KR102549828B1 - Bbb-온-칩 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 미세유체칩에 구현한 혈액뇌장벽 혈관망에 관한 것으로, 본 발명의 체외 혈액뇌장벽 모사칩의 제조방법으로 제조된 체외 혈액뇌장벽 모사칩은 특정 세포 구성에 의해 기존의 체외 혈액뇌장벽 모사칩에 비해 실제 인간의 생체 내 혈액뇌장벽을 더 유사하게 재현할 수 있으므로, 이를 더 정확한 시험관 내 혈액뇌장벽으로 이용할 수 있으며, 다양한 뇌 질환의 치료에 작용하는 다양한 세포 치료제 또는 약물 개발에 사용될 수 있다.

Description

BBB-온-칩{Blood Brain Barrier-On-a-Chip}
본 발명은 미세유체칩에 구현한 혈액뇌장벽 혈관망에 관한 것이다.
2차원 세포 배양(two-dimensional(2D)) 모델이 의생명과학 연구에서 가치를 인정받음에도 불구하고, 상기 2차원 세포 배양 모델은 세균 배양 접시(petri dish)를 이용하여 접시 바닥에 세포를 2차원으로 배양시키므로 많은 세포 타입의 조직 특이적 분화 기능들(tissue-specific, differentiated functions)을 설명하지 못하거나 생체내(in vivo)의 조직 기능과 약물 활성도를 정확하게 예측하지 못한다. 특히, 생체 내에서 3차원 접촉을 하고 있는 뉴런(neuron) 및 신경줄기세포(neural stem cell)를 가지는 뇌조직 세포의 경우 상기 2차원 세포 배양 모델의 한계로 인해서, 살아있는 조직의 공간적 구조와 생화학적 복잡성을 잘 모사하는 3차원 세포 배양 모델에 대한 관심이 높아지고 있다. 3차원 세포 배양 모델은 생체내 상태(situation)를 잘 모방하므로 생체외 실험에서 방향적 성장과 세포-세포 연결의 복잡성을 구현할 수 있고, 더불어 3차원 세포 배양 모델은 2차원 세포 배양 모델에 비하여 개선된 세포 생존(improved cell survival)과 향상된 신경줄기세포 분화(enhanced neuronal differentiation)를 보여준다. 따라서, 3차원 세포 배양 모델은 분자 기반(molecular basis)의 조직 기능을 연구하는데 있어서 2차원 세포 배양 모델 대비 다양한 질병 상태의 신호기전(signaling pathway)과 약물 반응(drug responsiveness)을 잘 포착하는데 유용하다.
최근 생화학 연구분야 전반에 걸쳐 이용되고 있을 뿐만 아니라, 신경과학 분야에서도 그 이용도가 증가하고 있는 미세유체 기술은 단일 칩 또는 기판 상에 적용되어 실험실에서 수행되는 전체 연구과정을 하나의 칩으로 통합하는 것을 가능하게 하였다. 랩온어칩(lab-on-a-chip)과 같은 미세유체칩은 필요한 다양한 기능을 통합하기 위해, 혼합기, 유체 분리 채널 및 밸브 등과 같은 복잡한 차원의 구성을 포함한다. 미세유체에 대한 연구는 세포 기반 연구 및 다른 응용연구의 수행에서 그 사용 빈도가 점진적으로 증가하고 있다. 미세유체에 기반한 연구는 보다 더 적은 부피의 제제를 사용하면서 보다 더 신속하고 감도 높은 탐지 결과를 제공하므로, 통상의 연구실 수준의 분석공정에 비해 여러 가지 장점을 갖는다.
혈액뇌장벽(Blood Brain Barrier: BBB)은 뇌 모세혈관에 특이적으로 존재하는 혈관망으로, 뇌졸중과 같은 허혈성 혈관질환 및 모야모야병, 알츠하이머 치매 등 다양한 뇌질환에서 정상 혈액뇌장벽의 손상이 동반되고 초기에 혈액뇌장벽을 복원해주는 기술은 이러한 질환 치료 및 예방적 치료에 매우 중요한 기술이다. 혈액뇌장벽은 맨 안쪽에 혈관내피세포로 만들어진 미세혈관이 있고, 이를 주피세포(pericyte)가 감싸고 있고, 그 위에 성상세포(astrocytes)의 endfoot이 감싸는 3중막 구조를 하고 있어, 정상 조건에서는 많은 약물 및 면역세포들이 혈액뇌장벽을 통하여 뇌기질로 전달되지 못하도록 하는 장벽을 형성하므로, 뇌환경을 혈액의 변화로부터 차단/보호하는 기능을 수행하고 있다. 그런데 허혈성 뇌졸중의 경우처럼 혈전이 발생하여 혈관을 막게 되면 혈액뇌장벽 및 주위 신경세포들이 허혈상태에 노출되고, 혈액뇌장벽의 기능이 소실되어 혈중 다양한 면역세포 특히 염증 세포들이 뇌기질로 침투하여 다양한 질환을 야기하는 원인을 제공하고, 이로 인한 뇌 기능 손상이 초래되어 다양한 뇌질환이 발생하게 된다. 이 과정에서 특히 주피세포(pericyte)의 기능 소실이 매우 중요한 초기 반응의 하나로 인식되고 있다.
한편, 뇌졸중(stroke)은 전세계적으로 두 번째 많은 사망의 원인이며, 이러한 사망의 약 84%가 허혈성 뇌졸중이 원인이다. 한국에서 뇌졸중은 암 다음으로 두 번째로 빈번히 발생하는 사망의 원인이며, 심장질환보다 더 많이 발생한다. 뇌졸중의 위험요소로는 고혈압, 당뇨병, 노화, 흡연, 고지혈증, 고호모시스테인혈증(hyperhomocysteinemia) 및 혈관의 혈전성향증(thrombophilia)이 잘 알려져 있으며, 몇몇 다른 질환이 허혈성 뇌졸중을 일으킬 수 있다. 허혈성 뇌졸중의 가장 일반적인 원인은 머리에서의 동맥 폐쇄(arterial occlusion)로, 동맥 폐쇄는 주로 죽상동맥경화증(atherosclerosis), 점진적 콜레스테롤 침적(gradual cholesterol deposition) 또는 혈전증(thrombosis)으로 인해 발생한다. 혈관 폐색(occlusion)은 주로 혈전증으 로 인해 발생(53%)하거나 색전증으로 인해 발생(31%)한다. 최근에는 이와 같은 뇌졸중의 치료제로서 다양한 줄기세포 치료제가 시도되고 있으나 (Sarmah, D. et al. Clin Pharmacol Ther. 103, 990-998 (2018); Boese, A. C. et al. Stem Cell Res Ther. 9, 154 (2018); Chen, S. J. et al.. Stem Cells Dev. 19, 1757-1767 (2010)), 동물 뇌졸중 모델이 기술적으로 어렵고 특별히 설계된 비싼 의료 도구가 많이 필요하며, 효능 평가에 시간과 노력이 많이 들기 때문에, 전임상 연구에서 적용하여 다양한 줄기세포 치료제의 뇌졸중 치료 효과를 평가하기 어려운 실정이다. 따라서, 생체 내 뇌 미세혈관계와 유사한 혈액뇌장벽(BBB: Blood-brain barrier)을 재현하기 위한 실험실 내 시스템이 뇌 손상 및 질환의 치료에 작용하는 다양한 줄기세포 치료제 또는 약물을 개발하는데 필수적이다.
본 발명의 목적은 체외 혈액뇌장벽 모사칩을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 체외 혈액뇌장벽 모사칩의 제조방법을 제공하는 것이다.
아울러, 본 발명의 목적은 약물 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.
상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 체외 혈액뇌장벽 모사칩을 제공한다.
또한, 본 발명은 체외 혈액뇌장벽 모사칩의 제조방법을 제공한다.
아울러, 본 발명은 체외 혈액뇌장벽 모사칩을 이용한 약물 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명의 체외 혈액뇌장벽 모사칩의 제조방법으로 제조된 미세유체칩 내에 형성된 혈액뇌장벽 혈관망 구조(BBB on a chip) (체외 혈액뇌장벽 모사칩)은 특정 세포 구성에 의해 기존의 체외 혈액뇌장벽 모사칩에 비해 실제 인간의 생체 내 혈액뇌장벽을 더 유사하게 재현할 수 있으므로, 이를 더 정확한 시험관 내 혈액뇌장벽으로 이용할 수 있으며, 다양한 뇌 질환의 치료에 작용하는 다양한 세포 치료제 또는 약물 개발에 사용될 수 있다.
도 1은 2색 라이브 세포 이미징을 통해 혈관신생 미세유체 칩 상의 인간 BBB-유사 미세혈관계(BBB-like microvasculature)의 재현(reconstruction) 및 각 세포의 모세관 네트워크 상에서의 역할을 확인한 도이다:
A: 혈관신생 미세유체 칩의 개략도;
B: 세포 접종 7일 후 채널 C를 가로지른 혈관신생의 위상차 현미경 이미지 (Scale bar = 100 μm); 및
C 내지 E: hBMECs (PKH-red)와 hPCs (PKH-green), hBM-MSCs (PKH-green) 또는 hACs (PKH-green)의 서로 다른 조합으로 재현된 인간 BBB-유사 미세혈관계의 7일차 2색 라이브 세포 이미지 (화살표: hBMECs와 hPCs 또는 hBM-MSCs의 공동-국소화; 및 원: 미세혈관계의 연접).
도 2는 칩 상의 재현된 인간 BBB-유사 미세혈관계 내의 루멘화된 내피 혈관, 세포 표현형 및 hPCs, hBM-MSC 및 hACs의 혈관 결합을 확인한 도이다:
A: 내피세포 (UEA-lectin) 및 혈관 주위 주피세포 (α-SMA)의 면역형광염색 후 채널 C에서 인간 BBB-유사 미세혈관계의 전체 이미지 (7일차);
B: 재현된 인간 BBB-유사 미세혈관계의 콘포칼 Z-섹션 이미지 (노란색 화살표: α-SMA를 발현하는 hPC 또는 hBM-MSC); 및
C: 칩 상의 인간 BBB-유사 미세혈관계의 3색 콘포칼 이미지 (내피맥관: UEA-lectin 염색 (red), 혈관 주위 주피세포: α-SMA 염색 (green), 성상세포 종말-발: GFAP (yellow)) (Scale bar = 100 μm).
도 3은 칩 상의 인간 BBB-유사 미세혈관계의 구조적 패턴 및 특징에 대한 정량 분석 결과를 나타낸 도이다:
A: 서로 다른 세포 조합 하에 재현된 칩 상의 인간 BBB-유사 미세혈관계 내의 hBMEC-모세혈관 네트워크의 전체 이미지 (백색 선: 혈관신생 시작검, Scale bar =100 μm);
B 및 C: 7일차 혈관 직경 및 혈관 분절 길이의 정량 분석 (n=6);
D: NIH Image J 혈관신생 분석기에 의한 분석 트리 (보라색: 분절, 원: 연접; 녹색: 브랜치, 블루: 메쉬);
E: 총 길이
F: 분절 길이;
G: 브랜치 길이;
H: 연접 수;
I: 메쉬 수;
J: 분절 수; 및
K: 브랜치 수.
도 4는 칩 상의 인간 BBB-유사 미세혈관계에서 밀착 연접 단백질 ZO-1의 발현을 확인한 도이다 (Scale bar = 100 μm):
적색: ZO-1;
녹색: 내피 마커 렉틴(lectin); 및
파란색: 핵.
도 5는 인간 BBB-유사 미세혈관계에서 기저막의 재현을 확인한 도이다:
A 및 B: 칩 상의 BBB-유사 미세혈관계의 기저막 관련 단백질 면역형광 염색 (type IV 콜라겐 및 렉틴: red 및 라미닌: green).
도 6은 칩 상의 인간 BBB-유사 미세혈관계의 투과성을 확인한 도이다:
A: 70 kDa의 FITC-덱스트란의 흐름 이미지 (40초);
B: 10 kDa의 FITC-덱스트란의 시간-경과 형광 흐름 이미지 (5, 40 및 80초) (화살표: 미세혈관 누출 지점); 및
C: 각 미세혈관계의 투과성 계수 (n=3).
도 7은 hBMEC와 단독 또는 공동 배양 하의 hPC 및 hBM-MSC 사이의 주피세포의 기능 및 혈관신생 관련 단백질 발현을 비교한 도이다:
A: α-SMA, desmin, PDGFR-β, CD13, N-cadherin 및 VE-cadherin의 웨스턴 블롯 분석 결과 (칩 상의 세포배양과 유사한 6:1 비율의 hBMECs:hPCs 또는 hBM-MSCs에서);
B: α-SMA의 상대적 발현;
C: desmin의 상대적 발현;
D: PDGFR-β의 상대적 발현;
E: CD13의 상대적 발현;
F: N-cadherin의 상대적 발현; 및
G: VE-cadherin의 상대적 발현.
도 8은 hBMEC와 단독 또는 공동 배양 하의 hPC 및 hBM-MSC 배양 배지 간의 기저막 및 혈관신생 인자 관련 단백질의 발현을 비교한 도이다:
A: laminin-β1, type IV 콜라겐 및 피브로넥틴(fibronectin)의 웨스턴 블롯 분석;
B: VEGF의 ELISA 분석 결과;
C: SDF-1α의 ELISA 분석 결과;
D: TGF-β의 ELISA 분석 결과; 및
E: HGF의 ELISA 분석 결과.
도 9는 본 발명을 통해 구현된 체외 혈액뇌장벽(BBB) 모사칩의 사시도이다.
도 10은 본 발명을 통해 구현된 체외 혈액뇌장벽(BBB) 모사칩의 평면도이다.
이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 구현예로 본 발명을 상세히 설명하기로 한다. 다만, 하기 구현예는 본 발명에 대한 예시로 제시되는 것으로, 당업자에게 주지 저명한 기술 또는 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에는 그 상세한 설명을 생략할 수 있고, 이에 의해 본 발명이 제한되지는 않는다. 본 발명은 후술하는 특허청구범위의 기재 및 그로부터 해석되는 균등 범주 내에서 다양한 변형 및 응용이 가능하다.
또한, 본 명세서에서 사용되는 용어(terminology)들은 본 발명의 바람직한 실시예를 적절히 표현하기 위해 사용된 용어들로서, 이는 사용자, 운용자의 의도 또는 본 발명이 속하는 분야의 관례 등에 따라 달라질 수 있다. 따라서, 본 용어들에 대한 정의는 본 명세서 전반에 걸친 내용을 토대로 내려져야 할 것이다. 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.
본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미로 사용된다. 또한 본 명세서에는 바람직한 방법이나 시료가 기재되나, 이와 유사하거나 동등한 것들도 본 발명의 범주에 포함된다. 본 명세서에 참고문헌으로 기재되는 모든 간행물의 내용은 본 발명에 도입된다.
도 9 및 도 10에 도시된 바와 같이 본 발명의 구조에 대해 살펴보면 다음과 같다.
일 측면에서, 본 발명의 체외 혈액뇌장벽(BBB) 모사칩은 일단에 혈관형성채널유입구와 타단에 혈관형성채널유출구가 형성된 혈관형성채널 (C); 상기 혈관형성채널을 중심으로 싱크채널 (LI)을 매개로 연결된 채 각각 소정 공간이 형성된 한 쌍의 배양액싱크; 상기 혈관형성채널을 중심으로 소스채널 (RI)을 매개로 연결된 채 각각 소정 공간이 형성된 한 쌍의 배양액싱크; 상기 싱크채널과 접하면서 일측에 제1배양채널유입구와 타측에 제1배양채널유출구가 형성된 제1배양채널 (LO); 상기 소스채널과 접하면서 일측에 제2배양채널유입구와 타측에 제2배양채널유출구가 형성된 제2배양채널 (RO);을 포함하되, 상기 제1배양채널, 상기 싱크채널, 상기 혈관형성채널, 상기 제2배양채널 및 상기 소스채널이 각각 접하는 경계에는 각 채널에 포함된 생화학물질들 상호간의 상호작용이 이루어지도록 복수의 미세구조물에 의한 간극이 형성된 것을 특징으로 한다.
일 구현예에서, 상기 배양액싱크에는 배지가 투입되고, 상기 제1배양채널유입구 또는 제2배양채널유입구에는 피브린 젤 및 피더세포(feeder cells)의 혼합물이 투입되며, 상기 혈관형성채널유입구에는 성상세포(astrocytes) 및 피브린젤의 혼합물이 투입될 수 있다.
일 구현예에서, 상기 혈관형성채널에서 혈관 형성이 발생할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 복수의 미세구조물은 100 μm 간격으로 존재할 수 있으며, 간극은 100 μm일 수 있다.
일 구현예에서, 채널의 길이는 3000 내지 5000μm일 수 있으며, 채널의 높이는 100 내지 200μm일 수 있다.
일 구현예에서, 혈관형성채널, 제1배양채널 및 제2배양채널의 너비는 700 내지 900μm일 수 있고, 싱크채널 및 소스채널의 너비는 600 내지 700μm일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 모사칩은 혈관형성채널에 인간 성상세포(hACs) 및 피브린젤을 포함하고, 싱크채널에 EGM-2 배지 및 AM 배지 혼합물을 포함하며, 혈관형성채널 측면의 싱크채널 벽에 인간 뇌 미세혈관 내피 세포 (human brain microvascular endothelial cells, hBMEC) 및 인간 골수유래-중간엽 줄기세포(human bone marrow mesenchymal stem cells, hBM-MSC)를 포함하고, 제2배양채널에 인간 폐 섬유아세포(Human lung fibroblast, hLFs) 및 피브리노겐을 포함하는, 체외 혈액뇌장벽 모사칩일 수 있다.
일 구현예에서, hLFs 및 피브리노겐을 3:1 (w/w)의 비율로 포함할 수 있다.
일 구현예에서, EGM-2 배지 및 AM 배지를 1:1 (v/v)의 비율로 포함할 수 있다.
일 구현예에서, hBMEC 및 hBM-MSC을 6:1 (w/w)의 비율로 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 체외 혈액뇌장벽은 주피세포로서 골수 유래 중간엽줄기세포(hBM-MSCs), 지방 유래 중간엽줄기세포, 혈액유래 중간엽줄기세포, 제대혈 유래 중간엽줄기세포를 포함할 수 있으며, hBM-MSCs를 포함하는 것이 더욱 바람직하고, 이는 hPCs보다 인간-BBB 미세혈관계의 기저막 재현 및 혈관신생 유도가 현저히 우수하다.
일 구현예에서, 제1배양채널에서 제2배양채널으로 VEGF 농도구배가 형성될 수 있다.
일 구현예에서, 싱크채널 측면의 혈관형성채널의 벽에서 혈관신생 발아가 시작될 수 있다.
일 측면에서, 본 발명은 1) 일단에 혈관형성채널유입구와 타단에 혈관형성채널유출구가 형성된 혈관형성채널 (C); 상기 혈관형성채널을 중심으로 싱크채널 (LI)을 매개로 연결된 채 각각 소정 공간이 형성된 한 쌍의 배양액싱크; 상기 혈관형성채널을 중심으로 소스채널 (RI)을 매개로 연결된 채 각각 소정 공간이 형성된 한 쌍의 배양액싱크; 상기 싱크채널과 접하면서 일측에 제1배양채널유입구와 타측에 제1배양채널유출구가 형성된 제1배양채널 (LO); 상기 소스채널과 접하면서 일측에 제2배양채널유입구와 타측에 제2배양채널유출구가 형성된 제2배양채널 (RO);을 포함하되,
상기 제1배양채널, 상기 싱크채널, 상기 혈관형성채널, 상기 제2배양채널 및 상기 소스채널이 각각 접하는 경계에는 각 채널에 포함된 생화학물질들 상호간의 상호작용이 이루어지도록 복수의 미세구조물에 의한 간극이 형성된 미세유체 칩을 제조하는 단계;
2) 제2배양채널에 hLFs, 피브리노겐 및 트롬빈을 주입하는 단계;
3) 혈관형성채널을 hACs 및 피브린젤의 혼합물로 채우는 단계;
4) 배양액싱크에 배지를 채우는 단계;
5) 싱크채널이 위쪽을 향하고 소수채널이 바닥쪽을 향하도록 위치시키는 단계; 및
6) 싱크 유입구로 hBMEC 및 hBM-MSC의 세포 현탁액을 주입하는 단계를 포함하는, 체외 혈액뇌장벽 모사칩의 제조방법에 관한 것이다.
일 구현예에서, hBMEC 및 hBM-MSC을 6:1 (w/w)의 비율로 포함할 수 있다.
일 구현예에서, hBMEC 및 hBM-MSC가 싱크채널의 혈관형성채널 측 벽면에 부착될 수 있다.
일 측면에서, 본 발명은 본 발명의 체외 혈액뇌장벽 모사칩에 약물 후보물질을 처리하는 단계를 포함하는, 체외 혈액뇌장벽 모사칩을 이용한 약물 스크리닝 방법에 관한 것이다.
일 구현예에서, 상기 방법은 약물 후보물질을 처리한 체외 혈액뇌장벽 모사칩과 약물 후보물질을 처리하지 않은 체외 혈액뇌장벽 모사칩의 혈액뇌장벽을 상호 비교하는 단계를 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 약물 후보물질은 파킨슨병, 알츠하이머 치매, 모야모야 병 또는 허혈성 뇌질환 치료제 약물 후보물질일 수 있으며, 허혈성 뇌질환은 뇌중풍 또는 뇌경색일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 약물 후보물질은 줄기세포를 포함한 세포치료제일 수 있다.
일 측면에서, 본 발명은 본 발명의 체외 혈액뇌장벽 모사칩에 약물을 처리하는 단계; 및 BBB 투과도를 평가하는 단계를 포함하는, BBB로의 약물 투과성을 평가하는 방법에 관한 것이다.
일 측면에서, 본 발명은 본 발명의 체외 혈액뇌장벽 모사칩에 뇌졸중을 유도하는 단계; 줄기세포 또는 약물 치료제 후보 물질을 처리하는 단계; 및 BBB의 회복 정도를 정량하는 단계를 포함하는, 뇌졸중 치료제의 평가 방법에 관한 것이다.
일 측면에서, 본 발명은 본 발명의 체외 혈액뇌장벽 모사칩에 후보 세포치료제를 처리하는 단계를 포함하는 세포치료제의 혈액뇌장벽의 재생 유효성을 평가하는 방법에 관한 것이다.
일 구현예에서, 상기 세포치료제는 BMEC(brain microvascular microvascular endothelial cells), BM-MSC(Bone marrow-derived mesenchymal stem cell), 주피세포(pericyte) 또는 성상세포(astrocytes)를 대체하기 위한 세포치료제일 수 있다.
일 구현예에서, BMEC을 대체하기 위한 세포치료제는 골수 유래 혈관내피전구세포(BM-EPC), 지방 유래 혈관내피전구세포, 혈액유래 혈관내피전구세포, 제대혈 유래 혈관내피전구세포, iPS 유래 혈관내피전구세포 및/또는 교차분화 혈관내피전구세포를 포함할 수 있다.
일 구현예에서, BM-MSC 또는 주피세포를 대체하기 위한 세포치료제는 골수 유래 중간엽줄기세포 (MSC), iPS 유래 중간엽줄기세포, 지방 유래 중간엽줄기세포, 혈액유래 중간엽줄기세포, 제대혈 유래 중간엽줄기세포, 중간엽줄기세포 유사 세포 및/또는 다른 조직 유래 주피세포를 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 성상세포를 대체하기 위한 세포치료제는 지방 세포 및 골수 세포로부터 직접 분화한 성상세포, iPS 유래 성상세포, 교차분화 성상세포 및/또는 내재성 성상세포를 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 세포치료제는 줄기세포 치료제일 수 있으며, 상기 줄기세포는 배아줄기세포, 성체줄기세포, 유도만능줄기세포, 배아생식세포 및 배아종양세포로 이루어진 군 중 어느 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 성체줄기세포는 조혈모세포, 신경줄기세포 및 중간엽줄기세포로 이루어진 군 중 어느 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 조혈모세포는 탯줄 또는 골수로부터 분리될 수 있으며, 상기 신경줄기세포는 뇌조직으로부터 분리할 수 있고, 중간엽줄기세포 골수, 지방조직 또는 탯줄로부터 추출할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 용어, "세포치료제"란 개체로부터 분리, 배양 및 특수한 조작을 통해 제조된 세포 및 조직으로, 치료, 진단 및 예방의 목적으로 사용되는 의약품으로서, 세포 혹은 조직의 기능을 복원시키기 위하여 살아있는 자가, 동종 또는 이종세포를 체외에서 증식 선별하거나 다른 방법으로 세포의 생물학적 특성을 변화시키는 등의 일련의 행위를 통하여 이러한 세포가 질병의 치료, 진단 및 예방의 목적으로 사용되는 의약품을 의미한다.
본 발명에서 용어, "줄기세포 (stem cells)"란 조직을 구성하는 각 세포로 분화 (differentiation) 되기 전 단계의 미분화 세포들을 총칭하는 것으로, 특정 분화 자극 (환경)에 의해 특정 세포로 분화가 진행되는 세포를 의미한다.
본 발명에서 용어, "중간엽 줄기세포 (mesenchymal stem cells, MSCs)"는 중간엽 줄기세포 혹은 성체 줄기세포라고도 하며 배아 이외의 조직에서 분리 및 배양된 줄기세포를 통칭하는 것이다. 간엽줄기세포는 이미 분화가 완료된 대부분의 조직에 소량으로 존재하는 것으로 현재까지 제대혈, 탯줄, 치아, 눈, 태반, 모낭, 허파, 간 등 연구된 거의 모든 조직에서 이의 존재가 확인된 바 있다.
일 측면에서, 본 발명은 본 발명의 체외 혈액뇌장벽 모사칩의 혈관형성채널유입구에 성상세포를 대체할 수 있는 후보 세포를 투입하는 단계; 및 상기 모사칩의 혈관형성채널 측면의 싱크채널 벽에 미세혈관 내피 세포(brain microvascular endothelial cells, BMEC), 주피세포 및 BM-MSC(Bone marrow-derived mesenchymal stem cell)로 구성된 군 중 어느 하나 이상의 세포를 대체할 수 있는 후보 세포를 포함시키는 단계를 포함하는 후보 세포의 혈액뇌장벽의 재생 유효성을 평가하는 방법에 관한 것이다.
일 구현예에서, 상기 방법은 하기로 이루어진 군 중 어느 하나 이상의 단계를 추가로 포함할 수 있다:
1) 혈액뇌장벽 모사칩의 내피미세혈관의 재현을 확인하기 위하여, 내피 미세혈관의 직경 및 웹-유사 구조를 확인하는 단계;
2) 상기 혈액뇌장벽 모사칩의 미세혈관계 내의 루멘화된 내피 혈관, 후보 세포들의 표현형 및 후보 세포들의 혈관 결합을 확인하는 단계;
3) 상기 혈액뇌장벽 모사칩의 미세혈관계의 혈관의 직경, 혈관의 총 길이, 분절길이, 브랜치 길이, 연접 수, 메쉬 수, 분절 수 및 브랜치 수를 확인하는 단계;
4) 상기 혈액뇌장벽 모사칩의 미세혈관계에서 밀착 연접을 확인하는 단계;
5) 상기 혈액뇌장벽 모사칩의 미세혈관계의 투과성을 확인하는 단계; 및
6) 상기 상기 미세혈관 내피 세포, 주피세포 또는 BM-MSC를 대체할 수 있는 후보 세포의 기저막 생성 관련 단백질 또는 혈관신생 관련 단백질 발현양을 확인하는 단계.
일 구현예에서, 상기 단계 5)의 기저막 재현 관련 단백질 또는 혈관신생 관련 단백질은 α-SMA, desmin, PDGFR-β, CD13, N-cadherin, VE-cadherin, laminin-β1, type IV 콜라겐, 피브로넥틴(fibronectin), VEGF, SDF-1α, TGF-β 및 HGF로 구성된 군 중 어느 하나 이상일 수 있다.
하기의 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 그러나 하기 실시예는 본 발명의 내용을 구체화하기 위한 것일 뿐 이에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 혈관신생 미세유체 칩을 이용한 BBB-유사 미세혈관계 제작
1-1. 미세유체 기기 제작
미세유체 기기를 소프트 리소그래피(soft lithography) 및 복제 몰딩(replica molding) 방법으로 제작하였다. 구체적으로, 포토레지스트 SU-8 (MicroChem, Newton, MA, USA)를 이용한 실리콘 웨이퍼 상에 미세구조를 패터닝하는 포소리소그래피(photolithography) 공정으로 몰딩용 마스터를 제작하고, 10:1 (w/w)의 PDMS 염기 및 경화제 혼합물을 혼합하여 PDMS(polydimethylsiloxane) (Sylgard 184, Dow Corning, Midland, MI, USA) 프리폴리머(prepolymer)를 준비하였다. 혼합물을 90 ℃ 핫 플레이트에서 30분 동안 열 경화시켜 마스터의 패턴에 캐스팅하였다. 경화된 PDMS 조각을 마스터로부터 분리하고, 검체 펀치를 이용하여 주입 포트 및 배지 저장소를 펀칭하였다. PDMS 조각을 무-잔류물 테이프(residue-free tape)로 세척하고 커버 글라스와 산소 플라즈마 처리하였다. 플라즈마 처리 후, PDMS 조각을 글라스 커버슬립에 결합시켜 공유 결합을 형성하였다. 마이크로채널 상의 하이드로겔 패터닝에 필요한 소수성을 복원시키기 위해 제작된 기기를 2일 동안 70 ℃로 건조시켰다. 세포를 로딩하기 전에, 칩을 UV에 20분 동안 노출시켜 살균하였다. 미체유체 기기는 LO(left outer), LI(left inner), C(center), RI(right inner) 및 RO(right outer)의 5개의 채널로 구성되었다. 상기 미세유체 기기의 LO 및 RO 채널은 피브린 젤 및 혈관 형성을 위한 VEGF를 분비하는 피더세포(feeder cells)의 혼합물을 접종 (분주)될 채널이며, LI 및 RI 채널은 배지 채널로 채널의 상단과 하단은 저장소와 연결된다. 채널 C는 혈관 형성이 발생하는 주요 채널이다. 하나의 미세유체 기기에 4개의 저장소가 있으며, 저장소의 상단이 열려 배지를 보충할 수 있다. 모든 채널의 길이는 3700 μm이고 높이는 150 μm이다. 또한, 채널 C, RO 및 LO의 너비는 800 μm이고, LI 및 RI의 너비는 650 μm이다. 아울러, 100 μm의 기공을 가진 포스트(post)가 각 채널을 분할하기 위해, 채널 C, RO 및 LO 사이의 경계에 100 μm 간격으로 존재한다.
1-2. 미세유체 혈관신생(angiogenesis) 모델 제작
상기 실시예 1-1에서 제작한 기기에 서로 다른 세포 구성 요소들을 다양한 조합으로 분주하여 인간 BBB-유사 미세혈관계(microvasculature)를 형성한 미세유체 혈관 모델을 칩 상에 제작하고 (도 1A), 이를 두 가지 색 형광 라이브 세포 이미징으로 시각화하여 확인하였다. 구체적으로, 소 혈장 유래 피브리노겐 (10 mg/ml, Sigma Aldrich)을 DPBS(Dulbecco's phosphate-buffered saline) (Welgene)에 희석하고 아프로티닌(aprotinin) (4 KIU/ml, Sigma Aldrich)과 25:4의 비율로 혼합하였다. 미세유체 기기에 걸쳐 VEGF 농도구배를 수립하기 위해, hLFs(Human lung fibroblast) (최종 세포 밀도: 6×106 cells/ml)를 피브리노겐과 3:1의 비율로 혼합하고 RO 채널에 주입하기 직전에 트롬빈 (Sigma Aldrich)을 50:1의 비율로 빠르게 첨가하여 최종 농도가 1 U/ml가 되도록 혼합하여 3분 내에 피브린 젤을 제작하였다. BBB-유사 미세혈관계(microvasculature)에 대한 뇌 실질(parenchyma)를 시뮬레이션하기 위해, 채널 C를 hAC(human astrocytes) (최종 세포 밀도: 4.5×106 cells/ml) 및 피브린 젤의 혼합물로 채웠다. 미세유체 기기에서 BBB-유사 미세혈관계의 성장 패턴을 관찰하기 위해, 상기 세포들은 접종하기 전에 PKH 그린 및/또는 PKH 레드 (Sigma Aldrich)로 표지하였다. 세포 접종 후, 두 개의 상부 저장소를 1:1 비율의 EGM-2 및 AM 배지 혼합물로 채우고, 두 개의 하부 저장소를 부드럽게 흡인하여 소수성 배지 채널을 적셨다. 그 후, 네 개의 저장소를 배지로 채우고 37℃에서 인큐베이션하였다. 하루 뒤, 네 개의 저장소의 배양 배지를 제거한 뒤, 기기를 수직으로 기울여 LI 채널이 위쪽을 향하고 RI 채널이 바닥쪽을 향하도록 위치시켰다. 뇌 실질-모방 채널 C를 통한 VEGF 농도 구배에 따른 지향성(directional) 혈관신생을 위해, hBMEC, hBMEC+hPC (6:1) 및 hBMEC+hBM-MSC (6:1)의 세포 현탁액 (최종 세포 밀도 5×106 cells/ml) 5 μl를 채널 LI와 연결된 저장소 중 하나에 주입하고 (일반적인 정상 뇌의 BBB는 약 3:1의 비율로 내피 세포(endothelial cells) 및 주피 세포(pericytes)로 구성되어 있으나, 본 미세 유체 혈관신생 모델에서는 hPCs 및 hBM-MSCs가 더 높은 세포 증식 및 매트릭스-분해능(matrix-degrading capacity)을 가지므로 비율을 6:1로 감소시킴), 37 ℃에서 30분 동안 인큐베이션하여 채널 C의 왼쪽 측면 포스트에 세포가 부착되도록 유도하였다. 세포 부착 후, 네 개의 저장소를 배양 배지 130 μl로 채우고, 미세 유체 기기 내부에서 자발적인 배지 흐름을 만들기 위해 RI 채널에 연결된 두 개의 저장소에 배지 10 μl를 추가하였다. 그 후, in vitro BBB-혈관신생을 위해, 미세유체 기기를 37 ℃ 및 5% CO2의 조건에서 7일 동안 배양하였으며, 배양 배지는 2일마다 교체하였다. 이를 통해, 서로 다른 세포 구성을 가진 인간 BBB-유사 미세혈관계를 확립하였다.
실시예 2. 미세유체 칩에서의 미세유체 혈관신생(angiogenesis) 모델 수립 확인
2-1. 세포 이동 확인
정단 세포(tip cell) 이동 및 미세혈관계 구조의 동역학을 7일동안 위상차 현미경으로 관찰한 결과, 5개 군 모두에서 정단 세포가 VEGF 농도 구배를 향해 초기 세포 접종으로부터 C 채널로 발아(sprout)되었다. 그러나, 이의 이동은 3일차에 hBMEC 단독 군 또는 hBMEC+hPC 군에 비해 hBMEC+hBM-MSC 군에서 현저히 빠르게 나타났으며, 이 이동은 5일차에 전체 채널 C를 통과하는 것으로 나타났고 7일차에 미세혈관계의 성숙 및 리모델링이 진행되는 것으로 나타났다 (도 1B). 상기 결과는 hBM-MSCs가 hPCs보다 정단 세포의 형성 및 내피 세포의 이동에서 더 잘 기능할 수 있음을 시사한다.
2-2. 주피세포로서의 작용 확인
내피 미세혈관계의 재현에서 hBM-MSCs의 역할을 확인하기 위해, PKH 그린 또는 PKH 레드 라이브-세포 표지 및 이미징을 통해 시각화하여 BBB-유사 미세혈관계의 성장 패턴을 관찰한 결과, PKH 그린-표지된 hPCs 및 PKH 그린-표지된 hBM-MSCs는 7일차에 모두 PKH 레드-표지된 hBMECs 미세혈관계에 잘 위치하였으며, 이의 결합(incorporation)이 내피 미세혈관계의 직경을 더 작아지게 하고 모세혈관(capillary) 웹-유사 구조(web-like structure)를 더욱 풍부하게 만들었다 (도 1C). 특히, 미세혈관계에서 대부분의 PKH-그린 표지된 hBM-MSCs는 PKH 레드-표지된 hBMECs 상에 매우 가깝게 부착되어 있었으며, 이는 hPCs보다 더 풍부한 것으로 나타났다. 따라서, 상기 결과는 hBM-MSCs가 hBMEC-미세혈관계 상에서 hPCs보다도 더욱 효과적으로 주피세포(pericyte)로서 작용할 수 있음을 나타내며, 이의 기능은 hPCs의 존재와 무관함을 확인할 수 있었다.
2-3. 세포 구성 요소 추적
hBMEC-미세혈관계 상에서 개별 세포 구성 요소들을 추적하기 위해, hBMECs를 PKH 레드로 표지하고 hPCs, hBM-MSCs 및 hACs를 PKH 그린으로 표지하여 미세유체 혈관신생 모델을 관찰하였다. 그 결과, 미세유체 혈관신생 모델에서 hACs의 결합은 hBMEC-미세혈관계의 직경을 더욱 작게 만들었으며, 모세혈관 웹-유사 구조를 증가하게 만들었다 (도 1D 및 E). 특히, 혈관 직경의 감소는 hPCs가 결합된 BBB-유사 미세혈관계보다 hBM-MSCs-결합된 BBB-유사 미세혈관계에서 더욱 두드러졌다. BBB-유사 미세혈관계에서 PKH 그린-표지된 hACs는 대부분 겔 내에 함침되어 존재하였으나, 일부는 미세혈관계쪽으로 늘어져 있어, BBB-미세혈관계로의 성상세포(astrocyte) 종말-발(end-foot) 투영(projection)을 시사하였다. 또한, hACs의 결합으로 인해 혈관 연접(vessel junction)의 수가 증가한 것으로 나타났다.
즉, 상기 실시예를 통해 인간 BBB-유사 미세혈관계가 미세유체 칩 상에서 성공적으로 재현되었으며, 이 시스템은 hBM-MSCs와 같은 BBB 재현에서 혈관 주피세포로서의 후보 세포 치료제의 역할뿐만 아니라, in vitro BBB 구조(architecture)의 확립에 대한 다른 세포 구성 요소의 기여도를 추정하는데 적합한 것을 알 수 있다.
실시예 3. 칩 상의 BBB-유사 미세혈관계에서 주피세포로서의 hBM-MSCs와 성상세포 종말-발의 상호작용 확인
BBB-유사 미세혈관계 구조 내의 세포 표현형을 확인하기 위해, 내피맥관(endothelial tubes)을 렉틴으로, 주피세포를 α-SMA로 성상세포 종말-발을 GFAP로 염색하였다. 구체적으로, 상기 실시예에서 제작한 미세유체 기기 내의 BBB-유사 미세혈관계에 30μl의 3.7% 포름알데하이드 (Sigma Aldrich)를 상단의 두 저장소에 첨가하여 15분 동안 고정시켰다. 그 후, 0.2% Triton X-100 (Sigma Aldrich) (in PBS)을 20분 동안 처리하여 투과성으로 만들고 3% FBS (Sigma Aldrich) (in PBS)를 1시간 동안 처리하여 비특이적 결합을 차단하였다. 내피 염색을 위해, dylight 594 (Vector, Burlingame, CA, USA, 1:200) 또는 Fluorescein (Vector, 1:200)가 컨쥬게이트된 렉틴(lectin)을 적용하였으며, 핵은 DAPI (Sigma Aldrich, 1:500)로 37 ℃에서 1시간 동안 염색하였다. 염색 절차를 위한 모든 시약은 상단의 두 저장소에 첨가하였다. 염색 후 이미징 동안 4개의 저장소를 PBS로 채워 배지 채널의 건조를 방지하였다. 또한, 면역형광 염색을 위해, 일차 항체로 αSMA (Dako, Santa Clara, CA, 1:100) 및 GFAP (Abcam, Cambridge, MA, USA, 1:500)를 4 ℃에서 2일 동안 처리하고 이차 항체로 고트 항-마우스 Alexa 488 (Invitrogen, Waltham, MA, USA, 1:500), 고트 항-래빗 Alexa 488 (Invitrogen, 1:500), 고트 항-마우스 Alexa 546 (Invitrogen, 1:500) 및 고트 항-래빗 Alexa 647 (Invitrogen, 1:500)를 각각 4 ℃에서 하룻밤 동안 처리하였다.
저배율에서 관찰한 결과, 렉틴-양성 내피 모세혈관 유사 네트워크의 전체 모습 및 α-SMA-양성 주피세포 부착(apposition)이 관찰되었으며, PKH로 표지된 미세혈관계에서 관찰된 것과 유사하게, hBM-MSCs 결합이 혈관 직경을 감소시키고 혈관 밀도 및 네트워크 형성을 증가시키는 것으로 나타났으며, 이는 hACs의 존재와 상관없이 hPCs보다 현저히 효율적이었다 (도 2A). 고배율에서 관찰한 결과, 루멘화된(lumenized) hBMEC 혈관이 명확하게 감지되었으며, 콘포칼 Z-섹션 이미징에 의해 내피 혈관의 기저측부(abluminal) 표면 상의 α-SMA-양성 주피세포의 밀접한 부착이 hPCs 및 hBM-MSCs 결합된 미세혈관계 모두에서 발견되었다 (도 2B). 또한, hBM-MSCs의 첨가가 hPCs보다 hBMEC-미세혈관계의 더 작은 혈관 직경 및 더 높은 모세혈관 밀도를 초래했다. 아울러, GFAP-양성 분기된(ramified) 성상세포 종말-발 투영 및 이들의 혈관으로의 밀접한 부착 또한 hPCs 또는 hBM-MSCs 결합된 미세혈관계에서 검출되었다 (도 2C). 따라서, hBM-MSCs가 α-SMA를 발현하는 내피-포위(endothelial-encircling) 주피세포로서 BBB-유사 미세혈관계로 결합될 수 있으며, 이는 더욱 생체 내 BBB에 유사한 BBB-유사 미세혈관계의 구조에 영향을 미치는 것을 확인할 수 있다.
실시예 4. 미세유체 칩에 재현된 BBB-유사 미세혈관계의 구조 특성 정량 분석
충분한 산소 및 영양 성분을 조직으로 효과적으로 공급하기 위해서는 모세혈관 미세 웹-유사 구조(capillary fine web-like architecture)가 매우 중요하므로, 본 발명의 미세유체 칩 상의 BBB-유사 미세혈관계의 혈관 직경을 정량 분석하기 위해, 7일차에 내피 미세혈관계의 내강(luminal) 측을 렉틴으로 염색하고, 5개 군 (hBMEC, hBMEC+hPC, hBMEC+hBM-MSC, hBMEC+hPC+hAC 및 hBMEC+hBM-MSC+hAC 군)의 콘포칼 이미지를 기반으로 혈관 신생 시작점으로부터 2/3 지점에서 혈관 너비를 측정하였다 (인간 뇌 모세혈관의 직경은 약 5-10 μm) (도 3A). Leica DMI 4000 B 형광 현미경 (Leica Microsystems, Wetzlar, Germany) 및 Nikon Ti2-E 도립 현미경 (Nikon, Tokyo, Japan)이 미세혈관계 이미징에 사용되었으며, 콘포칼 이미지는 Fiji 소프트웨어로 분석되었다. 여기에서, Z-섹션 이미지의 전체 스택(stack)에 동시에 적어도 두 개의 혈관이 포함되어 있으므로, Z-섹션 이미지를 혈관 네트워크 패턴을 기반으로 두 개의 파트로 나누고 2D 이미지로 스택킹하였다. in vitro 재현된 미세혈관계의 구조적 품질과 in vivo BBB와의 유사성을 추정하기 위해 중요한 미세혈관 구조에 대한 다른 변수들을 확인하기 위해, 미세 웹 유사 모세혈관 네트워크 및 혈관 밀도를 추정하기 위한 중요한 변수로서 고려되는 분절(segment) (양쪽 끝에서 두 개의 혈관 연접으로 구분되는 혈관)의 길이를 확인하였다. 분절 길이는 NIH Image J 소프트웨어로 분석하였고, 혈관신생 분석기로 분석된 총 길이, 분절 길이, 브랜치(branch) 길이, 및 메쉬(mesh), 세크먼트 및 연접(junction)의 수는 image J 소프트웨어로 분석하였다.
그 결과, 혈관 너비는 hBMEC 단독 군에서 78.63±16.13 μm, hBMEC+hPC 군에서 46.77±5.05 μm, hBMEC+hBM-MSC 군에서 28.2±2.99 μm, hBMEC+hPC+hAC 군에서 31.71±3.78 μm 및 hBMEC+hBM-MSC+hAC 군에서 21.58±2.11 μm로 나타났다 (도 3B). hBM-MSCs가 hPCs에 비해 혈관 수축에 현저히 효과적으로 작용하는 것으로 나타났으며, 성상세포 또한 혈관을 가늘게 만드는데(thinning) 어느 정도 기여하는 것으로 나타났고, 이의 효과는 hBMEC+hPC+hAC 군의 미세혈관계에서 더 잘 관찰되었다. 또한, 여러 개의 짧은 분절는 미세혈관계에서 더 미세한 네트워크 및 더 높음 혈관 밀도를 생성할 수 있으므로, 이를 혈관신생 분석기로 분석하여 확인한 결과, 각 군의 혈관 네트워크에서 평균 분절의 길이는 hBMEC 군에서 374.1±25.28 μm, hBMEC+hPC 군에서 322.1±20.1 μm, hBMEC+hBM-MSC 군에서 187.6±4.26 μm, hBMEC+hPC+hAC 군에서 193.2±4.86 μm 및 hBMEC+hBM-MSC+hAC 군에서 169.5±3.735 μm로 나타났다 (도 3C 및 D, Table S1, and Supplementary figure 1). 특히, hBMEC-미세혈관계에서 hBM-MSCs 결합에 의해 분절의 길이가 가장 극적으로 감소하였다 (374.1±25.28 μm에서 187.6±4.26 μm). 또한, 성상세포는 분절 길이를 더 줄일 수 있는 것으로 나타났으며, 이 효과는 hBM-MSCs-결합된 미세혈관계 (187.6±4.26 μm에서 169.5±3.735 μm)보다 hPCs-결합된 미세혈관계 (322.1±20.1 μm에서 193.2±4.86 μm)에서 더 강하게 나타나, 생체 내 BBB에서 관찰된 것에 더 유사한 것을 확인하였다. 또한, 미세 웹-유사 네트워크의 구조적 성숙도와 양의 상관 관계가 있는 총 혈관 길이 (도 3E), 총 분절 길이 (도 3F), 연접 수 (도 3H), 메쉬 수 (도 3I) 및 분절 수 (도 3J)와 미성숙 혈관 네트워크와 관련된 총 브랜치 길이 (도 3G) 및 브랜치 수 (도 3K)를 측정하였다. 그 결과, hBMEC+hPC+hAC 및 hBMEC+hBM-MSC+hAC로 각각 재현된 BBB-유사 미세혈관계는 hBMEC 단독, hBMEC+hPC 및 hBMEC+hBM-MSC로 각각 재현된 BBB-유사 미세혈관계에 비해 연접, 메쉬 및 분절 수가 더 높게 나타났으며, 브랜치 수는 더 낮게 나타났다. 이러한 구조적 특성들은 hPCs 및 hBM-MSCs 간에 유의미한 차이를 보이지 않아, 성상세포가 미세 웹-유사 모세혈관 네트워크를 성숙시키는데 가장 중요한 역할을 하는 것을 나타냈다. 또한, hBMEC+hBM-MSC 군에 비해 hBMEC+hPC 군에서 더 긴 브랜치 길이 (도 3G) 및 더 많은 브랜치 수 (도 3K)가 관찰되었으나, hACs를 hPCs-결합된 hBMEC-미세혈관계에 첨가함으로써 브랜치 길이 및 브랜치 수를 현저하게 감소시킬 수 있었으며, 이를 통해 hACs가 미세혈관계의 성숙에서 더 중요한 역할을 할 수 있음을 유추할 수 있었다.
실시예 5. 미세유체 BBB-유사 미세혈관계에서 hPCs 및 hBM-MSCs의 주피세포로서의 역할 확인
5-1. 밀착 연접(tight junction) 확인
BBB의 특정 표현형 특성 중 하나인 내피 세포 간의 밀착 연접 형성을 확인하기 위해, Alexa 594 (Invitrogen, 1:100)로 컨쥬게이트된 항-ZO-1 항체를 일차 항체로 이용하여 상기 실시예 3에서와 같이 면역형광 염색 분석하여 밀착 연접 단백질인 ZO-1의 발현을 7일차에 hBMEC 단독 군, hBMEC+hPC+hAC 군 및 hBMEC+hBM-MSC+hAC 군을 각각 이용한 칩의 미세혈관계에서 확인하였다. 그 결과, hBMEC 단독 군에서 ZO-1 발현은 주로 세포의 경계에 국소화(localize)되지 않고 관형(tubular) 구조에 있지 않은 세포질에 확산되어 있었다. 반면, hBMEC+hPC+hAC 군 및 hBMEC+hBM-MSC+hAC 군에서 ZO-1 발현은 세포의 경계에만 국소화되어, 인접한 내피 세포 사이에 밀착 연접 라이닝이 나타났다 (도 4).
5-2. BBB-유사 미세혈관계의 성숙도 확인
뇌 BBB에서, 내피맥관의 기저측부 측 및 미세혈관 주피세포는 내피 기저막으로 단단히 둘러싸여 있으므로, BBB 미세혈관계의 성숙도의 추정하는데 중요한 기준으로서 BBB-유사 미세혈관계를 따라 기저막의 연속적인 커버리지(coverage)를 확인하기 위해, 기저막의 주요 성분인 type IV 콜라겐 및 라미닌의 발현을 면역형광 염색으로 시각화하였다. 구체적으로, type IV 콜라겐 (Dako, 1:100) 및 라미닌(Laminin) (Dako, 1:100)를 일차 항체로서 이용하여 상기 실시예 3에서와 같이 면역형광 염색 분석하였다.
그 결과, hBMEC로 제작한 미세혈관계의 경우에만 type IV 콜라겐이 미세혈관계의 기저측부 표면에서 이산적으로(discretely) 국소화되지 않았다. 반면, 모세혈관 웹-유사 미세혈관계를 확인했을 때, hPCs 또는 hBM-MSCs가 결합된 네 개의 군 모두에서 미세혈관계를 따라 type IV 콜라겐이 이산적으로 검출되었으나, 결합되지 않은 주피세포 또는 성상세포에서는 이산적으로 검출되지 않았다 (도 5A). 또한, 라미닌의 이산 기저측부 국소화는 hBMEC+hPC+hAC 및 hBMEC+hBM-MSC+hAC의 BBB-유사 미세혈관계에서도 주목되었으며, 그것은 또한 렉틴-양성 미세혈관계로만 공동-국소화되었다 (도 5B). 이를 통해, 미세유체 BBB-유사 미세혈관계에 투입된 hPCs 및 hBM-MSCs 모두 미세혈관계를 따라 밀착 연접 및 기저측부막의 재형성을 복원함으로써 BBB 구조의 성숙에서 BBB 주피세포로서 역할을 하는 것으로 나타났다.
실시예 6. 칩 상의 BBB-유사 미세혈관계의 혈관의 관류 확인
BBB 붕괴시 혈액 내 알부민이 뇌 실질로 확산되므로 다양한 전임상 연구에서 생체 내 BBB에서 알부민의 누출을 확인한다. 따라서, 이와 같은 BBB-유사 미세혈관계의 관류(perfusion)를 실현하기 위해, 두 가지 크기의 FITC-덱스트란 (10 kDa 및 70 kDa FITC-dextran) (Sigma Aldrich)을 채널 LI에 적용하고 시간-경과 이미징을 기록하여, 미세유체 기기에서 BBB-유사 미세혈관계의 혈관 투과성을 시각화하였다. 구체적으로, BBB-유사 미세혈관계의 내피 내강(endothelial lumen)을 dylight 594 (Vector, 1:200)가 컨쥬게이트된 렉틴으로 30분 동안 라이브-염색하여 시각화하였다. 모든 저장소를 PBS로 채운 후, 5μl의 FITC-덱스트란을 채널 LI에 연결된 저장소 상단에 추가하였다. 이미지는 형광 현미경 하에서 80초 동안 5초마다 캡쳐되었다. 투과율 계수는 하기 수학식 1에 따라 계산되었다:
Figure 112021033521630-pat00001
[LW: 혈관 주위 영역 및 미세혈관 영역을 분리하는 혈관 벽의 길이; IV: 미세혈관계의 내부의 평균 강도; 및 I: 혈관 주위 영역의 총 강도.]
그 결과, 알부민의 크기와 유사한 분자 크기를 가진 70 kDa FITC-덱스트란이 모든 군의 미세혈관계에서 채널 C를 통과하여, 지속적인 관류 가능한 혈관 네트워크를 형성함을 확인하였다 (도 6F). 이에, 여러 군의 미세혈관계의 투과성 장벽 기능을 비교하기 위해, hBMEC-미세혈관계를 형광 렉틴 염색하여 라이브-세포 이미징으로 시각화한 결과, 10 kDa FITC-덱스트란이 채널 LI으로 흐르는 것을 확인하였다. 시간-경과에 이미징으로 확인한 결과에서, FITC-덱스트란은 5초 내에 채널 C의 미세혈관계로 들어갔으며, 10 KDa FITC-덱스트란은 hBMEC 군에서 40초에 관찰된 반면, hBMEC+hPC+hAC 군 및 hBMEC+hBM-MSC+hAC 군 모두에서 누출이 관찰되지 않았고 80초에 누출이 시작되었다 (도 6B). 10kDa FITC-덱스트란의 투과율 계수는 hBMEC 군에서 3.16±0.58×10-5 cm/s, hBMEC+hPC+hAC 군에서 1.38±0.23×10-5 cm/s 및 hBMEC+hBM-MSC+hAC 군에서 0.96±0.13×10-5 cm/s로 나타나 (도 6C), hPCs 또는 hBM-MSCs와 같은 혈관 주위 세포, 및 hACs를 모집함으로써 hBMEC-미세혈관계의 투과율 계수가 생체 내 BBB 투과율 계수 (0.31 × 10-6 cm/s)에 가까운 수준으로 현저히 감소하는 것을 알 수 있다.
실시예 7. hBM-MSCs를 이용한 BBB-유사 미세혈관계에서의 주피세포의 기능 및 혈관신생 우수성 확인
7-1. hPCs 및 hBM-MSCs의 혈관신생 기능 관련 단백질 발현 비교
본 발명의 칩 상의 BBB-유사 미세혈관계에서 혈관 주위 주피세포로서 hBM-MSCs가 hPCs보다 더 나은 기능적 역할을 하는 이유를 확인하기 위해, 주피세포의 표현형 및 이의 혈관 주위 모집(recruitment)과 관련된 단백질의 발현을, 미세유체 혈관신생 칩 상에서와 유사한 단일 세포 배양 및 공-배양 조건 하에 (1:1의 EGM2 및 AM의 혼합물에서 hBMEC+hPC, hBMEC+hBM-MSC, hPC, hBM-MSC 및 hBMEC) 웨스턴 블롯 분석으로 확인하였다. 구체적으로, hPC 및 hBM-MSC를 단독 배양 및 hBMEC와의 공동 배양 조건에서, 주피세포 기능에 중요한 단백질 α-SMA, PDGFR-β, CD13, N-cadherin 및 desmin, 내피 특이적 단백질 VE-cadherin, 기저막 재현 및 세포 이동을 위한 세포외기질(extracellular matrix) 단백질 라미닌, type IV 콜라겐 및 피브로넥틴(fibronectin)의 발현을 비교하였다. 미세유체 혈관신생 모델에서와 유사하게, 다섯 군의 세포 배양 군 (hPCs 단독, hBM-MSC 단독, 1:6 비율의 hPC+hBMEC, 1:6 비율의 hBM-MSC+hBMEC 및 hBMEC 단독)을 최종 세포 밀도가 100 mm 세포 배양 디쉬 당 2×105 세포가 되도록 분주한 뒤, 1:1 비율의 EGM2 및 AM 배지로 배양하였다. 배양 3일 후 세포를 파쇄하고 조정 배지(conditioned medium)를 수집하였다. 세포 파쇄물을 1% SDS (Sigma Aldrich) 및 2mM PMSF (Sigma Aldrich)를 함유하는 파쇄 버퍼 (Cell signaling technology, Danvers, MA, USA)로 준비하고, 세포 파쇄물을 6-10% SDS-PAGE로 분리하고 니트로셀룰로오스 멤브레인으로 옮긴 뒤 5% 스킴밀크 (TBS-T)로 블로킹하였다. 그 후, 일차 항체로서 α-Tubulin (Sigma Aldrich, 1:4000), α-SMA (Dako, 1:1000), N-cadherin (Invitrogen, 1:1000), PDGFR-β (Abcam, 1:5000), CD13 (Santa Cruz, Dallas, TX, USA, 1:400), desmin (Abcam, 1:3000), VE-cadherin (Cell signaling technology, 1:1000), type IV collagen (Abcam, 1:5000), fibronectin (MP biomedicals, Santa Ana, CA, USA, 1:1000) 및 laminin-β1 (Santa Cruz, 1:1300)를 이용하여 4 ℃에서 하룻밤 동안 인큐베이션하였다. 그 후, 이차 항체로 고트 항-래빗 HRP (Bio-rad, Hercules, CA, USA, 1:5000) 및 고트 항-마우스 HRP (Bio-rad, 1:3000)와 1시간 동안 인큐베이션하고 ECL 신호를 Fusion SL 3500 WL imaging system (Vilber Lourmat, Marne-la-Vallee, France)로 검출하였다.
그 결과, α-SMA, PDGFR-βN-cadherin 및 CD13와 같은 내피 모집된-주피세포들의 기능적 마커가 hPCs보다 hBM-MSCs에서 더 높게 발현되었으며, 이들 단백질이 내피 공-배양 하에 하향조절되는 것으로 나타난 반면, desmin 및 VE-cadherin 발현 패턴은 변화하지 않은 것으로 나타났다 (도 7). 이를 통해, hBM-MSCs 또는 hPCs의 내피와의 접촉이 서로 협력하여 내피 맥관을 둘러싸는 주피세포로 분화시키고 성숙한 모세혈관 네트워크 구조를 안정화시킬 수 있음을 알 수 있다.
7-2. 기저막 재현 관련 단백질 발현 및 혈관신생 인자 비교
기저막의 재현은 성숙한 모세혈관 네트워크의 재형성에서 매우 중요하므로, 기저막의 두 가지 중요한 구성 요소인 라미닌 및 type IV 콜라겐, 및 세포 이동 및 내피 세포의 생존을 위한 이펙터(effector)인 피브로넥틴의 발현을 hBMEC와 단일 또는 공동 배양 하에 hPC 및 hBM-MSC에서 웨스턴 블롯 분석으로 비교하였다. 그 결과, 라미닌-β1은 내피 세포 및 주피세포에서 발현되는 공통 소단위로, 이는 주로 hBMEC에서 발현된 반며, type IV 콜라겐은 hBMEC보다 hPC 및 hBM-MSC에서 더 많이 발현되고 있어, 기저막 재현에서 내피세포와 주피세포의 협력을 시사하였다 (도 8A). 그러나, 피브로넥틴 발현은 hBM-MSC 군에서 가장 높은 것으로 나타나, 주피세포로서 혈관을 둘러싸 연결시킴으로써 hBM-MSC에서 활성 세포 이동 및 공동-배양에서의 이의 억제를 시사하였다. 또한, 혈관신생과 관련된 주요 인자들인 VEGF, SDF-1α, TGF-β 및 HGF의 발현을 비교하기 위해, 상기 실시예 7-1에서 수집한 5군의 조정 배지와 VEGF, TGF-β, HGF 및 SDF-1α ELISA 키트 (R&D system, Inc., Minneapolis, MN, USA)를 이용하여 ELISA 분석하였다. 그 결과, 주요 저산소증-유도성 혈관신생인자인 VEGF 및 SDF-1α은 hBM-MSC에서만 발현된 것으로 나타났으며, 이의 발현은 hBM-MSC와 내피 세포를 공동-배양한 경우 현저하게 하향 조절되는 것으로 나타났다 (도 8B 및 C). TGF-β의 발현은 hPC보다 hBM-MSC에서 현저히 높게 나타난 반면 (도 8D), HGF는 hPC에서 가장 높게 나타났다 (도 8E). 이를 통해, hBM-MSCs가 혈관신생 자극에서 더 효율적으로 작용할 수 있음을 시사하며, 주피세포로서 내피 맥관을 둘러싸고 성숙한 모세혈관 네트워크를 유도함으로써 이의 활성은 hBMECs와의 공동 배양에서 하향 조절되는 것으로 유추될 수 있다.
100 : 혈관형성채널유입구 200 : 혈관형성채널유출구
300 : 배양액싱크 400 : 배양액싱크
500 : 배양액싱크 600 : 배양액싱크
700 : 제1배양채널유입구 800 : 제1배양채널유출구
910 : 제2배양채널유입구 920 : 제2배양채널유출구
110 : 유체패턴가이드구조(미세구조물)

Claims (29)

  1. 일단에 혈관형성채널유입구와 타단에 혈관형성채널유출구가 형성된 혈관형성채널 (C);
    상기 혈관형성채널을 중심으로 싱크채널 (LI)을 매개로 연결된 채 각각 소정 공간이 형성된 한 쌍의 배양액싱크;
    상기 혈관형성채널을 중심으로 소스채널 (RI)을 매개로 연결된 채 각각 소정 공간이 형성된 한 쌍의 배양액싱크;
    상기 싱크채널과 접하면서 일측에 제1배양채널유입구와 타측에 제1배양채널유출구가 형성된 제1배양채널 (LO);
    상기 소스채널과 접하면서 일측에 제2배양채널유입구와 타측에 제2배양채널유출구가 형성된 제2배양채널 (RO);을 포함하되,
    상기 제1배양채널, 상기 싱크채널, 상기 혈관형성채널, 상기 제2배양채널 및 상기 소스채널이 각각 접하는 경계에는 각 채널에 포함된 생화학물질들 상호간의 상호작용이 이루어지도록 복수의 미세구조물에 의한 간극이 형성된 것을 특징으로 하는, 체외 혈액뇌장벽(BBB) 모사칩로서,
    상기 혈관형성채널에 인간 성상세포(hACs) 및 피브린젤을 포함하고, 싱크채널에 EGM-2 배지 및 AM 배지 혼합물을 포함하며, 인간-BBB 미세혈관계의 기저막 재현능 및 혈관신생 유도능을 높이기 위하여 혈관형성채널 측면의 싱크채널 벽에 인간 뇌 미세혈관 내피 세포 (human brain microvascular endothelial cells, hBMEC) 및 인간 골수유래-중간엽 줄기세포(human bone marrow mesenchymal stem cells, hBM-MSC)를 포함하고, 제2배양채널에 인간 폐 섬유아세포(Human lung fibroblast, hLFs) 및 피브리노겐을 포함하는 것인 체외 혈액뇌장벽(BBB) 모사칩.
  2. 청구항 1에 있어서,
    상기 배양액싱크에는 배지가 투입되는, 체외 혈액뇌장벽 모사칩.
  3. 청구항 1에 있어서,
    제1배양채널유입구 또는 제2배양채널유입구에는 피브린 젤 및 피더세포(feeder cells)의 혼합물이 투입되는, 체외 혈액뇌장벽 모사칩.
  4. 청구항 1에 있어서,
    상기 혈관형성채널유입구에는 성상세포(astrocytes) 및 피브린젤의 혼합물이 투입되는, 체외 혈액뇌장벽 모사칩.
  5. 청구항 1에 있어서,
    혈관형성채널에서 혈관 형성이 발생하는, 체외 혈액뇌장벽 모사칩.
  6. 청구항 1에 있어서,
    복수의 미세구조물은 100 μm 간격으로 존재하는, 체외 혈액뇌장벽 모사칩.
  7. 청구항 1에 있어서,
    복수의 미세구조물의 간극은 100 μm인, 체외 혈액뇌장벽 모사칩.
  8. 청구항 1에 있어서, 채널의 길이는 3000 내지 5000μm인, 체외 혈액뇌장벽 모사칩.
  9. 청구항 1에 있어서, 채널의 높이는 100 내지 200μm인, 체외 혈액뇌장벽 모사칩.
  10. 청구항 1에 있어서, 혈관형성채널, 제1배양채널 및 제2배양채널의 너비는 700 내지 900μm인, 체외 혈액뇌장벽 모사칩.
  11. 청구항 1에 있어서, 싱크채널 및 소스채널의 너비는 600 내지 700μm인, 체외 혈액뇌장벽 모사칩.
  12. 삭제
  13. 제 1항에 있어서, hLFs 및 피브리노겐을 3:1 (w/w)의 비율로 포함하는, 체외 혈액뇌장벽 모사칩.
  14. 제 1항에 있어서, EGM-2 배지 및 AM 배지를 1:1 (v/v)의 비율로 포함하는, 체외 혈액뇌장벽 모사칩.
  15. 제 1항에 있어서, hBMEC 및 hBM-MSC을 6:1 (w/w)의 비율로 포함하는, 체외 혈액뇌장벽 모사칩.
  16. 제 1항에 있어서, 제1배양채널에서 제2배양채널으로 VEGF 농도구배가 형성되는, 체외 혈액뇌장벽 모사칩.
  17. 제 1항에 있어서, 싱크채널 측면의 혈관형성채널의 벽에서 혈관신생 발아가 시작되는, 체외 혈액뇌장벽 모사칩.
  18. 1) 일단에 혈관형성채널유입구와 타단에 혈관형성채널유출구가 형성된 혈관형성채널 (C); 상기 혈관형성채널을 중심으로 싱크채널 (LI)을 매개로 연결된 채 각각 소정 공간이 형성된 한 쌍의 배양액싱크; 상기 혈관형성채널을 중심으로 소스채널 (RI)을 매개로 연결된 채 각각 소정 공간이 형성된 한 쌍의 배양액싱크; 상기 싱크채널과 접하면서 일측에 제1배양채널유입구와 타측에 제1배양채널유출구가 형성된 제1배양채널 (LO); 상기 소스채널과 접하면서 일측에 제2배양채널유입구와 타측에 제2배양채널유출구가 형성된 제2배양채널 (RO);을 포함하되,
    상기 제1배양채널, 상기 싱크채널, 상기 혈관형성채널, 상기 제2배양채널 및 상기 소스채널이 각각 접하는 경계에는 각 채널에 포함된 생화학물질들 상호간의 상호작용이 이루어지도록 복수의 미세구조물에 의한 간극이 형성된 미세유체 칩을 제조하는 단계;
    2) 제2배양채널에 hLFs, 피브리노겐 및 트롬빈을 주입하는 단계;
    3) 혈관형성채널을 hACs 및 피브린젤의 혼합물로 채우는 단계;
    4) 배양액싱크에 배지를 채우는 단계;
    5) 싱크채널이 위쪽을 향하고 소수채널이 바닥쪽을 향하도록 위치시키는 단계; 및
    6) 인간-BBB 미세혈관계의 기저막 재현능 및 혈관신생 유도능을 높이기 위하여 싱크 유입구로 hBMEC 및 hBM-MSC의 세포 현탁액을 주입하는 단계를 포함하되, 상기 hBMEC 및 hBM-MSC가 싱크채널의 혈관형성채널 측 벽면에 부착되는, 체외 혈액뇌장벽 모사칩의 제조방법.
  19. 제 18항에 있어서, hBMEC 및 hBM-MSC을 6:1 (w/w)의 비율로 포함하는, 체외 혈액뇌장벽 모사칩의 제조방법.
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