WO2020060222A2 - 뇌혈관 모사용 미세유체 디바이스 및 이를 포함하는 고효율 혈액뇌관문 모사 시스템 - Google Patents

뇌혈관 모사용 미세유체 디바이스 및 이를 포함하는 고효율 혈액뇌관문 모사 시스템 Download PDF

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Definitions

  • the present invention relates to a novel method of microfluidic devices and systems capable of efficiently simulating blood brain barriers.
  • the technology for culturing cells using a microfluidic device is a technology that provides a fine environment suitable for cells and precisely regulates the culture conditions of cells that are sensitive to the surrounding environment. I am receiving.
  • Microfluidic-based studies have several advantages over conventional laboratory-level analytical processes because they provide faster and more sensitive detection results while using smaller volumes of formulation.
  • microfluidic technology is being used not only in biochemical research fields, but also in the neuroscience field.
  • dynamic culture unlike static culture (static culture) requires a flow of fluid, so complicated equipment such as a syringe pump or a hydraulic pump, and skilled workers are required.
  • the brain uses about 20% of the available oxygen for normal function to strictly regulate the oxygen flow necessary for blood flow and survival.
  • the transwell system which is mainly used as a conventional blood brain gateway model, is only 2D culture, and the microenvironment is different from the brain tissue, so it could not simulate the actual blood brain gateway.
  • the system has a problem in that it is not possible to confirm a clear cell morphology in real time due to a porous membrane having low transparency, and also cannot provide a unidirectional culture flow known to be very important for vascular function.
  • the existing chip-based dynamic culture system requires a tube tube and a fluid controller to be connected to each chip, so the structure is complicated and not easy to control, and in the case of 3D culture, the hydrogel with weak physical properties is subject to a slight pressure difference. High degree of proficiency was required because it could be damaged by.
  • the present invention not only does not require a separate auxiliary facility to solve the above-mentioned problems of the prior art, and derives a microfluidic device capable of precisely controlling the culture environment, and provides a high-efficiency blood brain barrier simulation system using the same It is aimed at.
  • the present invention is a first channel; A second channel adjacent to the first channel and connected through one or more microholes to cultivate neural stem cells; And it is connected to both ends of the first channel, it provides a microfluidic device for cerebral vascular simulation including a chamber containing a culture medium.
  • the inner surface of the first channel may be coated with a coating solution containing at least one selected from the group comprising poly-L-lysine and collagen.
  • the endothelial cells adhered to the inner surface of the first channel may be further included, and the endothelial cells attached to the inner surface of the first channel and the epidermal cells adhered to the inner surface of the first channel (Pericyte) may be further included.
  • the second channel may include a hydrogel for culturing the neural stem cells in three dimensions.
  • the hydrogel may include collagen and crosslinked or uncrosslinked hyaluronic acid.
  • the concentration of the collagen in the hydrogel is 3.0 mg / ml to 5.0 mg / ml, and the concentration of the crosslinked or uncrosslinked hyaluronic acid in the hydrogel may be 1.0 mg / ml to 10.0 mg / ml.
  • the hydrogel may have an expansion ratio of 50% to 150% represented by Equation 1 below:
  • Wi and Ws represent the dry weight before incubation and the wet weight of the hydrogel after incubation with PBS at 37 ° C for 3 days, respectively.
  • the culture medium may be a medium in which EGM-2 basic medium and DMEM / F12 basic medium are mixed, and N-2 supplement, EGM-2 supplement, epidermal cell growth supplement, and 0.5% to 3% in the mixed medium.
  • FBS can be added as a major factor.
  • a third channel adjacent to the second channel may be further included.
  • the average diameter of the first channel may be 0.1 to 1.0 mm, and the average diameter of the second channel may be 0.5 to 1.5 mm.
  • the first channel A second channel adjacent to the first channel and connected through one or more microholes, a second channel for culturing neural stem cells, and a second channel for culturing separate organ cells; And it is connected to both ends of the first channel, and provides a composite microfluidic device for cerebrovascular-separate organs comprising a chamber containing a culture medium.
  • the device In another embodiment of the present invention, the device; And a means for controlling the inclination of the device.
  • the means for controlling the tilt may be a syringe pump located at the bottom of the device.
  • Means for controlling the slope may provide unidirectional flowability to the culture medium of the first channel.
  • the second channel or the 2-1 channel may be located below the first channel.
  • the system of the present invention more effectively simulates the structure and function of a real human blood-brain barrier, it can be utilized as an in-vitro model system capable of discovering various drugs that can target or penetrate the blood-brain barrier.
  • the system of the present invention is easy to set up and use of the device, as it is required to connect an external device for dynamic culture, so that user convenience can be significantly increased.
  • the system of the present invention can build a mass production platform, which is an important factor in screening, the efficiency of drug development can be improved, and the development cost can be significantly reduced.
  • the system of the present invention enables real-time monitoring of various phenomena such as vascular permeability of drugs and effects on neurons, so that the success rate of drug development can be significantly increased.
  • FIG. 1 shows the design and dimensions of the hNVU chip. (a) Design and dimensions and (b) photos of microfluidic devices for hNVU chips.
  • Figure 2 shows the design and dimensions of a multi-organ hNVU chip.
  • A Design and dimensions and
  • b photos of microfluidic devices for multiple organ hNVU chips.
  • FIG. 3 shows an experimental setup for generating media flow for dynamic culture and shear stress simulation.
  • Figure 4 shows an image-based analysis for the fungal penetration and quantification of neuroaffinity in the hNVU chip.
  • (b) Neuroaffinity measurement analysis to quantify CFW-positive fluorescence regions in (A) brain and (B) liver images of the same size. Image analysis was processed with Image J software.
  • FIG. 5 shows a schematic of a 3D microfluidic human cerebrovascular unit (hNVU) chip study.
  • hNVU human cerebrovascular unit
  • FIG. 6 shows the surface coating of the microchannels on the chip. EC attachment and morphology on microchannels treated with collagen or poly-L-lysine-collagen double coating were compared on day 3. Scale bar represents 100 ⁇ m.
  • FIG. 7 shows the optimization of 3D hydrogel composition for hNVU chips.
  • Optical images of hydrogels with different concentrations of Col and catechol-modified hyaluronic acid (HA-CA) are intended to support EC and 3D NSC co-culture.
  • Col 3. mg / ml
  • HA-CA 7.1 mg / ml
  • Figure 8 shows the characteristics of collagen I (Col) and brain hybrid extracellular matrix (BHEM) hydrogel.
  • (a) Rheological analysis of Col and BHEM hydrogels in frequency sweep mode. The black and white symbols represent the storage modulus G 'and loss modulus G ", respectively.
  • (B) Average elastic modulus at 1 Hz (n 3, *** p ⁇ 0.001 compared to Col group).
  • (C) Col and Expansion and contraction properties of BHEM hydrogels (d, e) Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) analysis of hydrogels (d) Standardized fluorescence recovery curves and (e) 70 kDa fluorescein isothiocyanate labeled dex Diffusion coefficient of tran (FITC-dextran) probe.
  • FRAP Fluorescence recovery after photobleaching
  • (F) Quantitative reverse transcriptase chain reaction (qPCR) analysis to quantify neural stem cell differentiation after 5 days of culture in Col and BHEM hydrogels (n 3, Col group Contrast ** p ⁇ 0.01).
  • G Optical image of Col and BHEM hydrogels after 5 days of co-culture of human NSC and brain endothelial cells (EC) in hNVU chips.
  • H In Col and BHEM hydrogels in hNVU chips. Astrocytes derived from human EC (CD31, green) and human NSC 5 days after co-culture [glia cell fibrous acidic protein (GFAP), red Immunostaining of]. Scale bar represents the 100 ⁇ m.
  • GFAP glia cell fibrous acidic protein
  • NSC differentiation markers Tuj1, GFAP and Olig2
  • NSC medium EC medium
  • NSC + EC 0.5X
  • qPCR results for gene expression of EC marker P-gp.
  • NSC medium Three different medium conditions [NSC medium, NSC + EC (1X) medium: 0.5X basal medium and 1X factor for each cell type, and NSC + EC + PC (1X) medium: 0.5X basal medium for NSC and EC Or, 1X factor for all three cell types]
  • NSC differentiation marker 3
  • Figure 11 shows the generation of cerebrovascular units with BBB through NSC differentiation in hNVU chips.
  • (a) qPCR analysis to compare NSC differentiation between NSC alone and NSC-EC coculture groups with neurons (Tuj1) and astrocytes (GFAP) (n 3, * p ⁇ 0.05 and ** compared to NSC alone group) p ⁇ 0.01).
  • FIG. 12 shows immunostaining for glia cell differentiation and basement membrane deposition in hNVU chips.
  • Figure 13 shows the characteristics of the BBB transmittance in the hNVU chip.
  • (c) Permeability coefficient of 70 kDa FITC-dextran in NSC-EC / flow and NSC-EC-PC / flow groups at 60 minutes (n 3, ** p ⁇ 0.01). Scale bar represents 200 ⁇ m.
  • FIG. 16 shows a fungal brain infection model using the hNVU chip.
  • FIG. 17 shows fungal behavior and BBB transmission in hNVU chips.
  • White arrows indicate large Cryptococcus due to slow division.
  • FIG. 18 shows a multi-organ hNVU chip model for fungal neuroaffinity studies.
  • FIG. 19 shows a 3D liver-mimicking infection model. Fluorescence image of CFW-labeled C. neoformans injected into a liver-mimicking model where human NSCs have been replaced with a human liver cancer cell line (Huh-7). Fungal cells were cultured for 1 day. Scale bar represents 100 ⁇ m.
  • the first channel 101 A second channel 102 connected to the first channel 101 through one or more microholes and including neural stem cells; And it is connected to both ends of the first channel 101, a microfluidic device (100) is provided for the cerebral vascular simulation including a chamber 104 containing a culture medium.
  • the first channel 101; A second channel 102 for culturing neural stem cells, and a 2-1 channel 102 'for culturing separate organ cells, respectively, adjacent to the first channel 101 through one or more microholes; And it is connected to both ends of the first channel 101, and a cerebral blood vessel-separated long-term use of a complex microfluidic device (100 ') comprising a chamber containing a culture medium.
  • a complex microfluidic device 100 '
  • microfluidic device is a microfluidic device for brain blood vessel mimicry, which is a blood-brain barrier by three-dimensional co-culturing of human neural stem cells in a three-dimensional hydrogel matrix that mimics human vascular endothelial cells and brain tissue. -Barrier) can be efficiently simulated.
  • complex microfluidic device complex microfluidic device
  • complex microfluidic device is a structure in which the cerebral vascular microfluidic device and a separate long-term microfluidic device are integrated structures, wherein the separate organs include liver, lung, lung, It refers to various human organs such as the intestine, kidney, and heart.
  • the "blood brain barrier” is a vascular barrier for protecting the brain, which has a significantly lower permeability than other blood vessels, and an efficient model for the development of new drugs for brain disease treatment is essential because the permeation mechanism is not clear. It can be used as an animal replacement model for the development of new therapeutic drugs.
  • the most important factor in realizing the function of the blood-brain barrier is an astrocyte cell angio-terminal structure in which a tight junction of a cerebral vascular endothelial cell and an astrocyte form a protrusion to contact the vascular endothelial cell, and the device Can effectively implement the specific structure and structure of the blood-brain barrier.
  • a fluid controller has to be connected to each chip, but the device is capable of dynamic culture by providing a precise flow of the culture medium through a drop in an open channel structure chip.
  • the "microfluid” may be a component in which the moving fluid is trapped in a channel having a diameter of 10 mm or less (microscale) or guided through the channel.
  • the microfluidic channel may be larger than the microscale in one or more directions, although the channel may be microscale in at least one direction.
  • the geometry of the microfluidic channel may be configured to control the flow rate of the fluid passing through the channel.
  • the microfluidic channel may be formed of various geometries that facilitate it to allow passage through the channel at a wide range of flow rates.
  • the device includes polydimethylsiloxane (PDMS), polymethylmethacrylate (PMMA), polyacrylates, polycarbonates, polycyclic olefins, polyimide (polyimides), polyurethane (polyurethanes), glass, silicon, quartz, but may be composed of various materials, but is not limited thereto.
  • PDMS polydimethylsiloxane
  • PMMA polymethylmethacrylate
  • polyacrylates polycarbonates
  • polycyclic olefins polyimide
  • polyimides polyimides
  • polyurethane polyurethanes
  • glass silicon, quartz, but may be composed of various materials, but is not limited thereto.
  • the "first channel” is a microfluidic channel that mimics cerebral blood vessels, and a chamber 104 including a culture medium may be connected to both ends of the first channel 101.
  • the chamber 104 stores the culture medium as an open structure, and since it is connected to the first channel 101, the culture medium can be precisely formed by controlling the device tilt.
  • the "culture medium” is a culture medium for cells and a transmission medium such as nutrients and oxygen.
  • the culture medium can supply nutrients or oxygen necessary for cells and remove waste products, and in the device, the culture medium can simulate the blood flow of an actual brain blood vessel.
  • the culture medium may be a medium in which EGM-2 basic medium and DMEM / F12 basic medium are mixed, and EGM-2 basic medium and DMEM / F12 basic medium in a weight ratio of 2: 1 to 1: 2. It is preferably a mixed medium, but is not limited thereto.
  • N-2 supplement, EGM-2 supplement, epidermal cell growth supplement, and 0.5% to 3% (preferably, 1% to 2%) FBS may be added to the mixed medium as main factors. .
  • the second channel 102 is connected to the first channel 101 through one or more micro-holes, and may include neural stem cells.
  • neural stem cell is a cell capable of self-renewal and capable of differentiating into a nervous system cell. Neurons, astrocytes, oligodendrocytes (oligodendrocyte).
  • the “stem cell” refers to a cell having the ability to differentiate into various kinds of new cells while having self-replication ability, and totipotent stem cells, pluripotent stem cells, depending on the differentiation ability It can be classified as multipotent stem cells, and can be classified into adult stem cells, embryonic stem cells, and dedifferentiated stem cells according to the stem tissue.
  • the “second channel” is a microfluidic channel that is adjacent to the first channel 101 and simulates brain tissue of a living body, and can simulate permeability between the first channel 101 and the second channel 102.
  • the one or more "micro-holes" are in the form of connecting the first channel 101 and the second channel 102, the permeability of the first channel 101 and the second channel 102, the movement of substances, exchange Phenomena and the like can be reproduced.
  • the average diameter of the first channel 101 may be 0.1 to 1.0 mm, and the average diameter of the second channel 102 may be 0.5 to 1.5 mm.
  • the diameters of the first channel 101 and the second channel 102 may be varied as necessary, but the diameter of the second channel 102 may be determined by considering the diameter of a blood vessel that is relatively narrow compared to the brain tissue. It can be made larger than the diameter of the channel 101.
  • the device may further include endothelial cells and epidermal cells cultured attached to the inner surface of the first channel 101.
  • the inner surface of the first channel 101 may be coated with a coating solution containing at least one selected from the group consisting of poly-L-lysine and collagen, and preferably, a coating solution comprising poly-L-lysine and collagen. As it can be double coated, it can promote efficient endothelial monolayer formation.
  • the “endothelial cell” may preferably be a cerebral vascular endothelial cell, and optionally, astrocytes, optionally, neurons and, optionally, perivascular cells, wherein the cells have one or more structural structures in the blood brain barrier (BBB) or spinal cord. Alternatively, it can be cultured in a device under conditions that mimic functional features (eg, dense junctions).
  • BBB blood brain barrier
  • the "Pericyte” affects the differentiation or inhibition of endothelial cells by adhering to the endothelial cells, and plays a role as a progenitor cell through various differentiation abilities, so it is important for the development, stabilization, maturation and remodeling of blood vessels. It is recognized as a ruler and is considered an important target in studying the causes and treatments of vascular diseases.
  • the cerebral vascular endothelial cells may be adhered and cultured in a form of a single layer on the surface of the channel, and at the bottom of the endothelial cells, epithelial cells may be attached and cultured in a separate layer to simulate actual vascular endothelial tissue in vivo.
  • the second channel 102 may include a hydrogel for culturing the neural stem cells in three dimensions.
  • the culture refers to the process of maintaining and growing cells under suitable conditions, and suitable conditions may mean, for example, the temperature at which the cells are maintained, nutrient availability, atmospheric CO 2 content and cell density, and different types of cells Suitable culture conditions for maintenance, propagation, expansion and differentiation are well known and documented in the art.
  • hydrogel is a material that forms a porous structure by losing the fluidity of the liquid as a dispersion medium through the sol-gel phase shift, forming a porous structure, the hydrophilic polymer having a three-dimensional network structure and microcrystalline structure contains water Can be formed by expanding.
  • the "three-dimensional culture” provides an environment similar to a real tissue by excluding a process in which cells adapt to a two-dimensional environment of a flat plate, and induces cell growth, differentiation and function in vivo. You can.
  • the three-dimensional culture can effectively mimic the actual in vivo tissue environment in an in vitro environment and improve the certainty of results, stability and validity of the experiment.
  • the hydrogel may include collagen and crosslinked or uncrosslinked hyaluronic acid.
  • the crosslinked or uncrosslinked hyaluronic acid can significantly increase the physical properties (elastic modulus) of the hydrogel, and since physical properties are similar to those of actual brain tissue, it can more effectively simulate a blood-brain-barrier. .
  • the cross-linked hyaluronic acid may modify the catechol group to hyaluronic acid by reacting the hyaluronic acid with a substance containing a catechol group.
  • the molar ratio of the material containing the catechol group may be 2% to 7%.
  • hyaluronic acid is dopa, dopamine, norepinephrine, lithospermic acid, caffeic acid, rosmarinic acid, salvianolic acid ) And one or more selected from the group consisting of gallic acid.
  • the concentration of the collagen in the hydrogel may be 3.0 mg / ml to 5.0 mg / ml, preferably 3.5 mg / ml to 4.5 mg / ml, and the crosslinking or uncrosslinking in the hydrogel
  • the concentration of hyaluronic acid may be 1.0 mg / ml to 10.0 mg / ml, preferably 6.0 mg / ml to 8.0 mg / ml.
  • the storage modulus of the hydrogel can be maintained at a high level of 200 Pa to 500 Pa, preferably 200 Pa to 500 Pa.
  • the expansion ratio of the hydrogel represented by Equation 1 below can be maintained at a high level of 50% to 150%, preferably 100% to 150%:
  • Wi and Ws represent the dry weight before incubation and the wet weight of the hydrogel after incubation with PBS at 37 ° C for 3 days, respectively.
  • the device 100 or 100 ′ may further include a third channel 103 adjacent to the second channel 102.
  • the third channel 103 can supply various substances, such as drugs and nutrients, to the second channel 102, if necessary, so that substances can be exchanged between the second channel 102 and the third channel 103.
  • substances such as drugs and nutrients
  • One or more microholes that provide permeability can be formed.
  • a 3-1 channel 103 'adjacent to the 2-1 channel 102' may be further included.
  • the 3-1 channel 103 ' may also supply various substances such as drugs and nutrients to the 2-1 channel 102', if necessary, similarly, the 2-1 channel 102 'and the third One or more microholes may be formed to provide permeability to allow the exchange of material between -1 channels 103 '.
  • the device (100 or 100 '); And a means 200 for controlling the inclination of the device.
  • the device 100 or 100 includes the chamber 104 having an open structure, and the culture medium stored in the chamber 104 may be provided with unidirectional flowability in a desired direction through inclination, so that the device is disposed or fixed. Taking into consideration, it is possible to control the inclination of the device.
  • the blood-brain barrier simulation system does not require a controller to control the fluid of each device or chip, and can simply provide a flow of fluid by forming a drop through tilt control of the device.
  • the means for controlling the inclination of the device 200 is not particularly limited as long as the drop of the device 100 or 100 'is kept constant or can be precisely adjusted in proportion to time, but is preferably located at the bottom of the device It can be a syringe pump.
  • the syringe pump may represent a driving cycle consisting of two separate operations of suction and discharge of the fluid, and the syringe pump may be used for precisely controlling the amount of fluid.
  • the syringe pump may include a syringe cylinder, and a plunger of a rod piston that linearly reciprocates in a state inserted into the syringe cylinder by a predetermined driving means, and the syringe cylinder through linear reciprocation of the plunger It is possible to perform the operation of suction and discharge of the fluid.
  • the second channel 102 or the 2-1 channel 102 'in the device may be located under the first channel 101.
  • the device 100 or 100 ' may be arranged horizontally or vertically, but in a vertical form such that the second channel 102 or the 2-1 channel 102' is located below the first channel 101.
  • the system can be operated more easily, and in particular, an overflow phenomenon of the culture solution stored in the chamber 104 may be minimized despite a change in the tilt of the device.
  • the blood-brain barrier simulation system may include one or more of the devices (100 or 100 '); A support 300 supporting one or more of the devices; And it may include a syringe pump located at the bottom of the support 300.
  • the support 300 is sufficient if one or more devices can be arranged or arranged.
  • the support 300 may be a flat plate or box-shaped housing, but if one or more devices can be stably supported through planar characteristics,
  • the shape, size, and material are not particularly limited.
  • the blood-brain barrier simulation system may be equipped with one or more devices (100 or 100 '), and uniformly dynamic flow (flow) to a plurality of devices (100 or 100') by controlling the slope of the device collectively ), As well as being implemented by a single syringe pump, cultivation efficiency and ease of use can be maximized.
  • Human fetal NSCs were isolated from the human fetal brain at 13 weeks gestation (protocol # 4-2003-0078). NSC (passage 17-) in Dulbecco's modified Eagle's medium / nutrient mixture F-12 (DMEM / F12) medium (Gibco BRL, Gaithersburg, MD, USA) with N-2 supplement (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) 23) was cultured. For expansion, basic fibroblast growth factor (30 ng / ml, PeproTech, Rocky Hill, NJ, USA) and leukemia inhibitory factor (10 ng / ml, Merck Millipore, Darmstadt, Germany) were added to the culture medium.
  • DMEM / F12 Dulbecco's modified Eagle's medium / nutrient mixture F-12
  • Human cerebral microvascular endothelial cells (hCMEC / D3; Cedarlane, Ontario, Canada) were cultured in 150 ⁇ g / ml Col-coated flasks in endothelial growth medium (EGM TM -2 SingleQuots TM ; Lonza, Verviers, Belgium).
  • Human brain microvascular epithelial cells (HBVP; ScienCell Research Laboratories, Carlsbad, CA, USA) in epidermal cell media (ScienCell Research Laboratories) containing 2% FBS, 1% penicillin-streptomycin and PC growth supplement (ScienCell Research Laboratories) ) Were cultured.
  • the cell culture flask for HBVP culture was coated with 20 ⁇ g / ml PLL solution (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) before cell seeding.
  • HCMEC / D3 cells between passages 27-32 and HBVP cells between passages 2-10 were used for all experiments. Cells were cultured in a humidified incubator with 5% CO 2 at 37 ° C.
  • Unreacted dopamine hydrochloride was removed by repeated dialysis (4 times for 6 hours each for 1X PBS (pH 5.0, Biosesang, Seongnam, Korea) and 1 time for 4 hours for distilled water). The final solution was frozen and lyophilized.
  • the BHEM hydrogel was prepared by mixing a solution of Col (3.7 mg / ml final concentration) and HA-CA (final concentration of 7.1 mg / ml) containing an oxidizing agent (NaIO 4 , final concentration of 0.5 mg / ml).
  • PBS Sigma Aldrich
  • Wi and Ws represent the dry weight before incubation and the wet weight of the hydrogel after incubation with PBS at 37 ° C, respectively.
  • Fluorescence recovery was performed after photobleaching (FRAP) analysis to measure the diffusion coefficient of the FITC-dextran probe.
  • the hydrogel sample was placed on a PDMS chip with a glass cover slip at the bottom along with PBS serving as a control.
  • Photobleaching was induced using a laser scanning confocal microscope (LSM 880, Carl Zeiss, Jena, Germany) with a 20X magnification objective lens and a laser set to 488 nm emission with 100% output.
  • LSM 880 laser scanning confocal microscope
  • the hydrogel was incubated with a 0.5 mg / ml 70 kDa FITC-dextran (Sigma Aldrich) solution in PBS for 24 hours prior to the FRAP experiment.
  • the bleaching area was monitored with 10 pre-bleached images and 150 images (about 150 sec total) of fluorescence recovery after bleaching that was scanned with low laser intensity (1%).
  • the normalized fluorescence recovery curves f (t) were calculated according to equations (2) and (3), where F (t), R, Fin, F ⁇ and F 0 are respectively fluorescence intensity after photobleaching, shifting, photobleaching It shows the background fluorescence intensity before, the fluorescence intensity recovered at the end of the experiment, and the fluorescence intensity immediately after bleaching.
  • the diffusion coefficient (D) of FITC-dextran in a hydrogel was obtained by fitting equation (2) with equation (4), and was calculated according to equation (5), where b, ⁇ D and ⁇ are bleaching parameters and properties, respectively. Gaussian bleached spotset at diffusion time and 57.5 ⁇ m.
  • microfluidic devices were prepared with PDMS by standard soft lithography processes.
  • PDMS pre-polymer Sylgard 184; Dow Corning, Midland, MI, USA
  • the PDMS layer patterning the aligned microchannels was connected by a gap between the small posts.
  • the mold was then degassed in a vacuum chamber for 5 minutes and then cured in a drying oven at 60 ° C. for 4 hours. After the PDMS was completely cross-linked, it was peeled from the mold and punched to form the inlet, outlet and media chambers.
  • the PDMS unit and cover slip (24 mm x 32 mm; Marienfeld, Lauda-Koenigshofen, Germany) were sterilized by autoclaving and dried completely under UV light prior to assembly. Oxygen plasma treatment (CUTE; Femto Science, Seoul, Korea) was applied to combine the PDMS unit with the cover slip. The assembled device was then placed in a drying oven at 60 ° C. Figures, design and dimensions of the fabricated chip are shown in Figures 1 and 2.
  • the microchannel of the microfluidic device was coated with a 20 ⁇ g / ml PLL solution to improve the adhesion of the hydrogel and cells on the channel wall.
  • Col hydrogels were prepared using a 4.5 mg / ml Col solution. NSC was encapsulated in Col and BHEM hydrogel solutions at a cell density of 3.33 ⁇ 10 7 cells / ml, administered to the central channel, and incubated to crosslink the hydrogel (37 ° C., 20 min). The upper channel was further coated with 5 mg / ml collagen solution to improve EC adhesion and incubated for an additional 20 minutes.
  • DMEM / F12 medium with N-2 supplement was administered to the lateral channels and the device was incubated in a CO 2 incubator.
  • Media conditions optimized for triplicate co-culture of NSC, EC and PC were used in the experiment, as follows: N-2 supplement, EGM TM -2 SingleQuots TM supplement, PC growth supplement and 1% FBS. 1: 1 mixture of supplemented DMEM / F12 medium and EBM-2 medium (Lonza). The maximum shear stress provided to the EC layer gradually increased over the incubation time.
  • the intermediate parameter values are listed in Figure 3c.
  • Cells in the hNVU chip were fixed with 2% paraformaldehyde (Sigma-Aldrich) for 30 minutes and permeated with 0.05% Triton X-100 (Sigma-Aldrich) for 30 minutes. After washing and blocking with 5% bovine serum albumin (Wako, Osaka, Japan), the samples were incubated with the primary antibody at 4 ° C. for 2 days, followed by PBS washing for at least 6 hours. The samples were then incubated with Alexa Fluor 488 (Invitrogen) or Alexa Fluor 594 (Invitrogen) -tagged secondary antibody at 4 ° C. for 1 day, followed by PBS washing for at least 6 hours.
  • Alexa Fluor 488 Invitrogen
  • Alexa Fluor 594 Invitrogen
  • Nuclei were counterstained with 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, Tokyo Chemical Industry Co., Ltd., Tokyo, Japan).
  • the primary antibodies used in the present invention are: anti-CD31 (1: 200, Millipore, Billerica, MA, USA), anti-Tuj1 (1: 150, Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA), anti -GFAP (1: 200, Millipore), anti-O4 (1: 500, Millipore), anti-NG2 (1: 100, Abcam, Cambridge, UK), anti-ZO-1 (1: 100, Invitrogen) and anti -glucuronoxylomannan (anti-GXM, 1: 500, 18B7 mouse monoclonal antibody donated by Dr. Arturo Casadevall in Johns Hopkins University).
  • cDNA complementary deoxyribonucleic acid
  • human-specific primers with TaqMan genes for the nestin Hs00707120_s1
  • Tuj1 Hs00801390_s1
  • GFAP Hs00909238_g1
  • Olig2 Hs00300164_s1
  • GAPDH glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase
  • Human EC-specific primers for CD31 (Hs00169777_m1), ZO-1 (Hs01551861_m1) and P-gp (Hs00184500_m1) were used for gene expression analysis in human brain EC.
  • the expression level of each target gene was normalized to the expression level of the endogenous reference GAPDH.
  • the relative Ct method was used to determine relative gene expression levels.
  • hNVU chips were placed horizontally on the substrate, and both EC and media channels were filled with PBS to match the surface level to homogenize the pressure applied to the 3D matrix.
  • FITC-dextran (70 kDa) or PBS was flowed into both channels at a flow rate of 100 ⁇ l / h.
  • Vascular permeability was evaluated by the flow rate of the solute across the EC barrier according to the reference method.
  • the amount of 70 kDa FITC-dextran penetrating the EC layer is the same as the FITC-dextran accumulated in the NSC-containing 3D hydrogel region according to the mass conservation method.
  • Vascular barrier permeability is calculated using the average intensity of blood vessels (I v ) and tissues (NSC gel, I T ) at two different time points t1 and t2, according to equation (6) calculated by Image J software. Induced.
  • the ⁇ t, V and A surfaces are approximated by the average morphology of the EC layer in the hNVU chip in the 3D confocal image, respectively, and represent the time between two images in the selected region of interest, NSC gel volume, and the surface area of the EC layer.
  • EC-seed channels were first treated with PBS alone with 100 ⁇ g / ml P-gp inhibitor verapamil (99.9%, Acros Organics, Morris Plains, NJ, USA) or control for 30 minutes, followed by washing with PBS, followed by 30 minutes. During incubation with 1 ⁇ M calcein AM (Invitrogen). Using an LSM 880 confocal microscope, fluorescence images of the entire channel were captured along the z-axis, and the central layer of the z-axis image was quantified for fluorescence intensity. The same area including the cross section of the EC layer was set as the area of interest for measuring cell uptake of calcein AM. The laser intensity and gain values for a confocal microscope were adjusted to be the same for all samples.
  • verapamil 99.9%, Acros Organics, Morris Plains, NJ, USA
  • Yeast extract - peptone dextrose (YPD) Cryptococcus neoformans H99, Cryptococcus neoformans mpr1 D mutants, Cryptococcus and Candida glabrata deuterogattii R265 BG2 the strain was cultured and maintained on a culture medium. Each strain was inoculated in liquid YPD medium at 30 ° C. for 16 hours and washed with distilled water. For inoculation into the microfluidic chip, the cell number was counted with a hemocytometer and adjusted to 5 x 10 6 cells / ml in PBS.
  • each fungal cell (5 ⁇ 10 6 cells / ml in PBS) was suspended in the same volume of EGM TM -2 SingleQuots TM .
  • a total of 120 ⁇ l samples were inoculated into the upper channel of the hNVU chip (vascular side, final 3 X 10 5 cells / chip).
  • fungal cells were pre-incubated with 2% CFW (Sigma-Aldrich) in PBS for 30 minutes, washed 5 times with distilled water and resuspended in PBS. Analysis was performed at 37 ° C. in a CO 2 incubator for 24 hours.
  • Fluorescence images for image quantification were captured with an IX71 fluorescence microscope (Olympus, Tokyo, Japan).
  • the z-stacked fluorescence image was captured with an LSM 880 confocal microscope and the live image was recorded with a Lumascope 620 live imaging fluorescence microscope (Etaluma Inc., Carlsbad, CA, USA).
  • the image processing method is shown in FIG. 4A.
  • NSC, PC and EC were seeded in the same manner as described above for the preparation of the hNVU chip system, and 8 x 10 6 cells / ml Huh-7 cells encapsulated in BMEM hydrogel in the central channel of the liver unit of the multi-organ hNVU chip Seeding.
  • CFW-labeled fungal cells were injected through the upper reservoir of the liver unit so that the fungus was not affected by factors secreted from the brain unit.
  • inositol 200 mg / ml, Duchefa, RV Haarlem, Netherlands
  • the image processing method is shown in Fig. 4B.
  • Example 1 Microfluidic setup for hNVU chips
  • NSC human cells
  • Figure 1 Human NSCs have the potential to differentiate into multiple cell types, including neurons, astrocytes and oligodendrocytes.
  • the inventors have previously shown that NSCs exhibit a distinct tendency to differentiate in microfluids according to their proximity to the EC layer.
  • a microfluidic device with an vascular mimicking channel in which the EC was cultured on the side of the 3D NSC channel most of the NSCs near the EC layer differentiated into astrocytes, but the NSCs far away from the EC tended to differentiate into neurons.
  • NSCs neuronal units (3D brain ECM-mimicking matrix in microfluidic chips). Neurons) were established (Fig. 5a).
  • the microfluidic hNVU chip was made of polydimethylsiloxane (PDMS) with three parallel channels interconnected by small columns (FIG. 1A).
  • the central channel was designed for 3D hydrogel-encapsulated NSC culture, others were designed for EC culture, test molecule administration and medium supply.
  • the inventors have adopted an individual tubeless vertical chip design to increase product in culture compared to that of a conventional syringe pump based dynamic culture system with multiple tube connections. Vertical design not only facilitates space utilization by stacking many chips vertically, but also induces passive capture of fungi in the EC layer (FIG. 1B). However, the chip may also be used in the same horizontal structure as the conventional chip (Fig. 1B).
  • an intermediate flow rate can be generated simultaneously on all chips in the vessel.
  • the syringe pump presses one of the syringes, the pressure presses the plunger of the opposite syringe placed under the container.
  • the plunger pushes and tilts the container upwards and continuously provides a stepwise unidirectional flow formed by gravity in the channel for a specific time during incubation (FIGS. 3A and 5B).
  • Brain EC formed a uniform monolayer on the channel under unidirectional dynamic flow (FIG. 3B). It was found that the shear stress value calculated by computer simulation is controlled by the propulsion speed of the syringe pump (FIG. 3C).
  • the shear stress level gradually increased in the range of 0-6 dyne / cm 2 , similar to that in the brain vasculature.
  • Example 2 Optimization of 3D ECM hydrogel and culture conditions for hNVU chip
  • Brain ECM-mimicking hydrogel was applied to 3D culture of human NSC in hNVU chip. Surface coating of microchannels with poly-L-lysine (PLL) and collagen promoted efficient EC monolayer formation in the upper channel ( Figure 6).
  • PLL poly-L-lysine
  • Figure 6 For 3D culture in the central channel, we used a hybrid hydrogel of collagen I (Col) and HA, one of the highly concentrated ECM components in the brain; The hydrogel was named Brain Hybrid ECM (BHEM) hydrogel.
  • the 3D Col hydrogel for NSC culture in the central channel collapsed because the HA-free Col hydrogel contracted significantly and was unable to withstand the EC layer formed on the upper channel (FIG. 7). Therefore, 3D Col hydrogel was supplemented with HA to enhance mechanical properties.
  • HA was modified with a catechol group to improve the hydrogel adhesion.
  • catechol group As the oxidized catechol group has a large binding affinity to proteins and peptides, it is expected that the catechol modification will increase the interaction with Col in the hybrid hydrogel to promote the formation of an integrated polymer network.
  • An optimal ECM composition (Col: 3.7 mg / ml and HA-CA: 7.1 mg / ml) was found to maintain both the intact EC layer and the 3D hydrogel structure containing NSC.
  • the modulus of elasticity at the 1 Hz frequency of the optimized BHEM hydrogel was significantly higher than that of the Col hydrogel (380.58 ⁇ 16.99 and 96.48 ⁇ 10.65 Pa, respectively) (Fig. 8a, b).
  • Comparison of the swelling properties of each hydrogel under physiological conditions [phosphate buffered saline (PBS) at 37 ° C.] shows that Col hydrogel exhibits significant shrinkage, weight loss and structural deformation, while BHEM hydrogel exhibits its volume and 3D structure. The retention was shown (Fig. 8c).
  • the diffusion coefficient (D) of the BHEM hydrogel decreased slightly compared to that of the Col hydrogel, but not significantly (Fig.
  • NSC medium and EC medium were cultured under medium conditions prepared by simply mixing in a 1: 1 ratio [NSC + EC (0.5X) medium: 0.5X base medium and 0.5X supplemental factor for each cell type], and when culturing in medium conditions prepared, NSC to nerve
  • the differentiation efficacy of the NSCs of the cells was significantly reduced (Fig. 9a).
  • Neuronal differentiation of NSC is also modified NSC medium conditions [NSC + EC (1X) medium: 0.5X basal medium with each 1X supplement factor, NSC + EC + PC (1X) medium: 1X supplementation for 3 cell types 0.5X basal medium for NSC and EC with factor], but NSC maintained a certain level of differentiation potential for neurons (50-70% compared to differentiation potential in NSC medium) (Figure 10A).
  • NSC differentiation into astrocytes was significantly improved by these modified NSC medium conditions.
  • oligodendrocyte marker (Olig2) expression was significantly reduced under these conditions, optimization of media conditions was not considered because oligodendrocytes are not a major component of the cerebrovascular unit.
  • NSC + EC (1X) and NSC + EC + PC (1X) Similar expression of endothelial junction molecules (CD31 and Zonula occludens-1; ZO-1) and efflux pumps (P-gp) in EC and modified NSC media [NSC + EC (1X) and NSC + EC + PC (1X)] As indicated by the level, EC was not significantly affected by the modified culture conditions (FIG. 10B). When NSC + EC + PC (1X) medium supplemented with different fetal bovine serum (FBS) concentrations (0%, 1% and 2%) was tested for NSC differentiation, the presence of 1% and 2% FBS showed neurons Although it did not affect differentiation, astrocyte differentiation was significantly increased (FIG. 10C). Therefore, NSC-EC-PC (1X) medium supplemented with 1% FBS compatible with all three cell types was used for further experiments.
  • FBS fetal bovine serum
  • Example 3 Reconstruction of cerebrovascular unit with BBB structure in hNVU chip
  • HNVU was established in the microfluidic chip by inducing human in situ NSC differentiation through EC and coculture under optimized media and hydrogel conditions.
  • the direction of stem cell differentiation can be controlled by soluble factors secreted from neighboring cells.
  • Co-culture of human fetal NSCs with human brain ECs enhanced glial cell differentiation of NSCs, but reduced neuronal differentiation due to the paracrine effect of EC secretion (FIG. 11A). This differentiation pattern was similar to the pattern observed in our previous studies.
  • Co-culture of NSC and EC in different compartments of the microfluidic device induced spatially controlled NSC differentiation. GFAP-positive astrocytes increased significantly in differentiated NSCs near the EC layer (FIG. 11B).
  • PC vascular basement membrane
  • astrocytes angiogenesis vascular basement membrane
  • PC is an important component of functional BBB for vascular permeability and blood flow regulation. It has been reported that PC secretes laminin and induces EC to secrete the basement membrane component.
  • PC and EC were sequentially seeded in the upper channel, causing the formation of a tubular EC monolayer on the luminal surface of the channel and localization of the PC under the EC layer, and in direct contact with the other. ( Figure 11c).
  • Example 4 Control of BBB permeability in hNVU chips
  • Culture conditions can determine the permeability of the BBB unit as a diffusion barrier in the hNVU chip.
  • the barrier permeability using fluorescently-labeled dextran as a tracer under several culture environments. Permeability tests performed 5 days after NSC seeding showed that the NSC monoculture group rapidly transferred 70 kDa fluorescein isothiocyanate (FITC) -labeled dextran (FITC-dextran) into a 3D BHEM hydrogel containing NSC. Diffusion was shown, and a charted gradual diffusion fluorescence profile was shown (FIGS. 13A, B).
  • FITC fluorescein isothiocyanate
  • Example 5 Function of BBB reconstructed in hNVU chip
  • BBBs with tight junctions reconstituted in hNVU chips under optimizing conditions exhibit physiological barrier function.
  • Expression of P-gp one of the important effluent pumps in BBB function, was up-regulated in the NSC-EC / flow group (FIG. 14c), which may indicate improved effluent pump functionality of BBB in this group.
  • Non-fluorescent acetoxymethyl calcein (calcein AM) can be converted into fluorescent calcein when transported into living cells and then pumped from the cells by P-gp.
  • the fluorescence intensity of calcein AM increased significantly only in the EC layer after verapamil treatment (FIG. 14D).
  • Example 6 hNVU chip as an efficient in vitro model for monitoring microbial BBB infiltration
  • the present inventors used the hNVU chip to investigate the brain infection mechanism of the fungal pathogen C. neoformans , which is known to infect the brain and cause fatal meningitis encephalitis in individuals with weakened immunity worldwide. It was applied (Fig. 16A). These fungal pathogens efficiently cross the BBB and cluster in brain tissue near the BBB and are located in the perivascular space of the posterior capillary veins. The vertical chip setup allowed fungal cells to efficiently contact the EC. One day after inoculation into the upper channel of the hNVU chip (NSC-EC-PC / flow group), some C.
  • C. neoformans cells H99 strain were observed to accumulate in the EC-PC vascular layer across the BBB barrier of the hNVU chip Became (Fig. 16A).
  • C. neoformans formed clusters under the vasculature following the penetration of the EC layer, which repeats the morphology of actual brain tissue with C. neoformans infection.
  • Live imaging of calcofluor white (CFW) -labeled C. neoformans cells inoculated into the hNVU chip allows fungal cells to first access the EC layer, then spread faster near the 3D brain matrix (BHEM), and eventually penetrate the vascular layer Showed. In the latter half of live imaging, the CFW-fluorescence intensity tagged to chitin in the fungal cell wall was heterogenized due to fungal cell division during infection (FIG. 17A).
  • BBB penetration To quantify the ability of C. neoformans to penetrate BBB, we defined the extent of BBB penetration as follows (FIG. 16B; top panel): CFW-stained mold area (n) below the EC layer, above the EC layer And total CFW-stained mold area (m + n) at the bottom. 1) Candida glabrata (BG2 strain), which is not a common fungal meningitis pathogen, 2) Cryptococcus deuterogattii (R265 strain), and 3) metal, one of the pathogenic Cryptococcus species primarily targeting the lungs, not the brain during systemic host infection The ability to penetrate the BBB of three different strains of the C.
  • BG2 strain Candida glabrata
  • R265 strain Cryptococcus deuterogattii
  • metal one of the pathogenic Cryptococcus species primarily targeting the lungs, not the brain during systemic host infection The ability to penetrate the BBB of three different strains of the C.
  • neoformans mpr1 ⁇ mutant which is defective in BBB penetration and brain infection due to deletion of the loprotease MPR1 gene, was compared to that of the wild type (WT) strain C. neoformans H99.
  • WT wild type
  • C. glabrata BG2 strain did not penetrate the vascular barrier of the hNVU chip (FIG. 16B).
  • the C. deuterogattii R265 strain had a lower BBB penetration level compared to the penetration level exhibited by the C. neoformans H99 strain (FIG. 16B).
  • C. glabrata and C. deuterogattii cells uniformly stacked in the entire EC layer, C.
  • neoformans WT cells were more clustered over the EC layer near the 3D brain unit to cross the BBB barrier (FIG. 16B).
  • the C. neoformans mpr1 ⁇ mutation was also clustered near the 3D BHEM region, but showed much lower infiltration capacity than the C. neoformans H99 strain (FIG. 16B).
  • neoformans WT cells penetrating the EC layer in a single z-plane showed that the fungal cells are located mainly near the nucleus in the EC (FIG. 16D, yellow arrow). There was no noticeable damage to Cryptococcus cells after BBB infiltration ( Figure 16D, yellow arrowhead). The invaded and colonized Cryptococcus cells were shown to directly contact GFAP-positive astrocyte hemangioblasts derived from NSC (FIG. 16E, white arrow and FIG. 17B). In particular, in BBB, the EC form became irregular upon C. neoformans infection, but C. glabrata infection did not change the EC form (FIG. 16c). Nevertheless, there was no noticeable dissolution in the vascular layer during C. neoformans infection. Overall, our data clearly demonstrate that the hNVU chip models the selective BBB penetration process of fungal meningitis pathogens.
  • Example 7 Multi-organ hNVU chip for monitoring microbial neuroaffinity
  • C. neoformans unlike the C. glabrata and C. deuterogattii strains, tended to cluster mainly around the EC layer near the 3D brain unit, thereby monitoring the hNVU chip for microbial neuroaffinity. It was further tested as an in vitro model for (FIG. 18A). In order to confirm whether this neuroaffinity is caused by the interaction between neuronal cells and Cryptococcus by cell type, the present inventors used C. neoformans WT cells as the same chip cultured with a human liver cancer cell line (Huh-7) instead of NSC. Inoculation was performed, but no significant colonization similar to that observed in brain-mimicking hNVU chips was observed (FIG. 19).
  • the inventors further investigated C. neoformans neuroaffinity in multiple long-term hNVU chips prepared by adding liver-mimicking units to hNVU chips (FIG. 18B).
  • the multi-organ hNVU chip is designed to have brain (NSC) and liver (Huh-7) units connected to the EC layer and one channel to identify and visualize organ-specific preferences of microorganisms (FIGS. 2A, B and 18B). .
  • NSC brain
  • Human-7 liver
  • the fungal cells By flowing the medium from right to left, the fungal cells first contacted the liver unit (FIG. 18C).
  • the present inventors defined the degree of neuroaffinity according to the formula shown in FIG. 18B, where the CFW-stained fungal region (A) in the brain-mimicking unit was brain and It was divided into total CFW-stained fungal regions (A + B) in both liver-mimicking units.
  • the C. glabrata BG2 strain was evenly distributed over the entire EC layer regardless of the presence of 3D brain and liver units (FIG. 18C; degree of neuroaffinity ⁇ 0.5).
  • the C. deuterogattii R265 strain was more laminated to the EC layer adjacent to the 3D brain and liver units than the EC region with no cell contact in the middle of the chip, but showed no noticeable preference in any organ, which was a nerve in C. deuterogattii . It showed a lack of myth (Fig. 18c; degree of neuroaffinity-0.5).
  • C. glabrata and C. deuterogattii C.
  • neoformans cells were more preferentially deposited on the EC layer above the brain unit than on the liver unit, which showed a clear neuroaffinity (Fig. 18c; degree of neuroaffinity ⁇ 0.8).
  • the C. neoformans mpr1 mutant showed a degree of neurogenicity similar to that of the WT H99 strain, but significantly reduced BBB penetration (FIG. 18c), which is not the neuroaffinity of metalloprotease MPR1, C. neoformans , It has been shown to be important in its BBB penetration.
  • hNVU-mimicking chip containing functional BBB and nerve components in a microfluidic device.
  • the hNVU chip system has the following advantages over the previously reported BBB-mimicking platform: (1) a modified 3D hydrogel that mimics the brain matrix, and (2) an optimized culture that meets the co-culture of different cell types. Conditions, (3) in situ human NSC differentiation strategy to provide essential components for BBB and brain tissue, (4) placement of EC layers to facilitate easy quantification and real-time observation in BBB units, (5) culture and analysis Tube / syringe-free dynamic fluid system to increase efficiency, and (6) multiple long-term chip design for fungal penetration testing and neuroaffinity validation.
  • the hNVU chip successfully simulated the neuroaffinity and BBB infiltration process of human fungal pathogen C. neoformans.
  • Most previously reported platforms have been tested for drug infiltration and outflow across the BBB and response to drugs, and have not been applied to investigate the behavior and pathogenic mechanisms of living microorganisms during brain infection.
  • the hNVU-mimetic platform can be employed to investigate large-scale screening of BBB-microbial interactions and mutations to identify factors for microbial BBB-infiltration and neuroaffinity.
  • the hydrogel composition was originally optimized to better represent the brain 3D matrix.
  • Collagen hydrogels have been most widely used in 3D cultures due to their excellent cell-matrix interaction, but they often undergo significant shrinkage and contraction during cultures resulting in deformation of the 3D structure.
  • Another commonly used hydrogel, fibrin is also not suitable for BBB systems due to its angiogenic effect to induce EC migration.
  • BHEM hybrid hydrogel
  • the HA-CA component not only increased the similarity of mechanical properties to that of brain tissue, but also maintained the hydrogel structure inside the chip due to adhesion properties (FIG. 8).
  • HA is one of the most abundant ECM components and plays a major structural role in brain tissue
  • HA supplementation further contributes to the reconstruction of the original brain ECM microenvironment.
  • the optimal ratio and concentration of HA-CA and collagen components capable of forming the EC layer were confirmed (Fig. 8g, h).
  • the BHEM hydrogel appears to provide an ideal 3D niche without affecting the NSC differentiation potential ( Figure 8F).
  • the second remarkable feature of the hNVU chip is the successful reproduction of the function of the neurovascular unit in BBB and brain tissue through in situ differentiation of human NSCs in microfluidic devices and co-culture with brain EC and PC.
  • the compartmentalization of the cellular components required for the BBB and brain units in the hNVU chip was spontaneously induced in situ by a spatially regulated distinction pattern of human NSC differentiation according to the distance from the brain EC layer, which is essentially similar to cell morphogenesis in the brain. .
  • human NSCs were in direct contact with EC and tended to differentiate into astrocytes through paracrine signals from EC (Fig.
  • astrocyte-like angiogenesis-like structures Fig. 11E
  • the astrocytes of the astrocytes surrounding the blood vessels composed of EC are known to play an important role in regulating BBB function in the cerebrovascular unit, contributing to functional BBB-mimicking.
  • the EC moved towards the 3D hydrogel unit, causing the EC monolayer to collapse ( Figure 14A). It seems that astrocytes, cells that differentiate from NSC, somehow supported the EC layer in the right place. Human NSCs far from the EC layer were mostly neurons, differentiated into oligodendrocytes at low rates, forming 3D cerebrovascular units (FIGS. 11B and 12B).
  • In situ differentiation of human NSCs with EC co-culture is in vivo structurally similar to BBB and 3D brain tissue without the need for a primary culture or separate stem cell differentiation step to produce human brain cell sources such as astrocytes and neurons. -Enable the development of similar hNVU models.
  • this hNVU chip was emphasized by a simple and stable culture system with a constant unidirectional medium flow to improve the structural integrity and function of the BBB.
  • Many previous studies have generated medium flow in microfluidic chips using syringes or peristaltic pumps. In this case, each chip requires a tube connected to the pump for dynamic flow, making it difficult to conduct high throughput studies.
  • the inventors have devised a simple and efficient flow culture system with minimal setup. Since the chips can be stacked in a box without individually connecting to pumps and tubes (FIGS. 3A and 5B), the system can increase culture and analytical throughput, ultimately promoting high throughput screening and monitoring.
  • Laminar shear stress produced by normal blood flow is known to maintain the structure and function of blood vessels by controlling endothelial skeletal and vascular homeostasis.
  • Application of the inventors' set-up to the stepwise unidirectional flow promoted the formation of a tight junction between the ECs (FIGS. 14A, B), and substantially improved the integrity and functionality of the BBB unit in the hNVU chip.
  • the stepwise unidirectional flow culture up-regulated the expression of the efflux carrier P-gp, which pumps drugs and foreign substances out of the brain (Fig. 14c). Therefore, the inventors observed that the calcein AM molecule accumulated in the EC layer of the BBB unit without the medium flow, but not in the BBB with the medium flow (FIG.
  • BBB Under inflammatory, degenerative and traumatic conditions, BBB selectively responds to cytokines such as TNF- ⁇ for neuroendocrine control.
  • cytokines such as TNF- ⁇
  • the permeability gradually increased, but returned to the basic level when cytokine stimulation was withdrawn (Fig. 14e, f).
  • the hNVU chip not only provides a powerful and functional BBB system, but is also useful for modeling cerebrovascular disease, injury and inflammation using various fluid dynamics and biochemical treatments.
  • the hNVU chip has been successfully used to investigate the brain infection mechanism of the universal fungal meningitis pathogen C. neoformans , compared to other human fungal pathogens, including C. glabrata and C. deuterogattii , which do not cause fungal meningitis.
  • C. glabrata and C. deuterogattii human fungal pathogens
  • C. glabrata and C. deuterogattii which do not cause fungal meningitis.
  • neoformans does not reflect complex BBB structure and function due to lack of other important hNVU cell components (e.g. PC, neurons), fungi Unsuitable for visualization of movement.
  • Conventional murine-based toxicity and fungal testing only provides end-point results and no intrusion behavior can be observed at the BBB penetration point.
  • the hNVU chip system of the present invention is the best in vitro system capable of demonstrating both BBB penetration and neuroaffinity characteristics of fungal pathogens.
  • the present inventors visualized the BBB penetration process of C. neoformans in a real-time method for the first time due to the above-mentioned characteristics of the hNVU chip.
  • Trojan model of pathogen delivery mediated by (1) intercellular infiltration through damaged or loose junctions between ECs, (2) transcytosis through ECs, or (3) monocyte / macrophage. Based on our observations, after initial adhesion to BBB, C. neoformans appeared to form a biofilm-like cell cluster on the brain unit.
  • the present invention is the first experimental demonstration of the neuroaffinity of C. neoformans in a qualitative and quantitative manner.
  • C. neoformans tended to be closer to the brain units than liver units, while C. deuterogattii was similarly dense to both units (Fig. 18c).
  • C. neoformans mostly adhered to other fungi, its neuroaffinity is the result from increased specific adhesion of brain units to BBB in the hNVU chip. The most likely explanation for this phenomenon is that brain cells can secrete small molecules and / or protein factors that can improve the BBB adhesion of C. neoformans .
  • One such candidate may be inositol, which is known to be abundant in the brain. Previously, C.
  • neoformans were reported to induce expression of the HA synthase gene CPS1, produce HA upon inositol uptake, and then increase its binding to CD44 glycoproteins in blood ECs42.
  • inositol supplementation can increase recruitment and adhesion of C. neoformans to the EC layer of the liver unit (FIG. 18D, e).
  • inositol alone did not fully promote the EC-liver barrier penetration of pathogens (FIG. 8D, F), suggesting that other factors may be specifically present in the brain unit.
  • hNVU chips for high-throughput screening of recently constructed large-scale recruitment of C. neoformans mutants, the present inventors identified mechanisms of brain infection of C. neoformans and their associated complex signals by identifying novel factors critical for fungal BBB migration and neuroaffinity. You will be able to analyze your network more systematically. This will facilitate the discovery of microbial BBB penetration antagonists that contribute to the development of new therapeutics for infectious brain diseases.
  • hNVU chips will be useful in developing drug delivery systems targeting BBB and brain tissue.
  • the multi-organ hNVU chip system can extend its usefulness through a combination of different types of organ and tissue and brain models (eg, brain and intestine models to reconstruct the intestinal-brain axis for modeling Parkinson's disease).

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Abstract

본 발명은 제1채널; 상기 제1채널에 인접하여 하나 이상의 미세홀을 통해 연결되고, 신경줄기세포를 배양하기 위한 제2채널; 및 상기 제1채널 양 말단에 연결되고, 배양액을 포함하는 챔버를 포함하는 혈액뇌관문 모사용 미세유체 디바이스 및 이를 포함하는 혈액뇌관문 모사 시스템을 제공한다.

Description

뇌혈관 모사용 미세유체 디바이스 및 이를 포함하는 고효율 혈액뇌관문 모사 시스템
본 발명은 혈액뇌관문을 효율적으로 모사할 수 있는 신규한 방식의 미세유체 디바이스 및 시스템에 관한 것이다.
미세유체 디바이스를 이용하여 세포를 배양하는 기술은 매크로 스케일 배양과 달리 세포에 적합한 미세한 환경을 제공하고 주변 환경에 예민하게 반응하는 세포의 배양 조건을 정밀하게 조절하는 기술로서 최근 세포조직공학 분야에서 각광받고 있다.
미세유체에 기반한 연구는 보다 더 적은 부피의 제제를 사용하면서 보다 더 신속하고 감도 높은 탐지 결과를 제공하므로, 통상의 연구실 수준의 분석공정에 비해 여러 가지 장점을 갖는다.
최근, 미세유체 기술은 생화학 연구분야 전반에 걸쳐 이용되고 있을 뿐만 아니라, 신경과학 분야에서도 그 이용도가 증가하고 있다.
그러나, 동적 배양(dynamic culture)은 정적 배양(static culture)과 달리 유체의 흐름이 필요하므로 시린지 펌프나 유압 펌프와 같은 복잡한 설비, 및 숙련자가 요구된다.
뇌는 정상기능을 위하여 가용 산소의 약 20%를 사용하여 혈류 및 생존을 위해 필수적인 산소전달을 엄격히 조절한다.
종래의 혈액뇌관문 모델로 주로 사용되는 트랜스웰(transwell) 시스템은 2D 배양에 불과하며 미세환경이 뇌 조직과 상이하므로 실제 혈액뇌관문을 모사할 수 없었다.
또한, 상기 시스템은 투명성이 낮은 다공성 막 때문에 명확한 세포의 형태를 실시간으로 확인할 수 없을 뿐만 아니라 혈관 기능에 매우 중요하다고 알려진 단일 방향의 배양액 흐름을 제공할 수 없는 문제가 있었다.
혈액뇌관문 조직에서 성상교세포의 중요성이 대두되며 많은 연구들이 혈관내피세포가 배양되는 트랜스웰의 다공성 막의 아래쪽 면에 성상교세포를 공배양함으로써 기존 모델의 기능을 증진하고자 하였으나, 성상교세포 기능에 필수적인 혈관 내피세포와의 직접적인 접촉이 구현되지 못하는 문제가 있었다.
또한, 기존의 칩 기반 동적 배양 시스템은 각각의 칩에 튜브 관 및 유체 컨트롤러를 연결해야 하므로 구조가 복잡하고 제어가 용이하지 않았을 뿐만 아니라 3차원 배양의 경우 물성이 약한 하이드로겔이 미약한 압력 차이에 의해서도 손상될 수 있기 때문에 고도의 숙련도가 요구되었다.
본 발명은 전술한 종래기술의 문제점을 해결하기 위하여 별도의 부대시설이 불필요할 뿐만 아니라, 정밀하게 배양 환경을 제어할 수 있는 미세유체 디바이스를 도출하고, 이를 이용한 고효율 혈액뇌관문 모사 시스템을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 제1채널; 상기 제1채널에 인접하여 하나 이상의 미세홀을 통해 연결되고, 신경줄기세포를 배양하기 위한 제2채널; 및 상기 제1채널 양 말단에 연결되고, 배양액을 포함하는 챔버를 포함하는 뇌혈관 모사용 미세유체 디바이스를 제공한다.
상기 제1채널 내측 표면은 폴리-L-라이신 및 콜라겐을 포함하는 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함하는 코팅액으로 코팅될 수 있다.
상기 제1채널 내측 표면에 부착 배양된 내피세포를 더 포함할 수 있고, 상기 내피세포 하단 및 상기 제1채널 내측 표면에 부착 배양된 주피세포(Pericyte)를 더 포함할 수 있다.
상기 제2채널은 상기 신경줄기세포를 3차원 배양하기 위한 하이드로겔을 포함할 수 있다.
상기 하이드로겔은 콜라겐 및 가교 또는 미가교 히알루론산을 포함할 수 있다.
상기 하이드로겔 내 상기 콜라겐의 농도는 3.0 mg/ml 내지 5.0 mg/ml이고, 상기 하이드로겔 내 상기 가교 또는 미가교 히알루론산의 농도는 1.0 mg/ml 내지 10.0 mg/ml일 수 있다.
상기 하이드로겔의 하기 수학식 1로 표시되는 팽창비가 50% 내지 150%일 수 있다:
[수학식 1]
Figure PCTKR2019012135-appb-I000001
이때, Wi 및 Ws는 배양 전 건조 중량 및 37℃에서 PBS로 3 일 동안 배양한 후 하이드로겔의 습윤 중량을 각각 나타낸다.
상기 배양액은 EGM-2 기본 배지 및 DMEM/F12 기본 배지가 혼합된 배지일 수 있고, 상기 혼합된 배지에 N-2 보충물, EGM-2 보충물, 주피세포 성장 보충물 및 0.5% 내지 3% FBS가 주요인자로 첨가될 수 있다.
상기 제2채널에 인접하는 제3채널을 더 포함할 수 있다.
상기 제1채널의 평균 직경은 0.1 내지 1.0 mm이고, 상기 제2채널의 평균 직경은 0.5 내지 1.5mm일 수 있다.
본 발명의 일 구현예로, 제1채널; 상기 제1채널에 인접하여 하나 이상의 미세홀을 통해 각각 연결되고, 신경줄기세포를 배양하기 위한 제2채널 및 별도 장기 세포를 배양하기 위한 제2-1 채널; 및 상기 제1채널 양 말단에 연결되고, 배양액을 포함하는 챔버를 포함하는 뇌혈관-별도 장기 모사용 복합 미세유체 디바이스를 제공한다.
본 발명의 다른 구현예로, 상기 디바이스; 및 상기 디바이스의 기울기를 제어하는 수단을 포함하는 혈액뇌관문 모사 시스템을 제공한다.
상기 기울기를 제어하는 수단은 상기 디바이스 하단에 위치하는 시린지 펌프일 수 있다.
상기 기울기를 제어하는 수단은 상기 제1채널의 배양액에 단방향 흐름성을 제공할 수 있다.
상기 디바이스에서 상기 제2채널 또는 상기 제2-1채널이 상기 제1채널 하단에 위치할 수 있다.
본 발명의 시스템은 실제 인간 혈액뇌관문이 가지는 구조와 기능을 더욱 효율적으로 모사하므로 혈액뇌관문을 표적으로 하거나 투과할 수 있는 다양한 약물을 발굴할 수 있는 인비트로 모델 시스템으로서 활용될 수 있다.
본 발명의 시스템은 종래 미세유체 칩에서 동적 배양을 위해 외부 장치 연결이 요구되는 것과 달리 장치의 세팅 및 사용이 간편하므로 사용자 편의성이 현저히 증대될 수 있다.
본 발명의 시스템은 스크리닝에 있어 중요한 요소인 대량 생산 플랫폼을 구축할 수 있으므로 약물 개발의 효율을 증진시키고, 개발 비용은 현저히 절감시킬 수 있다.
본 발명의 시스템은 약물의 혈관 투과율 및 신경세포에 끼치는 영향 등 다양한 현상에 대한 실시간 모니터링을 가능하게 하므로 약물 개발의 성공률을 현저히 증대시킬 수 있다.
도 1은 hNVU 칩의 고안 및 치수를 나타낸 것이다. hNVU 칩에 대한 미세유체 장치의 (a) 고안 및 치수 및 (b) 사진.
도 2는 다중 장기 hNVU 칩의 고안 및 치수를 나타낸 것이다. 다중 장기 hNVU 칩에 대한 미세유체 장치의 (a) 고안 및 치수 및 (b) 사진.
도 3은 동적 배양 및 전단 응력 시뮬레이션을 위한 배지 흐름을 생성하기 위한 실험 설정을 나타낸 것이다. (a) hNVU 칩에 대한 동적 배양 설정의 구성. 유체가 시린지 펌프 상에 시린지의 한쌍에 연결된 시린지를 통해 밀어질 때, hNVU 칩을 포함하는 박스는 기울어지고, 이는 칩에서 배지 흐름을 생성하기 위해 요구되는 배지 수준 차이를 발생시킨다. (b) EC 단층의 3D 공초점 이미지의 단면(CD31, 녹색). 스케일바는 20 μm를 나타낸다. (c) COMSOL Multiphysics® 소프트웨어를 사용한 전단 응력의 시뮬레이션. EC 단층 3D 구조는 (b)에 도시된 3D 공초점 이미지로부터 추정된다. 그래프 상에 별표는 각 시점에서 EC 층에 적용된 최대 전단 응력을 나타낸다.
도 4는 hNVU 칩에서 곰팡이 침투 및 신경친화성의 정량화를 위한 이미지 기반 분석을 나타낸 것이다. (a) 곰팡이 침입 측정 분석. hNVU 칩에서 형성된 EC 장벽 무결성을 곰팡이 접종 전에 FITC-덱스트란으로 시험하였다. FITC 신호의 형광 영역을 사용하여 CFW로 표지된 곰팡이 침입 영역의 정량화를 위한 EC 층의 경계를 결정하였다. (b) 동일한 크기의 (A) 뇌 및 (B) 간 이미지에서 CFW-양성 형광 영역을 정량화하기 위한 신경친화성 측정 분석. 이미지 분석은 Image J 소프트웨어로 처리되었다.
도 5는 3D 미세유체 인간 뇌혈관 유닛(hNVU) 칩 연구의 개략도를 나타낸 것이다. (a) 혈액뇌관문(BBB)을 가진 hNVU-모사 칩의 개략도. (b) hNVU 칩 연구를 위한 세포 시딩 및 배양을 위한 실험적인 타임 라인 및 칩 시스템의 사진.
도 6은 칩에서 미세채널의 표면코팅을 나타낸 것이다. 콜라겐 또는 폴리-L-라이신-콜라겐 이중 코팅으로 처리된 미세채널 상에 EC 부착 및 형태를 3 일째에 비교하였다. 스케일 바는 100 μm를 나타낸다.
도 7은 hNVU 칩을 위한 3D 하이드로겔 조성물의 최적화를 나타낸 것이다. Col 및 카테콜-개질된 히알루론산(HA-CA)의 상이한 농도를 가진 하이드로겔의 광학 이미지는 EC 및 3D NSC 공동 배양을 지지하기 위한 것이다. 최종적으로 Col(3.7 mg/ml) 및 HA-CA(7.1 mg/ml) 조건이 최적화 하이드로겔 조성으로 선택되었다. 스케일 바는 100 μm를 나타낸다.
도 8은 콜라겐 I(Col) 및 뇌 하이브리드 세포외기질(BHEM) 하이드로겔의 특성을 나타낸 것이다. (a) 주파수 스위프 모드에서 Col 및 BHEM 하이드로겔의 유변학적 분석. 흑색 및 백색 상징은 각각 저장 탄성계수 G' 및 손실 탄성계수 G"를 나타낸다. (b) 1Hz에서 평균 탄성 탄성계수(n=3, Col 그룹 대비 ***p <0.001). (c) Col 및 BHEM 하이드로겔의 팽창 및 수축 특성. (d, e) 하이드로 겔의 광표백(FRAP) 분석 후 형광 회수. (d) 표준화된 형광 회수 곡선 및 (e) 70 kDa 플루오레세인 이소티오시아네이트 표지된 덱스트란(FITC-덱스트란) 프로브의 확산 계수. (f) Col 및 BHEM 하이드로겔에서 배양 5일 후 신경 줄기 세포 분화를 정량화하기 위한 정량적 역전사 중합효소 연쇄 반응(qPCR) 분석(n=3, Col 그룹 대비 **p<0.01). (g) hNVU 칩에서 인간 NSC 및 뇌 내피 세포(EC)의 공배양 5 일 후 Col 및 BHEM 하이드로겔의 광학 이미지. (h) hNVU 칩에서 Col 및 BHEM 하이드로겔에서 공배양 5일 후 인간 EC(CD31, 녹색) 및 인간 NSC 유래 성상교세포[아교세포 섬유질 산성 단백질(GFAP), 적색]의 면역염색. 스케일 바는 100 μm를 나타낸다.
도 9는 NSC에 대한 배지 조건의 영향을 나타낸 것이다. 3 가지 상이한 배지 조건[NSC 배지, EC 배지 및 NSC+EC(0.5X) 배지: 0.5X 기본 배지 및 세포 타입 각각에 대한 0.5X 인자] 하에 (a) NSC 분화 마커(Tuj1, GFAP 및 Olig2) 및 (b) EC 마커(P-gp)의 유전자 발현에 대한 qPCR 결과. 세포를 분석 전 5 일 동안 배양하였다(n=3, NSC 배지 대비 ***p <0.001 대, EC 배지 대비 #p<0.05).
도 10은 hNVU 칩 배양을 위한 배지 최적화를 나타낸 것이다. 3 가지 상이한 배지 조건[NSC 배지, NSC+EC(1X) 배지: 0.5X 기본 배지 및 세포 타입 각각에 대한 1X 인자, 및 NSC+EC+PC(1X) 배지: NSC 및 EC에 대한 0.5X 기본 배지이나, 3가지 세포 타입 모두에 대한 1X 인자] 하에 (a) NSC 분화 마커 및 (b) EC 마커의 유전자 발현에 대한 qPCR 결과(n=3, NSC 배지 대비 **p<0.01 및 ***p<0.001, EC 배지 대비 #p<0.05). (c) NSC 분화를 위한 상이한 혈청 농도를 가진 NSC+EC+PC(1X) 배지의 비교(n=3, NSC 배지 대비 *p<0.05, **p <0.01 및 ***p <0.001). 모든 세포를 분석 전 5 일 동안 배양하였다.
도 11은 hNVU 칩에서 NSC 분화를 통한 BBB를 가진 뇌혈관 유닛의 생성을 나타낸 것이다. (a) NSC단독 및 NSC-EC 공배양 그룹 사이에 NSC 분화를 신경세포(Tuj1) 및 성상교세포(GFAP)와 비교하기 위한 qPCR 분석(n=3, NSC 단독 그룹 대비 *p<0.05 및 **p<0.01). (b) EC 층에 대한 근접성에 기반한 NSC 분화 패턴을 조사하기 위한 Tuj1 및 GFAP에 대한 면역염색 및 염색된 이미지 정량(n=3, 생물학적 반복=3). (c) EC 단층(적색 화살표)에서 EC(CD31, 녹색) 주위를 감싸는 주피세포(PC; NG2, 적색)의 공초점 형광 이미지 및 (d) NSC로부터 분화된 GFAP 양성 성상교세포의 혈관종말발 유사 구조. (e) NSC로부터 분화한 GFAP 양성 성상교세포 및 EC 단층(흰색 화살표) 사이에 직접적인 접촉을 나타내는 공초점 이미지. 스케일 바는 100μm(흰색) 및 50 μm(적색)을 나타낸다.
도 12는 hNVU 칩에서 아교세포 분화 및 기저막 증착을 위한 면역염색을 나타낸 것이다. (a) 5 일째 EC 단층(CD31) 상에서 라미닌 침착을 나타내는 면역형광 이미지. (b) hNVU 칩 시스템에서 5 일 배양 후 NSC(희소돌기아교세포 마커: O4, GFAP 마커: GFAP)로부터 분화된 아교세포 계통 세포의 면역형광 염색. 스케일 바는 50 μm를 나타낸다.
도 13은 hNVU 칩에서 BBB 투과도의 특성을 나타낸 것이다. (a) 상이한 칩 조건에서 70 kDa FITC-덱스트란 투과의 시간 경과에 따른 이미지. (b) hNVU 칩에서 3D BHEM 하이드로겔 및 EC 단층 사이에 계면 영역에서 백색 점선을 따라 형광 덱스트란의 분포 및 그 정규화된 형광 강도. (c) 60분에 NSC-EC/흐름 및 NSC-EC-PC/흐름 그룹에서 70 kDa FITC-덱스트란의 투과성 계수(n=3, **p<0.01). 스케일 바는 200 μm를 나타낸다.
도 14는 hNVU 칩에서 BBB의 장벽 기능 및 생리학적 반응을 나타낸 것이다. (a) 상이한 조건 하의 칩에서 EC 단층에서 EC 형태 및 밀착 연접 형성. 흰색 및 적색 화살표는 각각 EC 침범 및 EC 층의 비정상 단위를 나타낸다. hNVU 칩에서 (b) 밀착 연접 마커 ZO-1 및 (c) 다중약물 유출 펌프 P-gp의 유전자 발현(독립적인 hNVU 칩을 나타내는 n= 3, *p<0.05). (d) P-gp 차단제 베라파밀을 사용하여 hNVU 칩에서 BBB의 약물 내성 시험. 축적된 아세토메실 칼세인(calcein AM)의 형광 이미지 정량을 수행하였다(독립적인 hNVU 칩을 나타내는 n= 3, ***p<0.001). (e) 계산된 투과성 계수 변화 및 (f) 20 ng/ml 종양 괴사 인자-알파(TNF-α) 노출 동안 70 kDa FITC-덱스트란의 시간 경과에 따른 이미지(독립적인 hNVU 칩을 나타내는 n= 3). 스케일 바는 50 μm(흰색) 및 100 μm(적색)을 나타낸다.
도 15는 양방향 배지 흐름 조건 하에 hNVU 칩에서 비정상적인 EC 형태 및 BBB의 손상된 장벽 기능을 나타낸 것이다. (a) 5 일째 흐름이 없거나(NSC-EC/흐름 없음) 축 방향 교반기에 의해 생성된 양방향 흐름을 가진(NSC-EC/진동 흐름) NSC-EC 공배양 조건에서 BBB 유닛의 형광 이미지. (b) 진동 흐름 조건 하에 NSC-EC 공배양을 가진 칩에서 EC 장벽을 통한 70 kDa FITC-덱스트란 투과의 시간 경과에 따른 이미지. 스케일 바는 50 μm(빨간색) 및 100 μm(흰색)를 나타낸다.
도 16은 hNVU 칩을 사용한 곰팡이 뇌 감염 모델을 나타낸 것이다. (a) 크립토 코커스 뇌수막염의 개략도 및 곰팡이 감염 모델에 대한 hNVU 칩의 실험적인 설정. (b) hNVU 칩에서 4 개 상이한 곰팡이의 BBB 침투 및 침입(n=5, 기술적인 반복=2-3, 칸디다 글라브라타 감염된 그룹 *p<0.05 및 ***p<0.001). (c) hNVU 칩에서 곰팡이로 접종 1일 후 인간 EC 층(CD31, 적색) 및 칼코플루오르 화이트(CFW)로 표지된 곰팡이의 면역형광 이미지. (d, e) 접종 1 일 후 EC 층을 관통하는 야생형 크립토코커스 네오포르만의 공초점 이미지. 단일 z축 이미지에서 EC를 관통하는 크립토코시[glucuronoxylomannan(GXM), 녹색]. 노란색 화살표는 EC를 관통하는 크립토코시를 나타낸다. (e) GFAP-양성 성상교세포와 상호작용하는 크립토코시(GXM, 녹색)(적색). 흰색 화살표는 NSC유래 성상교세포 및 곰팡이 사이에 직접적인 접촉을 나타낸다. (d) 및 (e)에서 흰색 점선은 EC 층의 추정된 위치를 나타낸다. 스케일 바는 20 μm(노란색), 50 μm(흰색) 및 100 μm(빨간색)을 나타낸다.
도 17은 hNVU 칩에서 곰팡이 거동 및 BBB 투과를 나타낸다. (a) 빈 칩에 주사 된 C. neoformans의 이미지(왼쪽) 및 hNVU 칩에 접종 1일 후 C. neoformans의 이미지(오른쪽). 흰색 화살표는 느린 분할로 인해 큰 크립토코커스를 나타낸다. (b) 뇌 모사 3D 매트릭스 내로 침투하는 GFAP-양성 성상교세포 및 C. neoformans 야생형 세포(GXM)의 상호작용을 보여주는 공초점 이미지. 스케일 바는 100μm (흰색) 및 50μm (빨간색)을 나타낸다.
도 18은 곰팡이 신경친화성 연구를 위한 다중 장기 hNVU 칩 모델을 나타낸 것이다. (a) 크립토코커스성 감염 경로의 개략도. (b) 뇌 및 간 유닛을 가진 다중 장기 hNVU 칩의 예시 및 신경친화성의 정도에 대한 계산 방법. (c) 뇌 및 간 유닛으로 구성된 다중 장기 hNVU 칩에서 곰팡이 신경친화성의 평가. 다중 장기 칩에서 CFW-표지된 곰팡이 세포의 분포 및 신경친화성의 정도의 정량화 (n=5, 기술적인 반복=2-3, C. glabrata 그룹 대비 **p<0.01). (d-f) 간 유닛의 하부면 내로 이노시톨의 보충(0.9 M). (d) 이노시톨 보충이 있는 다중 장기 칩에서 CFW-표지된 야생형 C. neoformans의 개략도 및 대표 이미지. 간 유닛 내로 이노시톨 보충이 있거나 없는 칩에서 (e) 신경친화성 및 (f) 조직 투과의 비교(n=5, 기술적인 반복 = 2-3, *p<0.05 및 **p<0.01). 접종 1일 후 모든 이미지를 촬영하였다. 스케일 바는 500 μm를 나타낸다.
도 19는 3D 간-모사 감염 모델을 나타낸 것이다. 인간 NSC가 인간 간암 세포주(Huh-7)로 대체된 간-모사 모델 내로 주입된 CFW-표지된 C. neoformans의 형광 이미지. 곰팡이 세포를 1일 동안 배양하였다. 스케일 바는 100 μm를 나타낸다.
이하에서는 첨부한 도면을 참조하여 본 발명을 설명하기로 한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며, 따라서 여기에서 설명하는 실시예로 한정되는 것은 아니다. 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성요소를 더 구비할 수 있다는 것을 의미한다.
달리 정의되지 않는 한, 세포 생물학, 분자 생물학, 미생물학, 단백질 정제, 단백질 공학, 및 DNA 서열 분석 및 당업자의 능력 범위 안에서 재조합 DNA 분야에서 흔히 사용되는 통상적인 기술에 의해 수행될 수 있다. 상기 기술들은 당업자에게 알려져 있고, 많은 표준화된 교재 및 참고저서에 기술되어 있다.
본 명세서에 달리 정의되어 있지 않으면, 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 당업계에 통상의 기술자가 통상적으로 이해하는 바와 같은 의미를 가진다.
본 명세서에 포함되는 용어를 포함하는 다양한 과학적 사전이 잘 알려져 있고, 당업계에서 이용가능하다. 본 명세서에 설명된 것과 유사 또는 등가인 임의의 방법 및 물질이 본원의 실행 또는 시험에 사용되는 것으로 발견되나, 몇몇 방법 및 물질이 설명되어 있다. 당업자가 사용하는 맥락에 따라, 다양하게 사용될 수 있기 때문에, 특정 방법학, 프로토콜 및 시약으로 본 발명이 제한되는 것은 아니다. 이하 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.
뇌혈관 모사용 미세유체 디바이스
본 발명의 일 측면에 따르면, 제1채널(101); 상기 제1채널(101)에 인접하여 하나 이상의 미세홀을 통해 연결되고, 신경줄기세포를 포함하는 제2채널(102); 및 상기 제1채널(101) 양 말단에 연결되고, 배양액을 포함하는 챔버(104)를 포함하는 뇌혈관 모사용 미세유체 디바이스(microfluidic device, 100)가 제공된다.
본 발명의 다른 측면에 따르면, 제1채널(101); 상기 제1채널(101)에 인접하여 하나 이상의 미세홀을 통해 각각 연결되고, 신경줄기세포를 배양하기 위한 제2채널(102) 및 별도 장기 세포를 배양하기 위한 제2-1 채널(102'); 및 상기 제1채널(101) 양 말단에 연결되고, 배양액을 포함하는 챔버를 포함하는 뇌혈관-별도 장기 모사용 복합 미세유체 디바이스(complex microfluidic device, 100')가 제공된다.
상기 "미세유체 디바이스(microfluidic device)"는 뇌혈관 모사용 미세유체 디바이스로서, 인간 혈관내피세포와 뇌 조직을 모사하는 삼차원 하이드로겔 매트릭스에서 인간 신경줄기세포를 삼차원 공배양 하여 혈액뇌관문(Blood-Brain-Barrier)을 효율적으로 모사할 수 있다. 또한, "복합 미세유체 디바이스(complex microfluidic device)"는 상기 뇌혈관 모사용 미세유체 디바이스와 별도 장기 모사용 미세유체 디바이스가 통합된 구조로서, 이때, 별도 장기라 함은 뇌혈관 외에 간, 폐, 장, 신장, 심장 등 다양한 인체 장기를 말한다.
상기 "혈액뇌관문"은 뇌를 보호하기 위한 혈관 장벽으로 다른 혈관에 비해 현저히 낮은 투과율을 가지고 있으며, 투과 메커니즘이 명확하지 않아 뇌질환치료 신약 개발을 위한 효율적인 모델이 필수적으로 요구되는데, 상기 뇌질환치료 신약 개발을 위한 동물 대체 모델로서 활용될 수 있다.
상기 혈액뇌관문의 기능을 구현함에 있어 가장 중요한 요소로서 뇌혈관내피세포의 밀착 연접(tight junction) 및 성상교세포(astrocyte)가 돌기를 형성해 혈관내피세포와 접촉하는 성상교세포 혈관종말발 구조가 있으며, 상기 디바이스는 상기 혈액뇌관문 특이적 세포 구성 및 구조를 효과적으로 구현할 수 있다.
특히, 종래 미세유체칩을 활용한 동적 배양 시스템들은 각각의 칩에 유체 컨트롤러를 연결해야 했으나, 상기 디바이스는 열린 채널 구조의 칩 내에 낙차를 통한 정밀한 배양액 흐름을 제공함으로써 동적 배양이 가능하다.
상기 "미세유체"는 이동 유체가 10mm 이하(미세규모) 직경의 채널 안에 갇혀 있거나, 상기 채널을 통해 안내되는 구성 요소일 수 있다.
상기 미세유체 채널은 비록 채널이 적어도 하나의 방향으로는 미세규모일 수 있으나, 하나 이상의 방향으로 미세규모보다 더 클 수 있다. 또한, 일 실시예에서, 상기 미세유체 채널의 기하학적 구조는 채널을 통과하는 유체의 유량을 제어할 수 있도록 구성될 수 있다.
상기 미세유체 채널은 넓은 범위의 유량으로 채널을 통과할 수 있도록 이를 촉진시키는 다양한 기하학적 구조로 형성될 수 있다.
상기 디바이스는 폴리디메틸실록산(poly(dimethylsiloxane); PDMS), 폴리메틸메타클릴레이트(polymethylmethacrylate; PMMA), 폴리아크리레이트(polyacrylates), 폴리카보네이트(polycarbonates), 폴리시클릭 올레핀(polycyclic olefins), 폴리이미드(polyimides), 폴리우레탄(polyurethanes), 유리, 실리콘, 석영 등 다양한 소재로 구성될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 "제1채널"은 뇌혈관을 모사하는 미세유체 채널로 상기 제1채널(101) 양 말단에 배양액을 포함하는 챔버(104)가 연결될 수 있다.
상기 챔버(104)는 열린 구조로서 배양액을 저장하고 있으며, 상기 제1채널(101)과 연결되어 있으므로 상기 디바이스 기울기를 제어함으로써 정밀하게 배양액을 형성할 수 있다.
상기 "배양액(culture medium)"은 세포에 대한 배양 배지인 동시에 영양분이나 산소 등의 전송 배지이다. 상기 배양액은 세포에 필요한 영양분이나 산소 등을 공급하고 노폐물을 제거할 수 있으며, 상기 디바이스에서 상기 배양액은 실제 뇌혈관의 혈류를 모사할 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 배양액은 EGM-2 기본 배지 및 DMEM/F12 기본 배지가 혼합된 배지일 수 있고, EGM-2 기본 배지 및 DMEM/F12 기본 배지가 2:1 내지 1:2의 중량비로 혼합된 배지인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 또한, 상기 혼합된 배지에 N-2 보충물, EGM-2 보충물, 주피세포 성장 보충물 및 0.5% 내지 3%(바람직하게는, 1% 내지 2%) FBS가 주요인자로 첨가될 수 있다.
상기 제2채널(102)은 상기 제1채널(101)에 인접하여 하나 이상의 미세홀을 통해 연결되고, 신경줄기세포를 포함할 수 있다.
상기 "신경줄기세포(neural stem cell; NSC)"는 자기 재생산(self-renewal)이 가능하고 신경계통 세포로 분화하는 능력을 가진 세포로서 신경세포(neuron), 성상교세포(astrocyte), 희소돌기아교세포(oligodendrocyte)로 분화될 수 있다.
상기 "줄기세포"는 자기 복제 능력을 가지면서 다양한 종류의 새로운 세포로 분화하는 능력을 갖는 세포를 의미하며, 분화능에 따라 만능 줄기세포(totipotent stem cell), 전분화능 줄기세포(pluripotent stem cells), 다분화능 줄기세포(multipotent stem cells)로 분류할 수 있고, 줄기세포의 유래 조직에 따라 성체줄기세포, 배아 줄기세포 및 역분화 줄기세포로 분류될 수 있다.
상기 "제2채널"은 상기 제1채널(101)에 인접하고 생체의 뇌 조직을 모사하는 미세유체 채널로서, 상기 제1채널(101) 및 제2채널(102) 간 투과성을 모사할 수 있으며, 상기 하나 이상의 "미세홀"은 상기 제1채널(101) 및 제2채널(102)을 연결하는 형태로 상기 제1채널(101) 및 제2채널(102) 간 투과성이나 물질의 이동, 교환 현상 등을 재현할 수 있다.
상기 제1채널(101)의 평균 직경은 0.1 내지 1.0 mm이고, 상기 제2채널(102)의 평균 직경은 0.5 내지 1.5 mm일 수 있다.
상기 제1채널(101) 및 제2채널(102)의 직경은 필요에 따라 달리할 수 있으나, 상대적으로 뇌조직 대비 좁은 혈관의 직경을 고려하여 상기 제2채널(102)의 직경을 상기 제1채널(101)의 직경보다 크게 할 수 있다.
상기 디바이스는 상기 제1채널(101) 내측 표면에 부착 배양된 내피세포 및 주피세포를 더 포함할 수 있다. 이때, 상기 제1채널(101) 내측 표면은 폴리-L-라이신 및 콜라겐으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함하는 코팅액으로 코팅될 수 있고, 바람직하게, 폴리-L-라이신 및 콜라겐을 포함하는 코팅액으로 이중 코팅될 수 있어, 효율적인 내피세포 단층 형성을 촉진시킬 수 있다.
상기 "내피세포"는 바람직하게는 뇌혈관내피세포일 수 있고, 임의적으로, 성상세포, 임의적으로, 뉴런 및 임의적으로, 혈관주위세포를 상기 세포가 혈액 뇌장벽(BBB) 또는 척수의 하나 이상의 구조적 또는 기능적 특징(예컨대, 치밀 연접)을 모방하는 조건하에 디바이스에서 배양될 수 있다.
상기 "주피세포(Pericyte)"는 내피세포와 접착함으로써 내피세포의 분화나 억제에 영향을 미치며, 다양한 분화능력을 통해 전구세포로의 역할을 수행하므로 혈관의 발생, 안정화, 성숙 및 리모델링에 중요한 조절자로 인식되고 있으며, 혈관 질환의 원인과 치료법을 연구하는데 있어 중요한 타깃으로 여겨지고 있다.
상기 뇌혈관내피세포는 채널 표면에 단일층을 이루는 형태로 부착 배양될 수 있으며, 상기 내피세포 하단에는 주피세포가 별개의 층을 이루며 부착 배양되어 실제 생체 내 혈관내피조직을 모사할 수 있다.
상기 제2채널(102)은 상기 신경줄기세포를 3차원 배양하기 위한 하이드로겔을 포함할 수 있다.
상기 배양은 적합한 조건에서 세포를 유지 및 성장시키는 과정을 의미하며, 적합한 조건은 예컨대, 세포가 유지되는 온도, 영양소 가용성, 대기 CO2 함량 및 세포 밀도를 의미할 수 있으며, 서로 다른 유형의 세포를 유지, 증식, 확대 및 분화시키기 위한 적절한 배양 조건은 당해 기술분야에 공지되어 있고, 문서화 되어있다.
상기 "하이드로겔(hydrogel)"은 졸-겔 상변이를 통해 물을 분산매로 하는 액체가 굳어 유동성을 상실하고 다공성 구조를 이루는 물질로서, 3차원 망목 구조와 미결정 구조를 갖는 친수성 고분자가 물을 함유하여 팽창함으로써 형성될 수 있다.
상기 "3차원 배양(three-dimensional culture)"은 세포가 평편한 플레이트의 2차원적인 환경에 적응하는 과정을 배제하여 실제 조직과 유사한 환경을 제공하며, 생체 내 세포 성장, 분화 및 기능을 유도할 수 있다.
상기 3차원 배양은 인비트로 환경에서 실제 인비보 조직 환경을 효율적으로 모방하며 결과의 확실성, 실험의 안정성 및 타당성을 향상시킬 수 있다.
상기 하이드로겔은 콜라겐 및 가교 또는 미가교 히알루론산을 포함할 수 있다.
상기 가교 또는 미가교 히알루론산은 상기 하이드로겔의 물성(탄성계수)을 현저히 증대시킬 수 있으며, 실제 뇌조직과 물성이 유사하므로 혈액뇌관문(Blood-Brain-Barrier)을 더욱 효율적으로 모사할 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 가교 히알루론산은 히알루론산을 카테콜기(catechol)를 포함하는 물질과 반응시킴으로써 히알루론산에 카테콜기를 수식할 수 있다. 이때, 상기 히알루론산에 대하여, 상기 카테콜기를 포함하는 물질의 몰비는 2% 내지 7%일 수 있다. 예컨대, 히알루론산을 도파(dopa), 도파민(dopamine), 노르에피네프린(norepinephrine), 리토스퍼믹에시드(lithospermic acid), 카페인산(caffeic acid), 로즈마리산(rosmarinic acid), 살비아놀산(salvianolic acid) 및 갈산(gallic acid)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상과 반응시킬 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 하이드로겔 내 상기 콜라겐의 농도는 3.0 mg/ml 내지 5.0 mg/ml, 바람직하게, 3.5 mg/ml 내지 4.5 mg/ml일 수 있고, 상기 하이드로겔 내 상기 가교 또는 미가교 히알루론산의 농도는 1.0 mg/ml 내지 10.0 mg/ml, 바람직하게, 6.0 mg/ml 내지 8.0 mg/ml일 수 있다.
이로써, 0.1 Hz 내지 10 Hz 의 주파수 범위에서, 상기 하이드로겔의 저장 탄성계수는 200 Pa 내지 500 Pa, 바람직하게, 200 Pa 내지 500 Pa로 높은 수준을 유지할 수 있다. 또한, 상기 하이드로겔의 하기 수학식 1로 표시되는 팽창비가 50% 내지 150%, 바람직하게, 100% 내지 150%로 높은 수준을 유지할 수 있다:
[수학식 1]
Figure PCTKR2019012135-appb-I000002
이때, Wi 및 Ws는 배양 전 건조 중량 및 37℃에서 PBS로 3 일 동안 배양한 후 하이드로겔의 습윤 중량을 각각 나타낸다.
일 실시예에 있어서, 상기 디바이스(100 또는 100')는 상기 제2채널(102)에 인접하는 제3채널(103)을 더 포함할 수 있다.
상기 제3채널(103)은 필요에 따라 약물이나 영양분 등 다양한 물질을 제2채널(102)로 공급할 수 있으며, 상기 제2채널(102) 및 제3채널(103) 간 물질의 교환이 가능하도록 투과성을 제공하는 하나 이상의 미세홀이 형성될 수 있다.
한편, 상기 다바이스(100 또는 100')가 복합 디바이스(100')인 경우, 상기 제2-1채널(102')에 인접하는 제3-1채널(103')을 더 포함할 수 있다.
상기 제3-1채널(103') 역시 필요에 따라 약물이나 영양분 등 다양한 물질을 제2-1채널(102')로 공급할 수 있으며, 마찬가지로, 상기 제2-1채널(102') 및 제3-1채널(103') 간 물질의 교환이 가능하도록 투과성을 제공하는 하나 이상의 미세홀이 형성될 수 있다.
혈액뇌관문 모사 시스템
본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 상기 디바이스(100 또는 100'); 및 상기 디바이스의 기울기를 제어하는 수단(200)을 포함하는 혈액뇌관문 모사 시스템이 제공된다.
상기 디바이스(100 또는 100')는 열린 구조의 챔버(104)를 포함하며, 상기 챔버(104)에 저장된 배양액은 경사를 통해 원하는 방향으로 단방향 흐름성이 부여될 수 있으므로 상기 디바이스의 배치나 고정 형태를 고려하여 상기 디바이스의 기울기를 제어할 수 있다.
상기 혈액뇌관문 모사 시스템은 종래와 달리 각각의 디바이스 또는 칩의 유체를 제어하는 컨트롤러가 불필요하며, 단순히 디바이스의 기울기 제어를 통해 낙차를 형성함으로써 유체의 흐름을 제공할 수 있다.
상기 디바이스의 기울기를 제어하는 수단(200)은 상기 디바이스(100 또는 100')의 낙차를 일정하게 유지하거나, 시간에 비례하여 정밀하게 조정할 수 있으면 특별히 제한되지 않으나, 바람직하게는 상기 디바이스 하단에 위치하는 시린지 펌프일 수 있다.
상기 시린지 펌프는 유체의 흡입 및 배출의 구분된 두 개 동작으로 이루어진 구동 사이클(cycle)을 나타낼 수 있으며, 상기 시린지 펌프는 유체의 양을 정밀 제어하는 용도로 사용될 수 있다.
상기 시린지 펌프는 시린지 실린더, 및 소정의 구동수단에 의해 시린지 실린더의 내부에 삽입된 상태로 직선왕복 운동하는 막대 피스톤의 플런저(plunger)를 포함할 수 있고, 상기 플런저의 직선 왕복운동을 통해 시린지 실린더로 유체의 흡입 및 배출하는 동작을 수행할 수 있다.
구체적으로, 상기 디바이스에서 상기 제2채널(102) 또는 상기 제2-1채널(102')이 상기 제1채널(101) 하단에 위치할 수 있다.
상기 디바이스(100 또는 100')는 수평 또는 수직으로 배치될 수 있으나, 상기 제2채널(102) 또는 상기 제2-1채널(102')이 상기 제1채널(101) 하단에 위치하도록 수직 형태로 배치하는 경우에는 더욱 용이하게 시스템을 운용할 수 있으며, 특히 상기 디바이스의 기울기 변화에도 불구하고 챔버(104)에 저장된 배양액의 넘침(overflow) 현상이 최소화될 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 혈액뇌관문 모사 시스템은 하나 이상의 상기 디바이스(100 또는 100'); 하나 이상의 상기 디바이스를 지지하는 지지체(300); 및 상기 지지체(300) 하단에 위치하는 시린지 펌프를 포함할 수 있다.
상기 지지체(300)는 하나 이상의 디바이스를 배열 또는 배치할 수 있으면 족하며, 예컨대, 평평한 플레이트(plate) 또는 박스 형태의 하우징일 수 있으나, 평면적인 특성을 통해 하나 이상의 디바이스가 안정적으로 지지될 수 있으면 그 형태, 크기, 소재가 특별히 제한되는 것은 아니다.
특히, 상기 혈액뇌관문 모사 시스템은 하나 이상의 디바이스(100 또는 100')를 탑재할 수 있으며, 상기 디바이스의 기울기를 일괄적으로 제어하므로 다수의 디바이스(100 또는 100')에 균일하게 동적 흐름(flow)을 부여할 수 있을 뿐만 아니라, 이는 단일 시린지 펌프에 의해 구현될 수 있으므로 배양 효율 및 사용 편의성이 극대화될 수 있다.
이하 실시예를 통해, 본 발명을 더욱 상술하나 하기 실시예에 의해 본 발명이 제한되지 아니함은 자명하다.
[실시예]
세포 배양
임신 13주에 인간 태아 뇌로부터 인간 태아 NSC를 분리하였다(프로토콜 # 4-2003-0078). N-2 보충물(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)을 첨가한 둘베코 수정 이글 배지/영양 혼합물 F-12(DMEM/F12) 배지(Gibco BRL, Gaithersburg, MD, USA)에서 NSC(계대 17-23)을 배양하였다. 확장을 위해, 배양 배지에 기본 섬유아세포 성장 인자(30 ng/ml, PeproTech, Rocky Hill, NJ, USA) 및 백혈병 억제 인자(10 ng/ml, Merck Millipore, Darmstadt, Germany)를 첨가하였다. 150 ㎍/ ml Col-코팅된 플라스크 상에 내피 성장 배지(EGMTM-2 SingleQuotsTM; Lonza, Verviers, Belgium)에서 인간 대뇌 미세혈관 내피 세포(hCMEC/D3; Cedarlane, Ontario, Canada)를 배양하였다. 2% FBS, 1% 페니실린-스트렙토마이신 및 PC 성장 보충물(ScienCell Research Laboratories)를 함유하는 주피세포 배지(ScienCell Research Laboratories)에서 인간 뇌 미세혈관 주피세포(HBVP; ScienCell Research Laboratories, Carlsbad, CA, USA)를 배양하였다. 세포 시딩 전에 HBVP 배양용 세포 배양 플라스크를 20 ㎍/ml PLL 용액(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)으로 코팅하였다. 모든 실험에 계대 27-32 사이 hCMEC/D3 세포 및 계대 2-10 사이 HBVP 세포를 사용하였다. 37℃에서 5% CO2를 가진 가습 인큐베이터에서 세포를 배양하였다.
Col 및 BHEM 하이드로겔의 제조
이전에 서술된 바에 따라, Col(Corning Inc., Corning, NY, USA)을 사용하여 준비하고, 37℃에서 30분 동안 인큐베이션에 의해 가교시켜 Col 하이드로겔(4.4 mg /ml의 최종 농도, pH 7.4, 1X PBS)을 제조하였다. 이전에 서술된 바에 따라, HA-CA 접합체를 합성하였다. 1%(w/v)의 농도로 증류수에 용해시키고, 30분 동안 HA에 대해 동일한 비율로 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카보디이미드(TCI Co., Tokyo, Japan) 및 N-하이드록시설포석신이미드(Sigma-Aldrich)로 처리하여 HA(MW 200 kDa, Lifecore Biomedical, Chaska, MN, USA)를 제조하였다. 그다음, HA에 대해 동일한 몰비로 반응 용액에 도파민 하이드로클로라이드(Sigma-Aldrich)를 첨가하였다. 혼합물의 밤새 반응 동안 도파민 산화를 방지하기 위해 용액의 pH를 5.0으로 유지하였다. 반복된 투석[1X PBS (pH 5.0, Biosesang, Seongnam, Korea)에 대해 6 시간 동안 각각 4 번 및 증류수에 대해 4 시간 동안 1 번]에 의해 미반응 도파민 하이드로클로라이드를 제거하였다. 최종 용액을 냉동 및 동결건조하였다. 산화제(NaIO4, 0.5 mg/ml의 최종 농도)를 함유하는 Col(3.7 mg/ml의 최종 농도) 및 HA-CA(7.1 mg/ml의 최종 농도) 용액을 혼합함으로써 BHEM 하이드로겔을 준비하였다.
하이드로겔의 특성
0.5% 일정 변형률에서 주파수 스위프 모드(0.1 내지 10Hz)로 회전 레오미터 (MCR102; Anton Paar, Ashland, VA, USA)를 사용하여 Col 및 BHEM 하이드로겔의 유동학적 특성을 측정하였다. 하이드로겔(각각 n = 4, 부피 = 50 μl)을 완전히 가교시키고 기판 상에 로딩하였다. 탄성계수를 측정하기 위해 250 μm의 갭 크기를 가진 편평한 프로브(직경 = 25 mm)를 사용하여 하이드로겔을 가압하였다. 3 일 동안 37℃에서 PBS(Sigma Aldrich)에서 하이드로겔 구조물을 배양함으로써 Col 및 BHEM 하이드로겔의 팽윤 및 수축 특성을 결정하였다. 인큐베이션 동안 여러 시점에서 하이드로겔 상에 과도한 물을 제거한 후에 하이드로겔의 습윤 중량을 측정하였다. 식 (1)에 의해 팽창비를 계산하였고, 이때, Wi 및 Ws는 배양 전 건조 중량 및 37℃에서 PBS로 배양한 후 하이드로겔의 습윤 중량을 각각 나타낸다.
Figure PCTKR2019012135-appb-I000003
(1)
FITC-덱스트란 프로브의 확산 계수를 측정하기 위해 광표백(FRAP) 분석 후 형광 회수를 수행하였다. 하이드로겔 샘플을 대조군으로 작용하는 PBS와 함께 바닥에 유리 커버슬립을 가진 PDMS 칩에 두었다. 20X 배율 대물 렌즈를 가진 레이저 스캐닝 공초점 현미경(LSM 880, Carl Zeiss, Jena, Germany) 및 100% 출력으로 488 nm 방출로 설정된 레이저를 사용하여 광표백을 유도하였다. 겔 구조물에 걸친 균일한 확산을 위해, 하이드로겔을 FRAP 실험 전에 24 시간 동안 PBS 내 0.5 ㎎/㎖ 70 kDa FITC-덱스트란(Sigma Aldrich) 용액과 함께 인큐베이션하였다. 표백 영역은 낮은 레이저 강도(1%)로 스캔되었던 표백 후 형광 회복의 10개 예비-표백 이미지 및 150개 이미지(총 약 150 초)로 모니터링되었다. 정규화된 형광 회복 곡선인 f(t)는 식 (2) 및 (3)에 따라 계산되었고, 여기서 F(t), R, Fin, F∞ 및 F0는 각각 광표백 후의 형광 강도, 이동 진영, 광표백 전에 배경 형광 강도, 실험 종료시 회수된 형광 강도 및 표백 직후의 형광 강도를 나타낸다.
Figure PCTKR2019012135-appb-I000004
(2)
Figure PCTKR2019012135-appb-I000005
(3)
하이드로겔에서 FITC-덱스트란의 확산계수(D)는 식 (2)를 식 (4)와 피팅하여 얻었고, 식 (5)에 따라 계산되었으며, 여기서 b, τD 및 ω는 각각 표백 파라미터, 특성 확산 시간 및 57.5 μm에서 Gaussian bleached spotset을 나타낸다.
Figure PCTKR2019012135-appb-I000006
(4)
Figure PCTKR2019012135-appb-I000007
(5)
미세유체 장치의 제작
전술한 바와 같이, 표준 소프트 리소그래피 공정에 의해 PDMS로 미세유체 장치를 제조하였다. PDMS 프리-폴리머(Sylgard 184; Dow Corning, Midland, MI, USA)를 1:10(w/w) 비로 경화제와 혼합하였고, 실리콘 웨이퍼 몰드에 부었다. 정렬된 미세채널을 패터닝하는 PDMS 층은 작은 포스트 사이의 갭에 의해 연결되었다. 그 다음, 몰드를 5분 동안 진공 챔버에서 탈기시킨 후 4시간 동안 60℃의 건조 오븐에서 경화시켰다. PDMS가 완전히 가교된 후, 몰드로부터 박리시키고, 입구, 출구 및 배지 챔버를 형성하기 위해 펀칭하였다. 오토 클레이빙에 의해 PDMS 유닛 및 커버 슬립(24mm x 32mm; Marienfeld, Lauda-Koenigshofen, Germany)을 멸균하였고, 조립 전에 자외선 하에 완전히 건조시켰다. PDMS 유닛을 커버 슬립과 결합하기 위해 산소 플라즈마 처리(CUTE; Femto Science, Seoul, Korea)를 적용하였다. 그 다음, 조립된 장치를 60℃의 건조 오븐에 두었다. 제작된 칩의 그림, 고안 및 치수는 도 1 및 2에 나타내었다.
hNVU 칩 시스템의 제조
hNVU 칩을 제조하기 위해, 미세유체 장치의 미세채널을 20 ㎍/ml PLL 용액으로 코팅하여 채널 벽 상에 하이드로겔 및 세포의 접착력을 향상시켰다. 4.5 mg/ml Col 용액을 사용하여 Col 하이드로 겔을 제조하였다. NSC를 3.33 Х 107 cells/ml의 세포 밀도로 Col 및 BHEM 하이드로겔 용액에 캡슐화하고 중심 채널에 투여하고, 인큐베이션 하여 하이드로젤을 가교시켰다(37℃, 20 분). EC 부착을 향상시키기 위해 상부 채널을 5 mg/ml 콜라겐 용액으로 추가로 코팅하였고, 추가 20 분 동안 배양하였다. N-2 보충물을 가진 DMEM/F12 배지를 측면 채널에 투여하였고 장치를 CO2 인큐베이터에서 배양하였다. 3D 하이드로 겔에서 NSC의 배양 1일 후, HBVP 세포 및 hCMEC/D3 세포를 각각 1 X 107 cells/ml 및 1 X 106 cells/ml의 세포 밀도로 상부 채널에 순차적으로 시딩하였다. NSC, EC 및 PC의 3 중 공배양에 최적화된 배지 조건을 실험에 사용하였고, 이는 다음과 같았다: N-2 보충물, EGMTM-2 SingleQuotsTM 보충물, PC 성장 보충물 및 1% FBS로 보충된 DMEM/F12 배지 및 EBM-2 배지(Lonza)의 1:1 혼합물. EC 층에 제공된 최대 전단 응력은 배양 시간에 걸쳐 점차 증가하였다. 중간 파라미터 값은 도 3c에 나열된다.
면역조직화학
hNVU 칩 내 세포를 30분 동안 2% 파라포름알데하이드(Sigma-Aldrich)로 고정시키고 30분 동안 0.05% Triton X-100(Sigma-Aldrich)으로 투과시켰다. 5% 소 혈청 알부민(Wako, Osaka, Japan)으로 세척 및 차단한 후, 샘플을 2일 동안 4℃에서 1 차 항체와 함께 인큐베이션한 후, 6시간 이상 동안 PBS 세척을 수행하였다. 그 다음, 샘플을 1일 동안 4℃에서 Alexa Fluor 488(Invitrogen) 또는 Alexa Fluor 594 (Invitrogen)-태그된 2 차 항체와 함께 인큐베이션한 후, 6시간 이상 동안 PBS 세척을 수행하였다. 핵을 4',6-디아미디노-2-페닐인돌(DAPI, Tokyo Chemical Industry Co., Ltd., Tokyo, Japan)로 대조 염색하였다. 본 발명에서 사용된 1차 항체는 다음과 같다: 항-CD31(1:200, Millipore, Billerica, MA, USA), 항-Tuj1(1:150, Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA), 항-GFAP(1:200, Millipore), 항-O4(1:500, Millipore), 항-NG2(1:100, Abcam, Cambridge, UK), 항-ZO-1(1:100, Invitrogen) 및 항-glucuronoxylomannan(anti-GXM, 1:500, 18B7 mouse monoclonal antibody donated by Dr. Arturo Casadevall in Johns Hopkins University).
정량 역전사 중합 효소 연쇄 반응(qPCR)
그룹 간의 상대적인 유전자 발현 수준을 비교하기 위해, RNeasy 미니 키트 (Qiagen, Chatsworth, CA, USA)를 사용하여 각 샘플(n = 3, 기술 반복 = 그룹당 3)로부터 총 RNA를 수집하였고, 제조사의 지시에 따라 cDNA 합성 키트(Takara, Shiga, Japan)를 이용하여 상보적 데옥시리보핵산(cDNA)을 합성하였다. StepOnePlus Real-Time PCR 시스템(Applied Biosystems) 상에 TaqMan 유전자 발현 어세이 및 TaqMan 패스트 유니버셜 PCR 마스터 믹스(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)로 qPCR 분석을 수행하였다. 인간 NSC에서 유전자 발현 분석을 위해 nestin(Hs00707120_s1), Tuj1(Hs00801390_s1), GFAP(Hs00909238_g1), Olig2(Hs00300164_s1) 및 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase(GAPDH; Hs02758991_g1)에 대한 인간-특이적 프라이머를 가진 TaqMan 유전자 발현 어세이를 사용하였다. EC 층으로부터 거리에 의존하는 NSC 분화 성향 분석에 마우스 NSC가 사용됨에 따라, 이러한 샘플을 위해 Tuj1(Mm00727586_s1), GFAP(Mm01253034_m1) 및 GAPDH(Mm99999915_g1)에 대한 마우스-특이적 마우스를 사용하였다. 인간 뇌 EC에서 유전자 발현 분석을 위해 CD31(Hs00169777_m1), ZO-1(Hs01551861_m1) 및 P-gp(Hs00184500_m1)에 대한 인간 EC-특이적 프라이머를 사용하였다. 각각 표적 유전자의 발현 수준을 내인성 기준 GAPDH의 발현 수준으로 정규화시켰다. 비교 Ct 방법을 사용하여 상대적인 유전자 발현 수준을 결정하였다.
장벽 투과성의 정량화
BBB 투과성을 평가하기 위해, hNVU 칩을 기판 상에 수평으로 두었고, EC 및 배지 채널 모두를 표면 수준에 맞추기 위해 PBS로 채워 3D 매트릭스에 적용된 압력을 균일화하였다. FITC-덱스트란(70 kDa) 또는 PBS를 100 ㎕/h의 유속으로 두 채널 모두에 흘렸다. 혈관 투과성은 기준 방법에 따라 EC 장벽을 가로지르는 용질의 유속으로 평가되었다. EC 층을 관통하는 70 kDa FITC-덱스트란의 양은 질량 보존법에 따라 NSC-함유 3D 하이드로겔 영역에서 축적된 FITC-덱스트란과 동일하다. 혈관 장벽 투과성(Pv)은 Image J 소프트웨어에 의해 계산된 식 (6)에 따라, 2개 상이한 시점 t1 및 t2에서 혈관(Iv) 및 조직(NSC 겔, IT)의 평균 강도를 사용하여 유도되었다. Δt, V 및 Asurface는 각각 3D 공초점 이미지에서 hNVU 칩에서 EC 층의 평균 형태에 의해 근사되고 선택된 관심 영역에서 2개 이미지 사이의 시간, NSC 겔 부피, 및 EC 층의 표면적을 나타낸다.
Figure PCTKR2019012135-appb-I000008
(6)
유출 펌프 효율 시험
뇌 미세혈관 EC에서 발현된 유출 펌프인 P-gp의 기능성을 측정하기 위해, 다중 약물 내성(MDR) 분석을 수행하였다. EC-시드 채널을 먼저 30 분 동안 100 μg/ml P-gp 억제제 베라파밀(99.9%, Acros Organics, Morris Plains, NJ, USA) 또는 대조군으로 PBS 단독으로 처리한 후, PBS로 세척한 다음, 30 분 동안 1 μM 칼세인 AM (Invitrogen)으로 인큐베이션하였다. LSM 880 공초점 현미경을 사용하여, 전체 채널의 형광 이미지를 z-축을 따라 포착하였고, z-축 이미지의 중심 층을 형광 강도에 대해 정량화하였다. EC 층의 단면을 포함하는 동일한 영역을 칼세인 AM의 세포 흡수를 측정하기 위한 관심 영역으로 설정하였다. 공초점 현미경에 대한 레이저 강도 및 이득 값은 모든 샘플에 대해 동일하도록 조정되었다.
자극 분석
미세유체 장치에서 생성된 흐름의 효과를 보여주기 위해 계산 모델을 개발하였다. 세부 인자 및 경계 조건은 도 3c에 나타내었다. COMSOL Multiphysics 소프트웨어(COMSOL Inc., Burlington, MA, USA)에서 상업용 유한 요소 해결을 이용하여 본 발명에서 모든 시뮬레이션을 수행하였다.
곰팡이 균주 준비
효모 추출물-펩톤 덱스트로스(YPD) 배지 상에서 Cryptococcus neoformans H99, Cryptococcus neoformans mpr1D 변이체, Cryptococcus deuterogattii R265 및 Candida glabrata BG2 균주를 배양 및 유지시켰다. 균주 각각을 16 시간 동안 30℃에서 액체 YPD 배지에 접종하였고 증류수로 세척하였다. 미세유체 칩 내로 접종을 위해, 세포 수를 혈구계로 계수하고 PBS에서 5 Х 106 cells/ ml로 조정하였다.
곰팡이 BBB 침입 어세이
칩 완전성의 검증 후, 곰팡이 세포 각각의 60 ㎕(PBS 내 5 X 106 cells/ml)를 EGMTM-2 SingleQuotsTM의 동일한 부피에 현탁시켰다. 총 120 ㎕ 샘플을 hNVU 칩의 상부 채널(혈관 측, 최종 3 X 105 cells/chip) 내로 접종하였다. 곰팡이 BBB 침입을 가시화하기 위해, 곰팡이 세포를 30분 동안 PBS에서 2% CFW(Sigma-Aldrich)와 함께 사전배양하였고, 증류수로 5 회 세척하였으며, PBS에서 재현탁시켰다. 24시간 동안 CO2 인큐베이터에서 37℃에서 분석을 수행하였다. 이미지 정량을 위한 형광 이미지를 IX71 형광 현미경(Olympus, Tokyo, Japan)으로 캡쳐하였다. z-적층형 형광 이미지를 LSM 880 공초점 현미경으로 캡쳐하였고, 라이브 이미지를 Lumascope 620 라이브 이미징 형광 현미경(Etaluma Inc., Carlsbad, CA, USA)으로 기록하였다. 이미지 처리 방법은 도 4a에 나타내었다.
곰팡이 신경친화성에 대한 다중 장기 hNVU 칩 연구
hNVU 칩 시스템의 제조를 위해 전술한 바와 동일한 방식으로 NSC, PC 및 EC를 시딩하였고, 다중 장기 hNVU 칩의 간 유닛의 중앙 채널에 BMEM 하이드로겔에 캡슐화된 8 x 106 cells/ml Huh-7 세포를 시딩하였다. 간 단위의 상부 저장소를 통해 CFW-표지된 곰팡이 세포를 주입하여 곰팡이가 뇌 단위로부터 분비된 인자에 의해 영향을 받지 않도록 하였다. 곰팡이 접종과 동시에 간 단위의 하부 채널에만 이노시톨(200 mg/ml, Duchefa, RV Haarlem, Netherlands)을 첨가하였다. 이미지 처리 방법은 도 4b에 나타내었다.
통계학적 분석
모든 데이터는 평균 ± 표준 편차(S.D.)로 표시된다. 통계적 확률을 계산하기 위해 Student's t-test를 적용하였다. GraphPad Prism 5 소프트웨어(GraphPad Software, San Diego, CA, USA)를 사용하여 통계 계산을 수행하였다. 95%(p < 0.05) 및 99%(p < 0.01) 신뢰 구간에서 데이터의 통계적 유의성을 결정하였다.
실시예 1: hNVU 칩에 대한 미세유체 설정
뇌혈관 유닛과 함께 인간 3D 뇌 조직을 모방하는 hNVU 칩 시스템을 개발하기 위해, 본 발명자들은 미세유체 장치에서 다중 인간 세포(NSC, 뇌 EC 및 뇌 PC)를 공배양하였다(도 1). 인간 NSC는 신경세포, 성상교세포 및 희소돌기아교세포를 포함하는 다중 세포 유형으로 분화할 가능성을 가진다. 본 발명자들은 이전에 NSC가 미세유체에서 EC 층에 대한 그들의 근접성에 따라 뚜렷한 분화 경향을 보인다는 것을 밝혔다. 3D NSC 채널 측면에 EC가 배양된 혈관 모사 채널을 가진 미세유체 장치에서, EC 층 근처의 NSC는 대부분 성상교세포로 분화되었지만, EC로부터 멀리 떨어져 있는 NSC는 신경세포로 분화하는 경향을 가졌다. EC 근처에서 NSC의 이러한 특별한 분화 패턴을 사용함으로써, 본 발명자들은 미세유체 칩 내 BBB 유닛(PC 및 NSC-파생 성상교세포와 함께 EC 층) 및 신경세포 유닛(3D 뇌 ECM-모사 매트릭스에서 NSC로부터 분화된 신경세포)을 포함하는 인비보-모사 hNVU를 확립하였다(도 5a).
미세유체 hNVU 칩은 작은 기둥으로 서로 연결된 3개 병렬 채널을 가진 폴리디메틸실록산(PDMS)으로 제조되었다(도 1a). 중심 채널은 3D 하이드로겔-캡슐화된 NSC 배양을 위해 고안되었고, 다른 것들은 EC 배양, 시험 분자 투여 및 배지 공급을 위해 고안되었다. 본 발명자들은 다중 튜브 연결과 함께 종래 시린지 펌프 기반 동적 배양 시스템의 산물과 비교하여 배양에서 산물을 증가시키기 위한 개별 튜브 없는 수직 칩 고안을 채택하였다. 수직 고안은 많은 칩을 수직으로 적층시킴으로써 공간 활용도를 보다 용이하게 할 뿐만 아니라, EC 층에서 진균의 수동적 포획을 유도한다(도 1b). 그러나, 칩은 역시 종래 칩과 같은 수평 구조로 사용될 수도 있다(도 1b). 오직 1개 시린지 펌프만 사용함으로써, 용기의 모든 칩에서 중간 유량을 동시에 생성할 수 있다. 시린지 펌프가 시린지 중 1개를 가압할 때, 압력은 용기 아래에 배치된 반대 시린지의 플런저를 가압한다. 플런저는 용기를 위로 밀고 기울이며, 인큐베이션 중 특정 시간 동안 채널에서 중력에 의해 형성되는 계단식 단방향 흐름을 연속적으로 제공한다(도 3a 및 도 5b). 뇌 EC는 단방향 동적 흐름 하에서 채널 상에 균일한 단층을 형성하였다(도 3b). 컴퓨터 시뮬레이션에 의해 계산된 전단 응력 값은 시린지 펌프의 추진 속도에 의해 제어되는 것으로 밝혀졌다(도 3c). 전단 응력 수준은 뇌 혈관구조에서의 것과 유사한 범위인, 0-6 dyne/cm2의 범위에서 점차적으로 증가하였다.
실시예 2: hNVU 칩에 대한 3D ECM 하이드로겔 및 배양 조건의 최적화
뇌 ECM- 모사 하이드로겔을 hNVU 칩에서 인간 NSC의 3D 배양에 적용하였다. 폴리-L-라이신(PLL) 및 콜라겐으로 미세채널의 표면 코팅은 상부 채널에서 효율적인 EC 단층 형성을 촉진시켰다(도 6). 중앙 채널에서의 3D 배양을 위해, 본 발명자들은 뇌에서 고농축된 ECM 성분 중 하나인, 콜라겐 I(Col) 및 HA의 하이브리드 하이드로겔을 사용하였고; 하이드로겔은 뇌 하이브리드 ECM (BHEM) 하이드로겔이라고 명명하였다. HA가 없는 Col 하이드로겔은 크게 수축하였고 상부 채널 상에 형성된 EC 층을 견딜 수 없었기 때문에, 중앙 채널에서 NSC 배양을 위한 3D Col 하이드로겔이 붕괴되었다(도 7). 따라서, 기계적 특성을 강화하기 위해 3D Col 하이드로겔에 HA를 보충하였다. 하이드로 겔 접착성을 향상시키기 위해 HA를 카테콜기로 수식하였다. 산화된 카테콜기가 단백질 및 펩타이드에 큰 결합 친화성을 가짐에 따라, 카테콜 수식은 하이브리드 하이드로겔에서 Col과의 상호 작용을 증가시켜 통합된 폴리머 네트워크의 형성을 촉진할 것으로 예상되었다. 물의 존재 하에 카테콜로 가교된 HA(HA-CA) 하이드로겔의 팽창 특성으로 인해, 보다 높은 HA-CA 대 Col 비로 형성된 BHEM 하이드로겔은 상부 채널 상에 위치한 EC 층을 돌출시켰다(도 7). 온전한 EC 층 및 NSC를 함유하는 3D 하이드로겔 구조 모두를 유지하기 위한 최적 ECM 조성물(Col: 3.7 mg/ml 및 HA-CA: 7.1 mg/ml)이 확인되었다. 최적화 BHEM 하이드로겔의 1Hz 주파수에서 탄성계수는 Col 하이드로겔의 것 보다 현저히 높았다(각각, 380.58 ± 16.99 및 96.48 ± 10.65 Pa)(도 8a, b). 생리학적 조건[37℃에서 인산 완충 식염수(PBS)] 하에서 각각 하이드로겔의 팽창 특성의 비교는 Col 하이드로겔이 상당한 수축, 중량 손실 및 구조적 변형을 나타내지만, BHEM 하이드로겔은 그 부피 및 3D 구조를 유지함을 보여주었다(도 8c). BHEM 하이드로겔의 확산 계수(D)는 Col 하이드로겔의 것과 비교하여 약간 감소하지만 유의적으로 감소하지 않았으며(도 8d, e), 이는 BHEM 및 Col 하이드로겔 사이 분자 확산에 실질적인 차이가 없음을 나타내고; 따라서, 영양 공급과 가스 교환은 HA 보충에 영향을 받지 않을 수 있다. BHEM 및 Col 하이드로겔은 상이한 기계적 및 팽창 특성을 나타내었지만, 3D 하이드로겔 모두에서 인간 태아 NSC의 분화 프로파일은 유사한 수준의 신경세포 및 아교 계통 분화 마커에 의해 확인된 바와 같이, 유의적으로 변화하지 않았다(도 8f). 5일 동안 NSC 및 EC를 공배양 한 후, BHEM 하이드로겔은 측면 채널 상에 EC 층을 유지한 반면, Col 하이드로겔은 수축하여 포스트 근처의 3D 하이드로겔 영역에서 EC 층의 붕괴를 초래하였다(도 8g, h). 이들 데이터는 BHEM 하이드로 겔이 hNVU 칩 시스템의 성공적인 확립을 위해 뇌 ECM 성분 및 향상된 기계적 특성을 갖는 3D 뇌 모사 미세환경을 제공할 수 있음을 나타낸다.
본 발명자들은 hNVU 칩에서 다중 세포 타입을 공배양하기 위한 배지 조건을 최적화하였다. 3가지 세포 타입(EC, PC 및 NSC) 모두의 성장을 지원하는 최적화 배양 배지를 식별하기 위해, 인간 NSC 배양에서 신경세포[신경세포-특이 클래스 III 베타-튜불린(Tuj1)] 및 아교세포[아교세포 섬유소 산성 단백질(GFAP), 희소돌기아교세포 전사 인자 2 (Olig2)] 계통 마커의 발현을 다양한 배지 조성 하에서 정량적으로 비교하였다. NSC 배지 및 EC 배지를 1:1 비율[NSC + EC(0.5X) 배지: 0.5X 기본 배지 및 세포 타입 각각에 대한 0.5X 보충 인자]로 간단히 혼합하여 준비된 배지 조건에서 배양할 때, NSC 대 신경세포의 NSC의 분화 효능이 현저하게 저하되었다(도 9a). BBB의 다중 약물 내성 기능에 대한 중요한 마커인 P-gp의 발현은 NSC 배지에서 배양된 EC에서 현저하게 감소되었다(도 9b). 따라서, 배지 조성은 세포 타입 각각에 대한 보충 인자에 대해 추가로 최적화되었다.
NSC의 신경세포 분화는 역시 변형된 NSC 배지 조건[NSC + EC(1X) 배지: 1X보충 인자 각각을 가진 0.5X 기본 배지, NSC + EC + PC(1X) 배지: 3가지 세포 타입에 대한 1X 보충 인자를 가진 NSC 및 EC에 대한 0.5X 기본 배지]에서 감소되었지만, NSC는 신경세포에 대한 일정 수준의 분화 잠재력을 유지하였다(NSC 배지에서 분화 잠재력과 비교하여 50-70%)(도 10a). 성상교세포로의 NSC 분화는 이러한 변형된 NSC 배지 조건에 의해 유의적으로 향상되었다. 희소돌기아교세포 마커(Olig2) 발현이 이러한 조건 하에서 크게 감소하였지만, 희소돌기아교세포가 뇌혈관 유닛의 주요 성분이 아니기 때문에 배지 조건의 최적화는 고려되지 않았다. EC 및 변형된 NSC 배지[NSC+EC(1X) 및 NSC+EC+PC(1X)]에서 내피 연접 분자(CD31 및 Zonula occludens-1; ZO-1) 및 유출 펌프(P-gp)의 유사한 발현 수준에 의해 나타난 바와 같이, EC는 변형된 배양 조건에 의해 크게 영향을 받지 않았다(도 10b). 상이한 태아 소 혈청(FBS) 농도(0%, 1% 및 2%)로 보충된 NSC+EC+PC(1X) 배지를 NSC 분화를 위해 시험하였을 때, 1% 및 2% FBS의 존재는 신경세포 분화에 영향을 미치지 않았지만, 성상교세포 분화를 유의적으로 증가시켰다(도 10c). 따라서, 3 가지 세포 타입 모두와 호환되는 1% FBS가 보충된 NSC-EC-PC(1X) 배지를 추가 실험에 사용하였다.
실시예 3: hNVU 칩에서 BBB 구조를 가진 뇌혈관 유닛의 재구성
최적화 배지 및 하이드로겔 조건 하에서 EC와 공배양을 통해 in situ 인간 NSC 분화를 유도함으로써 미세유체 칩에서 hNVU를 확립하였다. 줄기 세포 분화의 방향은 이웃 세포로부터 분비되는 가용성 인자에 의해 제어될 수 있다. 인간 뇌 EC와 함께 인간 태아 NSC의 공배양은 NSC의 아교세포 분화를 향상시키지만, EC 분비의 파라크린 효과로 인한 신경세포 분화를 감소시켰다(도 11a). 이러한 분화 패턴은 본 발명자들의 이전 연구에서 관찰된 패턴과 유사하였다. 미세유체 장치의 상이한 구획에서 NSC 및 EC의 공배양은 공간적으로 조절된 NSC 분화를 유도하였다. GFAP-양성 성상교세포는 EC 층 근처의 분화된 NSC에서 현저하게 증가하였다(도 11b). 그러나, Tuj1-양성 신경세포는 EC 층으로부터 멀리 떨어진 NSC 집단에서 증가하였다. 뇌에서 PC는 혈관 기저막을 감싸고 있으며, 이는 성상교세포 혈관종말발과 연결되어 있다. PC는 혈관 투과성 및 혈류 조절을 위한 기능성 BBB의 중요한 구성 요소이다. PC는 라미닌을 분비하고 EC가 기저막 성분을 분비하도록 유도하는 것으로 보고되었다. hNVU 칩을 제조하기 위해, PC와 EC를 상부 채널에 순차적으로 시딩하였고, 채널의 루미날 표면 상에 관형 EC 단층의 형성 및 EC 층 아래에 PC의 국부화를 야기하였으며, 서로 다른 것과 직접 접촉시켰다(도 11c). EC 및 PC가 칩에서 공배양될 때, 중요한 기저막 단백질(라미닌)은 BBB의 기저판을 모방함으로써, 혈관 층 아래에 침전되었다(도 12a). 이러한 hNVU 칩에서 EC는 균일한 단층을 가진 혈관-유사 구조를 형성하였고 EC 근처에서 NSC는 대부분 성상교세포 내로 분화되었다(도 11d). GFAP-양성 성상교세포는 뇌혈관 형태의 성상교세포 혈관종말발을 모방함으로써, EC 층을 향해 그들의 아교세포 덴드라이트를 신축하였고 혈관 구조를 둘러싼 직접 접촉하였다(도 11d, e). 중추 신경계에서 골수화에 중요한 역할을 하는 희소돌기아교세포 내로 인간 NSC의 분화는 미세유체 칩의 3D BHEM 하이드로겔에서 때때로 관찰되었다(도 12b).
실시예 4: hNVU 칩에서 BBB 투과성의 제어
배양 조건(예컨대, 공배양, 동적 흐름)은 hNVU 칩에서 확산 장벽으로서 BBB 유닛의 투과성을 결정할 수 있다. BBB의 기능을 제어하는 요인을 식별하기 위해, 본 발명자들은 여러 배양 환경 하에 추적자로서 형광성-표지된 덱스트란을 사용하여 장벽 투과성을 모니터링하였다. NSC 시딩 후 5 일에 수행된 투과성 시험은 NSC 단일배양 그룹이 70 kDa 플루오레세인 이소티오시아 네이트(FITC)-표지된 덱스트란(FITC-덱스트란)을 NSC를 함유하는 3D BHEM 하이드로겔 내로 빠르게 확산시켰음을 나타내었고, 도표화된 점진적인 확산 형광 프로파일을 보였다(도 13a, b). 배지 흐름이 없는 NSC 및 EC 공배양 그룹(NSC-EC)에서 EC 층을 통한 FITC-덱스트란의 침투는 NSC 단독 그룹의 것보다 낮았지만, 특히, EC 배양 채널 및 3D NSC 채널 사이의 포스트 근처에서, 장벽이 부분적으로 누출되었다(도 13a, b). 배지 흐름은 EC 층에 전단 응력을 제공하고 누출을 감소시켰지만(NSC-EC/흐름), 투과성 계수는 17.32 Х 10-6 cm/s로 여전히 높았다(도 13a-c). 동적 흐름(NSC-EC-PC/흐름)을 가진 NSC, EC 및 PC의 3중 공배양은 EC 장벽을 통한 FITC-덱스트란의 명백한 통과 없이 장벽 투과성을 4.71 Х 10-6 cm/s로 현저하게 감소시켰고(도 13a-c), hNVU 칩에서 BBB의 기능이 개선되었음을 나타내었다.
공배양 및 배지 흐름으로 인한 hNVU 칩의 장벽에서 투과성 차이에 대한 가능한 이유를 설명하기 위해, 본 발명자들은 상이한 배양 환경에서 EC 형태 및 거동을 면밀히 관찰하였다. EC 단일배양 그룹에서, EC는 채널을 따라 단층을 형성하지 않았고, 자가-조직화된 미세혈관 구조를 형성하거나 혈관신생을 연상시키는 포스트 근처의 3D BHEM 하이드로겔 매트릭스 내로 침입하였다(도 14a, 흰색 화살표). 어떠한 기계적 자극이 없는(NSC-EC /흐름 없음) NSC 및 EC 공배양 그룹에서, EC는 형성되었으나, 층으로부터 압출된 세포를 무작위로 분포시켰다(도 14a, 적색 화살표). 이러한 불규칙한 장벽은 도 13a에 나타난 누출의 원인인 것으로 보여졌다. 반면, 유체 흐름(NSC-EC/흐름) 하에 NSC 및 EC 공배양 그룹에서 EC는 채널 상에 조직화되고 견고한 단층을 형성하였다(도 14a). 밀착 연접 단백질 ZO-1은 흐름이 있는 공배양 그룹에서만 세포 사이의 경계에 잘 분포되어 있었다(도 14a). ZSC-1의 발현 수준은 NSC-EC/흐름 없는 그룹에서 발현 수준과 비교하여 NSC-EC/흐름 그룹에서 역시 향상되었다(도 14b). 시린지 펌프 대신 교반기를 사용하는 진동 양방향 흐름 조건 하에, EC는 비정상적인 형태를 보였고 EC 장벽을 통한 FITC- 덱스트란의 침투가 크게 증가하였다(도 15a, b). 이러한 결과는 EC가 강력한 장벽 기능을 제공하고 누출을 방지하기 위해 적절한 기계적 자극과 주변 세포와의 상호 작용이 필요하다는 것을 나타낸다. 전반적으로, 본 발명자들은 실제 뇌 조직에서와 같이 전단 응력 및 PC가 미세유체 뇌 모델에서 재구성된 BBB의 완전성을 제어하는데 중요한 역할을 한다는 것을 확인하였다.
실시예 5: hNVU 칩에서 재구성된 BBB의 기능
본 발명자들은 최적화 조건 하에 hNVU 칩에서 재구성된 밀착 연접을 가진 BBB가 생리학적 장벽 기능을 나타내는지 여부를 확인하였다. BBB 기능에서 중요한 유출 펌프 중 하나인 P-gp의 발현은 NSC-EC/흐름 그룹에서 상향 조절되었고(도 14c), 이는 이러한 그룹에서 BBB의 향상된 유출 펌프 기능성을 나타낼 수 있다. 비-형광 아세톡시메틸 칼세인(calcein AM)은 살아있는 세포 내로 수송될 때 형광 칼세인으로 전환된 다음, P-gp에 의해 세포로부터 펌핑될 수 있다. 흐름 없이 hNVU 칩에서 BBB에 칼세인 AM의 첨가는 P-gp에 대한 화학적 억제제(verapamil)로의 처리와 상관없이, 뇌 EC 층에서 일정하게 높은 형광 강도를 얻었고(도 14d), 흐름 없이 형성된 BBB가 다소 미숙할 수 있고 칼세인 AM 분자를 효율적으로 환류시킬 수 없음을 나타내었다. 반대로, 형광 신호의 한계 강도에 의해 확인되는 바와 같이, 동적 흐름에 의해 형성된 밀착 연접을 가진 보다 견고하고 완전한 EC 층을 포함하는 BBB는 EC의 향상된 유출 펌프 기능으로 인해 EC 층에서 칼세인 AM 분자의 축적을 차단하였다(도 14d). NSC-EC/흐름 그룹에서, 칼세인 AM의 형광 강도는 베라파밀 처리 후 EC 층에서만 유의적으로 증가하였다(도 14d). 이러한 결과는 hNVU 칩 시스템이 기능성 BBB의 가장 중요한 특징 중 하나인, 들어오는 약물에 대한 생리학적 활성 장벽을 가지고 있음을 나타낸다. hNVU 칩에서 BBB이 EC 층(NSC-EC-PC /흐름 그룹)이 미생물 감염에 반응하여 BBB 투과성을 증가시키는 것으로 알려진 전-염증성 사이토카인인, 종양 괴사 인자-알파(TNF-α)에 노출되었을 때, 70 kDa FITC- 덱스트란에 대한 EC 층의 투과성은 현저히 증가하였다(~ 2.8 배)(도 14e). TNF-α가 120 분 후 배지 교환에 의해 제거된 후, BBB 층은 본래 투과성을 신속하게 회복시켰다(도 14e, f). 이러한 결과는 이러한 hNVU 칩 시스템에서 BBB가 사이토카인에 대한 생리학적 반응을 나타내고 가역적으로 활성인 기능성 장벽으로서 작용한다는 것을 밝혀냈다.
실시예 6: 미생물 BBB 침투를 모니터링하기 위한 효율적인 인비트로 모델로서 hNVU 칩
hNVU 칩의 실질적인 유용성을 입증하기 위해, 본 발명자들은 전세계적으로 면역력이 약화된 개인에게 뇌를 감염시키고 치명적인 수막뇌염을 유발하는 것으로 알려진, 곰팡이 병원균 C. neoformans의 뇌 감염 메커니즘을 조사하기 위해 hNVU 칩을 적용하였다(도 16a). 이러한 곰팡이 병원균은 BBB를 효율적으로 가로질러 BBB 근처의 뇌 조직에 클러스터링하여 후모세혈관정맥의 혈관주위 공간에 위치한다. 수직 칩 설정으로 곰팡이 세포가 EC와 효율적으로 접촉하게 되었다. hNVU 칩(NSC-EC-PC/흐름 그룹)의 상부 채널에 접종한 1일 후, 일부 C. neoformans 세포(H99 균주)가 hNVU 칩의 BBB 장벽을 가로질러 EC-PC 혈관 층에 축적된 것으로 관찰되었다(도 16a). 흥미롭게도, C. neoformans는 EC 층의 침투에 따라 혈관구조 아래에 클러스터를 형성하였고, 이는 C. neoformans 감염으로 실제 뇌 조직의 형태를 되풀이한다. hNVU 칩 내로 접종된 CFW(calcofluor white)-표지된 C. neoformans 세포의 라이브 이미징은 곰팡이 세포가 먼저 EC 층에 접근한 다음, 3D 뇌 매트릭스(BHEM) 근처에서 더 빠르게 확산되고, 결국 혈관 층을 관통함을 보여주었다. 라이브 이미징의 후반부에서, 곰팡이 세포벽의 키틴에 태그된 CFW-형광 강도는 감염 동안 곰팡이 세포 분열로 인해 이질화되었다(도 17a).
C. neoformans의 BBB 침투 능력을 정량화하기 위해, 본 발명자들은 BBB 침투의 정도를 다음과 같이 정의하였다(도 16b; 상부 패널): EC 층 하부의 CFW-염색된 곰팡이 면적(n)을 EC 층 상부 및 하부의 총 CFW- 염색된 곰팡이 면적(m + n)으로 나누었다. 1) 일반적인 곰팡이 뇌수막염 병원균이 아닌, Candida glabrata (BG2 균주), 2) 전신 숙주 감염 동안 뇌가 아닌, 폐를 주로 표적하는 병원성 크립토코커스 종의 하나인, Cryptococcus deuterogattii(R265 균주), 및 3) 메탈로프로테아제 MPR1 유전자가 결실되어 BBB 침투 및 뇌 감염에 결함이 있는, C. neoformans mpr1Δ 돌연변이의 3개 다른 균주의 BBB 침투 능력은 야생형(WT) 균주 C. neoformans H99의 BBB 침투 능력과 비교하였다. 예상한 바와 같이, C. glabrata BG2 균주는 hNVU 칩의 혈관 장벽을 관통하지 않았다(도 16b). C. deuterogattii R265 균주는 C. neoformans H99 균주에 의해 나타난 침투 정도와 비교하여 BBB 침투 정도가 낮았다(도 16b). 특히, 전체 EC 층에 균일하게 쌓인 C. glabrata 및 C. deuterogattii 세포와는 달리, C. neoformans WT 세포는 3D 뇌 유닛 근처의 EC 층 위에 더 군집화되어 BBB 장벽을 통과하였다(도 16b). C. neoformans mpr1Δ 돌연변이는 또한 3D BHEM 영역 근처에서 군집화되었지만, C. neoformans H99 균주보다 훨씬 낮은 침투 능력을 나타내었다(도 16b).
hNVU 칩에서 BBB를 침투한 후, C. neoformans는 EC 층 아래에 클러스터링되었다. 면역 염색 이미지에서, 염색 과정 동안 세척에 의해 채널로부터 휩쓸려 가면서 혈관 층 위에 곰팡이 세포가 거의 보이지 않았다(도 16c). 그러나, 다수의 C. neoformans H99 균주 세포는 CD31-염색된 EC 층 아래에 클러스터링되었다(도 16c). 수평 EC 장벽으로 구성된 기존 BBB 모델과 달리, hNVU 칩에는 수직 EC 장벽이 있어 곰팡이 침투를 직접 관찰할 수 있다. 단일 z-면에서 EC 층을 관통하는 C. neoformans WT 세포의 공초점 이미지는 곰팡이 세포가 EC 내 핵 근처에 주로 위치하는 것을 보여주었다(도 16d, 노란색 화살표). BBB 침투 후 크립토코커스 세포에는 눈에 띄는 손상이 없었다(도 16d, 노란색 화살촉). 침범되고 군집화된 크립토코커스 세포는 NSC로부터 유래된 GFAP-양성 성상교세포 혈관종말발에 직접 접촉하는 것으로 나타났다(도 16e, 흰색 화살표 및 도 17b). 특히, BBB에서 EC 형태는 C. neoformans 감염시 불규칙해졌지만 C. glabrata 감염은 EC 형태를 변화시키지 않았다(도 16c). 그럼에도 불구하고, C. neoformans 감염시 혈관 층에는 눈에 띄는 해체가 없었다. 종합적으로, 본 발명자들의 데이터는 hNVU 칩이 곰팡이 뇌수막염 병원균의 선택적 BBB 침투 과정을 모델링함을 명백히 입증한다.
실시예 7: 미생물 신경친화성을 모니터링하기 위한 다중 장기 hNVU chip
본 발명자들은 C. neoformans가 C. glabrata 및 C. deuterogattii 균주와 달리 3D 뇌 유닛 근처의 EC 층을 중심으로 주로 군집화하는 경향이 있다는 사실을 발견하여, hNVU 칩을 미생물의 신경친화성 행동을 모니터링하기 위한 인비트로 모델로서 추가 시험하였다(도 18a). 이러한 신경친화성 현상이 신경 계통 세포와 크립토코커스의 세포 타입별 상호 작용에 의해 유발되는지 확인하기 위해, 본 발명자들은 C. neoformans WT 세포를 NSC 대신 인간 간암 세포주(Huh-7)와 배양된 동일한 칩 내로 접종하였으나, 뇌-모사 hNVU 칩에서 관찰된 것과 유사한 현저한 군집화가 관찰되지 않았다(도 19). 본 발명자들은 간-모사 유닛을 hNVU 칩에 첨가함으로써 제조된 다중 장기 hNVU 칩에서 C. neoformans 신경친화성을 추가로 조사하였다(도 18b). 다중 장기 hNVU 칩은 미생물의 장기별 선호도를 식별하고 시각화하기 위해 EC 층과 하나의 채널로 연결된 뇌(NSC) 및 간(Huh-7) 유닛을 가지도록 설계되었다(도 2a, b 및 도 18b). 배지를 오른쪽에서 왼쪽으로 흘림으로써, 곰팡이 세포가 먼저 간 유닛과 접촉하였다(도 18c). 곰팡이 세포의 신경친화성 움직임을 정량적으로 측정하기 위해, 본 발명자들은 도 18b에 제시된 식에 따라 신경친화성의 정도를 정의하였고, 여기서 뇌-모사 단위에서 CFW-염색된 곰팡이 영역(A)을 뇌 및 간-모사 유닛 모두에서 총 CFW-염색된 곰팡이 영역(A + B)으로 나누었다.
다중 장기 hNVU 칩 모델에서, C. glabrata BG2 균주는 3D 뇌 및 간 유닛의 존재와 무관하게 전체 EC 층 상에 고르게 분포되었다(도 18c; 신경친화성의 정도 ~ 0.5). 반대로, C. deuterogattii R265 균주는 칩의 중간에 세포 접촉이 없는 EC 영역보다 3D 뇌 및 간 단위에 인접한 EC 층에 보다 적층되었지만, 어느 장기에도 눈에 띄는 선호도를 보이지 않았고, 이는 C. deuterogattii에서 신경신화도의 결핍을 나타내었다(도 18c; 신경친화성의 정도 ~ 0.5). C. glabrata 및 C. deuterogattii와 달리, C. neoformans 세포는 간 유닛 보다 뇌 유닛 위의 EC 층에 보다 우선적으로 적층되었고, 이는 명확한 신경친화성을 나타내었다(도 18c; 신경친화성의 정도 ~ 0.8) 특히, C. neoformans mpr1 돌연변이는 WT H99 균주와 유사한 정도의 신경신화성의 정도를 보였으나, BBB 침투를 상당히 감소 시켰고(도 18c), 이는 메탈로프로테아제 MPR1이 C. neoformans의 신경친화성이 아니라, 그 BBB 침투에서 중요함을 나타내었다.
크립토코커스 뇌 감염 과정에서, 숙주-유래 이노시톨은 C. neoformans의 BBB 침투를 촉진시키는 주요 자극제로서의 역할을 하는 것으로 보고되었다. 인간 뇌가 다량의 이노시톨을 함유함에 따라, 뇌 조직에서 유리 이노시톨은 C. neoformans의 이노시톨 수송체인 Itr1a 및 Itr3c에 의해 흡수된 다음, C. neoformans에서 HA 신타아제(CPS1) 발현을 유도한다. 결과적으로, C. neoformans 세포 상의 HA의 증가된 표면 발현은 ECs42 상에 CD44 수용체에 대한 결합을 용이하게 함으로써 그 BBB 침투를 촉진시킨다. 이러한 이전의 발견에 기초하여, 본 발명자들은 다중 장기 칩에서 간 유닛으로 이노시톨 보충이 C. neoformans의 간 향성을 유도하고 간 유닛으로 침투를 증가시킬 수 있다는 가설을 세웠다. 이러한 가능성을 시험하기 위해, 본 발명자들은 하부 채널을 통해 간 유닛에만 200 mg/ml 이노시톨을 첨가하였다(도 18d). 이노시톨 처리는 실제로 간 유닛 근처에서 EC 층에 대한 C. neoformans의 모집을 증가시켰고(도 7d), 따라서, C. neoformans의 신경친화성의 정도를 감소시켰다(도 18e). 그럼에도 불구하고, 오직 이노시톨의 존재는 EC 장벽을 통해 간 유닛으로 곰팡이 침투를 증가시키지 않았다(도 18d, f). 이러한 결과는 이노시톨이 C. neoformans 신경친화성 모집에 필요하지만, C. neoformans EC 장벽 침투를 용이하게 하는 다른 신경친화성 인자가 있을 수 있음을 나타낸다. 모든 결과를 고려하면, 다중 장기 hNVU 칩은 미생물 신경친화성 행동을 조사하는 효율적인 도구가 될 수 있다.
본 발명에서, 본 발명자들은 미세유체 장치에서 기능적인 BBB 및 신경 성분을 함유하는 hNVU-모사 칩을 개발하였다. hNVU 칩 시스템은 이전에 보고된 BBB-모사 플랫폼에 비해 다음과 같은 이점이 있다: (1) 뇌 매트릭스를 모사한 변형된 3D 하이드로겔, (2) 상이한 세포 타입의 공배양을 충족시키는 최적화된 배양 조건, (3) BBB 및 뇌 조직에 대한 필수적인 성분을 제공하기 위한 in situ 인간 NSC 분화 전략, (4) BBB 유닛에서 간편한 정량화 및 실시간 관찰을 용이하게 하는 EC 층의 배치, (5) 배양 및 분석 효율을 증가시키기 위한 튜브/시린지-프리 동적 유체 시스템, 및 (6) 곰팡이 침투 시험 및 신경친화성의 검증을 위한 다중 장기 칩 고안. 이러한 이점들에 기초하여, hNVU 칩은 인간 곰팡이 병원균 C. neoformans의 신경친화성 및 BBB 침투 과정을 성공적으로 시뮬레이션하였다. 이전에 보고된 플랫폼은 대부분 BBB를 가로지른 약물 침투 및 유출과 약물에 대한 반응에 대해 시험되었고, 뇌 감염 동안 살아있는 미생물의 행동 및 병원성 메커니즘을 조사하기 위해 적용된바 없었다. 따라서, 본 hNVU-모사 플랫폼은 미생물 BBB- 침투 및 신경친화성에 대한 인자를 식별하기 위해 BBB-미생물 상호작용 및 돌연변이의 대규모 스크리닝을 조사하는데 채용될 수 있다.
먼저, 하이드로겔 조성물은 본래 뇌 3D 매트릭스를 보다 나타내도록 최적화되었다. 콜라겐 하이드로겔은 그 탁월한 세포-매트릭스 상호 작용으로 인해 3D 배양에 가장 널리 사용되었지만, 이는 3D 구조물의 변형을 초래하는 배양 중에 상당한 줄어듬 및 수축을 종종 겪는다. 일반적으로 사용되는 다른 하이드로겔인, 피브린은 역시 EC 이동을 유도하기 위한 혈관신생 효과로 인해 BBB 시스템에 적합하지 않다. 현재 ECM 하이드로 겔의 이러한 단점을 극복하기 위해, 본 발명자들은 HA-CA, 카테콜기로 변형된 HA 컨쥬게이트 및 콜라겐으로 구성된 하이브리드 하이드로겔(BHEM)을 사용하였다. HA-CA 성분은 뇌 조직의 것과 기계적 성질의 유사성을 증가시켰을 뿐 아니라, 접착 성질로 인해 칩 내부의 하이드로겔 구조물을 유지하였다(도 8). HA가 가장 풍부한 ECM 성분 중 하나이고 뇌 조직에서 주요한 구조적 역할을 하기 때문에, HA 보충은 본래 뇌 ECM 미세환경의 재구성에 추가적으로 기여한다. 오른쪽 위치에서 EC 층을 형성 할 수 있는 HA-CA 및 콜라겐 성분의 최적 비율과 농도가 확인되었다(도 8g, h). 따라서, BHEM 하이드로겔은 NSC 분화 전위에 영향을 미치지 않으면서 이상적인 3D 틈새를 제공하는 것으로 보인다(도 8f).
hNVU 칩의 두 번째 주목할만한 특징은 미세유체 장치에서 인간 NSC의 in situ 분화 및 뇌 EC 및 PC와의 공배양을 통해 BBB 및 뇌 조직에서 신경혈관 유닛의 기능을 성공적으로 재현하는 것이다. hNVU 칩에서 BBB 및 뇌 유닛에 필요한 세포 성분의 구획화는 뇌 EC 층으로부터 거리에 따라 인간 NSC 분화의 공간적으로 조절된 구분 패턴에 의해 in situ 자발적으로 유도되었고, 이는 본래 뇌에서 세포 형태형성과 유사하다. EC 층 근처의 3D BHEM 하이드로겔에서 인간 NSC는 EC와 직접적으로 접촉하고 EC부터의 파라크린 신호를 통해 성상교세포로 분화되는 경향이 있었으며(도 11b, d), 따라서 성상교세포 혈관종말발 유사 구조를 형성하였다(도 11e). EC로 구성된 혈관을 둘러싸는 성상교세포 혈관종말발 구조는 뇌혈관 단위에서 BBB 기능을 조절하는데 중요한 역할을 한다고 알려져 있어 기능적인 BBB-모사에 기여하였다. 3D 매트릭스 내 NSC가 없는 시스템에서, EC는 3D 하이드로겔 유닛 쪽으로 이동하여, EC 단층을 붕괴시켰다(도 14a). 이는 아마도 성상교세포인, NSC로부터 분화되는 세포가 어떻게 든 EC 층을 올바른 위치에서 지지한 것으로 보인다. EC 층으로부터 멀리 떨어져 있는 인간 NSC는 대부분 신경세포로, 낮은 비율로 희소돌기아교세포로 분화되어 3D 뇌혈관 유닛을 형성하였다(도 11b 및 12b). 신경세포 및 희소돌기아교세포는 종종 BBB 모델의 주요 성분으로 간주되지 않았다. 그러나, 뇌에서 생리학, 대사 및 항상성을 제어하기 위해 BBB와의 알려진 상호작용을 감안할 때, 최근 연구는 신경세포를 포함하는 3D 뇌혈관 유닛을 확립하려고 시도하였다. BBB 기능을 제어하는 PC의 보고된 중요한 역할로 인해 PC는 3D 뇌혈관 유닛 내로 통합되었고, 이는 EC로 구성된 혈관을 둘러싸면서 상호 작용하여 BBB 장벽의 구조 및 기능을 지원하였다(도 11c 및 13). 또한, 본 발명자들은 배지 성분, 보충 인자 및 혈청 함량을 조절함으로써 hNVU 칩에서 NSC, EC 및 PC의 다중 공배양을 지원하도록 배양 조건을 최적화하였다(도 9 및 10). EC 공배양과 함께 인간 NSC의 in situ 분화는 성상교세포 및 신경세포와 같은 인간 뇌 세포 공급원을 제조하기 위한 1 차 배양 또는 별도 줄기 세포 분화 단계의 필요 없이 BBB 및 3D 뇌 조직과 구조적으로 유사한 인비보-유사 hNVU 모델의 개발을 가능하게 한다.
본 hNVU 칩의 최종 고유 특징은 BBB의 구조적 무결성 및 기능을 향상시키기 위해 일정한 단방향 배지 흐름을 가진 단순하고 안정적인 배양 시스템으로 강조되었다. 많은 이전의 연구는 시린지 또는 연동 펌프를 사용하여 미세유체 칩 내에서 배지 흐름을 발생시켰다. 이러한 경우, 각 칩은 동적 흐름을 위해 펌프에 연결된 튜브가 필요하므로 처리량이 많은 연구를 수행하기가 어렵다. 본 발명자들은 최소한의 설정으로 간단하고 효율적인 흐름 배양 시스템을 고안하였다. 칩은 펌프 및 튜브에 개별적으로 연결하지 않고 박스 내 쌓을 수 있기 때문에(도 3a 및 5b), 시스템은 배양 및 분석 처리량을 증가시켜 궁극적으로 높은 처리량 스크리닝 및 모니터링을 촉진할 수 있다. 정상 혈류에 의해 생성된 라미나 전단 응력은 내피세포 골격 및 혈관 항상성을 제어함으로써 혈관의 구조 및 기능을 유지하는 것으로 알려져 있다. 단계적 단방향 흐름에 대한 본 발명자들의 설정의 적용은 EC 사이의 밀착 연접 형성을 촉진시켰고(도 14a, b), hNVU 칩에서 BBB 유닛의 무결성 및 기능을 실질적으로 향상시켰다. 단계적 단방향 흐름 배양은 뇌 밖으로 약물 및 외부 물질을 펌핑하는 유출 운반체 P-gp의 발현을 상향 조절하였다(도 14c). 따라서, 본 발명자들은 칼세인 AM 분자가 배지 흐름 없는 BBB 유닛의 EC 층에 축적되었지만, 배지 흐름을 가진 BBB에는 축적되지 않았던 것을 관찰하였으며(도 14d), 이는 뇌 혈관세포에서 많이 분포한다고 알려진 P-gp의 발현뿐만 아니라 기능 또한 배양액의 흐름 하에서 증진됨을 나타내었다. 또한, 전단 응력은 과도한 EC 증식을 억제하고, 이에 의해 미세유세 칩에서 EC 과성장 및 3D 하이드로겔 유닛으로 이동을 방지하는 것으로 알려져 있다. 흥미롭게도, 본 발명자들은 축 교반기에 의해 생성된 진동 양방향 흐름이 비정상적인 EC 표현형 및 혈관 누출을 일으킨다는 것을 발견하였다(도 15). 그러한 비층류적 흐름은 비정상적인 EC 표현형을 유도하고, 이는 EC 장벽 투과성을 증가시키고 결과적으로 혈관 질환 발생을 유발하는 것으로 보고되었다. 염증성, 퇴행성 및 외상성 조건 하에서, BBB는 신경내분비 제어를 위해 TNF-α와 같은 사이토 카인에 선택적으로 반응한다. hNVU 칩의 BBB 층이 TNF-α에 노출되었을 때, 투과성은 점차 증가했지만 사이토카인 자극이 철회될 때 기본 수준으로 회복되었다(도 14e, f). 따라서, hNVU 칩은 강력하고 기능적인 BBB 시스템을 제공할 뿐만 아니라, 다양한 유체 역학 및 생화학적 처리를 이용하여 뇌혈관 질환, 부상 및 염증을 모델링하는데 유용하다.
hNVU 칩은 곰팡이 뇌수막염을 유발하지 않는, C. glabrata 및 C. deuterogattii를 포함한, 다른 인간 곰팡이 병원균과 비교하여, 범용 곰팡이 뇌수막염 병원균 C. neoformans의 뇌 감염 메커니즘을 조사하는데 성공적으로 사용되었다. 크립토코커스 뇌수막염의 전세계 발병률이 증가하고, 특히, 면역결핍 환자에서 치사율이 높음에도 불구하고, 중추 신경계에 접근하고 BBB를 관통하는 C. neoformans의 근본적인 메커니즘은 여전히 애매하게 남아 있다. 이는 병원균의 실시간 신경친화성 이동 및 침투를 시각화하고, 이러한 사건을 정량적으로 평가할 수 있는 믿을만한 모델 시스템이 없기 때문일 수 있다. C. neoformans의 BBB 침투를 모니터링하는 데 가장 널리 사용되는 EC를 배양한 트랜스웰 시스템은 다른 중요한 hNVU 세포 성분(예컨대, PC, 신경세포)의 결핍으로 인해 복합 BBB 구조 및 기능을 반영하지 않고, 곰팡이 이동의 시각화에 부적합하다. 종래 뮤린 기반 독성 및 곰팡이 시험은 엔드-포인트 결과만 제공하며 BBB 침투 지점에서 침입 행동을 관찰할 수 없다. 특히, 현재까지 곰팡이 신경친화성을 모니터링하기 위해 유효한 인비트로 모델 시스템이 없다. 따라서, 본 발명의 hNVU 칩 시스템은 곰팡이 병원균의 BBB 침투 및 신경친화성 특성을 모두 입증할 수 있는 최조의 인비트로 시스템이다.
본 발명에서, 본 발명자들은 hNVU 칩의 상기 언급한 특징으로 인해, 처음으로 실시간 방법으로 C. neoformans의 BBB 침투 과정을 시각화하였다. C. neoformans의 BBB 침투의 메커니즘에 대한 3가지 가능한 가설이 있었다. (1) EC 사이 손상되거나 느슨해진 밀착 연접을 통한 세포 사이 침투, (2) EC를 통한 트랜스사이토시스, 또는 (3) 단핵구/대식세포에 의해 매개되는 병원균 전달의 트로이 목마 모델. 본 발명자들의 관찰에 기초하여, BBB에 대한 초기 접착 후, C. neoformans는 뇌 유닛 위에 바이오필름-유사 세포 클러스터를 형성하는 것으로 보였다. 특히, 그렇게 클러스터된 세포는 EC 밀착 연접에 상당한 영향을 미치거나 어떤 증거 홀을 생성하지 않으면서 BBB를 침투할 수 있었다. 이전의 연구에 따르면, C. neoformans는 밀착 연접의 분열 없이 EC를 통과할 수 있다고 보고되었다. 대신, 본 발명자들은 트랜스사이토시스 과정에서 발생할 수 있는 C. neoformans의 BBB 침투 동안 EC 형태에서 변화를 관찰하였다(도 16c). 밀착 연접이 분열되지 않더라도 C. neoformans에 의한 EC 상에 일부 손상이 있을 수 있으며, 이는 그러한 구조적 변화의 원인이 될 수 있다. 본 발명에서는, 면역 세포가 칩에 포함되지 않았기 때문에, 트로이 목마 가설을 시험할 수 없었다. 그러나, 시스템이 곰팡이 및 면역 세포를 공배양할 수 있기 때문에, 이러한 가설은 추후 연구될 수 있다.
다중 장기 칩 연구에서 얻은 데이터는 C. neoformans의 신경친화성 운동에 대한 새로운 통찰력을 제공한다. 본 발명은 정성적 및 정량적 방식으로 C. neoformans의 신경친화성을 실험적으로 최초 입증한 것이다. 동일한 EC 층을 가진 별도 뇌 및 간 유닛을 가진 다중 장기 hNVU 칩에서, C. neoformans은 간 유닛 보다 뇌 유닛에 보다 가깝게 밀집되는 경향이 있는 반면, C. deuterogattii은 양 유닛에 유사하게 밀집되었다(도 18c). 이러한 결과는 C. neoformans가 뇌를 우선적으로 감염시켜 조기 사망으로 이끄는 반면, C. deuterogattii는 상대적으로 낮은 신경친화성을 가지고 주로 폐 질환을 유발한다는 이전 발견을 뒷받침한다. 반대로, C. glabrata는 뇌 및 간 유닛의 존재와 무관하게, EC 층에 고르게 분포되었다(도 18c). C. neoformans이 대부분 다른 곰팡이와 같이 고착되었기 때문에, 그 신경친화성은 hNVU 칩에서 뇌 유닛의 BBB에 대한 증가된 특이 부착으로부터의 결과와 같다. 이러한 현상에 대한 가장 그럴듯한 설명은 뇌 세포가 C. neoformans의 BBB 부착을 향상시킬 수 있는 작은 분자 및/또는 단백질 인자를 분비할 수 있다는 것이다. 그러한 후보 중 하나는 이노시톨일 수 있고, 이는 뇌에 풍부하다고 알려져 있다. 이전에, C. neoformans은 HA 신타아제 유전자 CPS1의 발현을 유도하고 이노시톨 흡수시 HA를 생성한 다음, 혈액 ECs42에서 CD44 당단백질에 대한 그 결합을 증가시키는 것으로 보고되었다. 이를 뒷받침하기 위한 실험에서, 본 발명자들은 이노시톨 보충이 간 유닛의 EC 층에 대한 C. neoformans의 모집 및 부착을 증가시킬 수 있음을 발견하였다(도 18d, e). 그러나, 이노시톨 단독은 병원균의 EC-간 장벽 투과를 완전히 촉진 시키지는 않았고(도 8d, f), 다른 요인들이 뇌 유닛에 특별히 존재할 수 있음을 시사한다.
결론적으로, 본 발명자들은 기능적인 인간 BBB 및 3D 뇌-유사 조직으로 구성된 hNVU를 모사할 수 있는, 장기-온-어 칩 모델을 성공적으로 확립하였다. 최근에 구축된 대규모 C. neoformans 돌연변이 모집의 고처리량 스크리닝을 위해 hNVU 칩을 사용하여, 본 발명자들은 곰팡이 BBB 이동 및 신경친화성에 결정적인 신규 인자를 식별함으로써 C. neoformans의 뇌 감염 메커니즘 및 이와 연관된 복합 신호 네트워크를 보다 체계적으로 분석할 수 있을 것이다. 이는 감염성 뇌 질환에 대한 새로운 치료제 개발에 기여하는 미생물 BBB 침투 길항제의 발견을 촉진할 것이다. 또한, hNVU 칩은 BBB 및 뇌 조직을 표적하는 약물 전달 시스템을 개발하는데 유용할 것이다. 다중 장기 hNVU 칩 시스템은 다른 타입의 장기 및 조직과 뇌 모델의 조합을 통해 그 유용성을 확장할 수 있다(예컨대, 파킨슨 질환 모델링을 위한 장-뇌 축을 재구성하기 위한 뇌 및 장 모델).
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 예를 들어, 단일형으로 설명되어 있는 각 구성 요소는 분산되어 실시될 수도 있으며, 마찬가지로 분산된 것으로 설명되어 있는 구성 요소들도 결합된 형태로 실시될 수 있다
본 발명의 범위는 후술하는 청구범위에 의하여 나타내어지며, 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
[부호의 설명]
100 : 미세유체 디바이스
100' : 복합 미세유체 디바이스
101 : 제1채널
102 : 제2채널
102' : 제2-1채널
103 : 제3채널
103' : 제3-1채널
104 : 챔버
200 : 기울기 제어 수단
300 : 지지체

Claims (17)

  1. 제1채널;
    상기 제1채널에 인접하여 하나 이상의 미세홀을 통해 연결되고, 신경줄기세포를 배양하기 위한 제2채널; 및
    상기 제1채널 양 말단에 연결되고, 배양액을 포함하는 챔버를 포함하는 뇌혈관 모사용 미세유체 디바이스.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 제1채널 내측 표면은 폴리-L-라이신 및 콜라겐을 포함하는 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함하는 코팅액으로 코팅된, 미세유체 디바이스.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 제1채널 내측 표면에 부착 배양된 내피세포를 더 포함하는, 미세유체 디바이스.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 내피세포 하단 및 상기 제1채널 내측 표면에 부착 배양된 주피세포(Pericyte)를 더 포함하는, 미세유체 디바이스.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 제2채널은 상기 신경줄기세포를 3차원 배양하기 위한 하이드로겔을 포함하는, 미세유체 디바이스.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 하이드로겔은 콜라겐 및 가교 또는 미가교 히알루론산을 포함하는, 미세유체 디바이스.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 하이드로겔 내 상기 콜라겐의 농도는 3.0 mg/ml 내지 5.0 mg/ml이고, 상기 하이드로겔 내 상기 가교 또는 미가교 히알루론산의 농도는 1.0 mg/ml 내지 10.0 mg/ml인, 미세유체 디바이스.
  8. 제6항에 있어서,
    상기 하이드로겔의 하기 수학식 1로 표시되는 팽창비가 50% 내지 150%인, 미세유체 디바이스:
    [수학식 1]
    Figure PCTKR2019012135-appb-I000009
    이때, Wi 및 Ws는 배양 전 건조 중량 및 37℃에서 PBS로 3 일 동안 배양한 후 하이드로겔의 습윤 중량을 각각 나타낸다.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 배양액은 EGM-2 기본 배지 및 DMEM/F12 기본 배지가 혼합된 배지인, 미세유체 디바이스.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 혼합된 배지에 N-2 보충물, EGM-2 보충물, 주피세포 성장 보충물 및 0.5% 내지 3% FBS가 주요인자로 첨가된, 미세유체 디바이스.
  11. 제1항에 있어서,
    상기 제2채널에 인접하는 제3채널을 더 포함하는, 미세유체 디바이스.
  12. 제1항에 있어서,
    상기 제1채널의 평균 직경은 0.1 내지 1.0 mm이고, 상기 제2채널의 평균 직경은 0.5 내지 1.5mm인, 미세유체 디바이스.
  13. 제1채널;
    상기 제1채널에 인접하여 하나 이상의 미세홀을 통해 각각 연결되고, 신경줄기세포를 배양하기 위한 제2채널 및 별도 장기 세포를 배양하기 위한 제2-1 채널; 및
    상기 제1채널 양 말단에 연결되고, 배양액을 포함하는 챔버를 포함하는
    뇌혈관-별도 장기 모사용 복합 미세유체 디바이스.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항의 디바이스; 및
    상기 디바이스의 기울기를 제어하는 수단을 포함하는 혈액뇌관문 모사 시스템.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 기울기를 제어하는 수단은 상기 디바이스 하단에 위치하는 시린지 펌프인, 혈액뇌관문 모사 시스템.
  16. 제14항에 있어서,
    상기 기울기를 제어하는 수단은 상기 제1채널의 배양액에 단방향 흐름성을 제공하는, 혈액뇌관문 모사 시스템.
  17. 제14항에 있어서,
    상기 디바이스에서 상기 제2채널 또는 상기 제2-1채널이 상기 제1채널 하단에 위치하는, 혈액뇌관문 모사 시스템.
PCT/KR2019/012135 2018-09-19 2019-09-19 뇌혈관 모사용 미세유체 디바이스 및 이를 포함하는 고효율 혈액뇌관문 모사 시스템 WO2020060222A2 (ko)

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