EP1993730A1 - Verfahren zur durchführung einer reaktion zur vervielfältigung einer nukleinsäure - Google Patents

Verfahren zur durchführung einer reaktion zur vervielfältigung einer nukleinsäure

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EP1993730A1
EP1993730A1 EP07711807A EP07711807A EP1993730A1 EP 1993730 A1 EP1993730 A1 EP 1993730A1 EP 07711807 A EP07711807 A EP 07711807A EP 07711807 A EP07711807 A EP 07711807A EP 1993730 A1 EP1993730 A1 EP 1993730A1
Authority
EP
European Patent Office
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liquid
reaction vessel
piston
conducting system
vessel
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP07711807A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Jürgen SCHÜLEIN
Ugur ÜLKER
Jürgen KRAUSE
Dirk Kuhlmeier
Roland Barten
Herbert Argauer
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Kloiber Michael
Progen Biotechnik GmbH
Original Assignee
Kloiber Michael
Directif GmbH
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Filing date
Publication date
Application filed by Kloiber Michael, Directif GmbH filed Critical Kloiber Michael
Publication of EP1993730A1 publication Critical patent/EP1993730A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L7/00—Heating or cooling apparatus; Heat insulating devices
    • B01L7/52—Heating or cooling apparatus; Heat insulating devices with provision for submitting samples to a predetermined sequence of different temperatures, e.g. for treating nucleic acid samples
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
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    • B01L2200/04—Exchange or ejection of cartridges, containers or reservoirs
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    • B01L2300/0809—Geometry, shape and general structure rectangular shaped
    • B01L2300/0816—Cards, e.g. flat sample carriers usually with flow in two horizontal directions
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    • B01L2400/0475—Moving fluids with specific forces or mechanical means specific mechanical means and fluid pressure
    • B01L2400/0478—Moving fluids with specific forces or mechanical means specific mechanical means and fluid pressure pistons
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
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    • B01L3/502—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures
    • B01L3/5027—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip

Definitions

  • the invention relates to a method for carrying out a reaction for the amplification of a nucleic acid (nucleic acid amplification reaction, - NSV) in a liquid-conducting system and to a device suitable for carrying out the method.
  • a fluid-conducting system is understood to be an arrangement of fluid-conducting or fluidically interconnected fluid conduits and fluid chambers.
  • Such a method and apparatus are known in the art.
  • a liquid which contains a nucleic acid to be amplified and all reagents required for carrying out a polymerase chain reaction (PCR) is passed through a hose.
  • the tube is heated at different intervals in different sections, so that the liquid flowing through it passes through the temperatures required for the PCR.
  • a disadvantage of this method is that the temperature profile, which passes through the liquid, is determined by the course of the tube by predetermined temperature zones. It is not or only with great difficulty possible with such a device to change the temperature profile required for carrying out the PCR and thereby adapt it, for example, to the nucleic acid to be amplified.
  • the object of the present invention is to provide a method and a device which make it possible to carry out a NSI within a fluidic system while avoiding the abovementioned disadvantages.
  • liquid for example in the form of vapor, escapes from the device. This would change the defined concentration or amount of reagents or nucleic acid to be amplified present in the liquid.
  • a method for carrying out a reaction for amplifying a nucleic acid (nucleic acid amplification reaction, - NSV) in a liquid-conducting provided the system, wherein the nucleic acid is contained in a first liquid.
  • a cylindrical reaction vessel is provided which has an opening at a first end, which is connected in fluid-conducting manner via a first liquid line to the liquid-conducting system. Via the first liquid line, the reaction vessel can be filled with the first liquid and emptied. Between an outer space and the interior of the reaction vessel, the reaction vessel has a first piston displaceable in the reaction vessel.
  • the method comprises the following steps:
  • the reaction vessel is also connected to the liquid-conducting system in a liquid-conducting manner, when the flow of the liquid between the reaction vessel and the remaining liquid-conducting system is reversibly interrupted by a valve or another device.
  • the first liquid can partially replace the reagents required to carry out the NSV in addition to the nucleic acid to be amplified or completely included.
  • the first fluid may also contain only the nucleic acid.
  • the first liquid is any liquid containing the first liquid. Accordingly, a first liquid is understood as meaning a mixture of first liquid and other liquids or a solution of reagents in the first liquid.
  • the introduction of the first liquid into the reaction vessel according to step lit. a) can also be done after the first liquid has been moved back and forth between the reaction vessel and another vessel for better mixing or dissolution of reagents in the liquid.
  • a reaction vessel is provided by the first piston, which has a variable volume by the movable first piston.
  • the method according to the invention makes it possible to carry out a NSI in a fluidic system under precisely defined conditions with regard to temperature, concentration of the reagents used and amount of nucleic acid used. Preventing fluid loss through the plunger also helps prevent contamination of the infectious specimen. Furthermore, contamination of the first liquid by contaminants from the environment can also be avoided by the first piston. This is particularly important in carrying out an NSV which causes an exponential nucleic acid amplification since even the smallest impurities, for example due to dander falling into the reaction vessel, can falsify the result.
  • the first piston allows a pressure equalization between the interior of the reaction vessel and the first piston
  • the fluidic system is preferably a microfluidic system.
  • a microfluidic system is understood to mean a fluid-conducting system in which the fluid conduits have a diameter or a diagonal in a predominant part of the length of the fluid conduits, which is shorter than 2 mm, in particular shorter than 1 mm, preferably shorter than 0.5 mm , is.
  • the first piston is located at the first end of the cylindrical reaction vessel before the first liquid is introduced.
  • the volume of the interior of the reaction vessel is minimized, so that after the introduction of the first liquid no or almost no gas such.
  • B. air located in the reaction vessel.
  • a gas in the reaction vessel is compressible and thereby makes it more difficult to discharge a precisely defined volume from the reaction vessel by pressing the first piston.
  • the first piston is displaced by the introduction of the first liquid.
  • the NSV is preferably a polymerase chain reaction (PCR) or another reaction in which the temperature of the first liquid is changed. If the first liquid changes its volume or forms gas by a temperature change, either by outgassing air dissolved therein or by vaporization, the first piston can be moved by the first liquid, thereby changing the volume of the interior of the reaction vessel.
  • PCR polymerase chain reaction
  • the first piston is only exposed during the entire process by the first liquid and / or by gas formed from the first liquid and / or by pressing the first piston from outside the reaction vessel. vessel is moved.
  • a particularly simple design actuator for automated implementation of the method can be used, because no constructive measures must be taken to move the first piston by train.
  • the first piston lit. a) and / or lit. b) is moved to a predetermined stop.
  • the predetermined stop makes it possible to fill a defined volume in the reaction vessel. Given a concentration of the nucleic acid to be amplified in the first liquid, a precisely defined amount of nucleic acid to be amplified can be filled into the reaction vessel. By the stop can be ensured that enters the reaction vessel a defined volume, without the amount of liquid which is forced through the opening of the reaction vessel, must be regulated on the part of the remaining liquid-conducting system.
  • the stop between the steps lit. a) and lit. b) is displaced or removed in the opposite direction to the opening.
  • the attack can be z. B. be formed by a displaceable or removable rod.
  • a respective desired volume of liquid can be adjusted by the stop when filling the reaction vessel. After filling, the stop may be removed or withdrawn to carry out the reaction, thereby allowing pressure equalization.
  • the counterforce can be generated by a force acting on the first piston by an expansion of the first liquid against gravity to moving weight or by a frictional resistance of the first piston relative to the reaction vessel.
  • the weight can be z. B. act on the piston by the piston itself has this weight. Due to the frictional resistance of the piston moves only when a certain minimum pressure is reached and it comes to a stop before complete pressure in the reaction vessel is reached.
  • the reaction vessel is preferably arranged in such a way that bubbles forming in the first liquid can rise to the first piston.
  • This can be achieved, in particular, by arranging the longitudinal axis of the reaction vessel essentially vertically.
  • the bubbles enter the liquid-conducting system during the subsequent emptying of the reaction vessel.
  • This can be done in particular by the fact that the first piston for pushing out the first liquid in the direction of the first end but not pressed to the first end. It can be a defined
  • the method is the ratio of height to inner diameter greater than 2, preferably greater than 4, in particular greater than 6.
  • the cylindrical reaction vessel can in particular also run slightly conically towards the first end.
  • a first piston made of an elastic material this is achieved in that the first piston can easily be displaced by the introduction of the first fluid and a lower pressure is required for the introduction.
  • the wall thickness of the cylindrical reaction vessel is less than 1 mm, preferably less than 0.5 mm, in particular less than 0.3 mm. As a result, good heat transfer to the interior of the reaction vessel is possible. The heat transfer is better, the thinner the wall thickness. Most preferably, the wall thickness is as low as it can just be made by an injection molding process.
  • the liquid-conducting system or the opening or the first liquid line between the steps lit. a) and lit. b) is sealed liquid-tight. It is understood that the opening or the first liquid line after step lit. b) is opened again when the first liquid is then to be passed out of the reaction vessel again. By closing the liquid-conducting system, after the introduction of the first liquid any contamination of the environment can be avoided. This is especially important for infectious samples. It is very particularly preferred if the nucleic acid, in particular in the form of a biological sample, before step lit. a) is introduced into the liquid-conducting system and the liquid-conducting system after and before performing the step lit. a) is sealed liquid-tight.
  • Both the NSV and the detection can be done within the liquid-tight liquid-conducting system. Thereafter, the liquid-conducting system, including any liquids contained therein, can be disposed of completely. As a result, the inventive method is very safe. By closing the opening or the first liquid line, it can be achieved that a pressure building up in the reaction vessel can not affect the remaining liquid-conducting system.
  • the reaction vessel is lit. b) to set the conditions required by the NSA, in particular by blowing with an air stream, heated or cooled. Due to the cylindrical shape of the reaction vessel, the reaction vessel can be isolated and exposed so that substantially only the reaction vessel is heated or cooled. By blowing with a heated or cooled air flow, a particularly rapid temperature change within the reaction vessel and thereby a quick execution of the NSV is possible.
  • the reaction vessel in step lit. b) a cyclic temperature profile. This means that several times the same temperature levels are passed through within a given time sequence. It is particularly preferred if the
  • Air flow through an air duct, in particular an air deflector, at least partially, is guided around the reaction vessel.
  • the proof according to step lit. c) takes place outside the reaction vessel and the first liquid between the steps lit. b) and lit. c) by the opening and the first liquid line is passed, in particular by advancing the first piston, out of the reaction vessel.
  • the detection can be effected, for example, by means of an electrode with capture molecules immobilized thereon, with which the amplified nucleic acids hybridize, by means of an electrochemical reaction.
  • the first liquid is preferably conducted via the liquid-conducting system into a detection chamber in fluid communication with the liquid-conducting system.
  • a hybridization of the amplified nucleic acids with, in particular immobilized, further nucleic acids.
  • the further nucleic acids can be immobilized on a chip, in particular arranged in the detection chamber.
  • the proof according to step lit. c) can be done on the chip by means of an optical or an electrical detection method.
  • the presence of nucleic acids which have bound to other nucleic acids immobilized on the chip can be detected, for example, by measuring the fluorescence of fluorophores incorporated into the amplified nucleic acids.
  • the electrochemical detection can be carried out, for example, by means of graphic electrodes arranged on the chip, to which the further nucleic acids are immobilized as probes. After binding of the specific amplified nucleic acids, electrochemical detection of bound nucleic acids can then be performed.
  • an injection molded Plastic preferably polycarbonate
  • the liquid-conducting system comprises a line plate containing at least partially open lines and a closure means connected thereto, which closes the open lines.
  • the closing means can z.
  • Such a liquid-conducting system is simple and inexpensive to manufacture and has a high density and pressure stability of the lines.
  • the reaction vessel can also be provided in the form of a cartridge, which before the step lit. a) is connected in liquid-tight manner by plugging onto a receiving unit provided for this purpose and fluid-tightly to the outside with the liquid-conducting system.
  • the receiving unit can be provided for example by a connecting piece for inserting a connecting portion of the cartridge.
  • At least one cylindrical vessel which contains a second or further liquid and is connected fluid-conducting to the liquid-conducting system, the vessel having between an outer space and an inner space of the vessel a second or further piston displaceable in the vessel, wherein the second or further liquid is pressed into the reaction vessel by actuating the second or further piston via the liquid-conducting system. It is preferred if three cylindrical vessel is provided, which contains a second or further liquid and is connected fluid-conducting to the liquid-conducting system, the vessel having between an outer space and an inner space of the vessel a second or further piston displaceable in the vessel, wherein the second or further liquid is pressed into the reaction vessel by actuating the second or further piston via the liquid-conducting system. It is preferred if three cylindrical vessel is provided, which contains a second or further liquid and is connected fluid-conducting to the liquid-conducting system, the vessel having between an outer space and an inner space of the vessel a second or further piston displaceable in the vessel, wherein the second or further liquid
  • Containers are provided, each having a liquid and a flask, each containing one of the liquids required for performing a PCR reagent, in particular polymerase, primer and buffer.
  • the cylindrical vessel is provided in the form of a cartridge, which before the step lit. a) by connecting to a dedicated receiving unit with the liquid-conducting system liquid-conducting and liquid-tightly connected to the outside.
  • a dedicated receiving unit with the liquid-conducting system liquid-conducting and liquid-tightly connected to the outside.
  • the cylindrical vessel or, in the case of the provision of a plurality of cylindrical vessels the cylindrical vessels contain or contain all the reagents required for carrying out the NSV in addition to the nucleic acid, in particular polymerase, primer and buffer.
  • the liquid-conducting system comprises a plurality of second liquid lines arranged in a plane in a plate-like conduit element and the receiving unit / receiving units for attaching the cartridge / cartridges.
  • the implementation of the method with such a liquid-conducting system is particularly advantageous because the specificity of the method for certain nucleic acids can be chosen arbitrarily by attaching appropriate cartridges.
  • the second fluid lines can be provided, in particular provided by a membrane, valves.
  • the membrane is arranged and designed so that by applying pressure, a passage through the second liquid lines can be shut off.
  • the pressure may, for example, be exerted by a plunger actuated by an automated actuator on the diaphragm.
  • the liquid-conducting system may have a respective sample preparation chamber and waste chamber in fluid communication with the liquid-conducting system, as well as a connection pipe in fluid communication with the liquid-conducting system, in particular with a profile for producing a bayonet closure.
  • a tube containing a biological sample such as a so-called Monovette TM
  • the sample preparation chambers, the waste chamber, the connecting piece and the liquid-conducting system are integrally made of the same material, in particular of injection-molded plastic, preferably polycarbonate. It does not conflict with the one-piece construction if the conduit element comprises a conduit plate containing at least partially open conduits and a closure means connected thereto and closing off the open conduits.
  • the first and the second piston or, in the case of providing a plurality of cylindrical vessels, the first, the second and the further piston (s) is actuated by feed from the same side of the plate-like conduit element.
  • the invention further relates to an apparatus for carrying out the method according to the invention, consisting of a cylindrical reaction vessel, which is connected in liquid-conducting manner via a provided at a first end of the reaction vessel opening and opening into the opening first liquid line to a liquid-conducting system, so that the reaction vessel via the liquid-conducting system can be filled and emptied with a first, second or further liquid.
  • the reaction vessel has, between an outer space and an inner space of the reaction vessel, a first piston which is displaceable in the reaction vessel, wherein the first piston is designed so that it can be moved through the first, second or further liquid as it flows through the reaction vessel Opening is introduced or changes its volume or gas forms at a temperature change, thereby changing the volume of the interior of the reaction vessel is changed.
  • At least one vessel is provided, which contains the second or further liquid and is connected in a fluid-conducting manner to the liquid-conducting system.
  • the vessel or, in the case of the presence of multiple vessels, the vessels contain / contain reagents necessary for the performance of the NSV in addition to the nucleic acid. All can be included for performing the NSV in addition to the nucleic acid to be amplified reagents. If some of the reagents required for NSA are already introduced into the reaction vessel or contained in the first fluid, only the remaining part of the reagents necessary for the NSV can also be present.
  • the reaction vessel preferably has a rigid vessel wall, in particular consisting of polycarbonate.
  • a rigid vessel wall improves the tightness between the piston and the vessel wall.
  • Polycarbonate allows good heat transfer from the outside to the reaction vessel and is also compatible with performing a PCR.
  • the rigid vessel wall ensures a precise change in the volume of the interior of the reaction vessel and a precise
  • 1 is a schematic representation of a device according to the invention prior to carrying out the method according to the invention
  • 2 is a schematic representation of a device according to the invention at the beginning of filling the reaction vessel with a liquid
  • FIG. 3 is a schematic representation of a device according to the invention after filling with the liquid
  • Fig. 4 is a schematic representation of a device according to the invention in carrying out the method according to the invention.
  • Fig. 5 is an exploded view of a device according to the invention contained liquid-conducting system.
  • the device 10 consists of the reaction vessel 12 and a liquid-conducting system 14, to which the reaction vessel 12 via at least a first
  • the device 10 has a movable closure in the form of a first piston 18. Furthermore, the device 10 has a stop 21 formed by a removable rod 20 for the first piston 18.
  • the liquid-conducting system 14 has a closable or self-closing, designed here as a valve 22, inlet opening. Instead of the valve 22, a septum or a rubber stopper could also be provided here, which can be pierced by means of a cannula. Furthermore, the device 10 has a further valve 24.
  • Fig. 2 the beginning of the filling of the reaction vessel 12 with the first liquid 26 is shown schematically.
  • the The first liquid 26 is initially in the syringe 28.
  • the first liquid 26 is injected by means of a cannula through the open valve 22 into the liquid-conducting system 14. Since the further valve 24 is closed, the first liquid 26 is pressed into the reaction vessel 12 via the first liquid line 16. In this case, the first piston 18 is raised.
  • Into the reaction vessel 12 passes a precisely defined volume, which is predetermined by the stop 21 formed by the rod 20 for the first piston 18.
  • the syringe 28 is removed and the valve 22 is brought into the closed position. This condition is shown in FIG.
  • Fig. 4 shows the device 10 schematically in carrying out the method according to the invention.
  • the rod 20 has been removed to allow the first piston 18 to move freely.
  • the first liquid 26 is, as usual in performing a PCR, heated and cooled again. In this case, the volume of the first liquid changes 26. This change in volume causes a movement of the first piston 18. As a result, the volume change of the first liquid 26 is compensated by a corresponding change in volume of the interior of the reaction vessel 12. It is also possible to withdraw the rod 20 only slightly, so that by a movement of the first
  • Piston 18 Although the volume change of the first liquid 26 is indeed compensated, the formation of gas bubbles by a still existing formed by the rod 20 stop 21 for the first piston 18 is avoided or at least weakened.
  • FIG. 5 shows a fluidic system comprising a carrier 30. Liquid lines run on the underside of the carrier 30, which is not shown in the drawing. Finally, the first fluid line 16, which have a downwardly at least partially open side and are closed by the closure plate 32. On the support 30, the reaction vessel 12 is provided. For connecting cartridges 34 containing reagents further
  • connection element 38 is provided.
  • the connecting element 38 is connected to the carrier 30 and the chip 40, which serves to detect nucleic acids amplified in the reaction vessel 12, is latched to the latching hooks 42.
  • the liquid-conducting system 14 shown in Fig. 5 may form a unit after plugging the cartridges 34, in the complex processes such. For example, an opening of cells, a purification of biomolecules, a nucleic acid amplification and a detection of biomolecules can take place by means of the chip 40.
  • reaction vessel 14 liquid-conducting system

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Durchführung einer Reaktion zur Vervielfältigung einer Nukleinsäure (Nukleinsäurevervielfältigungsreaktion; NSV) in einem flüssigkeitsleitenden System (14), wobei die Nukleinsäure in einer ersten Flüssigkeit (26) enthalten ist, wobei ein zylinderförmiges Reaktionsgefäß (12) vorgesehen ist, welches an einem ersten Ende eine Öffnung aufweist, die flüssigkeitsleitend über eine erste Flüssigkeitsleitung (16) an das flüssigkeitsleitende System (14) angeschlossen ist und welches über die erste Flüssigkeitsleitung (16) mit der ersten Flüssigkeit (26) gefüllt und entleert werden kann, wobei das Reaktionsgefäß (12) zwischen einem Außenraum und dem Innenraum des Reaktionsgefäßes (12) einen im Reaktionsgefäß (12) verschiebbaren ersten Kolben (18) aufweist.

Description

Verfahren zur Durchführung einer Reaktion zur Vervielfältigung einer Nukleinsäure
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Durchführung einer Reaktion zur Vervielfältigung einer Nukleinsäure (Nukleinsäu- revervielfältigungsreaktion,- NSV) in einem flüssigkeitsleitenden System sowie eine zur Durchführung des Verfahrens geeignete Vorrichtung. Unter einem flüssigkeitsleitenden System wird eine Anordnung flüssigkeitsleitend bzw. fluidisch miteinander verbundener Flüssigkeitsleitungen und Flüssigkeits- kammern verstanden.
Ein solches Verfahren und eine solche Vorrichtung sind aus dem Stand der Technik bekannt. Dabei wird eine Flüssigkeit, welche eine zu vervielfältigende Nukleinsäure und sämtliche zur Durchführung einer Polymerasekettenreaktion (PCR) erforderlichen Reagenzien enthält, durch einen Schlauch geleitet. Der Schlauch wird in verschiedenen Abschnitten unterschied- lieh temperiert, so dass die darin fließende Flüssigkeit die für die PCR erforderlichen Temperaturen durchläuft. Nachteilig bei diesem Verfahren ist es, dass das Temperaturprofil, welches die Flüssigkeit durchläuft, durch den Verlauf des Schlauchs durch vorgegebene Temperaturzonen festgelegt ist . Es ist mit einer solchen Vorrichtung nicht oder nur sehr schwer möglich, das für die Durchführung der PCR erforderliche Temperaturprofil zu verändern und dadurch beispielsweise an die zu vervielfältigende Nukleinsäure anzupassen. Weiterhin besteht bei einer solchen Anordnung das Problem, dass sich bei Temperaturen in der Nähe des Siedepunkts der Flüssigkeit in der Flüssigkeit Gasblasen bilden, die zu einem Auseinanderziehen der Probe im Schlauch führen. Dadurch ist das Temperaturprofil, welches die Flüssigkeit durchläuft, für verschiedene Teile der Flüssigkeit uneinheitlich. Das führt zu uneinheitlichen, schlecht reproduzierbaren und oft auch unzureichenden Vervielfältigungsreaktionen.
Aus EP 1 123 980 A2 ist ein Verfahren zur Durchführung einer Nukleinsäureanalytik bekannt. Dabei ist eine Kapillare über einen Dreiwegehahn mit zwei Spritzen verbunden. Über die Spritzen kann Flüssigkeit durch die Kapillare gesaugt und zur Durchmischung zwischen den Spritzen hin und hergepumpt werden. In der Kapillare erfolgt sowohl eine Bindung von Nu- kleinsäuren als auch eine anschließende Amplifikation der Nukleinsäuren in einer PCR. Zur Durchführung der PCR wird die Kapillare von den Spritzen abgenommen und mit Stopfen verschlossen. Dadurch ist das Verfahren nicht automatisierbar. Ohne einen Verschluss der Kapillare würde es bei der Durch- führung der PCR jedoch zu einem Flüssigkeitsverlust kommen.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren und eine Vorrichtung bereitstellen, welche es ermöglichen, eine NSV innerhalb eines fluidischen Systems unter Vermeidung der oben genannten Nachteile durchzuführen. Insbesondere soll es möglich sein, beliebige, für die NSV günstige, Temperaturbedingungen zu wählen. Darüber hinaus soll vermieden werden, dass Flüssigkeit, beispielsweise in Form von Dampf, aus der Vorrichtung entweicht. Dadurch würde sich die in der Flüssig- keit vorhandene definierte Konzentration oder Menge der Reagenzien oder der zu vervielfältigenden Nukleinsäure ändern.
Diese Aufgabe wird durch die Merkmale der Ansprüche 1 und 35 gelöst. Zweckmäßigen Ausgestaltungen der Erfindung ergeben sich aus den Merkmalen der Ansprüche 2 bis 34 und 36 bis 57.
Erfindungsgemäß ist ein Verfahren zur Durchführung einer Reaktion zur Vervielfältigung einer Nukleinsäure (Nukleinsäure- vervielfältigungsreaktion,- NSV) in einem flüssigkeitsleiten- den System vorgesehen, wobei die Nukleinsäure in einer ersten Flüssigkeit enthalten ist. Dabei ist ein zylinderförmiges Reaktionsgefäß vorgesehen, welches an einem ersten Ende eine Öffnung aufweist, die flüssigkeitsleitend über eine erste Flüssigkeitsleitung an das flüssigkeitsleitende System angeschlossen ist. Über die erste Flüssigkeitsleitung kann das Reaktionsgefäß mit der ersten Flüssigkeit gefüllt und entleert werden. Zwischen einem Außenraum und dem Innenraum des Reaktionsgefäßes weist das Reaktionsgefäß einen im Reaktions- gefäß verschiebbaren ersten Kolben auf.
Das Verfahren umfasst die folgenden Schritte:
a) Einleiten der ersten Flüssigkeit und von für die Durch- führung der NSV erforderlichen Reagenzien, soweit die Reagenzien nicht im Reaktionsgefäß (12) vorgelegt sind, durch die erste Flüssigkeitsleitung (16) in das Reaktionsgefäß (12) , so dass sämtliche für die Durchführung der NSV erforderlichen Reagenzien im Reaktionsgefäß (12) vorhanden sind,
b) Inkubation der ersten Flüssigkeit in dem Reaktionsgefäß unter Bedingungen, welche für die NSV erforderlich sind und
c) Nachweis der bei der NSV entstandenen vervielfältigten Nukleinsäure.
Im Sinne der Erfindung ist das Reaktionsgefäß auch dann flüssigkeitsleitend an das flüssigkeitsleitende System angeschlossen, wenn der Fluss der Flüssigkeit zwischen dem Reak- tionsgefäß und dem restlichen flüssigkeitsleitenden System durch ein Ventil oder eine andere Einrichtung reversibel unterbrochen ist. Beim Schritt lit. a kann die erste Flüssigkeit die für die Durchführung der NSV neben der zu vervielfältigenden Nukleinsäure erforderlichen Reagenzien teilweise oder vollständig enthalten. Die erste Flüssigkeit kann auch nur die Nukleinsäure enthalten. Im Sinne der Erfindung ist die erste Flüssigkeit jede Flüssigkeit, welche die erste Flüssigkeit enthält. Als erste Flüssigkeit wird demnach auch eine Mischung aus erster Flüssigkeit und sonstigen Flüssigkeiten oder eine Losung von Reagenzien in der ersten Flüssigkeit verstanden. Das Einleiten der ersten Flüssigkeit in das Reaktionsgefäß gemäß Schritt lit. a) kann auch erfolgen, nachdem die erste Flüssigkeit zwischen dem Reaktionsgefäß, und einem weiteren Gefäß zur besseren Durchmischung oder Auflösung von Reagenzien in der Flüssigkeit hin und her bewegt worden ist.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren wird durch den ersten Kolben ein Reaktionsgefäß bereitgestellt, welches durch den beweglichen ersten Kolben ein variables Volumen aufweist. Ein dadurch erreichter Vorteil besteht darin, dass ein Entweichen der ersten Flüssigkeit in Form von Dampf oder beispielsweise indem die erste Flüssigkeit durch die Entstehung einer Dampf- blase aus dem Reaktionsgefäß herausgedrückt wird, verhindert wird. Das Vorsehen eines zylinderförmigen Reaktionsgefäßes ermöglicht eine weit gehende thermische Entkopplung des Reaktionsgefäßes von dem restlichen flüssigkeitsleitenden System, so dass nur die in dem Reaktionsgefäß vorhandene erste Flüs- sigkeit entsprechend der für die NSV erforderlichen Temperaturen temperiert werden kann. Durch die thermische Entkopplung des Reaktionsgefäßes ist es außerdem möglich, Temperaturwechsel in dem Reaktionsgefäß schneller zu vollziehen. Eine NSV, welche vielfache Temperaturwechsel erfordert, wie z. B. eine PCR, kann dadurch schneller durchgeführt werden. Darüber hinaus ist es durch ein zylinderförmiges Reaktionsgefäß möglich, im Verhältnis zum Volumen des Reaktionsgefäßes eine große Oberfläche bereitzustellen. Auch dadurch wird ein schneller Temperaturwechsel in dem Reaktionsgefäß begünstigt und eine vielfache Temperaturwechsel erfordernde NSV kann schneller durchgeführt werden.
Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht die Durchführung eine NSV in einem fluidischen System unter genau definierten Bedingungen hinsichtlich Temperatur, Konzentration der eingesetzten Reagenzien und Menge der eingesetzten Nukleinsäure. Das Verhindern eines Flüssigkeitsverlusts durch den Kolben ermöglicht es außerdem, bei infektiösen Proben eine Kontami- nation der Umgebung zu vermeiden. Weiterhin kann durch den ersten Kolben auch eine Kontamination der ersten Flüssigkeit durch Verunreinigungen aus der Umgebung vermieden werden. Insbesondere bei der Durchführung einer eine exponentielle Nukleinsäurevervielfältigung bewirkenden NSVs ist das wich- tig, da hier auch kleinste Verunreinigungen, beispielsweise durch in das Reaktionsgefäß fallende Hautschuppen, das Ergebnis verfälschen können.
Darüber hinaus ermöglicht der erste Kolben einen Druckaus - gleich zwischen dem Innenraum des Reaktionsgefäßes und dem
Außenraum, so dass sich in dem System kein oder nur ein durch die Stellung des Kolbens vorgegebener Überdruck aufbaut. Dadurch kann eine Druckbelastung des flüssigkeitsleitenden Systems und insbesondere darin enthaltener Ventile begrenzt oder sogar verhindert werden. Durch die Begrenzung der Druckbelastung kann weiterhin verhindert werden, dass Flüssigkeit durch den Druck über das flüssigkeitsleitende System in Bereiche des flüssigkeitsleitenden Systems gedrückt wird, in denen die Flüssigkeit unerwünscht ist. Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht insgesamt eine automatisierte, kontaminationsfreie und unter genau definierten Bedingungen erfolgende NSV. Bei dem fluidischen System handelt es sich bevorzugt um ein mikrofluidisches System. Unter einem mikrofluidischen System wird ein flüssigkeitsleitendes System verstanden, bei welchem die Flüssigkeitsleitungen in einem überwiegenden Teil der Länge der Flüssigkeitsleitungen einen Durchmesser oder eine Diagonale aufweisen, der/die kürzer als 2 mm, insbesondere kürzer als 1 mm, bevorzugt kürzer als 0,5 mm, ist.
In einer bevorzugten Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Ver- fahrens befindet sich der erste Kolben vor dem Einleiten der ersten Flüssigkeit am ersten Ende des zylinderförmigen Reaktionsgefäßes. Dadurch wird das Volumen des Innenraums des Reaktionsgefäßes minimiert, so dass sich nach dem Einleiten der ersten Flüssigkeit kein oder fast kein Gas, wie z. B. Luft, im Reaktionsgefäß befindet. Ein Gas im Reaktionsgefäß ist komprimierbar und erschwert es dadurch, ein genau definiertes Volumen durch Drücken des ersten Kolbens aus dem Reaktionsgefäß herauszuleiten.
Vorzugsweise wird der erste Kolben durch das Einleiten der ersten Flüssigkeit verschoben. Bevorzugt handelt es sich bei der NSV um eine Polymerasekettenreaktion (PCR) oder eine sonstige Reaktion, bei welcher die Temperatur der ersten Flüssigkeit verändert wird. Wenn die erste Flüssigkeit durch eine Temperaturänderung ihr Volumen ändert oder Gas bildet, sei es durch Ausgasen darin gelöster Luft oder durch Dampfentste- hung, kann der erste Kolben durch die erste Flüssigkeit bewegt werden, so dass dadurch das Volumen des Innenraums des Reaktionsgefäßes verändert wird.
Besonders bevorzugt ist es, wenn der erste Kolben während des gesamten Verfahrens nur durch die erste Flüssigkeit und/oder durch aus der ersten Flüssigkeit gebildetem Gas und/oder durch Drücken des ersten Kolbens von außerhalb des Reaktions- gefäßes verschoben wird. Dadurch kann eine besonders einfach aufgebaute Betätigungsvorrichtung zur automatisierten Durchführung des Verfahrens verwendet werden, weil keine konstruktiven Maßnahmen getroffen werden müssen, um den ersten Kolben durch Zug zu bewegen.
Vorteilhaft ist es, wenn der erste Kolben bei den Schritten lit. a) und/oder lit. b) bis zu einem vorgegebenen Anschlag bewegt wird. Der vorgegebene Anschlag ermöglicht es, ein de- finiertes Volumen in das Reaktionsgefäß zu füllen. Bei gegebener Konzentration der zu vervielfältigenden Nukleinsäure in der ersten Flüssigkeit kann dadurch eine genau definierte Menge zu vervielfältigender Nukleinsäure in das Reaktionsgefäß gefüllt werden. Durch den Anschlag kann gewährleistet werden, dass in das Reaktionsgefäß ein definiertes Volumen gelangt, ohne dass die Flüssigkeitsmenge, welche durch die Öffnung des Reaktionsgefäßes gedrückt wird, auf Seiten des restlichen flüssigkeitsleitenden Systems reguliert werden muss .
Vorteilhaft ist es, wenn der Anschlag zwischen den Schritten lit. a) und lit. b) in zur Öffnung hin entgegengesetzten Richtung verschoben oder entfernt wird. Der Anschlag kann dazu z. B. durch einen verschiebbaren oder entfernbaren Stab gebildet sein. Dadurch kann beim Befüllen des Reaktionsgefäßes ein jeweils gewünschtes Flüssigkeitsvolumen durch den Anschlag eingestellt werden. Nach dem Befüllen kann der Anschlag zur Durchführung der Reaktion entfernt oder zurückgezogen werden, um dadurch einen Druckausgleich zu ermöglichen.
Vorteilhaft ist es auch, wenn durch den ersten Kolben gegenüber der sich beim Erwärmen ausdehnenden ersten Flüssigkeit eine solche Gegenkraft ausgeübt wird, dass dadurch ein Druck aufgebaut wird, welcher eine Bildung von Gasblasen im Ver- gleich zu einem druckfreien System vermindert . Der sich dabei aufbauende Druck ist geringer als der Druck, der sich bei einem mit einem unbeweglichen Verschluss verschlossenen Gefäß aufbauen würde. Beispielsweise kann das erreicht werden, in- dem der beim Einfüllen der Flüssigkeit den Anschlag bildende Stab nach dem Einfüllen der Flüssigkeit soweit zurückgezogen wird, dass der Kolben sich in einem Bereich bewegen kann, welcher der temperaturbedingten Volumenänderung der Flüssigkeit entspricht. Die Gegenkraft kann durch ein auf den ersten Kolben wirkendes durch eine Ausdehnung der ersten Flüssigkeit gegen die Schwerkraft zu bewegendes Gewicht oder durch einen Reibwiderstand des ersten Kolbens gegenüber dem Reaktionsgefäß erzeugt werden. Das Gewicht kann z. B. auf den Kolben wirken, indem der Kolben selbst dieses Gewicht aufweist. Durch den Reibwiderstand bewegt sich der Kolben erst, wenn ein bestimmter Mindestdruck erreicht ist und er kommt zum Stillstand, bevor völlige Druckfreiheit in dem Reaktionsgefäß erreicht ist.
Vorzugsweise wird das Reaktionsgefäß bei der Durchführung des Verfahrens so angeordnet, dass dabei in der ersten Flüssigkeit sich bildende Blasen zum ersten Kolben aufsteigen können. Das kann insbesondere dadurch erreicht werden, dass die Längsachse des Reaktionsgefäßes im Wesentlichen lotrecht an- geordnet wird. Dadurch kann es vermieden werden, dass die Blasen beim späteren Entleeren des Reaktionsgefäßes in das flüssigkeitsleitende System gelangen. Das kann insbesondere dadurch erfolgen, dass der erste Kolben zum Herausdrücken der ersten Flüssigkeit in Richtung des ersten Endes aber nicht bis zum ersten Ende gedrückt wird. Es kann ein definiertes
Volumen im Zylinder verbleiben, in welchem die Blasen enthalten sind. Bei einer bevorzugten Ausgestaltung des erfindungsgemäßen. Verfahrens ist bei dem zylinderförmigen Reaktionsgefäß das Verhältnis von Höhe zum Innendurchmesser größer als 2, bevorzugt größer als 4, insbesondere größer als 6. Das zylinder- förmige Reaktionsgefäß kann insbesondere auch leicht konisch zum ersten Ende hin zulaufen. Bei einem aus einem elastischen Material bestehenden ersten Kolben wird dadurch erreicht, dass der erste Kolben durch das Einleiten der ersten Flüssigkeit leicht verschoben werden kann und für das Einleiten da- durch ein geringerer Druck erforderlich ist.
Weiterhin ist es vorteilhaft, wenn die Wandstärke des zylinderförmigen Reaktionsgefäßes geringer als 1 mm, bevorzugt geringer als 0,5 mm, insbesondere geringer als 0,3 mm, ist. Da- durch ist eine gute Wärmeübertragung auf den Innenraum des Reaktionsgefäßes möglich. Der Wärmeübertrag ist umso besser, je dünner die Wandstärke ist. Ganz besonders bevorzugt ist die Wandstärke so gering, wie sie durch ein Spritzgussverfahren eben noch hergestellt werden kann.
Bevorzugt ist es, wenn das flüssigkeitsleitende System oder die Öffnung oder die erste Flüssigkeitsleitung zwischen den Schritten lit. a) und lit. b) flüssigkeitsdicht verschlossen wird. Es versteht sich, dass die Öffnung oder die erste Flüs- sigkeitsleitung nach Schritt lit. b) wieder geöffnet wird, wenn die erste Flüssigkeit danach wieder aus dem Reaktionsgefäß geleitet werden soll. Durch das Verschließen des Flüssigkeitsleitenden Systems kann nach dem Einleiten der ersten Flüssigkeit jede Kontamination der Umgebung vermieden werden. Das ist insbesondere bei infektiösen Proben wichtig. Ganz besonders bevorzugt ist es, wenn die Nukleinsäure, insbesondere in Form einer biologischen Probe, vor Schritt lit. a) in das flüssigkeitsleitende System eingeleitet wird und das flüssigkeitsleitende System danach und vor Durchführung des Schritts lit. a) flüssigkeitsdicht verschlossen wird. Sowohl die NSV als auch der Nachweis kann innerhalb des flüssigkeitsdicht verschlossenen flüssigkeitsleitenden Systems erfolgen. Danach kann das flüssigkeitsleitende System inklusive darin enthal- tener Flüssigkeiten vollständig entsorgt werden. Dadurch ist das erfindungsgemäße Verfahren sehr sicher. Durch das Verschließen der Öffnung oder der ersten Flüssigkeitsleitung kann erreicht werden, dass ein in dem Reaktionsgefäß sich aufbauender Druck nicht auf das restliche flüssigkeitsleiten- de System wirken kann.
Bevorzugt wird das Reaktionsgefäß beim Schritt lit. b) zur Einstellung der Bedingungen, welche für die NSV erforderlich sind, insbesondere durch Anblasen mit einem Luftstrom, er- wärmt oder gekühlt. Durch die zylindrische Form des Reaktionsgefäßes kann das Reaktionsgefäß so isoliert und exponiert stehen, dass im Wesentlichen nur das Reaktionsgefäß erwärmt oder gekühlt wird. Durch das Anblasen mit einem erwärmten oder gekühlten Luftstrom ist ein besonders schneller Tempera- turwechsel innerhalb des Reaktionsgefäßes und dadurch ein schnelles Durchführen der NSV möglich. Bevorzugt durchläuft das Reaktionsgefäß beim Schritt lit. b) ein zyklisches Temperaturprofil. Das bedeutet, dass mehrfach dieselben Temperaturstufen innerhalb einer vorgegebenen zeitlichen Abfolge durchlaufen werden. Besonders bevorzugt ist es, wenn der
Luftstrom durch eine Luftführung, insbesondere ein Luftleitschild, zumindest teilweise, um das Reaktionsgefäß herumgeführt wird. Dadurch ist ein besonders intensiverer und dadurch auch schnellerer Wärmeaustausch zwischen dem Luftstrom und dem Reaktionsgefäß möglich.
Besonders bevorzugt ist es, wenn der Nachweis gemäß Schritt lit. c) außerhalb des Reaktionsgefäßes erfolgt und die erste Flüssigkeit zwischen den Schritten lit. b) und lit. c) durch die Öffnung und die erste Flüssigkeitsleitung hindurch, insbesondere durch Vorschub des ersten Kolbens, aus dem Reaktionsgefäß geleitet wird. In dem flüssigkeitsleitenden System kann der Nachweis beispielsweise mittels einer Elektrode mit daran immobilisierten Fängermolekülen, mit welchen die vervielfältigten Nukleinsäuren hybridisieren, durch eine elektrochemische Reaktion erfolgen. Vorzugsweise wird die erste Flüssigkeit über das flüssigkeitsleitende System in eine flüssigkeitsleitend mit dem flüssigkeitsleitenden System in Verbindung stehende Detektionskammer geleitet. Bevorzugt erfolgt beim Schritt lit. c) eine Hybridisierung der vervielfältigten Nukleinsäuren mit, insbesondere immobilisierten, weiteren Nukleinsäuren. Die weiteren Nukleinsäuren können auf einem, insbesondere in der Detektionskammer angeordneten, Chip immobilisiert sein. Der Nachweis gemäß Schritt lit. c) kann auf dem Chip mittels eines optischen oder eines elektrischen Nachweisverfahrens erfolgen. Beim optischen Nachweisverfahren kann das Vorhandensein von Nukleinsäuren, welche an auf dem Chip immobilisierte weitere Nukleinsäuren gebunden haben, beispielsweise dadurch nachgewiesen werden, dass die Fluoreszenz von in die vervielfältigten Nukleinsäuren eingebauten Fluorophoren gemessen wird. Der elektrochemische Nachweis kann beispielsweise durch auf dem Chip angeordnete Gra- fitelektroden erfolgen, an welche die weiteren Nukleinsäuren als Sonden immobilisiert sind. Nach dem Binden der spezifischen vervielfältigen Nukleinsäuren kann dann ein elektrochemischer Nachweis gebundener Nukleinsäuren durchgeführt werden.
Bei einer vorteilhaften Ausgestaltung des Verfahrens sind das Reaktionsgefäß und das flüssigkeitsleitende System oder das Reaktionsgefäß, zumindest ein Teil der Detektionskammer und das flüssigkeitsleitende System, bevorzugt einstückig, aus demselben Material, insbesondere aus einem spritzgegossenen Kunststoff, bevorzugt Polycarbonat , hergestellt. Durch die einstückige Herstellung kann das Todvolumen zwischen der De- tektionskammer und dem restlichen flüssigkeitsleitenden System und dem Reaktionsgefäß und dem restlichen flüssigkeits- leitenden System minimiert werden. Dadurch kann das Verfahren insgesamt mit weniger Flüssigkeit, weniger Nukleinsäuren und weniger Reagenzien für die NSV durchgeführt werden. Das Verfahren ist dadurch empfindlicher und kostengünstiger durchzuführen. Weiterhin ist die einstückige Herstellung durch ein Spritzgussverfahren besonders kostengünstig. Der Einstückig- keit steht es nicht entgegen, wenn das flüssigkeitsleitende System eine zumindest teilweise offene Leitungen enthaltende Leitungsplatte und ein damit verbundenes, die offenen Leitungen verschließendes, Verschlussmittel umfasst. Das Ver- Schlussmittel kann z. B. eine Kunststoffplatte sein, die mit der Leitungsplatte durch Laserschweißen entlang der offenen Leitungen in der Leitungsplatte fest verbunden ist . Ein derartiges flüssigkeitsleitendes System ist einfach und kostengünstig herzustellen und weist eine hohe Dichtigkeit und Druckstabilität der Leitungen auf.
Alternativ kann das Reaktionsgefäß auch in Form einer Patrone bereitgestellt werden, welche vor Durchführung des Schritts lit. a) durch Aufstecken auf eine dafür vorgesehene Aufnahme- einheit flüssigkeitsleitend und nach außen flüssigkeitsdicht mit dem flüssigkeitsleitenden System verbunden wird. Die Aufnahmeeinheit kann beispielsweise durch einen Anschlussstutzen zum Einstecken eines Anschlussabschnitts der Patrone bereitgestellt werden. Durch die Ausbildung des Reaktionsgefäßes als Patrone kann in dem Reaktionsgefäß beispielsweise die Nukleinsäure oder ein für die NSV erforderliches Reagenz vorgelegt werden. Bei einer bevorzugten Ausgestaltung des Verfahrens wird mindestens ein zylinderförmiges Gefäß bereitgestellt, welches eine zweite oder weitere Flüssigkeit enthält und an das flüssigkeitsleitende System flüssigkeitsleitend angeschlossen ist, wobei das Gefäß zwischen einem Außenraum und einem Innenraum des Gefäßes einen im Gefäß verschiebbaren zweiten oder weiteren Kolben aufweist, wobei die zweite oder weitere Flüssigkeit durch Betätigen des zweiten oder weiteren Kolbens über das flüssigkeitsleitende System in das Reaktionsgefäß gedrückt wird. Bevorzugt ist es, wenn drei zylinderförmige
Gefäße bereitgestellt werden, welche jeweils eine Flüssigkeit und einen Kolben aufweisen, wobei je eine der Flüssigkeiten ein für die Durchführung einer PCR erforderliches Reagenz, insbesondere Polymerase, Primer und Puffer, enthält.
Besonders bevorzugt ist es, wenn das zylinderförmige Gefäß in Form einer Patrone bereitgestellt wird, welche vor Durchführung des Schritts lit. a) durch Aufstecken auf eine dafür vorgesehene Aufnahmeeinheit mit dem flüssigkeitsleitenden Sy- stem flüssigkeitsleitend und nach außen flüssigkeitsdicht verbunden wird. Dadurch können beispielsweise einheitliche Patronen mit Polymerase und Puffer bereitgestellt werden und für die jeweils nachzuweisende Nukleinsäure individuelle Patronen mit einem jeweils dazu erforderlichen Primerpaar. Be- vorzugt ist es, wenn das zylinderförmige Gefäß oder, im Falle der Bereitstellung mehrerer zylinderförmiger Gefäße, die zylinderförmigen Gefäße sämtliche für die Durchführung der NSV neben der Nukleinsäure erforderlichen Reagenzien, insbesondere Polymerase, Primer und Puffer, enthält bzw. enthalten.
Bei einer Ausgestaltung des Verfahrens umfasst das flüssigkeitsleitende System eine Mehrzahl von in einer Ebene in einem plattenartigen Leitungselement angeordneten zweiten Flüssigkeitsleitungen und die Aufnahmeeinheit/Aufnahmeeinheiten zum Aufstecken der Patrone/Patronen. Die Durchführung des Verfahrens mit einem derartigen flüssigkeitsleitenden System ist besonders günstig, weil die Spezifität des Verfahrens für bestimmte Nukleinsäuren durch das Aufstecken entsprechender Patronen beliebig gewählt werden kann. In den zweiten Flüssigkeitsleitungen können, insbesondere durch eine Membran bereitgestellte, Ventile vorgesehen sein. Die Membran ist so angeordnet und ausgebildet, dass durch Ausüben von Druck ein Durchgang durch die zweiten Flüssigkeitsleitungen abgesperrt werden kann. Der Druck kann beispielsweise durch einen von einer automatisierten Betätigungsvorrichtung betätigten auf die Membran drückenden Stößel ausgeübt werden.
Weiterhin kann das flüssigkeitsleitende System eine jeweils flüssigkeitsleitend mit dem flüssigkeitsleitenden System in Verbindung stehende Probenaufbereitungskammer und Abfallkammer sowie einen flüssigkeitsleitend mit dem flüssigkeitsleitenden System in Verbindung stehenden Anschlussstutzen, insbesondere mit einem Profil zur Herstellung eines Bajonette- Verschlusses, aufweisen. An den Anschlussstutzen kann beispielsweise ein eine biologische Probe enthaltendes Rδhrchen, wie beispielsweise eine so genannte Monovette™, angeschlossen werden. Vorzugsweise sind die Probenaufbereitungskammern, die Abfallkammer, der Anschlussstutzen und das flüssigkeits- leitende System einstückig aus demselben Material, insbesondere aus spritzgegossenem Kunststoff, bevorzugt Polycarbonat, hergestellt. Der Einstückigkeit steht es nicht entgegen, wenn das Leitungselement eine zumindest teilweise offene Leitungen enthaltende Leitungsplatte und ein damit verbundenes, die of- fenen Leitungen verschließendes, Verschlussmittel umfasst .
Vorzugsweise werden beim erfindungsgemäßen Verfahren der erste und der zweite Kolben oder, im Falle des Bereitsteilens mehrerer zylinderförmiger Gefäße, der erste, der zweite und der/die weitere/n Kolben von derselben Seite des plattenartigen Leitungselements her durch Vorschub betätigt. Bei einer bevorzugten Ausgestaltung des Verfahrens werden die erste, zweite, eine ggf. vorhandene weitere Flüssigkeit und/oder; ei- ne Mischung daraus vor Schritt lit. b) zwischen dem zylinderförmigen Gefäß und einem ggf. vorhandenen weiteren Gefäß oder dem Reaktionsgefäß und dem zylinderförmigen Gefäß hin- und herbewegt . Dadurch kann eine besonders gute Durchmischung sämtlicher für die NSV erforderlicher Reagenzien und der nachzuweisenden Nukleinsäuren erreicht werden.
Die Erfindung betrifft weiterhin eine Vorrichtung zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens, bestehend aus einem zylinderförmigen Reaktionsgefäß, welches über eine an einem ersten Ende des Reaktionsgefäßes vorgesehene Öffnung und eine in die Öffnung mündende erste Flüssigkeitsleitung flüssigkeitsleitend an ein flüssigkeitsleitendes System angeschlossen ist, so dass das Reaktionsgefäß über das flüssigkeitsleitende System mit einer ersten, zweiten oder weiteren Flüssig- keit gefüllt und entleert werden kann. Das Reaktionsgefäß weist zwischen einem Außenraum und einem Innenraum des Reaktionsgefäßes einen im Reaktionsgefäß verschiebbaren ersten Kolben auf, wobei der erste Kolben derart ausgebildet ist, dass er durch die erste, zweite oder weitere Flüssigkeit be- wegt werden kann, wenn sie in das Reaktionsgefäß durch die Öffnung eingeleitet wird oder bei einer Temperaturänderung ihr Volumen ändert oder Gas bildet, so dass dadurch das Volumen des Innenraums des Reaktionsgefäßes verändert wird. Es ist mindestens ein Gefäß vorgesehen, welches die zweite oder weitere Flüssigkeit enthält und an das flüssigkeitsleitende System flüssigkeitsleitend angeschlossen ist. Das Gefäß oder, im Falle des Vorhandenseins mehrerer Gefäße, die Gefäße enthält/enthalten für die Durchführung der NSV neben der Nukleinsäure erforderliche Reagenzien. Dabei können sämtliche für die Durchführung der NSV neben der zu vervielfältigenden Nukleinsäure erforderlichen Reagenzien enthalten sein. Im Falle, dass bereits ein Teil der für die NSV erforderlichen Reagenzien im Reaktionsgefäß vorgelegt oder in der ersten Flüssigkeit enthalten ist, kann auch nur der restliche Teil der für die NSV erforderlichen Reagenzien enthalten sein.
Bevorzugt weist das Reaktionsgefäß eine starre, insbesondere aus Polycarbonat bestehende, Gefäßwand auf. Eine starre Ge- fäßwand verbessert die Dichtheit zwischen Kolben und Gefäßwand. Polycarbonat ermöglicht eine gute Wärmeübertragung von außen in das Reaktionsgefäß und ist darüber hinaus mit der Durchführung einer PCR kompatibel. Darüber hinaus gewährleistet die starre Gefäßwand eine präzise Änderung des VoIu- mens des Innenraums des Reaktionsgefäßes und eine präzise
Flüssigkeitsbewegung durch eine definierte Bewegung des ersten Kolbens.
Weitere vorteilhafte Ausgestaltung der erfindungsgemäßen Vor- richtung sind den Ansprüchen zu entnehmen.
Es versteht sich, dass die vorstehend genannten und die nachstehend noch zu erläuternde Merkmale nicht nur in den jeweils angegebenen Kombinationen, sondern auch in anderen Kombina- tionen oder in Alleinstellung verwendbar sind, ohne den Rahmen der vorliegenden Erfindung zu verlassen.
Nachfolgend wird eine vorteilhafte Ausgestaltung der Erfindung anhand eines Ausführungsbeispiels näher erläutert. Es zeigen:
Fig. 1 Eine schematische Darstellung einer erfindungsgemäßen Vorrichtung vor der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens, Fig. 2 eine schematische Darstellung einer erfindungsgemäßen Vorrichtung am Beginn des Befüllens des Reaktionsgefäßes mit einer Flüssigkeit,
Fig. 3 eine schematische Darstellung einer erfindungsgemäßen Vorrichtung nach dem Befüllen mit der Flüssigkeit,
Fig. 4 eine schematische Darstellung einer erfindungsgemäßen Vorrichtung beim Durchführen des erfindungsgemäßen Verfahrens und
Fig. 5 eine Explosionszeichnung eines die erfindungsgemäße Vorrichtung enthaltenen flüssigkeitsleitenden Systems .
Die erfindungsgemäße Vorrichtung 10 besteht aus dem Reaktionsgefäß 12 und einem flüssigkeitsleitenden System 14, an welches das Reaktionsgefäß 12 über mindestens eine erste
Flüssigkeitsleitung 16 angeschlossen ist. Die Vorrichtung 10 weist einen beweglichen Verschluss in Form eines ersten Kolbens 18 auf. Weiterhin weist die Vorrichtung 10 einen durch einen entfernbaren Stab 20 gebildeten Anschlag 21 für den er- sten Kolben 18 auf. Das flüssigkeitsleitende System 14 weist eine verschließbare oder selbstschließende, hier als Ventil 22 ausgebildete, Eingangsöffnung auf. Statt des Ventils 22 könnte hier auch ein Septum oder ein Gummistopfen vorgesehen sein, welches/welcher mittels einer Kanüle durchstochen wer- den kann. Weiterhin weist die Vorrichtung 10 ein weiteres Ventil 24 auf.
In Fig. 2 ist der Beginn des Befüllens des Reaktionsgefäßes 12 mit der ersten Flüssigkeit 26 schematisch dargestellt. Die erste Flüssigkeit 26 befindet sich zunächst in der Injektionsspritze 28. Die erste Flüssigkeit 26 wird mittels einer Kanüle durch das geöffnete Ventil 22 in das flüssigkeitsleitende System 14 injiziert. Da das weitere Ventil 24 geschlos- sen ist, wird die erste Flüssigkeit 26 über die erste Flüssigkeitsleitung 16 in das Reaktionsgefäß 12 gedrückt. Dabei wird der erste Kolben 18 angehoben. In das Reaktionsgefäß 12 gelangt ein genau definiertes Volumen, welches durch den durch den Stab 20 gebildeten Anschlag 21 für den ersten KoI- ben 18 vorgegeben ist. Nach dem Füllen des Reaktionsgefäßes 12 wird die Injektionsspritze 28 entfernt und das Ventil 22 in Schließstellung gebracht. Dieser Zustand ist in Fig. 3 dargestellt .
Fig. 4 zeigt die Vorrichtung 10 schematisch bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens. Der Stab 20 ist entfernt worden, damit sich der erste Kolben 18 frei bewegen kann. Die erste Flüssigkeit 26 wird, wie bei der Durchführung einer PCR üblich, erwärmt und wieder abgekühlt. Dabei ändert sich das Volumen der ersten Flüssigkeit 26. Diese Volumenänderung bewirkt eine Bewegung des ersten Kolbens 18. Dadurch wird die Volumenänderung der ersten Flüssigkeit 26 durch eine entsprechende Volumenänderung des Innenraums des Reaktionsgefäßes 12 ausgeglichen. Es ist auch möglich, den Stab 20 nur etwas zurückzuziehen, so dass durch eine Bewegung des ersten
Kolbens 18 die Volumenänderung der ersten Flüssigkeit 26 zwar ausgeglichen wird, die Bildung von Gasblasen durch einen weiterhin bestehenden durch den Stab 20 gebildeten Anschlag 21 für den ersten Kolben 18 jedoch vermieden oder zumindest ab- geschwächt wird.
Fig. 5 zeigt ein fluidisches System, welches einen Träger 30 umfasst. Auf der in der Zeichnung nicht dargestellten Unterseite des Trägers 30 verlaufen Flüssigkeitsleitungen ein- schließlich der ersten Flüssigkeitsleitung 16, welche eine nach unten zumindest teilweise offene Seite aufweisen und durch die Verschlussplatte 32 verschlossen werden. Auf dem Träger 30 ist das Reaktionsgefäß 12 vorgesehen. Zum Anschlie- ßen von Patronen 34 mit Reagenzien enthaltenden weiteren
Flüssigkeiten oder Probenbehälter 36 ist ein Anschlusselement 38 vorgesehen. Das Anschlusselement 38 wird mit dem Träger 30 verbunden und der Chip 40, welcher zum Nachweis von im Reaktionsgefäß 12 amplifizierter Nukleinsäuren dient, wird mit den Rasthaken 42 verrastet. Das flüssigkeitsleitende System
14 weist eine Probenaufbereitungskammer 44, eine Abfallkammer 46, verschiedene Anschlussstutzen zum Aufstecken von Patronen 34 und Probenbehälter 36 sowie eine Reaktionskammer 12 auf. Das in Fig. 5 dargestellte flüssigkeitsleitende System 14 kann nach einem Aufstecken der Patronen 34 eine Einheit bilden, in der komplexe Vorgänge, wie z. B. ein AufSchluss von Zellen, eine Reinigung von Biomolekülen, eine Nukleinsäuream- plifikation und ein Nachweis von Biomolekülen mittels des Chips 40 erfolgen kann.
Bezugszeichenliste
10 Vorrichtung
12 Reaktionsgefäß 14 flüssigkeitsleitendes System
16 erste Flüssigkeitsleitung
18 erster Kolben
20 Stab
21 Anschlag 22 Ventil
24 weiteres Ventil
26 erste Flüssigkeit
28 Injektionsspritze
30 Träger 32 Verschlussplatte
34 Patrone
36 Probenbehälter
38 Anschlusselement
40 Chip 42 Rasthaken
44 Probenaufbereitungskammer
46 Abfallkammer

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur Durchführung einer Reaktion zur Vervielfältigung einer Nukleinsäure (Nukleinsäurevervielfältigungsreak- tion; NSV) in einem flüssigkeitsleitenden System (14) , wobei die Nukleinsäure in einer ersten Flüssigkeit (26) enthalten ist, wobei ein zylinderförmiges Reaktionsgefäß (12) vorgesehen ist, welches an einem ersten Ende eine Öffnung aufweist, die flüssigkeitsleitend über eine erste Flüssigkeitsleitung (16) an das flüssigkeitsleitende System (14) angeschlossen ist und welches über die erste Flüssigkeitsleitung (16) mit der ersten Flüssigkeit (26) gefüllt und entleert werden kann, wobei das Reaktionsgefäß (12) zwischen einem Außenraum und dem Innenraum des Reaktionsgefäßes (12) einen im Reaktionsge- faß (12) verschiebbaren ersten Kolben (18) aufweist, mit folgenden Schritten:
a) Einleiten der ersten Flüssigkeit (26) und von für die Durchführung der NSV erforderlichen Reagenzien, soweit die Reagenzien nicht im Reaktionsgefäß (12) vorgelegt sind, durch die erste Flüssigkeitsleitung (16) in das Reaktionsgefäß (12) , so dass sämtliche für die Durchführung der NSV erforderlichen Reagenzien im Reaktionsgefäß (12) vorhanden sind,
b) Inkubation der ersten Flüssigkeit (26) in dem Reaktionsgefäß (12) unter Bedingungen, welche für die NSV erforderlich sind und
c) Nachweis der bei der NSV entstandenen vervielfältigten Nukleinsäure .
2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der erste Kolben (18) durch das Einleiten der ersten Flüssigkeit (26) verschoben wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die NSV eine Po- lymerasekettenreaktion (PCR) oder eine sonstige Reaktion ist, bei welcher die Temperatur der ersten Flüssigkeit (26) verändert wird.
4. Verfahren nach Anspruch 3, wobei der erste Kolben (18) durch die erste Flüssigkeit (26) bewegt wird, wenn die erste Flüssigkeit (26) durch eine Temperaturänderung ihr Volumen ändert oder Gas bildet, so dass dadurch das Volumen des Innenraums des Reaktionsgefäßes (12) verändert wird.
5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der erste Kolben (18) während des gesamten Verfahrens nur durch die erste Flüssigkeit (26) und/oder durch aus der ersten Flüssigkeit (26) gebildetem Gas und/oder durch Drücken des ersten Kolbens (18) von außerhalb des Reaktionsgefäßes (12) verschoben wird.
6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der erste Kolben (18) bei den Schritten lit. a) und/oder b) bis zu einem vorgegebenen Anschlag (21) bewegt wird.
7. Verfahren nach Anspruch 6, wobei der Anschlag (21) zwischen den Schritten lit. a) und b) in zur Öffnung hin entgegengesetzten Richtung verschoben oder entfernt wird.
8. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei durch den ersten Kolben (18) gegenüber der sich bei einem Erwärmen ausdehnenden ersten Flüssigkeit (26) eine solche Gegenkraft ausgeübt wird, dass dadurch ein Druck aufgebaut wird, welcher eine Bildung von Gasblasen im Vergleich zu einem druckfreien System vermindert .
9. Verfahren nach Anspruch 8, wobei die Gegenkraft durch ein auf den ersten Kolben (18) wirkendes durch eine Ausdehnung der ersten Flüssigkeit (26) gegen die Schwerkraft zu bewegendes Gewicht oder durch einen Reibwiderstand des ersten Kolbens (18) gegenüber dem Reaktionsgefäß (12) erzeugt wird.
10. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Reaktionsgefäß (12) bei der Durchführung des Verfahrens so angeordnet wird, dass dabei in der ersten Flüssigkeit (26) sich bildende Blasen zum ersten Kolben (18) aufsteigen können.
11. Verfahren nach Anspruch 10, wobei die Längsachse des Reaktionsgefäßes (12) im Wesentlichen lotrecht angeordnet wird.
12. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei bei dem zylinderförmigen Reaktionsgefäß (12) das Verhältnis von Höhe zum Innendurchmesser größer als 2, bevorzugt größer als 4, insbesondere größer als 6, ist.
13. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Wandstärke des zylinderförmigen Reaktionsgefäßes (12) geringer als 1 mm, bevorzugt geringer als 0,5 mm, besonders bevorzugt geringer als 0,3 mm, ist.
14. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das flüssigkeitsleitende System (14) oder die Öffnung oder die erste Flüssigkeitsleitung (16) zwischen den Schritten lit. a) und lit. b) flüssigkeitsdicht verschlossen wird.
15. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Nukleinsäure, insbesondere in Form einer biologischen Probe, vor Schritt lit. a) in das flüssigkeitsleitende System (14) eingeführt wird und wobei das flüssigkeitsleitende Sy- stem (14) danach und vor der Durchführung des Schritts lit. a) flüssigkeitsdicht verschlossen wird.
16. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Reaktionsgefäß (12) beim Schritt lit. b) zur Einstellung der Bedingungen, welche für die NSV erforderlich sind, insbesondere durch Anblasen mit einem Luftström, erwärmt oder gekühlt wird.
17. Verfahren nach Anspruch 16, wobei das Reaktionsgefäß (12) beim Schritt lit. b) ein zyklisches Temperaturprofil durchläuft.
18. Verfahren nach Anspruch 16 oder 17, wobei der Luftstrom durch eine Luftführung, insbesondere ein Luftleitschild, zu- mindest teilweise, um das Reaktionsgefäß (12) herum geführt wird.
19. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Nachweis gemäß Schritt lit. c) außerhalb des Reaktionsge- fäßes (12) erfolgt und die erste Flüssigkeit (26) zwischen den Schritten lit. b) und lit. c) durch die Öffnung und die erste Flüssigkeitsleitung (16) hindurch, insbesondere durch Vorschub des ersten Kolbens (18) , aus dem Reaktionsgefäß (12) geleitet wird.
20. Verfahren nach Anspruch 19, wobei die erste Flüssigkeit (26) über das flüssigkeitsleitende System (14) in eine flüssigkeitsleitend mit dem flüssigkeitsleitenden System (14) in Verbindung stehende Detektionskammer geleitet wird.
21. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei bei Schritt lit. c) eine Hybridisierung der vervielfältigten Nukleinsäuren mit, insbesondere immobilisierten, weiteren Nu- kleinsäuren erfolgt .
22. Verfahren nach Anspruch 21, wobei die weiteren Nukleinsäuren auf einem, insbesondere in der Detektionskammer angeordneten, Chip (40) immobilisiert sind.
23. Verfahren nach Anspruch 22, wobei der Nachweis gemäß Schritt lit. c) auf dem Chip (40) mittels eines optischen oder eines elektrochemischen Nachweisverfahrens erfolgt.
24. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Reaktionsgefäß (12) und das flüssigkeitsleitende System (14) oder das Reaktionsgefäß (12) , zumindest ein Teil der Detektionskammer und das flüssigkeitsleitende System (14) , bevorzugt einstückig, aus demselben Material, insbesondere aus einem spritzgegossenen Kunststoff, bevorzugt Polycarbonat , hergestellt sind.
25. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 23, wobei das Reaktionsgefäß (12) in Form einer Patrone (34) bereitgestellt wird, welche vor Durchführung des Schritts lit. a) durch Aufstecken auf eine dafür vorgesehene Aufnähmeeinheit flüssigkeitsleitend und nach außen flüssigkeitsdicht mit dem flüssigkeitsleitenden System (14) verbunden wird.
26. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei mindestens ein zylinderförmiges Gefäß bereitgestellt wird, welches eine zweite oder weitere Flüssigkeit enthält und an das flüssigkeitsleitende System (14) flüssigkeitsleitend angeschlossen ist, wobei das Gefäß zwischen einem Außenraum und dem Innenraum des Gefäßes einen im Gefäß verschiebbaren zweiten oder weiteren Kolben aufweist, wobei die zweite oder v/eitere Flüssigkeit durch Betätigen des zweiten oder weiteren Kolbens über das flüssigkeitsleitende System (14) in das Re- aktionsgefäß (12) gedrückt wird.
27. Verfahren nach Anspruch 26, wobei das zylinderförmige Gefäß in Form einer Patrone (34) bereitgestellt wird, welche vor Durchführung des Schritts lit. a) durch Aufstecken auf eine dafür vorgesehene Aufnähmeeinheit mit dem flüssigkeitsleitenden System (14) flüssigkeitsleitend und nach außen flüssigkeitsdicht verbunden wird.
28. Verfahren nach Anspruch 27, wobei das zylinderförmige Ge- faß oder, im Falle des Bereitstellens mehrerer zylinderförmiger Gefäße, die zylinderförmigen Gefäße sämtliche für die Durchführung der NSV neben der Nukleinsäure erforderlichen Reagenzien, insbesondere Polymerase, Primer und Puffer, enthält/enthalten.
29. Verfahren nach Anspruch 27 oder 28, wobei das flüssigkeitsleitende System (14) eine Mehrzahl von in einer Ebene in einem plattenartigen Leitungselement angeordnete zweite Flüssigkeitsleitungen und die Aufnahmeeinheit/Aufnahmeeinheiten zum Aufstecken der Patrone/Patronen (34) umfasst.
30. Verfahren nach Anspruch 29, wobei in den zweiten Flüssigkeitsleitungen, insbesondere durch eine Membran, welche durch Ausüben von Druck einen Durchgang durch die zweiten Flüssig- keitsleitungen absperren kann, bereitgestellte, Ventile (22, 24) vorgesehen sind.
31. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Vorrichtung (10) weiterhin eine jeweils flüssigkeitslei- tend mit dem flüssigkeitsleitenden System (14) in Verbindung stehende Probenaufbereitungskammer (44) und Abfallkammer (46) sowie einen flüssigkeitsleitend mit dem flüssigkeitsleitenden System (14) in Verbindung stehenden Anschlussstutzen, insbe- sondere mit einem Profil zur Herstellung eines Bajonetteverschlusses, aufweist.
32. Verfahren nach Anspruch 31, wobei die Probenaufbereitungskammer (44) , die Abfallkammer (46) , der Anschlussstutzen und das flüssigkeitsleitende System (14) einstückig aus demselben Material, insbesondere aus einem spritzgegossenen Kunststoff, bevorzugt Polycarbonat , hergestellt sind.
33. Verfahren nach einem der Ansprüche 29 bis 32, wobei der erste (18) und der zweite Kolben oder, im Falle des Bereitsteilens mehrerer zylinderförmiger Gefäße, der erste (18) , der zweite und der/die weitere (n) Kolben von derselben Seite des plattenartigen Leitungselements her durch Vorschub betätigt werden.
34. Verfahren nach einem der Ansprüche 26 bis 33, wobei die erste (26), zweite, eine ggf. vorhandene weitere Flüssigkeit und/oder eine Mischung daraus vor Schritt lit. b) zwischen dem zylinderförmigen Gefäß und einem ggf. vorhandenen weite- ren Gefäß oder dem Reaktionsgefäß (12) und dem zylinderförmigen Gefäß hin- und herbewegt wird.
35. Vorrichtung (10) zur Durchführung eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 34, bestehend aus einem zylinder- förmigen Reaktionsgefäß (12) , welches über eine an einem ersten Ende des Reaktionsgefäßes (12) vorgesehene Öffnung und eine in die Öffnung mündende erste Flüssigkeitsleitung (16) flüssigkeitsleitend an ein flüssigkeitsleitendes System (14) angeschlossen ist, so dass das Reaktionsgefäß (12) über das flüssigkeitsleitende System (14) mit einer ersten (26) , zweiten oder weiteren Flüssigkeit gefüllt und entleert werden kann, wobei das Reaktionsgefäß (12) zwischen einem Außenraum und dem Innenraum des Reaktionsgefäßes (12) einen im Reakti- onsgefäß (12) verschiebbaren ersten Kolben (18) aufweist, wobei der ersten Kolben (18) derart ausgebildet ist, dass er durch die erste (26) , zweite oder weitere Flüssigkeit bewegt werden kann, wenn sie in das Reaktionsgefäß (12) durch die Öffnung eingeleitet wird oder bei einer Temperaturänderung ihr Volumen ändert oder Gas bildet, so dass dadurch das Volumen des Innenraums des Reaktionsgefäßes (12) verändert wird, wobei mindestens ein Gefäß vorgesehen ist, welches die zweite oder weitere Flüssigkeit enthält und an das flüssigkeitsleitende System (14) flüssigkeitsleitend angeschlossen ist, wo- bei das Gefäß oder, im Falle des Vorhandenseins mehrerer Gefäße, die Gefäße für die Durchführung der NSV neben der Nukleinsäure erforderliche Reagenzien enthält/enthalten.
36. Vorrichtung (10) nach Anspruch 35, wobei das Reaktionsge- faß (12) eine starre, bevorzugt aus Polycarbonat bestehende,
Gefäßwand aufweist.
37. Vorrichtung (10) nach Anspruch 35 oder 36, wobei bei dem zylinderförmigen Reaktionsgefäß (12) das Verhältnis von Höhe zum Innendurchmesser größer als 2, bevorzugt größer als 4, insbesondere größer als 6, ist.
38. Vorrichtung (10) nach einem der Ansprüche 35 bis 37, wobei die Wandstärke des zylinderförmigen Reaktionsgefäßes (12) geringer als 1 mm, bevorzugt geringer als 0,5 mm, insbesondere geringer als 0,3 mm, ist.
39. Vorrichtung (10) nach einem der Ansprüche 35 bis 38, wobei der erste Kolben (18) so ausgebildet ist, dass er eine Gegenkraft erzeugt, wenn das Volumen des Innenraums des Reaktionsgefäßes (12) durch eine sich darin ausdehnende erste Flüssigkeit (26) vergrößert wird.
40. Vorrichtung (10) nach Anspruch 39, wobei die Gegenkraft durch ein auf den ersten Kolben (18) wirkendes durch eine Ausdehnung der ersten Flüssigkeit (26) gegen die Schwerkraft zu bewegendes Gewicht oder durch einen Reibwiderstand des ersten Kolbens (18) gegenüber dem Reaktionsgefäß (12) erzeugt wird.
41. Vorrichtung (10) nach einem der Ansprüche 35 bis 40, wobei der erste Kolben (18) so ausgebildet und in der Vorrichtung (10) angeordnet ist, dass mittels des ersten Kolbens (18) eine in dem Reaktionsgefäß (12) enthaltene erste Flüssigkeit (26) aus dem Reaktionsgefäß (12) durch die Öffnung und die erste Flüssigkeitsleitung (16) gedrückt werden kann.
42. Vorrichtung (10) nach einem der Ansprüche 35 bis 41, wo- bei das flüssigkeitsleitende System (14) ein mikrofluidisches
System ist.
43. Vorrichtung (10) nach einem der Ansprüche 35 bis 42, wobei das Reaktionsgefäß (12) freistehend ausgebildet ist.
44. Vorrichtung (10) nach einem der Ansprüche 35 bis 43, wobei eine Luftführung, insbesondere ein Luftleitschild, vorgesehen ist, welche so angeordnet ist, dass dadurch ein Luft- strom, zumindest teilweise, um das Reaktionsgefäß (12) herum geführt wird.
45. Vorrichtung (10) nach einem der Ansprüche 35 bis 44, wobei die Vorrichtung (10) flüssigkeitsdicht verschließbar ausgebildet ist.
46. Vorrichtung (10) nach einem der Ansprüche 35 bis 45, wobei eine flüssigkeitsleitend mit dem flüssigkeitsleitenden System (14) in Verbindung stehende Detektionskammer vorgese- hen ist.
47. Vorrichtung (10) nach einem der Ansprüche 35 bis 46, wobei in der Detektionskammer ein, insbesondere immobilisierte Nukleinsäuren aufweisender, Chip (40) vorgesehen ist.
48. Vorrichtung (10) nach einem der Ansprüche 35 bis 47, wobei das Reaktionsgefäß (12) und das flüssigkeitsleitende System (14) oder das Reaktionsgefäß (12), die Detektionskammer und das flüssigkeitsleitende System (14) , bevorzugt einstük- kig, aus demselben Material, insbesondere aus einem spritzgegossenen Kunststoff, bevorzugt Polycarbonat , hergestellt sind.
49. Vorrichtung (10) nach einem der Ansprüche 35 bis 47, wo- bei das Reaktionsgefäß (12) in Form einer Patrone (34) ausgebildet ist, welche auf eine dafür vorgesehene Aufnahmeeinheit aufgesteckt und dadurch flüssigkeitsleitend an das flüssigkeitsleitende System (14) angeschlossen ist.
50. Vorrichtung (10) nach einem der Ansprüche 35 bis 49, wobei das Gefäß zylinderförmig ist und zwischen einem Außenraum und dem Innenraum des Gefäßes einen im Gefäß verschiebbaren zweiten oder weiteren Kolben aufweist.
51. Vorrichtung (10) nach Anspruch 50, wobei das zylinderförmige Gefäß die Form einer Patrone (34) aufweist, welche durch Aufstecken auf eine dafür vorgesehene Aufnahmeeinheit mit dem flüssigkeitsleitenden System (14) flüssigkeitsleitend und nach außen flüssigkeitsdicht verbunden ist.
52. Vorrichtung (10) nach einem der Ansprüche 35 bis 51, wobei es sich bei den Reagenzien um Polymerase, Primer und Puffer handelt.
53. Vorrichtung (10) nach einem der Ansprüche 35 bis 52, wobei das flύssigkeitsleitende System (14) eine Mehrzahl von in einer Ebene in einem plattenartigen Leitungselement angeordneten zweiten Flύssigkeitsleitungen und die Aufnahmeein- heit/Aufnahmeeinheiten zum Aufstecken der Patrone/Patronen (34) umfasst .
54. Vorrichtung (10) nach Anspruch 53, wobei in den zweiten Flüssigkeitsleitungen Ventile (22, 24) vorgesehen sind, wel- che insbesondere durch eine Membran bereitgestellt werden, welche durch Ausüben von Druck einen Durchgang durch die zweiten Flüssigkeitsleitungen absperren können.
55. Vorrichtung (10) nach einem der Ansprüche 35 bis 54, wo- bei weiterhin eine jeweils flüssigkeitsleitend mit dem flüssigkeitsleitenden System (14) in Verbindung stehende Probenaufbereitungskammer (44) und Abfallkammer (46) sowie ein flüssigkeitsleitend mit dem flüssigkeitsleitenden System (14) in Verbindung stehender Anschlussstutzen, insbesondere mit einem Profil zur Herstellung eines Bajonetteverschlusses, vorgesehen sind.
56. Vorrichtung (10) nach einem der Ansprüche 35 bis 55, wobei die Probenaufbereitungskammer (44) , die Abfallkammer (46) , der Anschlussstutzen und das flüssigkeitsleitende Sy- stem (14) einstückig aus demselben Material, insbesondere aus einem spritzgegossenen Kunststoff, bevorzugt Polycarbonat , bestehen.
57. Vorrichtung (10) nach einem der Ansprüche 53 bis 56, wobei das Reaktionsgefäß (12) und das zylinderförmige Gefäß oder die zylinderförmigen Gefäße so angeordnet sind, dass der erste (18) und der zweite Kolben oder der erste (18) , der zweite und der/die weitere (n) Kolben von derselben Seite des plattenartigen Leitungselements her durch Vorschub betätigt werden können .
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Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111205971B (zh) * 2020-04-22 2020-07-31 博奥生物集团有限公司 采样管

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA1338505C (en) * 1989-02-03 1996-08-06 John Bruce Findlay Containment cuvette for pcr and method of use
AU2001259770A1 (en) * 2000-05-15 2001-11-26 Biomicro Systems, Inc. Air flow regulation in microfluidic circuits for pressure control and gaseous exchange
DE10319045A1 (de) * 2003-04-25 2004-12-09 november Aktiengesellschaft Gesellschaft für Molekulare Medizin Vorrichtung und Verfahren zur Aufbereitung Biopolymerhaltiger Flüssigkeiten
DE50308515D1 (de) * 2003-07-04 2007-12-13 November Ag Molekulare Medizin Verwendung eines einwegbehälters, mikrofluidische vorrichtung und verfahren zur bearbeitung von molekülen
DE202004012163U1 (de) * 2004-07-08 2004-10-07 Tecan Trading Ag System mit Einrichtung zum Verhindern von Luftblasen in einer Hybridisierkammer
DE102004058828B4 (de) * 2004-10-28 2010-08-19 Progen Biotechnik Gmbh Vorrichtung und Verfahren zur parallelen Aufbereitung von Biopolymeren

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
See also references of WO2007101653A1 *
WITTWER C.T. ET AL: "Minimizing the time required for DNA amplification by efficient heat transfer to small samples", ANALYTICAL BIOCHEMISTRY, ACADEMIC PRESS INC, NEW YORK, vol. 186, no. 2, 1 May 1990 (1990-05-01), pages 328 - 331, XP024823234, ISSN: 0003-2697, [retrieved on 19900501], DOI: DOI:10.1016/0003-2697(90)90090-V *

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