WO2021125845A1 - 구형의 3차원 종양 스페로이드 - Google Patents

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WO2021125845A1
WO2021125845A1 PCT/KR2020/018577 KR2020018577W WO2021125845A1 WO 2021125845 A1 WO2021125845 A1 WO 2021125845A1 KR 2020018577 W KR2020018577 W KR 2020018577W WO 2021125845 A1 WO2021125845 A1 WO 2021125845A1
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spheroid
tumor
spheroids
cells
cell
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Application number
PCT/KR2020/018577
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English (en)
French (fr)
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김상헌
오승자
최우식
배인영
Original Assignee
한국과학기술연구원
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing

Definitions

  • It relates to a spherical three-dimensional tumor spheroid and a method for evaluating the efficacy of a tumor therapeutic using the same.
  • 3D culture technology has recently attracted attention as a tool to improve the physiological relevance of an in vitro model for evaluating drug efficacy.
  • Numerous studies have developed in vitro models with 3D platforms including multicellular spheroids, scaffolds and biochips. This 3D culture platform has led to the development of new, more physiological human health tissue and tumor models.
  • Many researchers have established in vitro models of tumors and living organs, including liver, heart, intestines and kidneys, that are involved in drug metabolism in the human body.
  • An object of the present invention is to provide a spherical three-dimensional tumor spheroid and a method for evaluating the efficacy of a tumor therapeutic using the same.
  • One aspect is a core portion comprising a tumor cell group; and an adipose-derived stromal cell group and an extracellular matrix component, and an outer part surrounding the core part; provides a spherical three-dimensional tumor spheroid comprising a.
  • Another aspect provides a tumor cell model comprising the three-dimensional tumor spheroid.
  • Another aspect provides a screening composition comprising the cell model.
  • Another aspect provides a composition for evaluation of a tumor therapeutic agent comprising the three-dimensional tumor spheroid.
  • the cells included in the tumor cell group and adipose-derived stromal cell group are not particularly limited as long as they are from an individual having a tissue capable of forming a tumor, for example, those derived from humans, mice, rabbits, dogs, pigs, or monkeys. and, more specifically, may be human.
  • the tumor cell group is not particularly limited as long as it is obtained from a tumor cell line that can be easily obtained in the art, for example, breast cancer cells, lung cancer cells, fibrosarcoma cells, gastric cancer cells, oral cancer cells, prostate cancer cells, liver cancer cells, ovarian cancer cells , including thyroid cancer cells, uterine cancer cells, glioblastoma cells, melanoma cells, gingival cancer cells, tongue cancer cells, pancreatic cancer cells, kidney cancer cells, bone cancer cells, testicular cancer cells, mesothelioma cells, lymphoma cells, brain tumor cells, colon cancer cells or bladder cancer cells may be, but is not limited thereto.
  • the tumor cell group includes MDA-MB-231, MDA-MB-468, BT-549, MCF-10A, MCF-7, A549, HT1080, MKN45 or SK-BR-3 cells. may be, but is not limited thereto.
  • the extracellular matrix component may be a product expressed by the interaction between the tumor cell group and the adipose-derived stromal cell group, which is a component present in the entire outer part including the surface of the spheroid, and encloses the entire core part.
  • the extracellular matrix component may not be implemented similarly to an actual tumor tissue known to be overexpressed, and thus it may be difficult to be utilized for screening or efficacy evaluation of cancer or tumor therapeutic agents.
  • Collagen and fibronectin may be included as components of the extracellular matrix, which may be products expressed by the interaction between the tumor cell population and the adipose-derived stromal cell population as described above.
  • Collagen type 1 may be included as the collagen, which plays a main role in preventing penetration of cancer or tumor therapeutic agents, and serves as a main gateway when evaluating the efficacy of cancer or tumor therapeutic agents or performing screening using the spheroids. can do.
  • the diameter of the spheroid may be 200 to 900 ⁇ m, 250 to 850 ⁇ m, 300 to 800 ⁇ m, 350 to 750 ⁇ m, 400 to 700 ⁇ m, 450 to 650 ⁇ m or 500 to 600 ⁇ m, but 3D tumor spheroids in vitro It may preferably be 500 to 600 ⁇ m in terms of being able to similarly mimic an in vivo tumor while maintaining an appropriate size as a roid.
  • the value of the roundness of the spheroid may be 0.90 or more.
  • the value of the sphericity (sphericity) of the spheroid may be 0.90 or more.
  • the value of roundness may be 0.99 or more, and the value of sphericity may be 0.99 or more.
  • the uniformity of the spherical shape and the consistency of formation are very important for the establishment of metabolic activity, the spheroid may exhibit a complete, uniform, and stable spherical shape.
  • the spheroids may be formed by co-culturing the tumor cell group and the adipose-derived stromal cell group at a cell density of 7:3 to 3:7, preferably formed by co-culture at a cell density of 1:1, It may be based on the effect that the viability of the spheroid itself increases and the drug permeability decreases as it approaches the cell density ratio of 1:1. In this case, the efficacy of cancer or tumor therapeutics may be screened or compared using spheroids in which the co-cultured cell density ratio of the tumor cell group and the adipose-derived stromal cell group is appropriately set within the range of 7:3 to 3:7. will be.
  • the co-cultured cell density ratio of the tumor cell group and the adipose-derived stromal cell group is 7:3, penetration of the spheroid into the core part was successful, but in the case of 1:1, the first drug did not succeed, 7: In both cases of 3 and 1:1, it can be determined that the cancer or tumor treatment efficacy is weaker compared to the second drug that has successfully penetrated into the core.
  • the step of treating the target drug to the spheroid; and analyzing the distribution of the target drugs in the core part of the spheroid, or analyzing the viability of cells in the spheroid provides a method for evaluating the efficacy of a cancer or tumor therapeutic agent, including.
  • a conventional method in the art for evaluating the efficacy of a cancer or tumor therapeutic agent in vitro may be followed, for example, a cancer or tumor therapeutic agent in a culture medium seeded with spheroids. It may be in the form of adding and culturing for a certain period of time, but is not necessarily limited thereto.
  • a plurality of spheroids may be processed in correspondence with each of a plurality of drugs 1:1, and a plurality of drugs may be processed in one spheroid, but is not necessarily limited thereto, If there is no problem in performing the next step of analyzing the distribution of drugs in the core part of the spheroid or analyzing the viability of the cells in the spheroid, any method may be taken.
  • any method known in the art that can track the route or the degree of distribution of the target drug can be used without any particular limitation, for example, in the detection of fluorescence obtained from the drug. distribution can be analyzed.
  • the viability can be analyzed through a method such as counting the cells surviving in the spheroid after preparation before and after the treatment of the drug. It can be borrowed and used without it.
  • the survival rate of cells in the spheroid reflects the overall phenomenon of a decrease in the size or number of tumor cell groups according to the treatment of the target drug, and various and comprehensive phenomena including apoptosis or necrosis are reflected. it may be
  • the survival rate of the cells in the spheroid may be the survival rate of the tumor cell group in the core part of the spheroid, preferably in terms of considering the selective therapeutic ability of the cancer or tumor treatment for tumor cells.
  • the distribution of one target drug in the core part of the spheroid when the distribution of one target drug in the core part of the spheroid is higher than the distribution of the other target drug, or the viability of cells in the spheroid is lower than when the other target drug is treated when one target drug is treated , It may further include the step of determining that the cancer or tumor treatment efficacy of the one target substance is more excellent, the distribution of the drug in the core part and the survival rate of the cells in the spheroid may have an inverse correlation, specifically , means that the higher the distribution of the drug in the core, the better the drug is delivered by penetrating the outer part, and may be based on the fact that the survival rate of the tumor cell group existing in the core can be lowered.
  • the distribution of the target drug in the core part of the spheroid is not observed at all, or the survival rate of the cells in the spheroid or the survival rate of the tumor cell group in the core part is the survival rate compared to before treatment when the target drug is treated If the reduction is not significant, it is clear to those skilled in the art that the one target drug may be evaluated or screened as unsuitable as a cancer or tumor treatment beyond low efficacy.
  • Another aspect provides a method of screening a material for treating a tumor, comprising incubating the three-dimensional tumor spheroid and a candidate material.
  • the tumor spheroids are as described above.
  • the method includes incubating the three-dimensional tumor spheroid and a candidate substance.
  • the candidate substance means a substance expected to prevent or treat a tumor or cancer.
  • the candidate material may be an organic or inorganic material, and may be a single compound or a complex compound. In addition, it may be a protein, peptide, DNA, RNA, etc., and all substances existing in nature may be a target.
  • the method includes measuring the expression level of the tumor biomarker of the cultured spheroids, or determining whether survival.
  • the biomarker is a substance that can distinguish and diagnose a normal group individual from an individual having a tumor or cancer, and a polypeptide, protein or nucleic acid, gene lipid, glycolipid, glycoprotein or sugar that shows an increase or decrease in an individual having cancer, etc. Includes all of the same organic biomolecules.
  • a change in the expression of a biomarker of a tumor or cancer may increase or decrease the expression.
  • the method provides a step of selecting a candidate material when the expression of the tumor biomarker of the cultured spheroid increases or decreases, or the cultured spheroid dies.
  • Another aspect provides a method of providing information on the cell permeability of an anticancer agent using the three-dimensional tumor spheroid.
  • the spheroid and arm are the same as described above.
  • the term “anticancer drug” refers to a drug that prevents the division of cancer cells and kills cancer cells.
  • the anticancer agent has a characteristic of penetrating and penetrating the surface of cancer cells. Therefore, the information on the cell permeability of the anticancer agent, obtaining information on the cell permeability of the anticancer agent may be a clue that can be inferred about the effect of the anticancer agent. When it is determined that the cell permeability of the anticancer agent is high, it can be determined that the anticancer agent is effective in treating cancer.
  • the anticancer agent is vatalanib, lenvatinib, dovitinib, ammonium-glycyrrhizinate, epirubicin, temsirolimus, lintitript (SR-27897), cabozantinib, tesmilifene (DPPE), KX-01 (KX2-391, tirbanibulin), rubitecan, bardoxolone-methyl, bardoxolone- mitomycin-c, genistein, paclitaxel, carboxyamidotriazole, pazopanib, halofuginone, vinblastine, SGX523, lonafarnib, marimastat, patupilone (epothilone-b), derenofylline, lorlatinib, OSI-930, everolimus, capecitabine, tin iboxifltamine, rucapinib, OSI-930, everolimus, capecitabine ,
  • the method may further include inducing a regression analysis model in consideration of various chemical properties of each anticancer agent or their interactions.
  • the method may further include performing regression analysis using the regression analysis model.
  • regression analysis is a statistical technique that enables estimation of the influence of one or more independent variables on the dependent variable.
  • independent A regression line can be obtained through the distribution of points where the variable and the dependent variable meet
  • the design of the regression analysis model is analyzed through stepwise regression method may be included, and the variable selection method may include utilization of a forward method.
  • the regression analysis is the molecular weight (MW) of the drug, partition coefficient (LogP), water solubility (LogS), acid dissociation equilibrium constant (pKa), physiological charge, hydrogen acceptor count, number of hydrogen donors selected from the group consisting of hydrogen donor count, polar surface area, rotatable bond count, polarizability, refractivity and number of rings It may be performed using one or more chemical characteristics as input parameters.
  • the regression analysis model may include a regression analysis equation expressed by Equation 1 below.
  • the regression analysis equation may be to derive the predicted cell viability difference value (or permeability).
  • PO is the predicted cell viability difference (or permeability)
  • K is MW (g/mol)
  • L is logP
  • M is logS
  • N hydrogen acceptor count (units)
  • O hydrogen donor count (units)
  • P is the polar surface area
  • Q is the rotatable bond count (units)
  • R is the refractivity (m3/mol)
  • S is the polarizability.
  • the multiple regression equation may be a standardized value between 0 and 1 for the difference value (or permeability) of the viability of the 3D multicellular tumor spheroid and the 3D single cell spheroid. A value closer to 1 may mean that the transmittance value predicted through chemical properties is similar to the actual value.
  • Multiple regression analysis may be a linear fitting method, or it may be to derive a regression line by grasping the distribution composition of the point where the transmittance value predicted through chemical properties and the actual value meet.
  • the coefficient of determination (R2) of the regression line may be 0.60 to 0.75 or 0.62 to 0.70.
  • the method comprises: collating the derived cell viability difference value (or permeability) with an actual output variable; And it further comprises the step of evaluating the permeability of the anticancer agent based on the control result.
  • Another aspect provides the use of the three-dimensional tumor spheroid, or a composition comprising the same, in the manufacture of a cellular model.
  • Another aspect provides the use of the tumor spheroid, or a composition comprising the same, in the preparation of a screening composition for a substance for treating a tumor.
  • One aspect of the spherical three-dimensional tumor spheroid has a diameter, a roundness, and a sphericity that can be used appropriately in vitro , and expresses an ECM structure similar to that of an in vivo , thus evaluating the efficacy of various tumor treatment drugs can be used for
  • 1 is a schematic of three types of 3D multicellular tumor spheroids.
  • FIG. 2 is a schematic diagram of an experimental method (workflow) described in Examples.
  • 3 to 6 are for the results of analysis of the 3D multicellular tumor spheroid, each for a measured image, diameter, roundness (roundness) and sphericity (sphericity).
  • A, D, G are ASC+MDA-MB-231
  • B, E, H are BMSC+MDA-MB-231
  • C, F , I are for FIB+MDA-MB-231.
  • 10 to 13 are the results of confirming the penetration of doxorubicin into three types of 3D multicellular tumor spheroids, respectively, from the left ASC+MDA-MB-231, BMSC+MDA-MB-231, FIB+MDA-MB-231. and red means doxorubicin.
  • 15 and 16 are results of measuring apoptosis (apoptosis) and necrosis (necrosis) of cells in three types of 3D multicellular tumor spheroids, respectively, when 10 ⁇ M doxorubicin was treated for 48 hours.
  • 17 is a result of analyzing the viability of cells in the monolayer when 10 ⁇ M doxorubicin is treated with fibroblasts and co-cultured MDA-MB-231 2D breast cancer cell monolayer for 48 hours.
  • the co-cultured ratio of ASC:MDA-MB-231 is 10:0, 3 from the left, respectively. :7, 5:5, 7:3, 0:10.
  • the co-cultured ratios of ASC:MDA-MB-231 are 10:0, 3:7, and 5: from the left, respectively. 5, 7:3, 0:10, and red means doxorubicin.
  • Figures 21a and b show the names and structures of 44 anticancer agents used for drug efficacy evaluation in addition to doxorubicin.
  • Figure 22 shows the viability of cells in 3D multicellular tumor spheroids (ASC+MDA-MB-231) and 3D single-cell tumor spheroids when 44 types of anticancer agents that are clinically used or in clinical process stage other than doxorubicin were treated for 48 hours. is the result of comparative analysis.
  • ASC+MDA-MB-2311 shows the chemical properties of 16 anticancer agents for multiple regression analysis and the results of comparing the viability of cells in 3D multicellular tumor spheroids (ASC+MDA-MB-231) and 3D single-cell tumor spheroids.
  • FIG. 24 is a graph expressing the results of multiple regression analysis, and shows the results predicted through the actual experimental results and the chemical properties of the anticancer drug of FIG. 23 .
  • Figure 25 is the result of analyzing the penetration of epirubicin in 3 types of 3D multicellular tumor spheroids, red means epirubicin.
  • Figure 26 is the result of analyzing the penetration of topotecan in 3 types of 3D multicellular tumor spheroids, green means topotecan.
  • Figure 27 shows that 5 types of solid cancer cells (A549, HT1080, MKN45, SK-BR-3 or MCF-7) were utilized to form 3D single cell tumor spheroids (top), or they were co-cultured with ASCs to form 3D multicellular It is the result of the actual measurement image for the case where the tumor spheroid was formed (lower side).
  • ASC Human adipose-derived stromal cells
  • Bone marrow stromal cells (BMSC) and human dermal fibroblasts (FIB) were purchased from the clergy University of Korea (Seoul, Korea) and supplemented with 10% FBS, 1% L-glutamine and penicillin/streptomycin. was maintained in DMEM 1X (GibcoTM, Cat#11965092). Medium was changed every 2 days.
  • MDA-MB-231 human breast cancer cell line A549 human lung cancer cell line, HT1080 human fibrosarcoma cell line, MKN45 human gastric cancer cell line, SK-BR-3 human breast cancer cell line and MCF-7 human breast cancer cell line KCLB (The Korean Cell Line Bank, Seoul) ) and cultured in RPMI 1640 medium (GibcoTM, Cat #11875-093) supplemented with 10% FBS, 1% L-glutamine and penicillin/streptomycin. The cell line was cultured in an incubator at 37°C and 5% CO2 conditions. Medium was changed every 2 days.
  • poly-HEMA Poly-hydroxyethyl methacrylate
  • doxorubicin doxorubicin, SIGMA, #D1515
  • cell viability assay Real Time-Glo TM MT Cell Viability Assay, Promega, Cat#G9711
  • apoptosis/ Necrosis analysis Real Time-Glo TM Annexin V Apoptosis and Necrosis Assay, Promega, Cat#JA1011
  • doxorubicin and 44 anticancer drugs for drug efficacy evaluation were provided by the Korea Research Institute of Chemical Technology Compound Bank, and a list of 44 types is shown in FIG. 21 .
  • the plates were centrifuged at 1000 rpm for 2 minutes to collect cells in the center of the wells. 50 ⁇ L of 10% matrigel solution diluted in growth medium was gently added to the plate on ice to prevent gelation of the matrigel. The plates with cells and Matrigel were then centrifuged at 1000 rpm for 2 minutes. Plates were centrifuged at 1000 rpm for 2 minutes and then plates were incubated at 37° C. in a 5% CO 2 incubator for 48 hours.
  • the 3D multicellular tumor spheroids were rinsed 3 times with PBS. To fix the 3D spheroids, they were treated with 2.5% glutaraldehyde at 4°C for 1 hour, and fixed with 1% osmium tetroxide in deionized water for 2 hours. The immobilized 3D spheroids were dehydrated twice (5 min each) with a series of graded ethanol (30%, 50%, 70%, 80%, 90%, 100%), followed by hexamethyldisilazane (hexamethyldisilazane; HMDS) for 2 min, followed by vacuum drying overnight. Before using scanning electron microscopy (SEM), the 3D spheroids were transferred to an adhesive carbon tape and sputter-coated with gold at 10 mA for 60 seconds. SEM images were taken at 15 kV (Inspect F50).
  • SEM scanning electron microscopy
  • Cells were labeled with the cell tracking dye CMFDA (molecular probe) for 30 min at RT.
  • CMFDA cell tracking dye
  • stromal cells and tumor cells were stained with Cell Tracker Green CMFDA dye and Cell Tracker Red CMTPX dye before seeding on the plate, respectively.
  • a confocal microscope LSM700, Zeiss.
  • Section samples for immunofluorescence staining were washed with distilled water to remove OCT compounds, and permeabilized with 0.25% Triton X-100 in PBS for 15 minutes at room temperature. Samples were washed 3 times (5 min each) with PBS. After blocking with 3% bovine serum albumin (BSA) for 1 hour at room temperature, the samples were treated with mouse anti-collagen type 1 antibody (1:200) and rabbit anti-fibronectin antibody (1:200, respectively). ) and incubated overnight at 4°C. Samples were washed 3 times with PBS and then incubated for 1 hour with Alexa Fluor ® 488 Donkey anti-mouse IgG (1:500) for 1 hour. After washing the samples with PBS, they were observed using a confocal microscope.
  • BSA bovine serum albumin
  • the spheroids were treated with drugs (doxorubicin, epirubicin, topotecan or 44 species in FIG. 21) at a concentration of 10 ⁇ g/mL for 2 days.
  • the drug stock solution (1 mg/mL) was diluted to a final concentration of 2X in the culture medium immediately before use.
  • spheroids were analyzed for Real Time-Glo TM Annexin V apoptosis and necrosis.
  • Real Time-Glo TM Annexin V apoptosis and necrosis assays were performed in parallel with cell viability assays. Transfer the spheroids in medium (50 ⁇ L) generated by 3D culture for 2 days to an opaque-walled multi-walled plate, and 50 ⁇ L of 2X drug (doxorubicin epirubicin, topotecan or the 44 species) were treated. Afterwards, an equal volume (100 ⁇ L) of 2X apoptosis and necrosis agent was added to each well according to the proposed protocol according to the manufacturer's instructions. Luminescence and fluorescence values were measured using a Glomax discovery multi-microplate reader (Promega, Glomax discovery) with an integration time of 0.25 - 1.0 sec per well.
  • Dilute doxorubicin, epirubicin, topotecan, or 44 drugs of FIG. 21 in 1:1 (RPMI-1640: DMEM) growth medium prepare a stock solution of 1000 ⁇ M/mL and dilute each time for drug treatment A working solution was prepared.
  • FIGS. 1 and 2 The overall overview of the experiment is shown in FIGS. 1 and 2 .
  • Three types of multicellular tumor spheroids were generated with the co-culture system for 2 days (Fig. 1), and the spheroid liver properties were analyzed.
  • the drug penetration, cell viability and death rate of multicellular tumor spheroids were measured and compared after treatment with an anticancer drug for 2 days (FIG. 2).
  • the tumor microenvironment was selected for co-culture with three types of stromal cells and tumor cells.
  • Three types of multicellular tumor spheroids were formed by co-culture of tumor cells on 5% Matrigel poly-HEMA-coated plates with ASC, BMSC and FIB, known as stromal cells in the tumor.
  • ASC fetal bovine serum
  • BMSC fetal bovine serum
  • FIB fetal fibroblastspheroids
  • three types of 3D multicellular tumor spheroids were formed with a diameter of 500 to 600 ⁇ m (Figs. 3 and 4).
  • This is an ideal model size for mimicking in vivo conditions as a tumor spheroid with a diameter of 500 ⁇ m or more, which shows a physicochemical gradient similar to micro metastases, and an avascular tumor with a hypoxic core ( avascular tumor) and cells with a different proliferation stage (proliferation stage).
  • the diameters of 500 to 600 ⁇ m are very suitable for the three types of spheroids to be used as in vitro 3D models to mimic tumors in vivo.
  • Roundness refers to the sharpness or smoothness of the boundary 2D.
  • the roundness of the spheroid indicates the circularity of the projected area of the spheroid. The range is from 0 to 1, the closer to 1, the higher the circularity of the projected area.
  • the generated three types of spheroids had a value of roundness of 0.99 or more, close to 1.0 (Figs. 3 and 5).
  • tumor spheroids can be classified as spherical (Spherical Index) ⁇ 0.90) or non-spherical (SI ⁇ 0.90).
  • Spherical Index spherical Index
  • SI non-spherical
  • the sphericity values of all three types of spheroids generated were higher than 0.99 and were close to 1.0. This suggests that all spheroids are spherical and have a three-dimensional well-fined shape (Figs. 3, 6).
  • 3D multicellular tumor spheroids were designed to mimic the interaction between stromal cells and cancer cells (tumor cells).
  • the local distribution of each cell type (breast cancer cells, stromal cells) was confirmed in 3D multicellular tumor spheroids using a cell tracker.
  • stromal cells ASC, BMSC, FIB
  • human breast cancer cells MDA-MB-231
  • Cell Tracker TM Green CMFDA dye and Cell Tracker TM Red CMTPX dye were stained with Cell Tracker TM Green CMFDA dye and Cell Tracker TM Red CMTPX dye, respectively.
  • the distribution of cancer cells in the spheroids was observed using a confocal microscope.
  • ASC+MDA-MB-231 spheroids appeared to be covered with ASCs as mammary stromal cells, and MDA-MB-231 human breast cancer cells were located inside the spheroids.
  • FIB+MDA-MB-231 spheroids were located outside of the spheroids compared to fibroblasts in which MDA-MB-231 human breast cancer cells were mostly co-cultured.
  • the distribution of human breast cancer cells and stromal cells was uniform.
  • the ASC+MDA-MB-231 spheroids seemed to be surrounded by ECM components, and the surface was smooth and no cell morphology was found.
  • Sections of 3D multicellular tumor spheroids were immunofluorescently stained for extracellular matrix (ECM) protein, collagen type 1 and fibronectin.
  • ECM extracellular matrix
  • ASC+MDA-MB-231 spheroids expressed collagen type 1 and fibronectin much more abundantly than FIB+MDA-MB-231 spheroids and BMSC+MDA-MB-231 spheroids ( FIG. 9 ).
  • collagen type 1 was overexpressed on the surface compared to other parts. This reflects the fact that collagen is the most abundant ECM protein outside the primary breast cancer area.
  • the smooth nature of the ASC+MDA-MB-231 spheroid surface contributes to high ECM secretion, hiding the shape of single cancer cells on most of the spheroid surface.
  • ECM overexpression is one of the important factors in the replication of cancer tissues, and cell-ECM interactions play an important role in the tumor microenvironment.
  • the expression of collagen type 1 and fibronectin is increased in breast cancer and is associated with tumor growth and metastasis and progression.
  • overexpression of ECM components, collagen type 1, and fibronectin in the tumor microenvironment play important roles in drug resistance as well as cancer progression.
  • collagen type 1 is a factor that increases drug resistance. For this reason, based on the distinct differences in the expression of ECM proteins in the three multicellular 3D tumor spheroids, it can be predicted that the responses to anticancer agents will all be different.
  • the spheroids were treated with the chemotherapeutic agent, doxorubicin, for 2 days.
  • Doxorubicin is a common chemotherapeutic agent used to treat various types of tumors, including breast cancer.
  • doxorubicin showed a difference in the degree of penetration into the spheroids ( FIGS. 10 to 13 ).
  • the distribution of doxorubicin was hardly observed at the point indicated by the white arrow in FIG. 11, and it can be seen that in the case of ASC+MDA-MB-231 spheroids whose surface is surrounded by ECM collagen type 1, much less penetration was made compared to other spheroids. have.
  • ASC+MDA-MB-231 spheroids treated with 10 ⁇ M doxorubicin for 2 days had the highest cell viability (56.67%) compared to other spheroid types. In contrast, the cell viability of BMSC+MDA-MB-231 spheroids was lower (48.33%), and the cell viability of FIB+MDA-MB-231 spheroids, where high drug penetration was observed, was the lowest (43%). ). There is a significant difference in viability between ASC+MDA-MB-231 spheroids and FIB+MDA-MB-231 spheroids (P 0.0024). These results suggest that the weak penetration of drugs into multicellular spheroids affects low drug efficacy or high resistance according to high viability ( FIG. 14 ).
  • Extracellular matrix (ECM) protein expression in 3D multicellular tumor spheroids according to the co-culture ratio of stromal cells ASC and breast cancer cells MDA-MB-231 was investigated.
  • 3D multicellular tumor spheroids were formed with coculture ratios of ASC:MDA-MB-231 of 10:0, 3:7, 5:5, 7:3 and 0:10, respectively, for collagen type 1 and fibronectin.
  • Sections of 3D multicellular tumor spheroids were immunofluorescently stained.
  • the co-culture ratio of ASC:MDA-MB-231 was 5:5, the most collagen type 1 and fibronectin were expressed ( FIG. 18 ).
  • the spheroids were treated with a chemotherapeutic agent, doxorubicin, for 2 days. Then, the actual image of the spheroid was observed, and the degree of drug penetration into the spheroid was analyzed using the natural red fluorescence of doxorubicin. As a result, the fluorescence image of the spheroids after incubation with doxorubicin for 48 hours showed differential drug distribution according to the co-culture ratio.
  • a chemotherapeutic agent doxorubicin
  • 3D multicellular tumor spheroids with an ASC:MDA-MB-231 coculture ratio of 5:5 showed a relatively high survival rate compared to 3D multicellular tumor spheroids with other coculture ratios ( FIG. 20 ).
  • 3D multicellular tumor spheroids In order to confirm the drug penetration inhibitory effect of 3D multicellular tumor spheroids on various anticancer agents, 44 kinds of anticancer agents that are clinically used or in clinical process stage other than doxorubicin were treated for 48 hours, and 3D multicellular tumor spheroids (ASC+MDA) were treated for 48 hours. -MB-231) and 3D single-cell tumor spheroids were compared and analyzed for viability (FIG. 21). If 3D multicellular tumor spheroids show a higher survival rate than 3D single cell tumor spheroids, this suggests the possibility of having low efficacy, or high resistance, to 3D multicellular tumor spheroids drugs. It can also be inferred that the high drug resistance will affect the degree of penetration of the drug into the spheroid.
  • 3D single cell tumor spheroids were formed by monoculture of tumor cells on plates coated with 5% Matrigel poly-HEMA. 50 ⁇ L of tumor cells were plated at a density of 0.5 ⁇ 10 4 cells/well in each well of the plate and incubated at 37° C. for 48 hours in a 5% CO 2 incubator. In culture for 48 hours, 3D single cell tumor spheroids were formed by self-organization of cells on the plate.
  • 3D multicellular tumor spheroids showed a higher survival rate than 3D single cell tumor spheroids, and 3D multicellular tumor spheroids for 14 drugs (about 31.82%) were treated. It was confirmed that the tumor spheroids exhibited a lower survival rate than the 3D single cell spheroids (FIG. 22). These results mean that a high proportion of anticancer drugs currently used in clinical or preclinical stages can exhibit high drug resistance in 3D multicellular tumor spheroids. Furthermore, it suggests the possibility of using 3D multicellular tumor spheroids as an in vitro- level platform to observe the permeability of newly developed anticancer drugs.
  • the extracted chemical properties include molecular weight (MW) of the drug, partition coefficient (LogP), water solubility (LogS), acid dissociation equilibrium constant (pKa), physiological charge, hydrogen acceptor count, Hydrogen donor count, polar surface area, rotatable bond count, polarizability, refractivity, number of rings, etc. and it was used as an input parameter (FIG. 23).
  • stromal cells are located on the surface in the tumor microenvironment, and ECM distribution on the surface is characterized. Therefore, in addition to MDA-MB-231 breast cancer cells, it was attempted to confirm whether these characteristics were exhibited even when 3D multicellular tumor spheroids were formed using other solid cancer cells.
  • A549 lung cancer cells
  • HT1080 fibrosarcoma cells
  • MKN45 gastric cancer cells
  • SK-BR-3 breast cancer cells
  • MCF-7 breast cancer cells
  • stromal cells and solid cancer cells were stained with Cell Tracker TM Green CMFDA dye and Cell Tracker TM Red CMTPX dye, respectively.
  • Cell Tracker TM Green CMFDA dye was stained with Cell Tracker TM Red CMTPX dye, respectively.
  • the morphology of the spheroids was observed using an optical microscope, and the distribution of cancer cells in the spheroids was observed using a confocal microscope.
  • ECM extracellular matrix
  • stromal cells located in the periphery, high surface distribution of ECM The expression of extracellular matrix (ECM) protein, collagen type 1 and fibronectin in 3D multicellular tumor spheroids using solid cancer was confirmed through immunofluorescence staining.
  • Three types of solid cancer cells (HT-1080, A549, MKN45) were utilized. Collagen type 1 and fibronectin were hardly expressed in 3D tumor spheroids formed using single tumor cells, whereas collagen type 1 and fibronectin were expressed in all three solid tumors in 3D multicellular tumor spheroids formed by co-culture with ASCs. It was highly expressed compared to single cell spheroids (FIG. 29).

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Abstract

일 양상의 구형의 3차원 종양 스페로이드는 in vitro 상에서 적절하게 이용될 수 있는 직경, 원마도 및 구형도를 지니고 있고, in vivo와 유사한 ECM 구조를 발현하고 있어, 각종 종양 치료용 약물의 효능 평가에 이용될 수 있다.

Description

구형의 3차원 종양 스페로이드
구형의 3차원 종양 스페로이드 및 이를 이용한 종양 치료제의 효능 평가 방법에 관련된 것이다.
현재, 새로운 항암 약물의 개발에 대한 전임상 in vitro 시험의 대부분은 2차원(2D) 환경의 전형적인 조직 배양 플레이트에서 배양된 세포를 이용하여 수행된다. 암 연구자의 약 70% 이상이 약물 개발을 위한 in vivo 시험 전에 결과를 얻기 위하여, 여전히 2차원(2D) 배양 시스템에 의존하는 것으로 추정된다. 그러나, 2차원(2D) 배양 시스템의 in vitro 세포는 평평한 표면상의 단일층으로 성장하여 약물 스크리닝에 적합하지 않기에, in vivo 3차원(3D) 환경에 존재하는 세포를 정확하게 반영하지 못한다. 이 점에서, 생체 내 약물 효능에 대한 예측이 좋지 않게 되고, 결국 막대한 재정 손실로 임상 시험에서 값비싼 실패가 발생한다.
전임상 단계에서 2D 배양 시스템의 한계를 극복하기 위해, 약물 효능을 평가하기 위한 in vitro 모델의 생리학적 관련성을 개선시키는 도구로서, 최근 3D 배양 기술이 주목받고 있다. 많은 연구에서 다세포 구상체(multicellular spheroids), 스캐폴드(scaffolds) 및 바이오칩(biochips)을 포함하는 3D 플랫폼을 갖춘 in vitro 모델이 개발되었다. 이 3D 배양 플랫폼은 새롭고, 보다 생리학적인 인간 건강 조직 및 종양 모델의 개발로 이어졌다. 많은 연구자들은 인체의 약물 대사와 관련이 있는 간, 심장, 내장 및 신장을 포함한 종양 및 생체 장기의 in vitro 모델을 확립했다.
구형의 3차원 종양 스페로이드 및 이를 이용한 종양 치료제의 효능 평가 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
일 양상은 종양세포군을 포함하는 코어부; 및 지방 유래 기질세포군과 세포외기질 성분(extracellular matrix component)을 포함하고, 상기 코어부를 에워싸는 외곽부;를 포함하는 구형의 3차원 종양 스페로이드(spheroid)를 제공한다.
다른 양상은 상기 3차원 종양 스페로이드(spheroid)를 포함하는 종양 세포 모델을 제공한다.
다른 양상은 상기 세포 모델을 포함하는 스크리닝 조성물을 제공한다.
다른 양상은 상기 3차원 종양 스페로이드를 포함하는 종양 치료제의 평가용 조성물을 제공한다.
상기 종양세포군과 지방 유래 기질세포군이 포함하는 세포들은 종양이 형성될 수 있는 조직을 갖는 개체의 것이라면 특별히 제한되지 아니하고, 예를 들면, 인간, 쥐, 토끼, 개, 돼지 또는 원숭이 등으로부터 유래된 것일 수 있고, 보다 구체적으로는 인간의 것일 수 있다.
상기 종양세포군은 당업계에서 용이하게 수득할 수 있는 종양 세포주로부터 얻어진 것이라면 특별히 제한이 없고, 예를 들면 유방암세포, 폐암세포, 섬유육종세포, 위암세포, 구강암세포, 전립선암세포, 간암세포, 난소암세포, 갑상선암세포, 자궁암세포, 교아종세포, 흑색종세포, 치은암세포, 설암세포, 췌장암세포, 신장암세포, 골암세포, 고환암세포, 중피종세포, 림프종세포, 뇌종양세포, 결장암세포 또는 방광암세포를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 종양세포군은 구체적인 일 실시예에 따를 때, MDA-MB-231, MDA-MB-468, BT-549, MCF-10A, MCF-7, A549, HT1080, MKN45 또는 SK-BR-3 세포를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 세포외기질 성분은 상기 종양세포군과 상기 지방 유래 기질세포군 간 상호작용에 의해 발현된 산물일 수 있는데, 이는 상기 스페로이드의 표면을 포함한 외곽부 전체에 존재하는 성분으로서, 코어부 전체를 에워싸는 형태일 수 있다. 상기 세포외기질 성분의 발현 정도가 낮은 경우, 세포외기질 성분이 과발현되는 것으로 알려진 실제 종양 조직과 유사하게 구현되지 못하여 암 또는 종양 치료제의 스크리닝이나 효능 평가에 활용되기 어려울 수 있다.
상기 세포외기질의 성분으로서 콜라겐과 피브로넥틴이 포함될 수 있는데, 이는 상술한 바대로 상기 종양세포군과 상기 지방 유래 기질세포군 간 상호작용에 의해 발현된 산물일 수 있다. 상기 콜라겐으로서 콜라겐 유형 1이 포함될 수 있는데, 이는 암 또는 종양 치료제의 침투를 막는 주된 역할을 하여, 상기 스페로이드를 이용하여 암 또는 종양 치료제의 효능을 평가하거나 스크리닝을 수행할 시 주된 관문 역할을 수행할 수 있다.
상기 스페로이드의 직경은 200 내지 900 μm, 250 내지 850 μm, 300 내지 800 μm, 350 내지 750 μm, 400 내지 700 μm, 450 내지 650 μm 또는 500 내지 600 μm일 수 있으나, in vitro 상의 3D 종양 스페로이드로서 적절한 크기를 유지하면서 생체 내 종양을 유사하게 모방할 수 있는 측면에서 바람직하게는 500 내지 600 μm일 수 있다.
상기 스페로이드의 원마도(roundness)의 값이 0.90 이상일 수 있다. 또한, 상기 스페로이드의 구형도(sphericity)의 값이 0.90 이상일 수 있다. 바람직하게는 원마도(roundness)의 값이 0.99 이상이고, 구형도(sphericity)의 값이 0.99 이상일 수 있다. 약물의 효능 평가나 스크리닝의 모델로 이용되기 위해서는 동일한 형태와 모양으로 구형을 안정적으로 만드는 것이 매우 중요하다. 특히 대사 활성의 확립을 위해서는 구형의 균일성과 형성의 일관성이 매우 중요한 점을 고려할 때, 상기 스페로이드는 완전하고 균일하며, 안정적인 구형을 나타내는 것일 수 있다.
상기 스페로이드는 상기 종양세포군과 지방 유래 기질세포군을 7:3 내지 3:7의 세포밀도로 공배양하여 형성된 것일 수 있고, 바람직하게는 1:1의 세포밀도로 공배양하여 형성된 것일 수 있는데, 1:1의 세포밀도 비에 근접할수록 스페로이드 자체의 생존력이 증가하고 약물 투과능이 감소하는 효과에 기반한 것일 수 있다. 이러한 경우, 상기 종양세포군과 지방 유래 기질세포군의 공배양 세포밀도 비를 7:3 내지 3:7 범위 내에서 적절히 설정한 스페로이드를 이용하여 암 또는 종양 치료제의 효능을 스크리닝 또는 비교 테스트할 수도 있을 것이다. 예를 들면, 상기 종양세포군과 지방 유래 기질세포군의 공배양 세포밀도 비가 7:3인 경우 스페로이드의 코어부 내 투과에 성공하였으나, 1:1인 경우 성공하지 못한 제1약물의 경우, 7:3인 경우와 1:1인 경우 모두 코어부 내 투과에 성공한 제2약물 대비 암 또는 종양 치료 효능이 보다 약한 것으로 판단할 수 있는 것이다.
일 구체예에 있어서, 상기 스페로이드에 대상 약물들을 처리하는 단계; 및 상기 스페로이드의 코어부 내 상기 대상 약물들의 분포도를 분석하거나, 상기 스페로이드 내 세포의 생존율을 분석하는 단계;를 포함하는 암 또는 종양 치료제의 효능 평가 방법을 제공한다.
상기 약물들의 처리에 있어서, in vitro 상에서 암 또는 종양 치료제의 효능을 평가하기 위해 수행하는 당업계의 통상의 방법을 따를 수 있고, 예를 들면, 스페로이드가 시딩된 배양 배지에 암 또는 종양 치료제를 일정 시간동안 첨가하여 배양하는 형식일 수 있으나, 반드시 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 대상 약물들을 처리함에 있어서, 복수개의 스페로이드에 복수개의 약물을 각각 1:1로 대응하여 처리할 수 있고, 1개의 스페로이드에 복수개의 약물을 처리할 수도 있으나, 반드시 이에 제한되지는 아니하고, 스페로이드의 코어부 내 약물들의 분포도를 분석하거나 상기 스페로이드 내 세포의 생존율을 분석하는 다음 단계의 수행에 문제가 없다면 어떠한 방식을 택하여도 무방하다.
상기 코어부 내 상기 대상 약물들의 분포도 분석에 있어서, 대상 약물이 이동하는 경로 또는 분포하는 정도를 추적할 수 있는 당업계 공지된 방법이라면 특별한 제한없이 사용할 수 있고, 예를 들면 약물로부터 얻는 형광 검출에 의해 분포도를 분석할 수 있다.
상기 스페로이드 내 세포의 생존율 분석에 있어서, 약물의 처리 전 대비 후에 상기 스페로이드 내 생존하는 세포를 계수하는 등의 방법을 통해 생존율을 분석할 수 있으나, 당업계 공지된 세포군의 생존율 분석법이라면 특별한 제한없이 차용하여 사용할 수 있다.
상기 스페로이드 내 세포의 생존율은 상기 대상 약물의 처리에 따른 종양세포군의 크기나 수가 감소하는 현상 전체를 반영하는 것으로서, 자멸(apoptosis)이나 괴사(necrosis) 등을 포함하는 다양하고 포괄적인 현상이 반영되는 것일 수 있다.
상기 스페로이드 내 세포의 생존율은 암 또는 종양 치료제의 종양세포에 대한 선택적 치료능을 고려한다는 측면에서, 바람직하게는 상기 스페로이드의 코어부 내 종양세포군의 생존율일 수 있다.
상기 방법에 있어서, 상기 스페로이드의 코어부 내 일 대상 약물의 분포가 타 대상 약물의 분포 대비 더 높거나, 상기 스페로이드 내 세포의 생존율이 일 대상 약물 처리시 타 대상 약물 처리시 대비 더 낮은 경우, 상기 일 대상 물질의 암 또는 종양 치료 효능이 더 우수한 것으로 판단하는 단계를 더 포함할 수 있는데, 코어부 내 약물의 분포와 스페로이드 내 세포의 생존율은 역의 상관관계를 가질 수 있으며, 구체적으로는, 코어부 내 약물의 분포가 높을수록 외곽부를 침투하여 약물의 전달이 더욱 잘 이루어짐을 의미하는 것으로서, 코어부 내 존재하는 종양세포군의 생존율을 낮출 수 있음에 기반한 것일 수 있다.
상기 방법에 있어서, 상기 스페로이드의 코어부 내 일 대상 약물의 분포가 전혀 관찰되지 아니하거나, 상기 스페로이드 내 세포의 생존율 또는 코어부 내 종양세포군의 생존율이 일 대상 약물 처리시 처리 전 대비 생존율의 감소가 유의미하지 않은 경우, 상기 일 대상 약물은 효능이 낮음을 넘어서, 암 또는 종양 치료제로서 적합하지 않은 것으로 평가하거나 스크리닝할 수도 있음은 당업계 통상의 기술자에 명확한 것이다.
다른 양상은 상기 3차원 종양 스페로이드(spheroid) 및 후보 물질을 인큐베이션하는 단계를 포함하는 종양 치료용 물질을 스크리닝하는 방법을 제공한다.
상기 종양 스페로이드는 전술한 바와 같다.
상기 방법은, 상기 3차원 종양 스페로이드(spheroid) 및 후보 물질을 인큐베이션하는 단계를 포함한다.
상기 후보 물질은 종양 또는 암을 예방 또는 치료할 것으로 기대되는 물질을 의미한다. 상기 후보물질은 유기 및 무기 물질일 수 있으며, 단일 화합물 또는 복합 화합물일 수 있다. 또한, 단백질, 펩티드, DNA, RNA 등일 수 있으며, 자연계에 존재하는 모든 물질이 대상이 될 수 있다.
이후, 상기 방법은 상기 배양된 스페로이드의 종양 바이오마커의 발현 정도를 측정하거나, 생존 여부를 판단하는 단계를 포함한다.
상기 바이오마커는 정상군 개체와 종양 또는 암을 가진 개체를 구분하여 진단할 수 있는 물질로, 암을 가지는 개체에서 증가 또는 감소를 보이는 폴리펩티드, 단백질 또는 핵산, 유전자 지질, 당지질, 당단백질 또는 당 등과 같은 유기 생체 분자들을 모두 포함한다. 종양 또는 암의 바이오 마커의 발현의 변화는 발현이 증가 또는 감소될 수 있다.
이후, 상기 방법은 상기 배양된 스페로이드의 종양 바이오마커의 발현이 증가 또는 감소하거나, 또는 상기 배양된 스페로이드가 사멸하는 경우 후보물질을 선별하는 단계를 제공한다.
다른 양상은, 상기 3차원 종양 스페로이드를 이용하여 항암제의 세포 투과도에 대한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
상기 스페로이드, 암은 전술한 바와 동일하다.
본 명세서에서 용어 "항암제(anticancer drug)"는 암세포의 분열을 막고 암세포를 죽이는 약을 총칭한다. 상기 항암제는 암 세포의 표면을 뚫고 침투하는 특징이 있다. 따라서, 상기 항암제의 세포 투과도에 대한 정보는, 항암제의 세포 투과도에 대한 정보를 수득하는 것은 항암제의 효과에 대해서 추측할 수 있는 단서일 수 있다. 상기 항암제의 세포 투과도가 높은 것으로 판단되면, 항암제가 암을 치료하는 데에 효과적인 것으로 판단할 수 있다.
상기 항암제는 vatalanib, lenvatinib, dovitinib, ammonium-glycyrrhizinate, epirubicin, temsirolimus, lintitript(SR-27897), cabozantinib, tesmilifene(DPPE),KX-01(KX2-391,tirbanibulin), rubitecan, bardoxolone-methyl, mifepristone, mitomycin-c, genistein, paclitaxel, carboxyamidotriazole, pazopanib, halofuginone, vinblastine, SGX523, lonafarnib, marimastat, patupilone(epothilone-b), derenofylline, lorlatinib, OSI-930, everolimus, capecitabine, tamoxifen, rucaparib, alisertib, canertinib, altretamine, etoposide (7-ethyl-10-hydroxycamptothecin), roquinimex, aminoglutethimide, talazoparib, imatinib, quinestrol, alectinib, verubulin, 또는 tipifarnib일 수 있다.
상기 방법은, 각 항암제의 다양한 화학적 특성 또는 이들의 상호작용을 고려하여 회귀분석 모델을 유도하는 단계를 더 포함할 수 있다.
상기 방법은, 상기 회귀분석 모델을 이용하여 회귀분석을 실시하는 단계를 더 포함하는 것일 수 있다.
본 명세서에서 용어 “회귀분석(regression analysis)"이란, 하나 이상의 독립변수의 종속변수에 대한 영향의 추정을 할 수 있도록 하는 통계기법이다. 예를 들어, 하나의 독립변수를 가지는 회귀분석의 경우 독립변수와 종속변수가 만나는 지점들의 분포 구성을 통해 회귀선을 구할 수 있다. 상기 회귀선은 Y=a+bX1+cX2의 형태일 수 있다. 회귀분석 모델의 설계는 단계적 회귀분석법(stepwise regression)을 통한 분석 방법이 포함될 수 있고, 변수 선택 방법으로는 전진(forward) 방식의 활용이 포함될 수 있다.
상기 회귀분석은 약물의 분자량(M.W), 분배 계수(LogP), 물 용해도(LogS), 산해리평형상수(pKa), 생리적 전하도(physiological charge), 수소 수용체 수(hydrogen acceptor count), 수소 공여체 수(hydrogen donor count), 극성 표면적(polar surface area), 회전 가능한 결합 수(rotatable bond count), 극갈림율(polarizability), 분극률(refractivity) 및 고리의 갯수(number of rings)로 이루어지는 군으로부터 선택된 하나 이상의 화학적 특징을 입력 변수(input parameter)로 사용하여 수행한 것일 수 있다.
상기 회귀분석은, 3D 다세포 종양 스페로이드와 3D 단일 세포 스페로이드의 생존율의 차이 값(혹은 투과도)을 출력 변수(output parameter)로 활용한 것일 수 있다.
상기 회귀분석 모델은 하기 수학식 1로 표현되는 회귀분석 방정식을 포함하는 것일 수 있다.
상기 회귀분석 방정식은 상기 회귀분석 방정식은 예측된 세포 생존력 차이값(혹은 투과도)를 도출하는 것일 수 있다.
[수학식 1]
Figure PCTKR2020018577-appb-I000001
상기 식에서, PO는 예측된 세포 생존력 차이값(혹은 투과도)이고, K는 M.W(g/mol), L은 logP, M은 logS, N은 hydrogen acceptor count(units), O는 hydrogen donor count(units), P는 polar surface area, Q는 rotatable bond count(units), R은 refractivity(m3/mol), S는 polarizability이다. a부터 j는 상수 값으로, a=0.1235313827, b=0.0035738171, c=0.0340283393, d=0.0340283393, e=-0.000519426, f=0.0108241714, g=-0.002123276, h=0.0007481956, i=-0.0050597, j=-0.018713752 이다.
상기 다중 회귀 방정식은 3D 다세포 종양 스페로이드와 3D 단일 세포 스페로이드의 생존율의 차이 값(혹은 투과도)을 0과 1 사이에서 표준화한 것일 수 있다. 1에 가까울수록 화학적 특성을 통해 예측한 투과도 값이 실제의 값과 유사함을 의미할 수 있다. 다중회귀분석은 Linear fitting 방법일 수 있고, 화학적 특성을 통해 예측한 투과도 값과 실제의 값이 만나는 지점의 분포 구성을 파악하여 회귀선을 도출하는 것일 수 있다. 상기 회귀선의 결정계수(R2) 는 0.60 내지 0.75 또는 0.62 내지 0.70일 수 있다.
상기 방법은, 상기 도출된 세포 생존력 차이값(혹은 투과도) 및 실제 출력 변수를 대조하는 단계; 및 상기 대조 결과를 바탕으로 항암제의 투과도를 평가하는 단계를 더 포함한다.
다른 양상은, 상기 3차원 종양 스페로이드, 또는 이를 포함하는 조성물의 세포 모델의 제조에 있어서의 용도를 제공한다.
다른 양상은, 상기 종양 스페로이드, 또는 이를 포함하는 조성물의 종양 치료용 물질의 스크리닝 조성물의 제조에 있어서의 용도를 제공한다.
일 양상의 구형의 3차원 종양 스페로이드는 in vitro 상에서 적절하게 이용될 수 있는 직경, 원마도 및 구형도를 지니고 있고, in vivo와 유사한 ECM 구조를 발현하고 있어, 각종 종양 치료용 약물의 효능 평가에 이용될 수 있다.
도 1은 3가지 유형의 3D 다세포 종양 스페로이드에 대한 도식이다.
도 2는 실시예에 기재된 실험방법(workflow)에 대한 도식이다.
도 3 내지 6은 3D 다세포 종양 스페로이드를 분석한 결과에 대한 것으로, 각각 실측 이미지, 직경(diameter), 원마도(roundness) 및 구형도(sphericity)에 대한 것이다.
도 7은 3가지 유형의 3D 다세포 종양 스페로이드에 대한 형광 염색 후 관찰한 결과이다.
도 8은 3가지 유형의 3D 다세포 종양 스페로이드에 대한 SEM 관찰 이미로서, A, D, G는 ASC+MDA-MB-231, B, E, H는 BMSC+MDA-MB-231, C, F, I는 FIB+MDA-MB-231에 대한 것이다.
도 9는 3가지 유형의 3D 다세포 종양 스페로이드의 ECM 마커에 대한 면역형광 염색을 관찰한 결과이다.
도 10 내지 13은 3가지 유형의 3D 다세포 종양 스페로이드에 대한 독소루비신의 침투를 확인한 결과로서, 좌로부터 각각 ASC+MDA-MB-231, BMSC+MDA-MB-231, FIB+MDA-MB-231이고, 빨간색이 독소루비신을 의미한다.
도 14는 48시간 동안 10 μM의 독소루비신을 처리한 경우 3가지 유형의 3D 다세포 종양 스페로이드 내 세포의 생존율을 분석한 결과이다.
도 15, 16은 48시간 동안 10 μM의 독소루비신을 처리한 경우 3가지 유형의 3D 다세포 종양 스페로이드 내 세포의 자멸(apoptosis)과 괴사(necrosis)를 각각 측정한 결과이다.
도 17은 48시간 동안 10 μM의 독소루비신을 섬유아세포와 공배양된 MDA-MB-231 2D 유방암 세포 단일층에 처리한 경우, 단일층 내 세포의 생존율을 분석한 결과이다.
도 18은 공배양 세포 비율이 서로 다른 3D 다세포 종양 스페로이드들의 ECM 마커에 대한 면역형광 염색을 관찰한 결과로서, ASC:MDA-MB-231의 공배양 되는 비율이 좌로부터 각각 10:0, 3:7, 5:5, 7:3, 0:10 이다.
도 19는 공배양 세포 비율이 서로 다른 3D 다세포 종양 스페로이드의 독소루비신의 침투를 확인한 결과로서, ASC:MDA-MB-231의 공배양 되는 비율이 좌로부터 각각 10:0, 3:7, 5:5, 7:3, 0:10 이고, 빨간색이 독소루비신을 의미한다.
도 20은 48시간 동안 10 μM의 독소루비신을 처리한 경우 공배양 비율별로 다른 유형의 3D 다세포 종양 스페로이드 내 세포의 생존율을 분석한 결과이다.
도 21a 및 b는 독소루비신 외, 약물 효능 평가에 활용한 항암제 44종의 명칭 및 화합물의 구조에 대한 것이다.
도 22는 독소루비신 외에 임상적으로 사용되거나 임상 과정 단계에 있는 항암제 44종을 48시간 동안 처리한 경우 3D 다세포 종양 스페로이드(ASC+MDA-MB-231)와 3D 단일 세포 종양 스페로이드 내 세포의 생존율을 비교 분석한 결과이다.
도 23은 다중회귀분석을 위한 항암제 16종의 화학적 특성 및 3D 다세포 종양 스페로이드(ASC+MDA-MB-231)와 3D 단일 세포 종양 스페로이드 내 세포의 생존율을 비교한 결과에 대한 것이다.
도 24는 다중회귀분석의 결과를 표현한 그래프로서, 실제 실험 결과값과 도 23의 항암제의 화학적 특성을 통해 예측한 결과를 나타낸 것이다.
도 25는 3가지 유형의 3D 다세포 종양 스페로이드에서 에피루비신의 침투를 분석한 결과로, 빨간색은 에피루비신을 의미한다.
도 26은 3가지 유형의 3D 다세포 종양 스페로이드에서 토포테칸의 침투를 분석한 결과로, 초록색은 토포테칸을 의미한다.
도 27은 5가지 유형의 고형암 세포(A549, HT1080, MKN45, SK-BR-3 또는 MCF-7)를 활용하여 3D 단일 세포 종양 스페로이드를 형성하거나(상측), 이들을 ASC와 공배양하여 3D 다세포 종양 스페로이드를 형성하였을 경우(하측)에 대한 실측 이미지 결과이다.
도 28은 5종의 고형암 세포 기반 3D 다세포 종양 스페로이드에 형광 염색 후 세포 분포를 관찰한 결과이다.
도 29는 3종의 고형암 세포 기반 3D 단일 세포 종양 스페로이드 및 3D 다세포 종양 스페로이드의 ECM 마커에 대한 면역형광 염색을 관찰한 결과이다.
이하, 보다 구체적인 설명을 위해 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 그러나, 이들 실시예가 발명의 범위를 제한하는 것은 아니다.
실험재료
1. 세포주
인간 지방-유래 기질세포(Human adipose-derived stromal cells; ASC)는 Cefobio(서울)에서 구입하였고, 10% FBS, 1% L-글루타민 및 페니실린/스트렙토마이신이 보충된 ASC 성장 배지(Cefobio, 서울, 한국)에서 유지되었다. 배지는 2일마다 교체되었다.
골수 기질세포(Bone marrow stromal cells; BMSC)와 인간 섬유아세포(Human dermal fibroblast; FIB)는 가톨릭대학교(서울, 한국)에서 구입하였고, 10% FBS, 1% L-글루타민 및 페니실린/스트렙토마이신이 보충된 DMEM 1X(GibcoTM, Cat#11965092)에서 유지되었다. 배지는 2일마다 교체되었다.
MDA-MB-231 인간 유방암 세포주, A549 인간 폐암 세포주, HT1080 인간 섬유 육종 세포주, MKN45 인간 위암 세포주, SK-BR-3 인간 유방암 세포주 및 MCF-7 인간 유방암 세포주는 KCLB(The Korean Cell Line Bank, 서울)에서 구입하였고, 10% FBS, 1% L-글루타민 및 페니실린/스트렙토마이신이 보충된 RPMI 1640 배지(GibcoTM, Cat #11875-093)에서 배양되었다. 세포주는 37℃, 5% CO2 조건의 인큐베이터에서 배양되었다. 배지는 2일마다 교체되었다.
2. 폴리-HEMA
95% 에탄올로 희석된 120 mg/mL의 폴리-HEMA(Poly-hydroxyethyl methacrylate) 저장용액(stock solution)을 준비하고, 이를 뒤집고 와류(vortex)를 가한 다음, 폴리-HEMA의 작업용액(working solution)을 얻기 위해 1 mL의 폴리-HEMA 저장용액을 23 mL의 95% 에탄올에 첨가하여 5 mg/mL의 최종 농도를 맞춘다. 새로운 플레이트를 만들 때 마다 새로운 작업용액을 준비하였다.
3. 기타
매트리겔(Matrigel® Basement Membrane Matrix, Corning, Cat#354234), 항암제(독소루비신, SIGMA, #D1515), 세포 생존력 분석(Real Time-GloTM MT Cell Viability Assay, Promega, Cat#G9711) 및 세포 자멸/괴사 분석(Real Time-GloTM Annexin V Apoptosis and Necrosis Assay, Promega, Cat#JA1011)을 이용하였다. 또한, 약물 효능 평가를 위한 독소루비신(Doxorubicin)과 항암제 44종은 한국화학연구원 화합물은행에서 제공받았으며, 상기 44종의 목록은 도 21에 나타내었다.
실험방법
1. 비흡착성 폴리-HEMA 플레이트의 준비
96-웰 U-바닥 플레이트의 각 웰에 60 μL의 폴리-HEMA 저장용액을 피펫팅(pipetting)한 후, 30℃의 인큐베이터에서 1주일 동안 리드(lid)와 함께 증발시켰다.
2. 3D 다세포 종양 스페로이드의 형성
3D 다세포 종양 스페로이드(3D multicellular tumor spheroids)를 형성하기 위해, 각 세포 유형의 현탁액을 성장 배지에서 제조하였다. 기질세포를 폴리-HEMA로 미리 코팅된 96-웰 플레이트에 웰당 0.5 x 104 세포/웰의 밀도로 시딩(seeding)하고, 5% CO2 인큐베이터에서 48시간 동안 37℃로 인큐베이션하였다. 그 다음, 기질 세포 위에 25 μL의 종양 세포(MDA-MB-231, A549, HT1080, MKN45, SK-BR-3 및 MCF-7)를 플레이트의 각 웰에 0.5 x 104 세포/웰의 밀도로 플레이팅(plating)하였다. 세포의 시딩 후, 플레이트를 1000 rpm에서 2분 동안 원심분리하여 웰의 중심에서 세포를 수집하였다. 성장배지에 희석된 50 μL의 10% 매트리겔(matrigel) 용액을 얼음 위의 플레이트에 부드럽게 첨가하여 매트리겔이 겔화되는 것을 방지하였다. 이어서, 세포 및 매트리겔을 갖는 플레이트를 1000 rpm에서 2분 동안 원심분리하였다. 플레이트를 1000 rpm에서 2분 동안 원심분리한 후, 플레이트를 5% CO2 인큐베이터에서 48시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다.
3. 형태학적 분석
5X 대물렌즈로 현미경에 부착된 카메라를 사용하여 세포를 시딩한 후, 2일 동안 모든 회전 타원체의 이미지를 촬영하였다. 모든 이미지는 소프트웨어 ImageJ(National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA)에 의해 분석되었다.
4. 주사 전자 현미경 분석
2일의 세포 배양 후, 3D 다세포 종양 스페로이드를 PBS로 3회 헹구었다. 3D 스페로이드를 고정시키기 위해, 4℃에서 1시간 동안 2.5%의 글루타르알데히드로 처리하고, 탈이온수 중 1% 오스뮴테트록사이드(osmium tetroxide)로 2시간 동안 고정시켰다. 고정된 3D 스페로이드는 일련의 등급화된 에탄올(30%, 50%, 70%, 80%, 90%, 100%)로 2회(각각 5분) 탈수되었고, 이 후, 헥사메틸디실라잔(hexamethyldisilazane; HMDS)으로 2분 동안 처리한 다음, 밤새 진공 건조시켰다. 주사 전자 현미경(SEM)을 사용하기 전에, 3D 스페로이드를 접착성 탄소 테이프로 옮기고, 10 mA에서 60초 동안 금으로 스퍼터-코팅(sputter-coating) 처리하였다. SEM 이미지는 15 kV에서 촬영되었다(Inspect F50).
5. 세포 표지
세포를 RT에서 30분 동안 세포 추적 염료 CMFDA(분자 프로브)로 표지하였다. 3D 스페로이드 내부의 공동배양된 세포의 분포를 관찰하기 위해, 플레이트 상에 시딩하기 전 기질세포 및 종양세포를 각각 세포 추적기 Green CMFDA 염료와 세포 추적기 Red CMTPX 염료로 염색하였다. 3D 스페로이드의 형성 후, 공초점 현미경(LSM700, Zeiss)으로 세포를 관찰하였다.
6. 면역형광 염색
면역형광 염색을 위한 절편 샘플을 증류수로 세척하여 OCT 화합물을 제거하고, PBS 중의 0.25% 트리톤 X-100으로 15분 동안 실온에서 투과시켰다. 샘플을 PBS로 3회(매 회 5분) 세척하였다. 실온에서 1시간 동안 3% 소 혈청 알부민(bovine serum albumin, BSA)으로 차단(block)한 후, 샘플을 각각 마우스 항-콜라겐 타입 1 항체(1:200), 토끼 항-피브로넥틴 항체(1:200)로 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 샘플을 PBS로 3회 세척한 후, 1시간 동안 Alexa Fluor® 488 Donkey 항-마우스 IgG(1:500)으로 1시간 동안 인큐베이션하였다. 샘플을 PBS로 세척한 후, 공초점 현미경을 사용하여 관찰하였다.
7. 세포 생존력 분석
3D 다세포 종양 스페로이드에 대한 항암 약물 효과를 비교하기 위해, 스페로이드를 2일 동안 10 μg/mL 농도의 약물(독소루비신, 에피루비신, 토포테칸 또는 도 21의 44종)으로 처리하였다. 약물 저장용액(1 mg/mL)을 사용 직전에 배양배지에서 2X의 최종 농도로 희석시켰다. 2일 동안 3D 배양으로 생성된 배지(50 μL) 내 스페로이드를 불투명 벽으로 된 다중 벽 플레이트로 옮기고, Real Time-GloTM MT 세포 생존력 분석(Promega, Cat#G9711)을 이용하여 ATP 기반 세포 생존력 분석을 수행하였다. 약물을 포함하는 Real Time-GloTM MT 세포 생존력 분석(Promega, Cat#G9711) 용액으로서 세포 배양 배지의 부피와 동일한 양을 갖는 용액을 각 웰에 첨가하였다. 이후, Glomax discovery 다중 마이크로플레이트 리더(Promega, Glomax discovery)를 이용하여 웰 당 0.25 - 1.0초의 통합 시간 동안의 발광을 기록하였다.
8. 세포 자멸 및 괴사 분석
스페로이드의 자멸하는 또는 괴사하는 세포를 Real Time-GloTM Annexin V 자멸 및 괴사 분석하였다. Real Time-GloTM Annexin V 자멸 및 괴사 분석은 세포 생존력 분석과 병행하여 수행되었다. 2일 동안 3D 배양으로 생성된 배지(50 μL)의 스페로이드를 불투명 벽으로 된 다중 벽 플레이트로 옮기고, 총 농도 10 μM가 되도록 50 μL의 2X 약물(독소루비신 에피루비신, 토포테칸 또는 도 21의 44종)을 처리하였다. 그 후, 제조자의 지시에 따라 제안된 프로토콜에 따라 동일 부피(100 μL)의 2X의 자멸 및 괴사 제제를 각 웰에 첨가하였다. 발광 및 형광 값은 웰 당 0.25 - 1.0초의 통합 시간을 갖는 Glomax discovery 멀티 마이크로플레이트 리더(Promega, Glomax discovery)를 사용하여 측정하였다.
9. 항암제의 처리
독소루비신, 에피루비신, 토포테칸 또는 도 21의 44종의 약물을 1:1(RPMI-1640: DMEM) 성장 배지에 희석하고, 1000 μM/mL의 저장용액을 준비하여 약물 처리를 위해 매번 희석된 작업용액을 제조하였다.
10. 통계적 분석
데이터의 통계분석은 Prism software(Graph Pad)를 사용하여 ANOVA 일원 테스트(one-way test)에 의해 수행되었다. 통계적 유의성은 각각 *p<0.05, **p<0.01 및 ***p<0.001로 정의되었다. 다중회귀분석은 JMPpro software(JMP)를 사용하여 단계적 회귀분석법(stepwise regression)에 의해 수행되었고, 변수 선택 방법으로는 전진(forward) 방식을 활용하였다.
실험결과
1. 실험의 개관
실험의 전체적 개관은 도 1, 2와 같다. 2일 동안 공동 배양 시스템으로 3가지 유형의 다세포 종양 스페로이드를 생성하고(도 1), 스페로이드 간 특성을 분석했다. 또한, 다세포 종양 스페로이드의 약물 침투, 세포 생존율 및 사멸 속도를 측정하고, 2일 동안 항암 약물로 처리한 후 비교하였다(도 2).
2. 3D 다세포 종양 스페로이드의 형성
(1) 종양 세포와 기질 세포의 공동배양
종양 미세 환경을 모방하기 위해, 3가지 종류의 기질 세포와 종양 세포와의 공동배양을 위한 종양 미세환경을 선택하였다. 5% 매트리겔의 폴리-HEMA로 코팅된 플레이트 상의 종양 세포와, 종양에서 기질세포로 알려진 ASC, BMSC 및 FIB의 공동배양으로 3가지 유형의 다세포 종양 스페로이드가 형성되었다. 48시간 동안의 배양에서, 플레이트 상 단일세포의 자가-조직화에 의해 3D 다세포 종양 스페로이드가 형성되었다.
(2) 3D 다세포 종양 스페로이드의 직경
다음 2일간의 배양기간 동안, 종양 세포와 공동배양된 기질세포 유형에 상관없이, 3가지 유형의 3D 다세포 종양 스페로이드의 직경은 500 내지 600 μm로 형성되었다(도 3, 4). 이는 직경이 500 μm 이상의 종양 스페로이드로서 생체 내 조건을 모방하기에 이상적인 모델 크기인 것인데, 미세전이(micro metastases)와 유사한 물리화학적 구배를 나타내고, 저산소성 코어(hypoxic core)를 가진 무혈관 종양(avascular tumor)과 다른 증식 단계(proliferation stage)를 가진 세포를 나타낸다. 이러한 이유로, 500 내지 600 μm의 직경은 3가지 유형의 스페로이드는 생체 내 종양을 모방하기 위해 in vitro 상의 3D 모델로서 사용되기에 매우 적합하다.
(3) 3D 다세포 종양 스페로이드의 원마도
원마도(roundness)는 경계(2D)의 선명도 또는 매끄러움을 나타낸다. 스페로이드의 둥근 정도는 스페로이드의 투영된 영역의 원형도를 나타낸다. 범위는 0 내지 1이고, 1에 가까울수록 투영된 영역의 원형도가 높음을 나타낸다. 생성된 3가지 유형의 스페로이드는 원마도의 값이 0.99 이상으로서, 1.0에 가깝다(도 3, 5).
(4) 3D 다세포 종양 스페로이드의 구형도
구형도(sphericity) 값에 따르면, 종양 스페로이드는 구형(SI(Spherical Index)≥0.90) 또는 비구형(SI≤0.90)으로 분류될 수 있다. 생성된 3가지 유형의 스페로이드 모두의 구형도 값은 0.99보다 높았고, 거의 1.0에 가까웠다. 이것은 모든 스페로이드가 구형으로 생성되어 3차원의 잘 정의된(well-fined) 형상을 갖고 있음을 암시한다(도 3, 6).
3. 3D 다세포 종양 스페로이드의 분석
(1) 3D 다세포 종양 스페로이드 내 종양세포의 분포
종양 미세환경의 특성 중 하나로, 기질 세포와 암세포(종양세포) 간 상호작용을 모방하기 위해 3D 다세포 종양 스페로이드를 설계하였다. 세포 추적기를 사용하여 3D 다세포 종양 스페로이드에서 각 세포 유형(유방암세포, 기질세포)의 위치 분포를 확인했다. 시딩(seeding) 전에 기질세포(ASC, BMSC, FIB) 및 인간 유방암세포(MDA-MB-231)를 각각 Cell TrackerTM Green CMFDA 염료와 Cell TrackerTM Red CMTPX 염료로 염색하였다. 3D 다세포 종양 스페로이드의 형성 후, 공초점 현미경을 사용하여 스페로이드에서 암세포의 분포를 관찰하였다.
흥미롭게도, 3D 다세포 종양 스페로이드 내 암세포 및 기질세포의 분포는 기질세포의 유형에 따라 상이하였다(도 7). ASC+MDA-MB-231 스페로이드는 유방 기질 세포로서의 ASC로 덮인 것처럼 보였고, MDA-MB-231 인간 유방암세포는 스페로이드 내부에 위치하였다. 이와 대조적으로, FIB+MDA-MB-231 스페로이드는 MDA-MB-231 인간 유방암세포가 대부분 공배양된 섬유아세포 대비 스페로이드의 외부에 위치하였다. BMSC+MDA-MB-231 스페로이드는 인간 유방암세포와 기질세포의 분포가 균일했다.
(2) 3D 다세포 종양 스페로이드의 표면
3가지 유형의 3D 다세포 종양 스페로이드의 표면을 각각 관찰하고 비교한 결과, 놀랍게도 각 기질세포의 유형에 따라 모두 상이하였다(도 8).
ASC+MDA-MB-231 스페로이드는 ECM 구성요소로 둘러싸여 있는 것 같고, 표면은 매끄러우며 세포의 형태가 발견되지 않았다. 한편, FIB+MDA-MB-231 스페로이드의 표면은 다른 스페로이드에 비해 훨씬 더 많은 암세포가 위치하고 있고, BMSC+MDA-MB-231 스페로이드의 표면은 암세포와 기질세포의 분포가 균일했다.
(3) 3D 다세포 종양 스페로이드에의 ECM 축적
세포 외 매트릭스(Extracellular matrix; ECM) 단백질, 콜라겐 유형 1 및 피브로넥틴에 대해 3D 다세포 종양 스페로이드의 절편이 면역형광 염색되었다. ASC+MDA-MB-231 스페로이드는 FIB+MDA-MB-231 스페로이드와 BMSC+MDA-MB-231 스페로이드보다 콜라겐 유형 1과 피브로넥틴을 훨씬 풍부하게 발현하였다(도 9).
특히, 콜라겐 유형 1은 다른 부분과 비교하여 표면에서 과발현되었다. 이것은 콜라겐이 원발성 유방암 영역(primary breast cancer area) 외에서 가장 풍부한 ECM 단백질이라는 사실을 반영한다. 또한, ASC+MDA-MB-231 스페로이드 표면의 부드러운 성질은 높은 ECM 분비에 기여하고, 스페로이드 표면의 대부분에서 단일 암세포의 모양을 숨긴다.
ASC+MDA-MB-231 스페로이드에서 확인할 수 있듯, ECM의 과발현은 암 조직의 복제에서 중요한 요소 중 하나인데, 세포-ECM 상호작용은 종양 미세환경에서 중요한 역할을 한다. 특히, 콜라겐 유형 1과 피브로넥틴의 발현은 유방암에서 증가하고, 종양의 성장과 전이 및 진행과 관련이 있다. 또한, 종양 미세환경 내 ECM 구성요소, 콜라겐 유형 1 및 피브로넥틴의 과발현이 암의 진행뿐만 아니라 약물 내성에서도 중요한 역할을 한다. 특히, 콜라겐 유형 1은 약물 내성을 증가시키는 인자이다. 이러한 이유로, 3개의 다세포 3D 종양 스페로이드에서 ECM 단백질의 발현에 뚜렷한 차이에 근거하여, 항암제에 대한 반응은 모두 상이할 것이라고 예측할 수 있다.
(4) 3D 다세포 종양 스페로이드에의 약물 침투
3가지 유형의 3D 다세포 종양 스페로이드에의 약물 침투를 평가하기 위해, 스페로이드를 화학요법 제제인 독소루비신으로 2일동안 처리하였다. 독소루비신은 유방암을 포함하는 다양한 유형의 종양을 치료하는 데에 사용되는 일반적은 화학요법 제제이다. 구조적 특성이 스페로이드에의 항암 약물 침투에 영향을 미치는지를 확인하고자, 독소루비신의 자연적 적색 형광을 사용하여 스페로이드 내로 약물의 불충분한 침투와 같은 저항(resistance)이 관찰되는지 분석했다. 독소루비신과 함께 48시간 동안 배양한 후의 스페로이드의 형광 영상은 스페로이드의 유형에 따른 차등적인 약물의 분포를 보여주었다.
공초점 이미지에서 독소루비신은 스페로이드에의 침투 정도의 차이를 보여주었다(도 10 내지 13). 도 11에서 흰색 화살표로 표시된 지점에서 독소루비신의 분포는 거의 관찰되지 않았는데, 표면이 ECM 콜라겐 유형 1로 둘러싸인 ASC+MDA-MB-231 스페로이드의 경우 다른 스페로이드 대비 훨씬 덜 침투가 이루어졌음을 확인할 수 있다.
(5) 3D 다세포 종양 스페로이드에의 약물 반응
1) 3D 다세포 종양 스페로이드의 세포 생존력
상기 약물의 낮은 침투와 관련하여, 2일 동안 10 μM의 독소루비신으로 처리된 ASC+MDA-MB-231 스페로이드는 다른 스페로이드 유형 대비 세포의 생존력이 가장 높다(56.67%). 이와 대조적으로, BMSC+MDA-MB-231 스페로이드 스페로이드의 세포 생존력은 이보다 낮았고(48.33%), 높은 약물 침투율이 관찰된 FIB+MDA-MB-231 스페로이드의 세포 생존력은 가장 낮았다(43%). ASC+MDA-MB-231 스페로이드와 FIB+MDA-MB-231 스페로이드 간 생존력은 상당한 차이가 존재한다(P=0.0024). 이러한 결과는, 다세포 스페로이드로의 약물의 약한 침투가 높은 생존력에 따른 낮은 약물 효능 또는 높은 저항성에 영향을 미친다는 것을 암시한다(도 14).
또한, 2D 배양 플레이트에서 동일한 실험을 수행한 경우, 섬유아세포와 공배양된 MDA-MB-231의 상태는 가장 높은 세포 생존력을 나타내었는데(도 17), 가장 낮은 세포 생존력은 ASC와 공배양된 MDA-MB-231에서 관찰되었다.
세포 생존력의 3D 및 2D 비교에서 3가지 유형의 3D 스페로이드 모두 2D 단일층 대비 약물 감도가 낮은 것으로 평가되었다. 또한, 3가지 유형의 3D 유방암 모델에서 독소루비신의 반응은 2차원 세포 모델과는 반대의 경향을 나타내어, 3D 유방암 모델에 대한 약물 효능의 차이와 함께 3D 종양 모델의 구조적 특성이 2D와 완전히 다른 약물 반응을 야기하였음을 알 수 있다.
이러한 결과는 3D 종양 모델의 구조적 특성의 중요성을 제시하는 것으로, 항암제의 효능을 스크리닝하기 위해, 2D가 아닌 3D가 될 때 발생하는 구조적 효과가 약물의 효능과 경향을 변화시킬 수 있음을 암시하는 것이다.
2) 3D 다세포 종양 스페로이드의 자멸 또는 괴사
스페로이드에서 독소루비신에 대한 생존력에 따른 약물 민감도를 조사하기 위해, Real Time-GloTM Annexin V 자멸(apoptosis) 및 괴사(necrosis) 분석을 수행하였다. 약물반응에 의해 자멸이 발생하면 세포막이 뒤집혀 포스파티딜-세린(Phosphatidyl-Serine; PS)이 노출되는데, 발광신호로 검출된 Annexin V와 PS의 결합을 통해 자멸세포가 측정된다. 괴사세포는 세포에 들어가서 막의 완전성(integrity) 상실시 형광 신호를 생성하는 PI(녹색)와 DNA를 결합시킴으로써 검출된다.
초기 자멸 마커인 아넥신 V 발현의 배수 변화는 생존율과 상관관계에 있다. 아넥신 V의 최고 증가 수준은 독소루비신으로 처리된 FIB+MDA-MB-231 스페로이드에서 관찰되었다. 또한, 독소루비신으로 처리된 ASC+MDA-MB-231 스페로이드에서 가장 낮은 수준의 아넥신 V가 관찰되었다. 도 15에서 확인할 수 있듯, 독소루비신으로 처리된 FIB+MDA-MB-231 스페로이드에서의 자멸은 BMSC+MDA-MB-231 스페로이드(10배)와 ASC+MDA-MB-231 스페로이드(9배) 대비 대략 13배나 증가하였다. 또한, 스페로이드 유형 간 독소루비신-유도된 자멸의 차이는 스페로이드의 세포 생존력에 반영되었다. 모든 유형의 3D 다세포 종양 스페로이드에서 괴사(PI)의 유의한 차이는 없었다(도 16).
4. 조건의 변화에 따른 3D 다세포 종양 스페로이드의 형성 및 분석
(1) 공배양 비율의 변화
1) ECM의 축적
기질세포인 ASC와 유방암 세포인 MDA-MB-231의 공배양 비율에 따른 3D 다세포 종양 스페로이드에서의 세포 외 매트릭스(Extracellular matrix; ECM) 단백질 발현이 조사되었다. ASC:MDA-MB-231의 공배양 비율을 각각 10:0, 3:7, 5:5, 7:3 및 0:10 으로 하여 3D 다세포 종양 스페로이드를 형성하였고, 콜라겐 유형 1 및 피브로넥틴에 대해 3D 다세포 종양 스페로이드의 절편이 면역형광 염색되었다. 그 결과, ASC:MDA-MB-231의 공배양 비율이 5:5인 경우 가장 많은 콜라겐 유형 1 및 피브로넥틴이 발현되었다(도 18).
2) 약물의 침투 및 세포 생존력
공배양 비율에 따른 3D 다세포 종양 스페로이드로의 약물 침투를 평가하기 위해, 상기 스페로이드를 화학요법 제제인 독소루비신으로 2일 동안 처리하였다. 이후 스페로이드의 실측 이미지를 관찰하였고, 독소루비신의 자연적 적색 형광을 사용하여 스페로이드 내로 약물이 침투되는 정도를 분석하였다. 그 결과, 독소루비신과 함께 48시간 동안 배양한 후의 스페로이드의 형광 영상은 공배양 비율에 따라 차등적인 약물의 분포를 보여주었다. 특히, ASC:MDA-MB-231의 공배양 비율이 5:5인 3D 다세포 종양 스페로이드에서는 스페로이드의 중심으로의 약물 침투가 다른 공배양 비율의 스페로이드 대비 덜 이루어진 것을 확인하였다(도 19).
다음으로, 공배양 비율에 따른 3D 다세포 종양 스페로이드의 생존력을 분석하였다. 그 결과 ASC:MDA-MB-231의 공배양 비율이 5:5인 3D 다세포 종양 스페로이드는 다른 공배양 비율의 3D 다세포 종양 스페로이드 대비 상대적으로 높은 생존율을 보였다(도 20).
이러한 결과는 기질세포와 유방암세포를 5:5(1:1) 비율로 공배양한 3D 다세포 종양 스페로이드에서 다른 공배양 비율을 가지는 스페로이드에 비해 높은 ECM 발현을 보이고, 그것이 독소루비신의 스페로이드로의 침투를 저해하였을 것을 시사한다. 또한 독소루비신이 가장 적게 침투하는 ASC:MDA-MB-231의 공배양 비율이 5:5인 3D 다세포 종양 스페로이드에서 가장 높은 가장 높은 생존력을 보였기 때문에, 스페로이드 내부로의 약물 침투 억제가 높아, 낮은 약물 효능 또는 높은 저항성에 영향을 미칠 가능성을 암시한다.
(2) 항암제의 변화
1) 세포 생존력
다양한 항암제에 대한 3D 다세포 종양 스페로이드의 약물 침투 저해 효과를 확인하기 위해, 독소루비신 외에 임상적으로 사용되거나 임상 과정 단계에 있는 항암제 44종을 48시간 동안 처리하고, 3D 다세포 종양 스페로이드(ASC+MDA-MB-231)와 3D 단일 세포 종양 스페로이드 내 세포의 생존율을 비교 분석하였다(도 21). 3D 다세포 종양 스페로이드가 3D 단일세포 종양 스페로이드보다 높은 생존율을 보인다면, 이는 3D 다세포 종양 스페로이드 약물에 대한 낮은 효능, 또는 높은 저항성을 가질 가능성을 시사한다. 또한 높은 약물 저항성은 약물의 스페로이드 내로의 침투 정도가 영향을 미칠 것이라는 사실을 유추할 수 있다.
3D 단일세포 종양 스페로이드는 5% 매트리겔의 폴리-HEMA로 코팅된 플레이트 상의 종양 세포를 단일 배양하는 방법으로 형성되었다. 50 μL의 종양 세포를 플레이트의 각 웰에 0.5 x 104 세포/웰의 밀도로 플레이팅(plating)하고, 5% CO2 인큐베이터에서 48시간 동안 37℃로 인큐베이션하였다. 48시간 동안의 배양에서, 플레이트 상 세포의 자가-조직화에 의해 3D 단일세포 종양 스페로이드가 형성되었다.
항암제 총 44종 중 30종(약 68.18%)의 약물을 처리하였을 때, 3D 다세포 종양 스페로이드가 3D 단일세포 종양 스페로이드보다 높은 생존율을 보였고, 14종(약 31.82%)의 약물에 대해서는 3D 다세포 종양 스페로이드가 3D 단일 세포 스페로이드보다 낮은 생존율을 나타냄을 확인하였다(도 22). 이러한 결과는 현재 임상, 또는 전임상 단계에서 활용되는 항암제 중 높은 비율이 3D 다세포 종양 스페로이드에서 높은 약물 저항성을 나타낼 수 있음을 의미한다. 나아가 3D 다세포 종양 스페로이드를 새로 개발되는 항암제의 약물의 투과도를 관찰할 수 있는 in vitro 수준의 플랫폼으로 활용할 수 있는 가능성을 제시한다.
2) 항암제의 화학적 특성과 세포 생존력 간의 관련성 확인
종양 스페로이드의 생존력 및 약물 투과에 미치는 항암제의 주요 화학적 특성이 무엇인지 확인하기 위해, 다중회귀분석법을 실시하였다. 구체적으로, 도 21에 나타낸 것과 같이, 44종의 항암제 중 핵(nucleus) 내에 작용하여 비슷한 작용기전을 나타내는 항암제 16종을 도출하였다. 다음으로, 항암제들의 화학적 특성을 Drugbank database(https://go.drugbank.com/drugs)로부터 추출하였다.
상기 추출된 화학적 특성으로는 약물의 분자량(M.W), 분배 계수(LogP), 물 용해도(LogS), 산해리평형상수(pKa), 생리적 전하도(physiological charge), 수소 수용체 수(hydrogen acceptor count), 수소 공여체 수(hydrogen donor count), 극성 표면적(polar surface area), 회전 가능한 결합 수(rotatable bond count), 극갈림율(polarizability), 분극률(refractivity), 고리의 갯수(number of rings) 등이 있으며, 이를 입력 변수(input parameter)로 활용하였다(도 23).
이후 3D 다세포 종양 스페로이드와 3D 단일 세포 스페로이드의 생존율의 차이 값(혹은 투과도)을 3회 반복 실험하여 출력 변수(output parameter)로 활용하였다. 항암제의 개별적인 화학적 특성의 차이로는 세포의 생존력을 완전히 설명할 수 없기 때문에, 각각의 화학적 특성뿐 아니라 각 요인의 상호 작용을 고려하여 다중 회귀 방정식을 도출하였다.
Figure PCTKR2020018577-appb-I000002
상기 식에서, PO는 예측된 세포 생존력 차이값(혹은 투과도)이고, K는 M.W(g/mol), L은 logP, M은 logS, N은 hydrogen acceptor count(units), O는 hydrogen donor count(units), P는 polar surface area, Q는 rotatable bond count(units), R은 refractivity(m3/mol), S는 polarizability 이다. a부터 j는 상수 값으로, a=0.1235313827, b=0.0035738171, c=0.0340283393, d=0.0340283393, e=-0.000519426, f=0.0108241714, g=-0.002123276, h=0.0007481956, i=-0.0050597, j=-0.018713752 이다.
본 발명자들은 도출된 방정식과 도 23에서 나타낸 실제 출력 변수를 대조하였다. 그 결과, 통계적으로 유의미한 회귀분석이 시행되었음을 관찰하였다(p value <0.05). 더불어 입력 변수 및 그들의 조합으로 출력 변수를 설명하기 충분한 결정계수를 가짐을 확인하였다(R2=0.69)(도 24). 화합물의 투과도는 LogP와는 양의 상관관계, polar surface area, refractivity, 및 polarizability 의 화학적 특성과는 음의 상관관계를 보임이 알려져 있다. 이러한 결과는 본 회귀분석을 통해 3D 다세포 스페로이드를 활용하여 예측한 항암제의 투과도는 알려진 상관관계를 잘 만족함을 의미한다(c는 양의 상수, g, i, j는 음의 상수). 또한, 3D 다세포 스페로이드 모델이 다양한 항암제의 화학적 특성에 따른 투과도의 차이를 잘 반영할 수 있는 모델임을 의미한다.
3) 약물 침투
다음으로, 처리한 다양한 종류의 항암제들의 3D 다세포 종양 스페로이드 내로 약물 침투 정도를 조사하였다. 이를 위하여 유방암을 비롯한 다양한 유형의 고형암에 대한 치료제로 사용되고 있는 2가지 화학 요법 제제인, 에피루비신, 토포테칸을 활용하였다. 자연적으로 에피루비신은 적색, 토포테칸은 녹색 형광을 발현하기 때문에, 형광의 발현을 측정하여 약물의 침투를 가늠할 수 있다. 3D 다세포 종양 스페로이드(ASC+MDA-MB-231)의 약물 침투 정도를 비교하기 위한 대조군으로, 앞서 독소루비신의 경우와 같이 FIB+MDA-MB-231 스페로이드와 BMSC+MDA-MB-231 스페로이드를 사용하였다.
이들 항암제를 각각 스페로이드에 48시간 동안 처리하고, 항암제의 분포를 형광현미경을 이용하여 분석하였다. 그 결과, 두 종류의 항암제 모두에서 3D 다세포 종양 스페로이드(ASC+MDA-MB-231) 는 BMSC+MDA-MB-231, FIB+MDA-MB-231 스페로이드에 비하여 통계적으로 유의미한 정도의 낮은 약물 투과도를 보였다(도 25 내지 26). 이는 독소루비신 뿐 아니라, 현재 활용되고 있는 추가적인 2종의 화학적 항암제에서도 3D 다세포 종양 스페로이드가 약물 투과를 실제로 억제할 수 있음을 암시하는 결과이다.
(3) 종양 세포의 변화
1) 종양세포의 분포 및 형태
고형암의 경우 종양 미세환경에서 기질세포가 표면에 위치하고, 표면에 ECM 분포가 많은 것을 특징으로 하고 있다. 따라서 MDA-MB-231 유방암 세포 외에, 다른 고형암 세포를 활용하여 3D 다세포 종양 스페로이드를 형성하였을 때에도 이러한 특성을 나타내는지 확인하고자 하였다. 이를 위하여 A549(폐암 세포), HT1080(섬유 육종 세포), MKN45(위암 세포), SK-BR-3(유방암 세포) 및 MCF-7(유방암 세포)를 활용하였고, 세포 추적기를 사용하여 3D 다세포 종양 스페로이드에서 각 세포 유형(고형암세포, 기질세포)의 위치 분포를 확인하였다. 시딩(seeding) 전에 기질세포 및 고형암세포(A549, HT1080, MKN45, SK-BR-3, MCF-7)를 각각 Cell TrackerTM Green CMFDA 염료와 Cell TrackerTM Red CMTPX 염료로 염색하였다. 3D 다세포 종양 스페로이드의 형성 후, 광학 현미경을 활용하여 스페로이드의 형태를 관찰하였고, 공초점 현미경을 사용하여 스페로이드에서의 암세포 분포를 관찰하였다.
단일 종양 세포를 활용하여 3D 종양 스페로이드를 형성하였을 때, 대부분의 고형암 세포가 스페로이드가 형성되지 않거나, 일관적이지 않은 형태로 형성되었다. 반면 3D 다세포 종양 스페로이드의 경우, 5종의 고형암 세포 모두에서 일관적인 구형의 형태로 스페로이드가 만들어졌다(도 27). 스페로이드 내 암세포 및 기질세포의 분포를 관찰하였을 때, 5종의 고형암세포(A549, HT1080, MKN45, SK-BR-3, MCF-7)로 형성한 3D 다세포 종양 스페로이드 모두에서 기질세포가 공배양된 고형암세포 대비 스페로이드의 외부에 위치하였다(도 28).
2) ECM의 발현
다음으로, 고형암을 활용한 3D 다세포 종양 스페로이드에서의 세포 외 매트릭스(Extracellular matrix; ECM) 단백질, 콜라겐 유형 1 및 피브로넥틴의 발현을 면역형광 염색을 통하여 확인하였다. 3종의 고형암 세포(HT-1080, A549, MKN45)가 활용되었다. 단일 종양 세포를 활용하여 형성한 3D 종양 스페로이드에서는 콜라겐 유형 1 및 피브로넥틴이 거의 발현되지 않은 반면, ASC와 공배양하여 형성한 3D 다세포 종양 스페로이드에서는 3종의 고형암 모두에서 콜라겐 유형 1 및 피브로넥틴이 단일세포 스페로이드 대비 높게 발현되었다(도 29). 이러한 결과는 다양한 고형암 세포를 활용하여 형성한 3D 다세포 종양 스페로이드에서도 고형암의 미세환경의 특성(주변부에 위치한 기질세포, ECM의 높은 표면 분포)을 적절히 반영하고 있음을 시사한다.

Claims (12)

  1. 종양세포군을 포함하는 코어부; 및
    지방 유래 기질세포군과 세포외기질 성분(extracellular matrix component)을 포함하고, 상기 코어부를 에워싸는 외곽부;를 포함하는 구형의 3차원 종양 스페로이드(spheroid).
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 종양세포군은 유방암세포, 폐암세포, 섬유육종세포 또는 위암세포를 포함하는 것인 스페로이드.
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 종양세포군은 MDA-MB-231, A549, HT1080, MKN45, SK-BR-3 또는 MCF-7 세포를 포함하는 것인 스페로이드.
  4. 청구항 1에 있어서, 상기 세포외기질 성분은 상기 종양세포군과 상기 지방 유래 기질세포군 간 상호작용에 의해 발현된 산물인 스페로이드.
  5. 청구항 1에 있어서, 상기 세포외기질 성분은 콜라겐과 피브로넥틴을 포함하는 것인 스페로이드.
  6. 청구항 1에 있어서, 상기 스페로이드의 직경은 500 내지 600 μm인 스페로이드.
  7. 청구항 1에 있어서, 상기 스페로이드의 원마도(roundness)의 값이 0.90 이상이고, 구형도(sphericity)의 값이 0.90 이상인 스페로이드.
  8. 청구항 1에 있어서, 상기 스페로이드는 상기 종양세포군과 지방 유래 기질세포군을 7:3 내지 3:7의 세포밀도로 공배양하여 형성된 것인 스페로이드.
  9. 청구항 1 내지 8 중 어느 한 항의 스페로이드를 포함하는 종양 치료제의 효능 평가용 조성물.
  10. 청구항 1 내지 8 중 어느 한 항의 스페로이드에 대상 약물들을 처리하는 단계; 및
    상기 스페로이드의 코어부 내 상기 대상 약물들의 분포도를 분석하거나, 상기 스페로이드 내 세포의 생존율을 분석하는 단계;를 포함하는 종양 치료제의 효능 평가 방법.
  11. 청구항 10에 있어서, 상기 스페로이드의 코어부 내 일 대상 약물의 분포가 타 대상 약물의 분포 대비 더 높거나, 상기 스페로이드 내 세포의 생존율이 일 대상 약물 처리시 타 대상 약물 처리시 대비 더 낮은 경우, 상기 일 대상 물질의 종양 치료 효능이 더 우수한 것으로 판단하는 단계를 더 포함하는 방법.
  12. 청구항 10에 있어서, 상기 생존율은 상기 스페로이드의 코어부 내 종양세포군의 생존율인 방법.
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