistance or to evaluate the effect on spheroid formation and size when the target gene expression is suppressed or overexpressed, and applied to the study of the characteristics of the target gene.
  • Example 4 Drug evaluation analysis using spheroids and organoids
  • Spheroids were prepared from the cell lines BT20, MDA_MB-231, and MDA-MB-468 through Example 1, and each spheroid prepared was treated with the drug NAM (nicotinamide) to evaluate the effectiveness of the drug.
  • NAM nicotinamide
  • organoids were cultured from fresh tissues obtained from triple-negative breast cancer patients, and the effectiveness of the drug was evaluated using this organoid culture. In this example, after the first analysis was performed as spheroids, the second analysis was performed as organoids to analyze drug evaluation.
  • the suspension was put through a 70 ⁇ m strainer and 10 ml of IMDM (Iscove's Modified Dulbecco's Medium) containing 10% FBS was added, followed by centrifugation at 800 rpm for 5 minutes. Thereafter, 1 ml of cold ACK (Ammonium-Chloride-Potassium) solution was added, reacted on ice for 5 minutes, centrifuged again at 800 rpm for 5 minutes, dissolved in PBS, and the number of living cells was determined.
  • IMDM Iscove's Modified Dulbecco's Medium
  • cold ACK Ammonium-Chloride-Potassium
  • the cells collected after centrifugation at 800 rpm for 5 minutes were suspended in BME type 2, dispensed into 24-well plates, and gelatin and cell culture medium were added to a 37°C incubator supplied with 5% CO 2 . cultured. The culture medium was replaced every 3-4 days, and the resulting organoids were again put on a 70 ⁇ m strainer and distributed in a 96-well plate, treated with the drug NAM (nicotinamide) at 20, 40, and 80 mM and reacted for 3 days. After that, live cells were evaluated using 3D Cell Titer-Glo Luminescent to evaluate the response of organoids to the drug NAM.
  • NAM nicotinamide
  • Organoids were successfully cultured from cancer tissues obtained from triple-negative breast cancer patients, and the anticancer drug efficacy of the drug NAM verified in spheroids was also evaluated in organoids. As a result of observation 72 hours after treatment with the drug NAM, an anti-cancer candidate, organoids, it was confirmed that organoids not only inhibited growth and maintenance, but also failed to maintain the spherical shape of organoids and were observed in a finely divided form. .
  • the organoids responded to the drug in a concentration-dependent manner of the drug NAM, which was observed when the spheroids of the cell lines BT20, MDA_MB-231, and MDA-MB-468 were cultured and then each spheroid was treated with the drug NAM.
  • IC 50 from patient#1 to patient#4 when cultured organoids from four patients were treated with the drug NAM, compared with IC 50 values estimated at 21.4 ⁇ 1.42, 27.9 ⁇ 1.40, and 34.7 ⁇ 3.89 mM, respectively.
  • the values were 18.0 ⁇ 0.89, 12.8 ⁇ 0.39, 29.1 ⁇ 1.77, and 29.9 ⁇ 1.48 mM, respectively, confirming that they were almost similar to the IC 50 values evaluated in spheroids.

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Abstract

본 발명은 유방암 세포주를 이용한 3차원 스페로이드 배양방법 및 이의 용도에 관한 것으로, 본 발명에 따른 세포주를 이용한 3차원 스페로이드 배양방법은 세포 저밀착성(Low attachment Surface) 방식을 이용하여 유방암 세포주를 표준화하여 배양할 수 있으며 이러한 3차원 스페로이드 배양방법에 따라 암의 분자 아형별 약물 반응이 다르므로 분자 아형별 세포주를 분류하고 3차원적 세포배양법을 표준화할 수 있는 이점이 있으며 약물의 유효성 평가 등 다양한 분야에 활용할 수 있다.

Description

유방암 세포주를 이용한 3차원 스페로이드 배양방법 및 이의 용도
본 발명은 유방암 세포주를 이용한 3차원 스페로이드 배양방법 및 이의 용도에 관한 것이다.
동물세포를 체외에서 안정적으로 배양하기 시작하면서부터 2차원적 세포배양법이 표준화되고 상용화 되었지만, 이는 3차원적으로 증식하는 동물세포와 형태적 차이는 물론 유전자 발현에도 큰 차이를 보이는 것으로 알려져 있다. 뿐만 아니라 동물세포의 2차원적 세포배양법보다 3차원적 세포배양법이 생체 대응성이 높으며, 약물에 대한 반응성에도 큰 차이를 보이는 것으로 보고되고 있다. 특히 질환에 대한 약물의 유효성 평가를 위해서는 생체 모사력이 뛰어난 3차원적 세포배양법이 요구되고 있으며 이는 신약개발의 패러다임의 변화를 초래하게 되었다.
신약 개발은 기존의 2차원적 세포배양법보다 3차원적 세포배양법 인 스페로이드, 오가노이드를 활용한 신약 후보물질 스크리닝 방법으로 패러다임이 변화되었다. 이미 분화된 세포로부터 체외에서 3차원적 세포배양을 수행하면 구형태의 스페로이드가 형성이 되며, 이는 비교적 손쉽게 접근할 수 있는 방법이며 전통적으로 널리 사용되는 세포주를 이용할 수 있다.
3차원적 세포배양법은 세포들이 뭉쳐져서 균일한 단일 형태를 이루는 스페로이드 (spheroid)를 형성하게 하는 방법과 환자 유래 조직으로부터 분리된 세포와 적절한 세포외기질 그리고 분화 및 성장인자를 첨가하여 장시간 배양함으로써 인체 장기와 유사한 기능을 일부 하는 인공미니 장기로 불리는 오가노이드 (organoid)를 생성하게 하는 방법이 있다. 특히 오가노이드를 이용한 약물 반응성 평가는 체외에서 수행할 수 있는 가장 생체 대응성이 높은 모델로 평가받고 있으나 환자 조직의 수급이 제한적이며, 오가노이드를 생성하는데 많은 어려움이 있어 쉽게 접근할 수 있는 방법은 아니다. 특히 유방암의 오가노이드 배양은 쉽지 않을 것으로 알려져 있다.
한편, 국내외 암환자 규모가 지속적으로 증가하는 추세이고 이중 여성에서 유방암이 국내외에서 공통적인 주요 암종으로 랭크됨을 확인되며 특히, 국내 여성 중 34.2%가 암발생이 예상되며 이 중 26.3%는 여성암 발병 위험이 있어 여성암을 타겟하는 치료제 개발이 필요한 실정이다.
본 발명은 유방암 세포주를 이용한 3차원 스페로이드 배양방법 및 이의 용도에 관한 것으로, 유방암 세포주를 세포 저밀착성(Low attachment Surface) 방식을 이용하여, 최적의 표준화된 배양방법을 확립하는 것을 특징으로 하는 스페로이드 배양방법 및 이의 용도에 관한 것이다.
또한, 참고로 본 발명은 아래의 과제들로부터 지원을 받았다.
[과제고유번호]01097
[과제번호]01097-2021001
[부처명]과학기술정보통신부
[과제관리(전문)기관명]한국연구재단
[연구사업명]대학창업활성화지원사업
[연구과제명]3차원 스페로이드 및 오가노이드 기반 유효성 평가 스크리
닝 기술
[기여율]70/100
[과제수행기관명]서울대학교 산학협력단
[연구기간]2021.08.01 ~ 2022.01.31
[이 발명을 지원한 국가연구개발사업]
[과제고유번호]1711140365
[과제번호]2021R1A2C4086635 (800-20210526)
[부처명]과학기술정보통신부
[과제관리(전문)기관명]한국연구재단
[연구사업명]이공분야기초연구사업/중견연구자지원사업
[연구과제명]난치성 삼중음성 유방암 극복을 위한 SLC1A4 암대사 단백질
기전 규명 및 제어 기술 발굴
[기여율]30/100
[과제수행기관명]서울대학교 산학협력단
[연구기간]2021.09.01 ~ 2022.02.28
상기 문제점을 해결하기 위해, 본 발명은 (a) 대상체로부터 세포주를 준비하는 단계; (b) 상기 준비된 세포를 세포 저밀착성 플레이트에 분주하는 단계; 및 (c) 상기 분주된 세포를 배양하여 증폭하는 단계;를 포함하는 암 세포를 이용한 스페로이드 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 방법에 의하여 제조된 스페로이드를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 스페로이드 제조방법에 의하여 제조된 스페로이드에 암의 예방 또는 치료를 위한 후보 약물을 처리하는 단계; 및 상기 스페로이드에서 후보 약물의 효능을 평가하는 단계를 포함하는 약물 평가 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 세포주를 이용한 3차원 스페로이드 배양방법은 세포 저밀착성(Low attachment Surface) 방식을 이용하여 유방암 세포주를 표준화하여 배양할 수 있으며 이러한 3차원 스페로이드 배양방법에 따라 암의 분자 아형별 약물 반응이 다르므로 분자 아형별 세포주를 분류하고 3차원적 세포배양법을 표준화할 수 있는 이점이 있으며 약물의 유효성 평가 등 다양한 분야에 활용할 수 있다.
도 1은 신약 물질의 유방암에 대한 약물 유효성 평가하는 절차를 나타낸 모식도이다.
도 2는 에스트로겐 양성 유방암 세포주(T47D)의 스페로이드 배양 결과를 나태낸 것이다.
도 3은 에스트로겐 양성 유방암 세포주(MCF7)의 스페로이드 배양 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 HER2 양성 유방암 세포주(BT474)의 스페로이드 배양 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 HER2 양성 유방암 세포주(JIMT-1)의 스페로이드 배양 결과를 나타낸 것이다.
도 6는 HER2 양성 유방암 세포주(HCC1954)의 스페로이드 배양 결과를 나타낸 것이다.
도 7는 HER2 양성 유방암 세포주(MDA-MB-453)의 스페로이드 배양 결과를 나타낸 것이다.
도 8는 HER2 양성 유방암 세포주(MDA-MB-453)의 스페로이드 배양 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 삼중음성유방암 세포주(BT20)의 스페로이드 배양 결과를 나타낸 것이다.
도 10는 삼중음성유방암 세포주(HCC70)의 스페로이드 배양 결과를 나타낸 것이다.
도 11은 삼중음성유방암 세포주(Hs578T)의 스페로이드 배양 결과를 나타낸 것이다.
도 12는 삼중음성유방암 세포주(HCC1395)의 스페로이드 배양 결과를 나타낸 것이다.
도 13은 삼중음성유방암 세포주(MDA-MB-157)의 스페로이드 배양 결과를 나타낸 것이다.
도 14는 삼중음성유방암 세포주(HCC1937)의 스페로이드 배양 결과를 나타낸 것이다.
도 15는 삼중음성유방암 세포주(MDA-MB-231)의 스페로이드 최적화 배양 결과를 나타낸 것이다.
도 16는 삼중음성유방암 세포주(MDA-MB-468)의 스페로이드 최적화 배양 결과를 나타낸 것이다.
도 17은 타겟 유전자 발현이 억제된 에스트로겐 양성 유방암 세포주 (MCF7)에서의 스페로이드 배양 결과를 나타낸 것이다.
도 18은 타겟 유전자 발현이 억제된 에스트로겐 양성 유방암 세포주 (T47D)에서의 스페로이드 배양 결과를 나타낸 것이다.
도 19a는 타겟 유전자 발현이 억제된 에스트로겐 양성 유방암 세포주(MCF7)에서의 스페로이드 크기 비교분석 결과를 나타낸 것이다.
도 19b는 타겟 유전자 발현이 억제된 에스트로겐 양성 유방암 세포주(T47D)에서의 스페로이드 크기 비교분석 결과를 나타낸 것이다.
도 19c는 타겟 유전자 발현이 억제된 에스트로겐 양성 유방암 세포주(BT474)에서의 스페로이드 크기 비교분석 결과를 나타낸 것이다.
도 20은 V자형 bottom 플레이트를 이용한 삼중음성유방암 세포주(MDA-MB-468)의 스페로이드 배양 결과를 나타낸 것이다.
도 21은 Spindle 형 bottom 플레이트를 이용한 삼중음성유방암 세포주(MDA-MB-468)의 스페로이드 배양 결과를 나타낸 것이다.
도 22는 특수 코팅이 된 bottom 플레이트를 이용한 삼중음성유방암 세포주(MDA-MB-468)의 스페로이드 최적화 배양 결과를 나타낸 것이다.
도 23은 삼중음성 유방암 환자로부터 확보한 신선 조직으로부터 오가노이드 배양 및 이에 대한 약물 유효성 평가를 나타낸 것이다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명하기로 한다.
신약 물질에 대한 유효성을 평가하고자 할 때 가장 생체모사 능력을 보이는 체외 세포 배양법이 필요하다. 암은 분자수준에서 아형별로 구분하였을 경우, 치료 약물에 대한 반응성이 서로 다르므로 이를 분류하여 신약 물질을 평가하는 것이 필요하다. 통상적인 세포주에서 확인한 신약 물질의 유효성은 실제 환자 조직을 체외 배양하여 적용시켰을 때에도 유효한 효능을 보이는지를 확인하는 과정이 필요하다. 오가노이드에서 약물의 효능을 평가하는 것이 생체 반응도와 유사하나 오가노이드의 배양이 쉽지 않고 환자 조직의 확보에 제한적이다.
따라서, 본 발명자들은 암의 분자 아형별 약물 반응이 다르다는 점을 활용하여 분자 아형별 세포주를 분류하고 3차원적 세포배양법을 표준화하여 약물의 유효성 평가를 수행하였다. 따라서, 분자 아형별 세포주를 이용한 3차원적 스페로이드 세포배양법에서 유효한 효과를 보이는 물질(치료제)이 선별되면, 이에 맞는 환자 유래 조직으로부터 3차원적 오가노이드 세포배양법을 적용하여 약효의 유효성 효능을 검증하여 도출할 수 있다.
또한, 본 발명에 의하여 제조된 스페로이드를 활용한 약물의 유효성 평가방법에 따르면 암의 약물 유효성 평가를 위하여 검증해야 할 신약물질을 3차원적 세포배양법을 적용하여 세포 수준에서 유방암 아형별 세포주로 스페로이드 배양 및 스크리닝하여 유효한 약물을 효과적인 손쉽게 선별할 수 있다. 이후, 유방암 아종별 효과를 보이는 약물을 분류하여 최종 환자 유래 검체를 이용한 오가노이드를 활용하여 최종 검증함으로써 유효한 약물을 아종별로 도출할 수 있다.
한편, 유방암은 크게 세가지 아형, 즉 호르몬 수용체 양성 유방암, HER2 양성 유방암, 삼중음성 유방암으로 구분된다. 각 아형에 따라 치료방법과 적용 항암제가 다르며, 개인별 반응성도 다른 것으로 알려져 있다. 이에 환자 맞춤형 유효한 약물을 적용하기 위해서는 어떠한 약물이 혹은 어떠한 약물과의 조합이 적절한지 평가하여 선별하는 것이 필요하다. 따라서, 본 발명의 세포주를 이용한 스페로이드 배양방법에 따라 약물을 스크리닝 하여 선별된 약물을 대상으로 유효한 약물을 최종적으로 도출할 수 있다.
본 발명은 (a) 세포주를 준비하는 단계; (b) 상기 준비된 세포를 세포 저밀착성 플레이트에 분주하는 단계; 및 (c) 상기 분주된 세포를 배양하여 스페로이드를 생성하는 단계;를 포함하는 암 세포를 이용한 스페로이드 제조방법을 제공한다.
본 발명의 암 세포를 이용한 스페로이드 제조방법을 단계별로 설명한다.
단계 (a): 대상체로부터 세포주를 준비하는 단계
본 발명에서의 세포주는 암 세포주일 수 있다. 본 발명에서의 일실시에 따르면 암 세포주는 유방암 세포주일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 유방암 세포주는 분자 아형별로 구분할 수 있으며, 바람직하게 상기 유방암 세포주는 에스트로겐 양성 유방암 세포주, HER2 양성 유방암 세포주, 삼중음성 유방암 세포주일 수 있다. 상기 에스트로겐 양성 유방암 세포주는 T47D, MCF7, ZR75-1 및 HCC1428로 이루어진 군으로 선택되는 어느 하나 일 수 있다. 상기 HER2 양성 유방암 세포주로는 SK-BR-3, MDA-MB-453, HCC1954, HCC1419 및 JIMT-1로 이루어진 군으로 선택되는 어느 하나 일 수 있다. 상기 삼중음성 유방암 세포주로는 BT20을 포함하여 MDA-MB-468, HCC1143, HCC1937, HCC70, BT549, MDA-MB-231, HCC38, Hs578T, MDA-MB-157 및 HCC1395로 이루어진 군으로 선택되는 어느 하나 일 수 있다. 본 발명의 일실시예에 따르면, 각각의 그룹에 속하는 유방암 세포주를 이용하여 최적의 스페로이드 배양법을 확립하고 표준화하기 위한 절차를 수행하였다.
본 발명에서의 암은 일반적으로 제어되어 있지 않은 세포 증식을 특징으로 하는 포유류의 생리학적 상태를 지칭한다. 암의 예로서는　유방암, 신경교종, 갑상선암, 폐암, 간암, 췌장암, 두경부암, 위암, 대장암, 요로상피암, 신장암, 전립선암, 고환암, 자궁경부암, 난소암, 자궁내막암, 흑색종양, 난관암, 자궁암, 혈액암, 골암, 피부암, 뇌암, 질암, 내분비암, 부갑상선암, 요관암, 요도암, 기관지암, 방광암, 골수암, 급성 림프구성 또는 림프아구성 백혈병, 급성 또는 만성의 림포구성 백혈병, 급성 비림프구성 백혈병, 뇌종양, 경관암, 만성 골수성 백혈병, 장암, T-존 림프종, 식도암, 담즙 방광암, 유잉 육종(Ewing's sarcoma), 설암, 홉킨스 림프종, 카포시스 육종, 중피종, 다발성 골수종, 신경아세포종, 비홉킨 림프종, 골육종, 신경아세포종, 유선암, 경관암, 페니스암, 레티노블라스토마, 피부암, 및 자궁암을 들 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서의 유방암은 예컨대 생검(biopsy)에 의해 악성 병리상태로 분류되는 상태이다.　유방암 진단의 임상적인 기술은 의학 분야에서 잘 알려져 있다. 당업자라면　유방암이 예컨대 악성 종양 및 육종을 포함한,　유방　조직의 모든 악성을 나타냄을 이해할 것이다. 특정 예에 있어서,　유방암은　유방내암(ductal carcinoma in situ, DCIS), 상피내 소엽성 암종(lobular carcinoma in situ, LCIS), 또는 점액성　유방암(mucinous carcinoma)이다. 또한,　유방암은 침윤성 관상피암(infiltrating ductal carcinoma, IDC) 또는 침윤성 소엽내암(infiltrating lobular carcinoma, ILC)이다. 본 발명의 대부분의 예에 있어서, 목적 대상자는　유방암으로 추측되거나 또는 실제 진단받은 인간 환자이다.
본 발명에서의 상기 세포주는 대상체로부터 준비할 수 있다. 본 발명에서의 대상체는 유방암이 발병하였거나 그 발병이 의심되는 환자로,　유방암의 적절한 치료가 필요하거나 예상되는 환자를 의미하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
단계 (b): 상기 준비된 세포를 세포 저밀착성 플레이트에 분주하는 단계
본 발명에서의 세포 저밀착성 플레이트(Low attachment surface plate)는 96개의 웰로 구성된 플레이트를 의미하는 것이다. 본 발명의 일실시예에 따르면, 본 발명에서의 세포 저밀착성 플레이트를 이용하여 세포수를 분주한 후 세포 분주일부터 스페로이드를 생성할 수 있는 플레이트를 의미한다. 본 발명의 일실시예에 따르면 본 발명에서의 세포 저밀착성 플레이트에 의하여 평균적으로 12시간 내지 1일, 바람직하게 1일 내지 2일 이내로 스페로이드를 생성할 수 있다. 본 발명의 일실시예에 따르면, 세포수를 각 웰당 3x103 내지 1x104로 분주할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 세포 저밀착성 플레이트에 세포수를 각 웰당 세포의 특성에 맞게 적게는 5x102 내지 1x103로 분주할 수 있다.
상기 세포 저밀착성 플레이트는, 특히 웰 바닥이 둥근 형태 (round bottom)인 플레이트가 유리하며, 스페로이드 관찰 및 촬영에도 이점이 있다. 특히 세포를 분주한 후 1000 rpm에서 원심분리기로 웰 바닥에 세포가 모이도록 가라앉히는 것이 스페로이드 생성에 이점이 있으며, 이 경우 반나절, 혹은 하루 정도면 모든 세포주에서 스페로이드 생성의 개시를 확인할 수 있다. 세포의 결집 개시(initiation)가 원심분리기에 의해서 촉진될 수 있으며 이는 스페로이드를 얼마나 빨리 생성하느냐의 결정적인 역할을 한다.
단계 (c): 상기 분주된 세포를 배양하여 스페로이드를 제조하는 단계
본 발명에서의 스페로이드가 생성되는 단계는 바람직하게 12시간 내지 1일 동안, 보다 바람직하게 1 내지 2일 동안 수행될 수 있다. 상기 배양 기간이 바람직하기는 하나, 스페로이드로의 생성 정도에 따라 배양 기간을 조정함으로써 원하는　스페로이드의 제조가 가능하다. 이러한 스페로이드 생성단계는 기존에 알려진 2차원　배양방법과 비교하여 시간적인 측면에서 단점이 있는 것은 아니다. 본 발명의 일실시예에 따르면, 2차원 배양법에서 세포가 배양용기에 부착이 확인되면 약물평가 혹은 다른 평가방법으로 적용하는 절차로 진행되고, 마찬가지로 3차원적 배양법으로 스페로이드가 생성이 된 것이 확인되면 바로 다음 절차 혹은 다음 단계로 진행하는 것이 바람직하다. 스페로이드가 생성되면 스페로이드의 안쪽은 저산소증으로 세포의 사멸이 시작되므로 스페로이드가 제조된 것이 바로 확인이 되면 다음 절차, 예를 들면, 약물 반응성 평가 혹은 세포 침습능을 평가하는 등의 단계로 진행하는 것이 바람직하다.
본 발명에서의 배양 배지는 스페로이드의 생성을 위해 이용될 수 있는 통상적인 배지를 사용할 수 있다. 상기 배양 배지는 세포주의 특성에 맞게 배양 배지를 선택하여 사용할 수 있다. 또한, 스페로이드 생성시 특별한 배양배지를 선택하여 배양하는 것을 전제로 하는 것이 아니라 각 세포주를 배양하던 그 배지를 바로 적용하여 사용해도 무관하다는 이점이 있다. 상기 배양 배지는 예를 들면, DMEM(Dulbecco's modified Eagle medium), Keratinocyte-SFM (Keratinocyte serum free medium), RPMI-1640 등을 사용할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서의 스페로이드 제조방법에 의하면 배양이 진행될수록 세포집합체의 직경이 줄어들다가 일정 수준으로 유지되면서 세포집합체의 표면에 울퉁불퉁한 형태들이 점차 상대적으로 매끈한 상태로 바뀌어 스페로이드 입체 형태를 가지게 된다. 상기 스페로이드는 스페로이드 내의 세포들의 활성이 유지되면서 삼차원의 형태를 유지할 수 있는 정도의 크기로 예컨대, 직경이 250 μm 이하인 것일 수 있으며, 바람직하게 80 내지 250 μm일 수 있다. 또한, 플레이트에 분주한 세포 개수는 스페로이드의 크기에 영향을 미치며 시간이 갈 수록 세포는 밀집하는 경향이 있어 형태학적으로 단단하고 매끈하게 관찰되었다.
본 발명에서의 스페로이드가 생성되는 단계는 세포외기질, 약물 입자 및 세포의 증식 및 분화를 촉진하기 위한 성장 인자 폴리머 비드 중 어느 하나 이상을 더 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 일실시예에 따르면, 본 발명에서의 스페로이드가 생성되는 단계는 공통적으로 U자형 96 웰 플레이트를 사용하여 진행할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 몇몇 세포주에 대해서는 적어도 세포외기질을 포함해 주어야 스페로이드 생성이 성공적으로 진행될 수 있다.
본 발명에서의 세포외기질은 인간 유래의 세포외기질 또는 인간을 제외한 동물 유래 세포외기질일 수 있다. 본 발명의 일실시예에 따른 세포외기질은 마트리겔(matrigel), 콜라겐(collagen), 비트로넥틴(vitronectin) 및 라미닌(laminin)으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 일 수 있고, 바람직하게 마트리겔(matrigel) 및 콜라겐 (collagen)으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 일실시예에 따르면, 세포외기질이 추가적으로 필요한 세포주에 대해서는 세포외 기질의 적정 농도가 스페로이드 생성에 중요한 역할을 한다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 본 발명의 스페로이드 제조방법은 타겟유전자를 발현하거나 억제하는 세포주에 적용될 수 있다. 따라서, 타겟유전자를 발현하거나 억제하는 세포주로부터의 스페로이드 생성 유무를 시간대별로 확인하여 스페로이드의 크기를 측정하거나 살아있는 세포를 측정할 수 있는 시약과 반응하여 3차원적 스페로이드 형성시 살아있는 세포의 수를 수치화 및 측정하였다.
또한, 본 발명은 상기 스페로이드 제조방법에 의하여 제조된 스페로이드를 제공한다. 상기 제조방법에 의하여 제조된 스페로이드는 암전이능을 확인할 수 있는 방법에 응용할 수 있으며 이는 뻗어 나간 세포의 직경을 측정하여 평가할 수도 있다.
또한, 본 발명은 상기 스페로이드 제조방법에 의하여 제조된 스페로이드에 암의 예방 또는 치료를 위한 후보 약물을 처리하는 단계; 및 상기 스페로이드에서 후보 약물의 효능을 평가하는 단계를 포함하는 약물 평가 방법을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 따른 스페로이드는 암 또는 질환의 약물 유효성 평가에 사용될 수 있기 때문에 암 또는 질환의 예방/치료를 위한 후보 약물의 성능을 평가하기 위해 유용하게 사용될 수 있다. 상기 스페로이드는 본 발명의 제조 방법에 따라 제조된 것일 수 있다.
한편, 본 발명의 약물 평가 방법은 스페로이드에서 후보 약물의 효능을 평가하는 단계 이후 추가로 환자 유래 검체를 이용한 오가노이드에서 후보 약물의 효능을 평가하는 단계를 포함할 수 있다.
따라서, 3차원 세포배양법인 스페로이드에서 1차 선별하고 환자 조직으로부터 배양된 오가노이드에서 최종 검증하여 순차적 스크리닝 방법을 통하여 최적의 효과적인 약물을 선별하여 후보 약물의 효능을 평가를 수행할 수 있다.
이에 상응하는 특징들은 상술된 부분에서 대신할 수 있으므로, 그 기재를 생략한다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
실시예 1 : 세포 저밀착성 스페로이드 제조
유방암 세포주는 분자 아형별로 에스트로겐 양성 유방암 세포주, HER2 양성 유방암 세포주, 삼중음성 유방암 세포주로 구분할 수 있다. 각각의 그룹에 속하는 유방암 세포주를 이용하여 최적의 스페로이드 배양법을 확립하고 표준화하기 위하여 실험을 설계하였다.
에스트로겐 양성 유방암 세포주로는 루미날 A 타입의 세포주 T47D, MCF7, ZR75-1, HCC1428을 스페로이드 배양에 이용하였으며, HER2 양성 유방암 세포주로는 SK-BR-3, MDA-MB-453, HCC1954, HCC1419, JIMT-1을 스페로이드 배양에 이용하였으며, 삼중음성 유방암 세포주로는 BT20을 포함하여 MDA-MB-468, HCC1143, HCC1937, HCC70, BT549, MDA-MB-231, HCC38, Hs578T, MDA-MB-157, HCC1395로 총 11개의 세포주를 스페로이드 배양에 이용하였다.
또한, 타겟유전자를 발현하거나 억제하는 세포주로부터의 스페로이드 생성 유무를 시간대별로 확인하여 스페로이드의 크기를 측정하거나 살아있는 세포를 측정할 수 있는 시약과 반응하여 3차원적 스페로이드 형성시 살아있는 세포의 수를 수치화하여 측정하고 타겟유전자의 암세포증식에 미치는 영향을 평가하였다.
1) 유방암 세포주를 이용한 스페로이드 제조
96개의 웰로 구성된 세포 저밀착성(Low attachment Surface) 플레이트를 이용하여, 세포수를 각 웰당 세포의 특성에 맞게 5x102 내지 1x104개까지 세포를 포함한 배양액 100 μl씩 각각 분주한 후, 1000 rpm으로 3분간 원심분리기로 웰바닥에 세포가 모이도록 가라 앉힌 다음 5% CO2가 공급되는 37°C 배양기에서 12기간 내지 1일동안 배양한 후 현미경으로 스페로이드 생성 유무를 판단하였다. 그 결과, 평균적으로 세포 분주일부터 스페로이드가 생성(평균적으로 1-2일안에 생성확인)되는 것을 확인하였다.
2) 세포외기질인자의 탑재
대표적으로 HER2 양성 유방암 세포주로 MDA-MB-453와 삼중음성 유방암 세포주로는 MDA-MB-468 및 MDA-MB-231은 저밀착성 플레이트를 이용하는 것만으로는 스페로이드 생성이 되지 않는 것을 확인하였다. 따라서, 이러한 세포주를 대상으로 마트리겔(matrigel)과 콜라겐(collagen)를 동시에 혹은 각각 첨가하였으며 아래 방법으로 제조하였다.
96개의 웰로 구성된 세포 저밀착성(Low attachment Surface) 플레이트를 이용하여, 세포수를 각 웰당 세포의 특성에 맞게 5x102 내지 1x104개까지 세포를 포함한 배양액 50 μl씩 각각 분주한 후, 1000 rpm으로 3분간 원심분리기로 웰바닥에 세포가 모이도록 가라 앉힌 다음, 세포주마다의 적정 농도인 마트리겔(matrigel)과 콜라겐 (collagen)를 포함한 배양액 50 μl를 세포가 가라앉아 있는 저밀착성 플레이트에 넣어주었다. 이 때, 가라앉아 있는 세포가 흐트러지지 않도록 천천히 윗층에 덮이도록 overlay로 첨가해주어 총 100 μl가 되도록하여 5% CO2가 공급되는 37°C 배양기에서 12기간 내지 1일동안 배양한 후 현미경으로 스페로이드 생성 유무를 판단하였다.
3) 타겟유전자를 발현하거나 억제하는 세포주로부터의 스페로이드 제조
타겟 유전자가 발현되거나 억제되는 세포주는 세포주 확립시에 타겟 유전자의 발현 유무를 확인한 후, 표준 배양법에 의해 세포를 배양하였다. 이후, 유방암 세포주에 적용했던 동일한 방법으로 96개의 웰로 구성된 세포 저밀착성(Low attachment Surface) 플레이트를 이용하여, 세포수를 각 웰당 세포의 특성에 맞게 보통 3x103 내지 5x103개까지 세포를 포함한 배양액 100 μl씩 각각 분주한 후, 1000 rpm으로 3분간 원심분리기로 웰바닥에 세포가 모이도록 가라 앉힌 다음 5% CO2가 공급되는 37°C 배양기에서 12기간 내지 1일동안 배양한 후 현미경으로 스페로이드 생성 유무를 판단하였다. 그 결과, 평균적으로 세포 분주일부터 스페로이드가 생성(평균적으로 1-2일안에 생성확인)되는 것을 확인하였다.
실시예 2: 유방암 세포주를 이용한 세포 저밀착성 스페로이드 형태 분석
상기 실시예 1에서 제조된 3차원 구조의 각 세포 스페로이드의 형태 변화를 Leica사의 DMI6000B 완전자동식 도립현미경 (Fully Automated Inverted Research Microscope)으로 확인하였다. 스페로이드의 형태 변화를 매일 관찰하여 촬영하였으며 2-3일마다 세포배양을 추가적으로 첨가해주어 1주간에 걸쳐 그 변화를 관찰하여 Leica Application Suite X 프로그램을 이용하여 분석하여 각각의 세포주를 이용한 최상의 스페로이드 배양 조건을 확립하였다.
1) 에스트로겐 양성 유방암 세포주로 제조된 스페로이드
에스트로겐 양성 유방암 세포주에 해당하는 루미날 A 타입의 세포주 T47D, MCF7, ZR75-1, HCC1428을 스페로이드 배양에 이용하였다(도 2 내지 도 3). 1일 안에 전형적인 구형의 스페로이드를 형성하는 세포주가 있는 반면, 2-5일까지 시간을 필요한 세포주도 있는 것을 확인할 수 있었다.
구체적으로, 에스트로겐 양성 유방암 세포주에 해당하는 루미날 A 타입의 세포주 T47D의 경우, 세포를 분주한 첫날 (0 day)부터 세포가 플레이트 바닥에 가라앉아 밀집하면서 스페로이드를 형성하기 시작하는데 이때는 세포의 수가 적은 5x102 내지 5x103개의 세포가 분주된 웰에서 관찰하기 용이 하였으며, 그 직경은 30-100 μm로 스페로이드의 직경은 세포의 수에 의존적이었다. 세포의 수가 1x104개 분주된 웰의 경우, 분주후 하루가 지나면 스페로이드가 생성되어 직경 180-200 μm로 측정되었다. 웰당 5x102 개의 세포를 분주한 경우, 스페로이드가 생성된 직후, 직경 30 μm에서 5일동안 배양한 후에는 직경 80 μm 로 스페로이드의 크기가 변화한 것을 확인하였다. 반면 웰당 1x104개의 세포가 분주된 웰의 경우, 스페로이드가 생성된 후 직경 180 μm에서 5일 배양 후 직경이 650 μm까지 성장하는 것을 확인하였다. 전형적인 구형의 스페로이드를 형성하였으며, 배양시간이 지날 수록 스페로이드는 견고한 모양을 갖추었으며, 구형 스페로이드 안쪽은 검게 관찰되었다(도 2 참조).
세포주 MCF7의 경우, 5x102개의 세포가 분주된 웰의 경우, 스페로이드 생성 후 직경 30 μm에서 배양 5일 후에는 직경 100 μm로 소폭 커지지만, 1x103개의 세포가 분주된 웰에서는 1978 μm로 커지는 것을 관찰하였으며 이는 전형적인 구형이라기 보다는 방사형에 가까운 것이 확인되었다. 대신 2x103개의 세포가 분주된 웰에서는 구형의 스페로이드가 배양 5일째 관찰되었으며 그 직경은 750 μm로 측정되었다(도 3 참조).
2) HER2 양성 유방암 세포주로 제조된 스페로이드
HER2 양성 유방암 세포주에 해당하는 세포주 SK-BR-3, MDA-MB-453, HCC1954, HCC1419, JIMT-1을 스페로이드 배양에 이용하였다(도 4 내지 도 8).
BT474 세포주의 경우, 1일 안에 전형적인 구형의 스페로이드를 형성하는 것을 확인하였으며, 이러한 스페로이드는 시간이 갈수록 더욱 견고한 스페로이드 형성을 보이는 것도 확인할 수 있었다. 그 외 세포주는 2-5일의 시간을 더 소요하여 스페로이드를 형성하는 것을 관찰할 수 있었다. 구체적으로, 측정한 스페로이드의 직경은 BT474의 경우 30 μm에서 최대 300 μm 로 측정되었으며 이 또한 분주한 세포의 수에 의존적인 것을 확인할 수 있었다. 스페로이드의 형태는 배양 후 최대 1일 후에 전형적인 구형의 형태를 갖추는 것을 관찰하였다(도 4 참조).
세포주 JIMT-1은 구형의 스페로이드 생성까지는 3-4일이 소요되었으며, 일정량의 세포수가 분주되어야 구형의 스페로이드를 생성하는 것을 확인할 수 있었으며, 웰당 5x103개의 세포주가 최적임을 확인할 수 있었다. 스페로이드의 직경은 1x104개의 세포를 분주해주었을 경우 최대 320 μm까지 성장하는 것을 확인하였다(도 5 참조).
HCC1954의 경우, 분주후 1일째 스페로이드를 관찰할 수 있었으며, 견고한 형태를 유지하는 것을 알 수 있었다. 반면 배양 4일째부터는 견고한 스페로이드 형태가 다소 흩어지는 것이 관찰되었다. 스페로이드의 직경은 분주된 세포의 수에 의존적이며 최대 530 μm까지 배양되는 것을 확인하였다(도 6 참조).
HER2 양성 유방암 세포주 중 MDA-MB-453은 충분한 배양시간을 주더라도 구형의 스페로이드 형성이 어려운 것을 확인하였다. 3차원적 스페로이드 배양을 위하여 세포외기질인 마트리겔 및 콜라겐을 추가적으로 공급하면 하루안에 구형의 스페로이드를 형성하는 최적화 조건을 확인하였다.
세포주 MDA-MB-453의 경우, 1x104개의 세포를 분주하고 4일동안 배양하더라도 플레이트 바닥에 퍼져있으며 세포가 밀집하여 스페로이드를 형성하지 못하는 것을 확인할 수 있었다. 세포의 밀집을 개시시키기 위하여 마트리겔(matrigel)과 콜라겐 (collagen)를 다양한 농도 배율로 첨가해주었을 때 세포 분주 후 1일안에 스페로이드를 형성하는 것을 관찰할 수 있었으며, 시간이 갈 수록 견고한 스페로이드 형태를 보이는 것을 확인할 수 있었다(도 7 참조).
세포주 MDA-MB-453의 경우, 콜라겐 (collagen) 없이 마트리겔(matrigel) 단독 15 μg/ml을 추가해 주면 스페로이드가 생성되며 그 형태는 초기에는 길죽한 형태였지만 점차 구형의 스페로이드를 형성하는 것을 확인할 수 있었으며, 3x103개의 세포를 분주했을 경우, 스페로이드의 크기는 직경은 250 μm가 되는 것을 알 수 있었다(도 8 참조).
3) 삼중음성 유방암 세포주로 제조된 스페로이드
삼중음성 유방암 세포주는 BT20을 포함하여 MDA-MB-468, HCC1143, HCC1937, HCC70, BT549, MDA-MB-231, HCC38, Hs578T, MDA-MB-157, HCC1395로 총 11개의 세포주를 스페로이드 배양에 이용하였다.
세포에 따라서는 세포를 분주하자마자 스페로이드 형성이 단시간내에 형성되어 비교적 손쉽게 유효성 약물 평가를 수행할 수 있는 세포주가 있는 반면, 스페로이드가 잘 배양되지 않는 세포주도 관찰되었다(도 9 내지 도 16).
세포주 BT20경우, 분주후 1일째 구형의 스페로이드를 형성하며, 그 직경은 분주한 세포의 수에 따라 달랐다. 5x102 내지 1x103개의 세포를 분주한 경우, 배양후 4일동안, 스페로이드의 직경은 30 μm에서 80 μm로, 1x103개의 세포를 분주한 웰의 스페로이드 직경은 300 μm에서 450μm로 측정되었다(도 9 참조).
세포주 HCC70의 경우, 세포 분주후 12시간안에 스페로이드 형태를 모두 갖추었으며 분주된 세포수에 따라 스페로이드의 직경은 증가하였다. 최소 30 μm에서 최대 550 μm까지 분주된 세포수에 따라 스페로이드의 크기가 다른 것을 확인하였다(도 10 참조).
세포주 Hs578T의 경우, 전형적인 구형의 스페로이드를 만 하루안에 형성하는 것을 확인할 수 있었으며, 이 또한 분주한 세포의 수에 따라 스페로이드의 크기가 결정되는 것을 확인할 수 있었다. 분주후 하루가 지나면 5x102개의 세포를 분주한 웰의 경우 스페로이드 직경이 20 μm였고, 1x103개의 세포를 분주한 웰의 스페로이드 직경은 280 μm로 측정되었다. 배양 4일후에는 5x102개의 세포를 분주한 웰의 경우 스페로이드 직경이 50 μm, 1x103개의 세포를 분주한 웰의 스페로이드 직경은 500 μm로 측정되었다. 스페로이드의 배양 시간이 길어질 수록 견고한 스페로이드의 형태를 관찰할 수 있었으며, 배양초기보다 스페로이드의 크기는 다소 작아진 것으로 관찰되었다(도 11 참조).
세포주 HCC1395도 분주된 세포수에 의존적으로 스페로이드의 직경이 달랐으며, 30 μm에서 550 μm로 측정되었다(도 12 참조).
세포주 MDA-MB-157의 세포 분주후 1일안에 스페로이드 형성이 확인되었고 그 직경 분주한 세포의 수에 따라 비례함을 확인하였다. 최소 20 μm에서 최대 450 μm의 직경이 측정되었다(도 13 참조).
세포주 HCC1937은 세포를 분주한지 12시간안에 구형의 스페로이드를 형성하며 최소 5x102개의 세포로도 스페로이드가 성공적으로 생성되는 것을 관찰하였다. 이 세포주 역시 분주된 세포의 수에 의존적으로 생성되는 스페로이드의 크기가 결정되는 것을 확인하였다. 5x102개의 세포를 분주한 웰에서는 직경이 30 μm의 스페로이드가 생성되어 5일동안 배양하면 직경이 80 μm의 스페로이드로 성장하는 것을 확인하였으며, 2x103개의 세포를 분주한 웰에서는 직경 110 μm의 스페로이드가 생성되어 5일동안 직경 150 μm의 스페로이드로 배양된 것을 측정하였다. 형태적으로는 전형적인 구형을 보였으며, 분주된 세포의 수가 많은 웰에서는 낱낱개의 세포가 다소 흩어지는 것을 관찰할 수 있었다(도 14 참조).
MDA-MB-231, MDA-MB-468 세포주의 경우, 충분한 배양 시간을 주더라도 스페로이드 배양이 잘되지 않았으나, 세포외기질인 마트리겔 및 콜라겐을 추가하여 3차원적 스페로이드 배양이 되는 최적의 조건을 수립하였다.
세포주 MDA-MB-231의 경우, 3x103개의 세포를 분주하고 3-4일을 배양하더라도 스페로이드는 형성되지 않았다. 그리하여 세포의 밀집을 촉진시키기 위하여 마트리겔(matrigel)과 콜라겐 (collagen)을 다양항 배율로 첨가하여 배양한 결과 최소 10 μg/ml 마트리겔(matrigel)과 18 μg/ml 콜라겐 (collagen)을 분주시 첨가해주면 배양 1일안에 스페로이드가 성공적으로 형성되는 것을 확인하였다(도 15 참조).
세포주 MDA-MB-468의 경우도 세포주 MDA-MB-231과 같은 조건으로 마트리겔(matrigel)과 콜라겐 (collagen)을 첨가해주면 성공적으로 스페로이드가 형성되는 것을 확인하였다. 각각 3x103개의 세포를 분주하여 생성된 스페로이드의 직경은 MDA-MB-231의 경우 320 μm로, MDA-MB-468의 경우 350 μm로 측정되었다(도 16 참조).
실시예 3: 타겟 유전자를 억제하는 유방암 세포주를 이용한 세포 저밀착성 스페로이드의 형태 분석
상기 실시예 1에서 제조된 3차원 구조의 각 세포 스페로이드의 형태 변화를 주사전자현미경(SEM)으로 확인하였다.
타겟 유전자의 발현이 억제되도록 확립된 MCF7, T47D, BT474 세포주 3x103개의 세포를 분주하고 관찰하여 3차원적 스페로이드 배양이 잘 되는 것을 확인하였다(도 17 내지 도 23).
각각의 세포주에 렌티바이러스 시스템을 이용하여 타겟유전자의 발현이 억제되는 세포주를 수립하였다. 대조군으로 타겟유전자가 발현이 없는 벡터를 넣어준 세포주는 shcon 으로 표기하였으며, 타겟유전자 ALDOA를 억제하는 shRNA (short hairpin RNA)를 발현하는 벡터의 후보군 #1-#3을 발현하는 세포주는 shALDOA#1, shALDOA#2, shALDOA#3으로 표기하였다. 예를 들면, 세포주 MCF에 대조군 벡터가 들어간 세포주는 MCF7/ shcon으로, ALDOA를 억제하는 후보 shRNA가 발현되는 벡터가 들어간 세포주는 각각 MCF7/shALDOA#1, MCF7/shALDOA#2, MCF7/shALDOA#3로 표기하였다.
타겟유전자 ALDOA의 발현이 억제되는 세포주에서의 스페로이드 생성 및 크기를 측정함으로써 타겟유전자가 3차원적 스페로이드 성장에 미치는 영향을 평가할 수 있다.
세포주 MCF7의 경우, 대조군 (MCF7/ shcon)의 스페로이드 직경은 평균 575 μm로 측정되었고 타겟유전자 ALDOA가 억제된 세포주에서의 스페로이드 직경은 각각 평균 512 (MCF7/shALDOA#1), 468 (MCF7/shALDOA#2), 564 (MCF7/shALDOA#3) μm로 측정되었다. 이로써 타겟유전자 발현에 따른 스페로이드 직경을 측정함으로써 타겟유전자가 스페로이드 성장에 영향을 미치는지 여부를 판단할 수 있다(도 17 및 도 19a 참조).
세포주 T47D의 경우, 대조군 (T47D/ shcon)의 스페로이드 직경은 평균 512 μm로 측정되었고 타겟유전자 ALDOA가 억제된 세포주에서의 스페로이드 직경은 각각 평균 534 (T47D/shALDOA#1), 505 (T47D/shALDOA#2), 504 (T47D /shALDOA#3) μm로 측정되었다(도 18 및 도 19b 참조).
세포주 BT474의 경우, 대조군 (BT474/ shcon)의 스페로이드 직경은 평균 530 μm로 측정되었고 타겟유전자 ALDOA가 억제된 세포주에서의 스페로이드 직경은 각각 평균 620 (BT474/shALDOA#1), 580 (BT474/shALDOA#2), 502 (BT474 /shALDOA#3) μm로 측정되었다(도 19c 참조).
U자형 웰이 아닌 V자형, spindle 형. 특수 코팅이 된 플레이트를 이용한 3차원적 스페로이드 배양 평가시에도 스페로이드가 잘 배양되는 것을 확인하였으며, 타겟 유전자 발현이 억제된 세포주에서도 3차원적 스페로이드가 잘 배양되는 것을 확인할 수 있었다(도 20 내지 도 23 참조).
타겟 유전자 SLC1A4의 발현이 억제된 세포주 MDA-MD-468/shSLC1A4는 10 μg/ml 마트리겔(matrigel)과 18 μg/ml 콜라겐을 첨가하여 V자형, spindle 형 저밀착형 플레이트에 배양하면 3차원 스페로이드가 잘 형성되는 것을 확인하였으며 그 직경은 대조군 (MDA-MD-468/shcon)은 130 μm, SLC1A4 유전자 발현이 억제된 MDA-MD-468/shSLC1A4 세포의 스페로이드 직경은 100 μm로 배양 후 2일째 측정되었다. 타겟 유전자 SLC1A4의 발현이 억제된 세포주 Hs578T/shSLC1A4 또한 V자형, spindle 형 저밀착형 플레이트에 배양하면 추가적인 마트리겔(matrigel)과 콜라겐 없이 스페로이드를 잘 형성하는 것을 확인할 수 있었으며 대조군(Hs578T/shcon)과 타겟유전자 SLC1A4 발현이 억제된 세포주 (Hs578T/shSLC1A4)에서의 스페로이드 직경은 각각 150 μm과 160 μm로 배양 2일째 측정되었다. 또한, 특수 코팅이 된 플레이트를 이용한 3차원적 스페로이드 배양에서도 spindle 형 저밀착형 플레이트에 배양 시와 유사한 결과가 확인되었다.
이를 이용하여 배양된 스페로이드에 약물을 처리하여 약물의 저항성을 확인하거나 타겟 유전자 발현이 억제되거나 과발현되었을 경우, 스페로이드 형성 및 크기에 미치는 영향을 평가하여 타겟 유전자의 특성 연구에도 응용할 수 있다.
실시예 4: 스페로이드 및 오가노이드를 활용한 약물 평가 분석
실시예 1을 통해 세포주 BT20, MDA_MB-231, MDA-MB-468로부터 스페로이드를 제조하고 제조된 각 스페로이드에 약물 NAM (nicotinamide)을 처리하여 약물에 대한 유효성 평가를 진행하였다. 또한, 삼중음성 유방암 환자로부터 확보한 신선 조직으로부터 오가노이드 배양을 하였으며 이를 이용하여 약물에 대한 유효성 평가를 진행하였다. 본 실시예에서는 스페로이드로서 1차 분석을 진행한 이후, 오가노이드로서 2차 분석을 진행하여 약물 평가를 분석하였다.
오가노이드를 제조하기 위하여, 심중음성유방암 환자로부터 확보한 암조직 1500mm3을 125U/ml DNase I과 1mg/ml collagenase 효소가 포함된 Media 199 용액 10ml에서 잘게 조직을 다져서 5% CO2가 공급되는 37°C 배양기에서 15분간 배양을 시작으로 혼합이 잘 되도록 섞어준 다음 최대 3시간 동안 15분 간격으로 파이펫을 이용하여 잘 섞어주며 5% CO2가 공급되는 37°C 배양기에서 반응시켰다. 세포가 잘 분리된 현탁액이 만들어지면, 70 μm 가는체 (strainer)로 걸려주고 10% FBS가 포함된 IMDM (Iscove's Modified Dulbecco's Medium)을 10 ml 추가한 후 800 rpm에서 5분간 원심분리하였다. 이후, 차가운 1ml의 ACK (Ammonium-Chloride-Potassium) 용액을 넣고 아이스에서 5분간 반응시킨 후 다시 800 rpm에서 5분간 원심분리한 후, PBS에 용해하여 살아 있는 세포의 수를 결정하였다. 추가로, 800 rpm에서 5분간 원심분리한 후 회수한 세포는 BME type 2에 부유하고 24 웰 플레이트에 분주하고 젤라틴(gelatin)과 세포 배양액을 추가하여 5% CO2가 공급되는 37°C 배양기에서 배양하였다. 3-4일마다 배양액을 교체해 주었으며, 생성된 오가노이드는 다시 70 μm 가는체 (strainer)로 걸려주어 96 웰 플레이트에 분주하고 약물 NAM (nicotinamide)을 20, 40, 80 mM로 처리하고 3일동안 반응시킨 후, 3D Cell Titer-Glo Luminescent 로 살아 있는 세포를 평가하여 약물 NAM에 대한 오가노이드의 반응을 평가하였다.
삼중음성유방암 환자로부터 확보한 암조직으로부터 성공적으로 오가노이드를 배양하여, 스페로이드에서 검증한 약물 NAM의 항암 약물 효능을 오가노이드에서도 평가하였다. 항암 후보 물질인 약물 NAM를 오가노이드에 처리한 후 72시간 후에 관찰한 결과, 오가노이드의 성장 및 유지를 억제할 뿐만 아니라 형태학적으로도 오가노이드의 구형을 유지 못하고 잘게 쪼개진 형태로 관찰됨을 확인하였다.
특히, 오가노이드는 약물 NAM의 농도 의존적으로 약물 반응하는 것으로 관찰되었으며, 이는 세포주 BT20, MDA_MB-231, MDA-MB-468의 스페로이드를 배양한 후 각각의 스페로이드에 약물 NAM을 처리하였을 때의 IC50 값이 각각 21.4±1.42, 27.9±1.40, 34.7±3.89 mM로 평가된 것과 대비하여 네 명의 환자로부터 배양된 오가노이드에 약물 NAM를 처리했을 때의 patient#1 내지 patient#4까지의 IC50 값이 각각 18.0±0.89, 12.8± 0.39, 29.1 ±1.77, 29.9±1.48 mM로 평가되어 스페로이드에서 평가한 IC50 값과 거의 유사한 것을 확인하였다.
이러한 결과는 1차 스페로이드로서 약물 반응에 대한 평가결과와 대비하여 2차 오가노이드에서도 거의 유사한 약물 반응 평가 결과를 갖는 것임을 확인한 것으로 오가노이드를 활용한 약물 평가 분석 또한 유효한 약물 평가임을 알 수 있다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (14)

  1. (a) 세포주를 준비하는 단계;
    (b) 상기 준비된 세포를 세포 저밀착성 플레이트에 분주하는 단계; 및
    (c) 상기 분주된 세포를 배양하여 증폭하는 단계;를
    포함하는 암 세포를 이용한 스페로이드 제조방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 세포주는 유방암 세포주인 것인 스페로이드 제조방법.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 유방암 세포주는 에스트로겐 양성 유방암 세포주, HER2 양성 유방암 세포주 및 삼중음성 유방암 세포주로 이루어진 군으로 선택되는 것인 스페로이드 제조방법.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 에스트로겐 양성 유방암 세포주는 T47D, MCF7, ZR75-1 및 HCC1428로 이루어진 군으로 선택되는 것인 스페로이드 제조방법.
  5. 제3항에 있어서,
    상기 HER2 양성 유방암 세포주로는 SK-BR-3, MDA-MB-453, HCC1954, HCC1419 및 JIMT-1로 이루어진 군으로 선택되는 것인 스페로이드 제조방법.
  6. 제3항에 있어서,
    상기 삼중음성 유방암 세포주로는 BT20을 포함하여 MDA-MB-468, HCC1143, HCC1937, HCC70, BT549, MDA-MB-231, HCC38, Hs578T, MDA-MB-157 및 HCC1395로 이루어진 군으로 선택되는 것인 스페로이드 제조방법.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 배양은 1 일 내지 3 일 동안 진행하는 것인 스페로이드 제조방법.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 배양은 세포수가 5x102 내지 1x104로 분주되는 것인 스페로이드 제조방법.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 암은　유방암, 신경교종, 갑상선암, 폐암, 간암, 췌장암, 두경부암, 위암, 대장암, 요로상피암, 신장암, 전립선암, 고환암, 자궁경부암, 난소암, 자궁내막암, 흑색종양, 난관암, 자궁암, 혈액암, 골암, 피부암, 뇌암, 질암, 내분비암, 부갑상선암, 요관암, 요도암, 기관지암, 방광암, 골수암, 급성 림프구성 또는 림프아구성 백혈병, 급성 또는 만성의 림포구성 백혈병, 급성 비림프구성 백혈병, 뇌종양, 경관암, 만성 골수성 백혈병, 장암, T-존 림프종, 식도암, 담즙 방광암, 유잉 육종(Ewing's sarcoma), 설암, 홉킨스 림프종, 카포시스 육종, 중피종, 다발성 골수종, 신경아세포종, 비홉킨 림프종, 골육종, 신경아세포종, 유선암, 경관암, 페니스암, 레티노블라스토마, 피부암, 및 자궁암으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 스페로이드 제조방법.
  10. 제1항에 있어서,
    세포외기질은 인간 유래의 세포외기질 또는 인간을 제외한 동물 유래 세포외기질인 스페로이드 제조방법.
  11. 제1항에 있어서,
    세포외기질은 마트리겔(matrigel) 및 콜라겐(collagen)으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 스페로이드 제조방법.
  12. 제1항 내지 제11항에 따른 제조방법에 의하여 제조된 스페로이드.
  13. 제12항의 스페로이드에 암의 예방 또는 치료를 위한 후보 약물을 처리하는 단계; 및
    상기 스페로이드에서 후보 약물의 효능을 평가하는 단계를 포함하는 약물 평가 방법.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 약물 평가 방법은 스페로이드에서 후보 약물의 효능을 평가하는 단계 이후 환자 유래 검체를 이용한 오가노이드에서 후보 약물의 효능을 평가하는 단계를 추가로 포함하는 약물 평가 방법.
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