WO2015058950A1 - Analyseeinheit zur durchführung einer polymerase-kettenreaktion, analysevorrichtung, verfahren zum betrieb einer solchen analyseeinheit und verfahren zum herstellen einer solchen analyseeinheit - Google Patents

Analyseeinheit zur durchführung einer polymerase-kettenreaktion, analysevorrichtung, verfahren zum betrieb einer solchen analyseeinheit und verfahren zum herstellen einer solchen analyseeinheit Download PDF

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analysis unit
recess
reaction
analysis
probe carrier
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Franz Laermer
Juergen Steigert
Jochen Hoffmann
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Robert Bosch Gmbh
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Definitions

  • the present invention relates to an analysis device for
  • Microfluidic diagnostic systems such as Lab-on-a-Chips (LOCs) allow the miniaturized and integrated execution of complex workflows for the specific detection of various molecules.
  • LOCs Lab-on-a-Chips
  • the sample material to be examined is first amplified by means of PCR and then analyzed on a microarray (see, for example, J. Choi et al .: An integrated allele-specific polymerase chain reaction-microarray chip for multiplex single nucleotide polymorphism typing, Lab on a Chip, vol. 12, 2012).
  • the combination of both operations and the multi-step process control require a longer process time and more complex processes
  • Analysis device for carrying out a polymerase chain reaction, an analysis device, a method for operating an analysis unit, on
  • the approach presented here provides an analysis unit for carrying out a polymerase chain reaction, the analysis device having the following features:
  • a lid member having at least one lid recess
  • a bottom member having at least one bottom recess, wherein the bottom recess of the lid recess is disposed opposite to form a reaction chamber;
  • Floor element is adapted to a fluid in the bottom recess of the
  • a probe carrier arranged in the bottom recess, which probe at least one indicator material for identifying a biochemical
  • a cover element and / or a bottom element can be understood, for example, a component which is made of a plastic, in particular of a polymer.
  • a recess for example, a depression in the cover element or the bottom element can be understood.
  • a film can be understood as meaning a flat, flexible element, such as a plastic layer. The film may be, for example, fluid-impermeable. Under a probe carrier, a rigid,
  • an indicator material can be understood as meaning a chemical reagent or a biomolecule which, on contact with a predetermined biochemical material, has a
  • Change of state undergoes which can be identified (for example, by optical analysis) and / or evaluated.
  • identification on the one hand a recognition of the presence of a predetermined material itself and / or a recognition of a quantity and / or a quality of the
  • Indicator material as a solid phase, i. is in solid state, the entire biochemical reaction process can be carried out in a small and compact analysis unit.
  • Reaction process are required, can be introduced in this case in the form of a fluid through the channel in the reaction chamber or the Bodenaus fundamentalung.
  • An embodiment of the present invention in which the film is fastened to the cover element is advantageous, in particular wherein the film fluid-tightly closes an opening of the lid recess opposite the through-opening and / or wherein the cover element has a passage opening in the region of the lid recess.
  • Such an embodiment of the present invention offers the advantage that a fluid or another material in the bottom recess or the reaction chamber can be very easily (further) moved, for example, from the bottom recess or the editorial board and / or in another
  • this movement of the fluid or of the other material can take place by a pressure on the lid element in the region of the lid recess which, via the film, acts on the fluid in the lid
  • the cover element may have at least one further cover recess and the bottom element at least one further bottom recess, wherein the further cover recess of the further bottom recess is arranged opposite and wherein the bottom recess and the other
  • a further probe carrier may be arranged in the further bottom recess, which has as another probe at least one further indicator material for identifying another biochemical material, wherein the further indicator material on the other probe carrier a solid state having.
  • the bottom recess can also separate the channel into at least two subchannels, wherein at least one subchannel enables a fluidic connection with an external environment of the analysis device, in particular wherein at least one subchannel has a valve.
  • the sub-channels are fluidically coupled or coupled to each other at an end remote from the bottom recess, in particular wherein the sub-channels are components of an annular channel.
  • a biochemical reagent for example, in different Bodenauslangungen or
  • Reaction chambers can be carried out by cyclic further displacement over the sub-channels, wherein a direction of movement for the reagent need not be changed.
  • An embodiment of the present invention is particularly favorable, in which the probe carrier as probe at least one additional one additional
  • Indicator material for identifying at least one additional biochemical material, wherein the additional indicator material on the
  • Probe carrier has a solid state of aggregation.
  • Embodiment of the present invention has the advantage that on a single probe carrier several different biochemical materials and / or different concentrations of such a material can be identified or detected particularly cost-effective, fast and technically easy to implement.
  • the probe carrier can, according to a favorable embodiment of the present invention, have at least one probe carrier recess in which the at least one probe carrier has Indicator material is arranged, in particular wherein the
  • the probe carrier can also be designed and arranged such that a reaction of a substance with the indicator material for identifying the biochemical material can be carried out during the polymerase chain reaction.
  • a reaction of a substance with the indicator material for identifying the biochemical material can be carried out during the polymerase chain reaction.
  • the approach presented here creates an analysis device for operating an analysis unit according to a variant presented here, wherein the
  • Analysis device has at least the following features:
  • a holder for placing and / or holding the analysis unit during operation of the analysis device
  • a tempering unit for controlling the temperature of a fluid or a solid in the analysis unit held by the holder
  • a holder may also be understood to mean a bearing surface on which the analysis unit is placed during the operation of the analysis device.
  • a tempering unit may be understood to be a unit which heats or cools at least one section of the analysis unit.
  • An evaluation unit can be understood as meaning a unit which detects a change in state of the at least one indicator material, for example by optical analysis of electromagnetic radiation converted or emitted by the indicator material (or by an indicator material changed by the biochemical material).
  • Embodiment of the present invention offers the advantage of a very compact analysis of a biochemical material with an inexpensive and easy-to-provide analysis unit.
  • An embodiment of the present invention in which the temperature control unit is designed to be different at the same time is particularly favorable To bring sections of the analysis unit to a different temperature.
  • Such an embodiment of the present invention offers the advantage that different partial reactions, which require different reaction temperatures, can be carried out simultaneously in different sections of the analysis unit. In this way, an analysis of a biochemical material can be performed very quickly with a technically simple to produce analysis unit.
  • the approach presented here provides a method for operating an analysis unit according to a variant presented here, the method having the following steps:
  • Such an embodiment of the present invention offers the advantage of a particularly rapid and inexpensive way of analyzing a biochemical material.
  • Polymerase chain reaction can be carried out simultaneously or in parallel, so that on the one hand can be analyzed very quickly a result of the polymerase chain reaction and on the other hand, the implementation of the polymerase chain reaction technically very simple, i. especially without manual
  • Invention offers the advantage that different sub-steps of the polymerase To be able to use chain reaction different reaction temperatures, so that the individual sub-steps of this polymerase chain reaction can proceed in an optimal environment for each case environment. Furthermore, a method for producing an analysis unit according to a variant presented here is proposed herein, the method comprising the following steps:
  • Cover member having a through hole, the bottom member having at least one bottom recess, the film and a
  • Probe carrier as a probe at least one indicator material for
  • Indicator material on the probe carrier has a fixed state of aggregation
  • Such an embodiment of the present invention offers the advantage of being able to produce an analysis unit for the particularly cost-effective and rapid identification of a biochemical material.
  • the present invention further provides a control device which is designed to implement or implement the steps of a variant of a method presented here in corresponding devices. Also through this
  • Embodiment variant of the invention in the form of a control unit in the form of a control unit
  • a control device can be understood as meaning an electrical device which processes sensor signals and outputs control and / or data signals in dependence thereon.
  • the control unit may have an interface, which may be formed in hardware and / or software.
  • the interfaces may be part of a so-called system ASIC, which performs various functions of the system
  • Control unit includes. However, it is also possible that the interfaces are their own integrated circuits or at least partially consist of discrete components. In a software training, the
  • Interfaces software modules that are available for example on a microcontroller in addition to other software modules.
  • An advantage is also a computer program product with program code, which on a machine-readable carrier such as a semiconductor memory, a
  • Hard disk space or an optical storage can be stored and used to carry out the method according to one of the embodiments described above, when the program product is executed on a computer or a device.
  • the approach presented here creates a computer program product with program code for carrying out or controlling the steps of a method presented here when the program product is executed on a device.
  • the present invention further provides an apparatus configured to perform the steps of a variant of a method presented herein in corresponding apparatus. Also through this
  • Embodiment of the invention in the form of a device the object underlying the invention can be solved quickly and efficiently.
  • a device can be understood as meaning an electrical device which processes sensor signals and outputs control and / or data signals in dependence thereon.
  • the device may have an interface, which may be formed in hardware and / or software.
  • the interfaces can be part of a so-called system ASIC, for example, which contains a wide variety of functions of the device.
  • the interfaces are their own integrated circuits or at least partially consist of discrete components.
  • the interfaces may be software modules that are present, for example, on a microcontroller in addition to other software modules.
  • 1A is a plan view of an analysis unit according to a
  • 1 B is a cross-sectional view of an analysis unit according to the in FIG.
  • FIG. 2 is a plan view of an analysis unit according to another embodiment of the present invention.
  • FIG. 3 is a cross-sectional view of an analysis unit according to the embodiment shown in FIG.
  • FIG. 4 is a plan view of an analysis unit according to another embodiment of the present invention.
  • 5A and 5B are top views of analysis units according to further embodiments of the present invention.
  • 6A is a cross-sectional view of a probe carrier according to a
  • 6B is a cross-sectional view of a probe carrier according to a
  • Fig. 7 is a schematic representation of an analysis device with a schematic representation of a in the analysis device
  • FIG. 9 is a flowchart of an embodiment of a method for manufacturing an analysis unit.
  • the DNA microarray (as an example of a probe carrier) is directly in a PCR reaction chamber
  • the DNA probes immobilized on the DNA microarray actively participate in the PCR and thus immobilize specifically
  • Amplification product i.e., the biochemical material.
  • FIG. 1A shows a top view of an analysis unit 100 according to an exemplary embodiment of the present invention.
  • FIG. 1B shows a
  • the analysis unit 100 comprises a plurality of layers, as can be seen from FIG. 1B.
  • a layer structure consists of a first polymer substrate as cover element 130, which has a cover recess 135 and a
  • a deflectable polymer membrane is attached as a film 140.
  • This film 140 may, for example, be connected in a fluid-tight manner to the cover element 130 so that contact between a medium that can be moved through the through-hole and not reach a region outside the film 140.
  • a bottom member 150 for example in the form of a second polymer substrate having in a Bodenelementaus Principleung 152, the PCR reaction chamber 1 10 with a DNA microarray as a probe support 155.
  • a DNA microarray as a probe support 155.
  • On the microarray 155 are different oligonucleotides as probes 157 in the form of individual Spots immobilized.
  • a microfluidic channel 160 (which is separated, for example, by the reaction chamber 110 into two sub-channels 160a and 160b) is connected to the chamber 110. Both channels 160a and 160b each have a controllable valve 165 to communicate with a PCR reaction mix (ie with material to be analyzed and / or with
  • Catalyst material which is used as auxiliary material for carrying out the
  • thermo energy for carrying out a PCR can be introduced and removed by an analysis device described in more detail below.
  • FIG. 2 shows a top view of an analysis unit 100 according to an embodiment of the present invention.
  • Fig. 3 shows a
  • Embodiment of the analysis unit 100 the two on the sub-channel 160b fluidly coupled to each other PCR reaction chambers 1 10 and 210 has.
  • the second reaction chamber 210 can be formed analogously to the (first) reaction chamber (except for the presence of the probe carrier 155).
  • the cover element 130 may have a further cover recess 235 which is fluidically connected to an external environment of the analyzer 100 via a further through-hole 237.
  • the film can also close the second lid recess 235 in a fluid-tight manner on a side opposite the further through-hole.
  • the bottom element 150 may have a further bottom recess 252 through which the second reaction chamber 210 is formed.
  • two defined temperature ranges 175 and 220 exist in which a constant, but different temperature is set over the entire time of the PCR.
  • This will be the Requirements for a temperature control unit of an analysis device compared to an analysis device for operation of the analysis unit 100 according to the embodiment illustrated in Figures 1 A and 1 B, in which the temperature between -60 ° C and -95 ° C in a time window of minutes are varied must (eg by means of Peltier element).
  • the reaction volume ie, the fluid having the material to be analyzed and / or the catalytic material
  • This reciprocating movement can take place, for example, by a pressure which exerts on the film 140 via the through-holes 137 or 237 on the respective reaction chambers 1 10 and 210, wherein the bulging of the film into these reaction chambers 1 10 or 210 let out the fluids located in the respective reaction chambers.
  • a polymeric layer structure of the analysis unit 100 with an integrated DNA microarray 155 can be used.
  • the DNA microarray 155 is present either directly in a PCR reaction chamber 110 or in a separate array chamber.
  • a reaction volume i.e., the fluid with the material to be analyzed or the catalytic material
  • Oligonucleotides as probes 157 of the microarray 155 actively participate in the PCR reaction so that DNA sequences are located at certain locations of the array 155.
  • the reaction takes place in a system of three PCR chambers 1 10, 210 and 310, which are fluidically interconnected via sub-channels 160, as described in US Pat
  • Analysis chambers 1 10, 210 and 310 constructed analogously to each other, wherein in the first two analysis chambers 1 10 and 210 each have a probe carrier 255th
  • annealing temperature 175 50 ° C.-65 ° C.
  • the array 155 or 255 can in this case either in the chamber 1 10 on
  • Extension temperature 220 is to be positioned. Furthermore, the first reaction chamber 1 10 and the second reaction chamber 310 to a
  • Extension temperature may be tempered to the melting temperature.
  • the reaction volume may first be reciprocated (using sub-channel 160b) between, for example, chambers 110 and 210 for between 1 to 40 cycles, and subsequently (under
  • FIG. 5A shows a top view of an analysis unit 110 according to a further exemplary embodiment of the present invention, in which a Reaction chamber 1 10 (array chamber) contains the array 155.
  • the chamber 1 10 is located either in the temperature range 175 of the annealing temperature or extension temperature 220 (as, for example, in the
  • FIG. 5B Top view of FIG. 5B can be seen).
  • This embodiment allows PCR to be initially performed in the PCR chambers 410, 210, or 310 without the array 155. After amplification, the reaction mixture is then transferred into the array chamber 110, so that the PCR products can be specifically bound to oligonucleotides 157.
  • the attachment can be by means of hybridization or primer extension reaction, for example by moving the reaction volume back and forth between a chamber
  • the chamber inlet 160a and outlets 160b of a fluidic layout may be provided with check valves 165 as shown in FIGS. 2, 4, 5A and 5B. This will be added
  • FIGS. 6A and 6B each show a structure to protect the surface of the array 155 (specifically, the spots of the immobilized oligonucleotides as probes 157).
  • the polymer membrane 140 is pneumatically deflected, while in the direction of the bottom of the
  • Array format 155 immobilized oligonucleotides 157 are damaged.
  • the spots of the array 155 may be immobilized in either wells 610 or on a microscopically rough surface 620.
  • Oligonucleotides 157 can be used with all immobilization chemistries known in the art, such as 3-aminopropyltriethoxysilane (APTES), 1-ethyl-3 (3-dimethylaminopropyl) -carbodiimide (EDC), 1, 4-phenylene diisothiocyanate (PDITC). , s-SIAB, s-MBS, s-GMBS or s-MBP on a variety of materials on the probe carrier 155 are fixed.
  • the arrays 155 may be either directly in one
  • Polymer substrate ie, the bottom member 130
  • Substrate 155 are spotted, which is then introduced and fixed in a second step in a PCR chamber.
  • FIG. 7 shows a cross-sectional illustration of an exemplary embodiment of an analysis device 700 for operating an analysis unit 100 according to an exemplary embodiment of the present invention with a polymer
  • the analysis device 700 has on its upper side a Bank, Inc. Tempering (tempering) 710 and on the underside of a detection unit 720 (evaluation unit) is mounted.
  • the arrangement of tempering element 710 and detection unit 720 can also be reversed.
  • the tempering element 710 may also comprise a plurality of subunits, in which the adjacently arranged regions of an analysis unit 100 are heated to different temperatures at the same time. Thermal energy for performing a temperature controlled PCR can be obtained from the
  • Tempering 710 be introduced inter alia by the use of tempered heating fingers, Peltier elements, infrared radiators or convection.
  • a holder 730 can also be provided which fixes the analysis unit 100, for example, on a surface of the temperature control unit 710 during the operation of the analyzer.
  • PCR products attached to a microarray 155 can be used either during or after the reaction with various methods in the
  • Detection unit 720 can be identified:
  • Fluorometric detection During PCR, fluorophores are incorporated into the resulting PCR products. After excitation of these fluorophores (eg with evanescent fields, confocal or with transmitted light), the emitted fluorescence signals can be measured by means of CCD cameras, CMOS chips or photomultipliers.
  • oligonucleotides 157 are immobilized on gold spots. After or during PCR, surface plasmons in the spots are excited. Depending on the amount of near-surface DNA molecules, the plasmon resonance frequency shifts. By measurement and evaluation of the Spots emitted intensities and / or frequencies can be up
  • the reaction mixture contains the components polymerase, reaction buffer, PCR primer and nucleotides and reaction-improving components such. BSA and / or Tween. If biotin-dUTP nucleotides are used in the PCR, the resulting PCR products are labeled with biotin molecules to which fluorophore streptavidin conjugates can be added in a further step. Alternatively, fluorophore-labeled primers can be used in the PCR so that the generated PCR products are labeled directly with a fluorophore. For the following biotin-dUTP nucleotides are used in the PCR, the resulting PCR products are labeled with biotin molecules to which fluorophore streptavidin conjugates can be added in a further step. Alternatively, fluorophore-labeled primers can be used in the PCR so that the generated PCR products are labeled directly with a fluorophore. For the following biotin-dUTP nucleot
  • the two PCR primers can be used in different concentrations.
  • the necessary structures in the polymer substrates can be produced for example by milling, injection molding, hot stamping or laser structuring.
  • the microarray 155 can either be formed directly in the polymer or be introduced into the polymer layer structure as an insert, for example made of glass.
  • Polymer substrate (for example for lid 130 and bottom element 150):
  • Thermoplastics eg PC, PP, PE, PMMA, COP, COC, PEEK
  • Linker molecules thiol groups, amino groups, gold, glutharaldehyde,
  • - PCR primer length between 5 and 100 nucleotides, whereby the
  • Thick polymer substrate 0.5 to 5 mm
  • volume of the cavities in the polymer substrates 1 mm 3 to 1000 mm 3
  • the invention can be used for analytical systems, in particular for microfluidic lab-on-chip systems for environmental analysis or medical diagnostics.
  • the method 800 includes a step 810 of providing the analysis unit and a step 820 of the
  • the method 800 includes a step 830 of evaluating a change in the indicator material on the probe carrier.
  • the method 900 comprises a step 910 of providing the lid element with the lid having at least one lid recess, wherein in the region of the lid recess
  • Cover element has a through hole, the bottom member having at least one bottom recess, the film and a probe carrier having at least one indicator material for identifying a biochemical material as a probe, wherein the indicator material on the
  • Probe carrier has a solid state of aggregation. Further, the method 900 includes a step 920 of placing the probe carrier in the bottom recess and a step 930 of covering the probe
  • the method 900 includes a step 940 of forming the channel region around a fluid in the
  • an exemplary embodiment comprises a "and / or" link between a first feature and a second feature, then this is to be read so that the embodiment according to one embodiment, both the first feature and the second feature and according to another embodiment either only first feature or only the second feature.

Abstract

Die Erfindung betrifft eine Analyseeinheit (100) zur Durchführung einer Polymerase-Kettenreaktion, wobei die Analyseeinheit (100) ein Deckelelement (130) mit zumindest einer Deckelausnehmung (135) und ein Bodenelement (150), das zumindest eine Bodenausnehmung (152) aufweist, wobei die Bodenausnehmung (152) der Deckelausnehmung (135) gegenüberliegend angeordnet ist, um eine Reaktionskammer (110) zu bilden. Ferner umfasst die Analyseeinheit (100) eine Folie (140), die zumindest im Bereich der Deckelausnehmung (135) zwischen dem Deckelelement (130) und dem Bodenelement (150) angeordnet ist. Auch umfasst die Analyseeinheit (100) zumindest einen Kanal (160a, 160b), der zwischen dem Deckelelement (130) und dem Bodenelement (150) ausgebildet ist, um ein Fluid in die Bodenausnehmung (152) der Reaktionskammer (110) einzuleiten und/oder auszuleiten. Schließlich umfast die Analyseeinheit (100) einen in der Bodenausnehmung (152) angeordneten Sondenträger (155), der als Sonde (157) zumindest ein Indikatormaterial zur Identifizierung eines biochemischen Materials aufweist, wobei das Indikatormaterial auf dem Sondenträger (155) einen festen Aggregatszustand aufweist.

Description

Beschreibung
Titel
Analvseeinheit zur Durchführung einer Polymerase-Kettenreaktion,
Analvsevorrichtung, Verfahren zum Betrieb einer solchen Analvseeinheit und Verfahren zum Herstellen einer solchen Analvseeinheit
Stand der Technik
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf eine Analysevorrichtung zur
Durchführung einer Polymerase-Kettenreaktion, eine Analysevorrichtung, ein
Verfahren zum Betrieb einer Analyseeinheit, auf Verfahren zum Herstellen einer Analyseeinheit sowie auf ein entsprechendes Computerprogrammprodukt.
Mikrofluidische Diagnosesysteme wie Lab-on-a-Chips (LOCs) erlauben die miniaturisierte und integrierte Durchführung komplexer Arbeitsabläufe für den spezifischen Nachweis verschiedenster Moleküle. In publizierten LOC Systemen wird zunächst das zu untersuchende Probenmaterial mittels PCR amplifiziert und anschließend auf einem Mikroarray analysiert (siehe beispielsweise auch J. Choi et al: An integrated allele-specific Polymerase chain reaction-microarray chip for multiplex Single nucleotide polymorphism typing, Lab on a Chip, vol. 12, 2012 beschrieben ist). Die Verknüpfung beider Operationen und die mehrschrittige Prozessführung bedingen eine verlängerte Prozesszeit und aufwendige
Prozessführung. Offenbarung der Erfindung
Vor diesem Hintergrund wird mit dem hier vorgestellten Ansatz eine
Analysevorrichtung zur Durchführung einer Polymerase-Kettenreaktion, eine Analysevorrichtung, ein Verfahren zum Betrieb einer Analyseeinheit, auf
Verfahren zum Herstellen einer Analyseeinheit sowie auf ein entsprechendes
Computerprogrammprodukt gemäß den Hauptansprüchen vorgestellt. Vorteilhafte Ausgestaltungen ergeben sich aus den jeweiligen Unteransprüchen und der nachfolgenden Beschreibung.
Der hier vorgestellte Ansatz schafft eine Analyseeinheit zur Durchführung einer Polymerase-Kettenreaktion, wobei die Analysevorrichtung folgende Merkmale aufweist:
ein Deckelelement mit zumindest einer Deckelausnehmung;
ein Bodenelement, das zumindest eine Bodenausnehmung aufweist, wobei die Bodenausnehmung der Deckelausnehmung gegenüberliegend angeordnet ist, um eine Reaktionskammer zu bilden;
eine Folie, die zumindest im Bereich der Deckelausnehmung zwischen dem
Deckelelement und dem Bodenelement angeordnet ist;
zumindest einen Kanal, der zwischen dem Deckelelement und dem
Bodenelement ausgebildet ist, um ein Fluid in die Bodenausnehmung der
Reaktionskammer einzuleiten und/oder auszuleiten; und
einem in der Bodenausnehmung angeordneten Sondenträger, der als Sonde zumindest ein Indikatormaterial zur Identifizierung eines biochemischen
Materials aufweist, wobei das Indikatormaterial auf dem Sondenträger einen festen Aggregatszustand aufweist.
Unter einem Deckelelement und/oder einen Bodenelement kann beispielsweise eine Komponente verstanden werden, die aus einem Kunststoff, insbesondere aus einem Polymer gefertigt ist. Unter einer Ausnehmung kann beispielsweise eine Vertiefung in dem Deckelelement oder dem Bodenelement verstanden werden. Unter einer Folie kann ein flächiges flexibles Element wie beispielsweise eine Kunststofflage verstanden werden. Die Folie kann dabei beispielsweise fluidundurchlässig sein. Unter einem Sondenträger kann ein starres,
insbesondere Element verstanden werden, auf welchem das Indikatormaterial angeordnet und befestigt ist. Unter einem Indikatormaterial kann beispielsweise eine chemische Reagenz oder ein Biomolekül verstanden werden, die bei Kontakt mit einem vorbestimmten biochemischen Material eine
Zustandsänderung erfährt, welche (beispielsweise durch optische Analyse) identifiziert und/oder ausgewertet werden kann. Unter einer Identifizierung kann einerseits eine Erkennung des Vorliegens eines vorbestimmten Materials selbst und/oder eine Erkennung einer Quantität und/oder einer Qualität des
vorbestimmten Materials verstanden werden. Der hier vorgestellte Ansatz basiert auf der Erkenntnis, dass es möglich ist, eine Festphasen-Reaktion im Bereich biochemische Analysevorgänge direkt in einer einzelnen Reaktionskammer vorzunehmen, in der auch eine Flüssigphasen- Reaktion eines biochemischen Reaktionsvorgangs stattfindet. Da meist das
Indikatormaterial als Festphase, d.h. in festem Aggregatzustand vorliegt, kann der gesamte biochemische Reaktionsvorgang in einer kleinen und kompakten Analyseeinheit ausgeführt werden. Das zu analysierende Ausgangsmaterial sowie eventuell erforderliche Katalysatormaterialien, die beispielsweise zur Erreichung bzw. Synthese von Zwischenprodukten des biochemischen
Reaktionsvorgangs erforderlich sind, können in diesem Fall in Form eines Fluids über den Kanal in die Reaktionskammer bzw. die Bodenausnehmung eingeführt werden.
Der hier vorgestellte Ansatz bietet den Vorteil, dass nunmehr eine sehr einfache technische Möglichkeit zur Durchführung einer biochemischen Reaktion eröffnet wird, ohne dass Zwischenprodukte der biochemischen Reaktion aus
unterschiedlichen Prozessstadien manuell miteinander zusammengeführt werden müssten. Insbesondere kann vermieden werden, dass ein Zwischenprodukt einer ersten Teilreaktion, in der eine Flüssigphasen-Reaktion ausgeführt wird, manuell in ein separates Kompartiment verbracht werden muss, um eine zweite
Teilreaktion auszuführen, in der eine Festphasen-Reaktion abläuft. Der hier vorgestellte Ansatz ermöglicht somit eine deutlich kostengünstigere und schnellere Ausführung einer gewünschten biochemischen Reaktion,
insbesondere wenn diese biochemische Reaktion zwei separate Teile bzw.
Teilreaktionen aufweist, die auf Materialien in unterschiedlichen
Aggregatszuständen basiert.
Günstig ist eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, bei der die Folie an dem Deckelelement befestigt ist, insbesondere wobei die Folie eine der Durchgangsöffnung gegenüberliegende Öffnung der Deckelausnehmung fluiddicht verschließt und/oder wobei im Bereich der Deckelausnehmung das Deckelelement eine Durchgangsöffnung aufweist. Eine solche Ausführungsform der vorliegenden Erfindung bietet den Vorteil, dass ein Fluid oder ein anders Material in der Bodenausnehmung bzw. der Reaktionskammer sehr leicht (weiter-) bewegt werden kann, um es beispielsweise aus der Bodenausnehmung bzw. der Redaktionskammer auszufördern und/oder in eine weitere
Reaktionskammer zu drücken. Beispielsweise kann diese Bewegung des Fluids oder des anderen Materials durch einen Druck auf das Deckelelement im Bereich der Deckelausnehmung erfolgen, der über die Folie auf das Fluid in der
Bodenausnehmung übertragen wird. Besonders einfach lässt sich eine solche Bewegung des Fluids oder des anderen Materials dann ausführen, wenn im Bereich der Deckelausnehmung das Deckelelement eine Durchgangsöffnung aufweist, über welche ein pneumatischer Druck in die Deckelausnehmung eingeleitet wird, und somit einen Druck auf die Folie ausübt, die sich
infolgedessen in den Bereich der Bodenausnehmung auswölbt.
Gemäß einer besonders günstige Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann das Deckelelement zumindest eine weitere Deckelausnehmung und das Bodenelement zumindest eine weitere Bodenausnehmung aufweisen, wobei die weitere Deckelausnehmung der weiteren Bodenausnehmung gegenüberliegend angeordnet ist und wobei die Bodenausnehmung und die weitere
Bodenausnehmung mittels des Kanals fluidisch gekoppelt sind. Eine solche Ausführungsform der vorliegenden Erfindung bietet den Vorteil, dass zwei unterschiedliche Reaktionskammern bereitgestellt werden können, sodass beispielsweise unterschiedliche Prozessstadien der biochemischen Reaktionen, die beispielsweise unterschiedliche Reaktionstemperaturen erfordern, auch in unterschiedlichen Bereichen der Analyseeinheit (das heißt den unterschiedlichen der Reaktionskammern) ausgeführt werden können. Dies ermöglicht vorteilhaft eine sehr flexible Verwendung der Analyseeinheit für unterschiedliche biochemische Reaktionen.
Um besonders flexibel und präzise einzelne biochemische Materialien nachweisen zu können, die beispielsweise für eine Reaktion mit einem
Indikatormaterial unterschiedliche Reaktionstemperaturen erfordern, kann gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung in der weiteren Bodenausnehmung ein weiteren Sondenträger angeordnet sein, der als weiteren Sonde zumindest ein weiteres Indikatormaterial zur Identifizierung eines anderen biochemischen Materials aufweist, wobei das weitere Indikatormaterial auf dem weiteren Sondenträger einen festem Aggregatszustand aufweist. Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann auch die Bodenausnehmung den Kanal in zumindest zwei Teilkanäle trennen, wobei zumindest ein Teilkanal eine fluidische Verbindung mit einer Außenumgebung der Analysevorrichtung ermöglicht, insbesondere wobei zumindest ein Teilkanal ein Ventil aufweist. Eine solche Ausführungsform der vorliegenden Erfindung bietet den Vorteil einer besonders einfachen und/oder steuerbaren Füllung oder Entnahme von Material, insbesondere einem fluidischen Material aus der Bodenausnehmung bzw. der Reaktionskammer. Um insbesondere mehrere Prozessstadien zyklisch wiederholen zu können, sind in einer besonders günstigen Ausführungsform der vorliegenden Erfindungen die Teilkanäle an einem der Bodenausnehmung abgewandten Ende fluidisch miteinander gekoppelt oder koppelbar, insbesondere wobei die Teilkanäle Komponenten eines ringförmigen Kanals sind. Eine solche Ausführungsform der vorliegenden Erfindung bietet den Vorteil, dass eine biochemische Reagenz beispielsweise in unterschiedliche Bodenausnehmungen bzw.
Reaktionskammern durch zyklische Weiterverschiebung über die Teilkanäle erfolgen kann, wobei eine Bewegungsrichtung für die Reagenz nicht verändert werden braucht.
Besonders günstig ist eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, bei der der Sondenträger als Sonde zumindest ein weiteres ein zusätzliches
Indikatormaterial zur Identifizierung zumindest eines zusätzlichen biochemischen Materials aufweist, wobei das zusätzliche Indikatormaterial auf dem
Sondenträger einen festen Aggregatszustand aufweist. Eine solche
Ausführungsform der vorliegenden Erfindung bietet den Vorteil, dass auf einem einzigen Sondenträger mehrere unterschiedliche biochemische Materialien und/oder unterschiedliche Konzentrationen eines solchen Materials identifiziert bzw. besonders kostengünstig, schnell und technisch einfach realisierbar detektiert werden können.
Um nun sicherzustellen, dass ein Indikatormaterial auf dem Sondenträger an einer vordefinierten Position angeordnet unverändert verbleibt, kann gemäß einer günstigen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung der Sondenträger zumindest eine Sondenträgerausnehmung aufweisen, in der das zumindest eine Indikatormaterial angeordnet ist, insbesondere wobei die
Sondenträgerausnehmung eine vorbestimmte Mindesttiefe aufweist.
Ferner kann auch gemäß einer Ausführungsform der Sondenträger ausgebildet und derart angeordnet sein, dass während der Polymerase-Kettenreaktion eine Reaktion einer Substanz mit dem Indikatormaterial zur Identifizierung des biochemischen Materials ausführbar ist. Eine solche Ausführungsform der vorliegenden Erfindung bietet den Vorteil einer besonders kompakten Bauform der Analyseeinheit, wobei die Analyseeinheit zudem sehr kostengünstig hergestellt werden kann.
Auch schafft der hier vorgestellte Ansatz eine Analysevorrichtung zum Betreiben einer Analyseeinheit gemäß einer hier vorgestellten Variante, wobei die
Analysevorrichtung zumindest folgende Merkmale aufweist:
einem Halter zur Platzierung und/oder Halterung der Analyseeinheit während eines Betriebs der Analysevorrichtung;
einer Temperierungseinheit zur Temperierung eines Fluids oder eines Feststoffs in der von dem Halter gehaltenen Analyseeinheit; und
einer Auswertungseinheit zur Auswertung einer Veränderung des
Indikatormaterials.
Unter einem Halter kann beispielsweise auch eine Auflagefläche verstanden werden, auf der die Analyseeinheit während des Betriebs der Analysevorrichtung platziert ist. Unter einer Temperierungseinheit kann eine Einheit verstanden werden, die zumindest einen Teilabschnitt der Analyseeinheit erhitzt oder kühlt.
Unter einer Auswertungseinheit kann eine Einheit verstanden werden, die eine Zustandsveränderung des zumindest einen Indikatormaterials erfasst, beispielsweise durch optische Analyse einer von dem Indikatormaterial (oder von einem durch das biochemische Material veränderten Indikatormaterial) konvertierten oder abgegebenen elektromagnetischen Strahlung. Eine solche
Ausführungsform der vorliegenden Erfindung bietet den Vorteil einer sehr kompakten Analyse eines biochemischen Materials mit einer kostengünstig und einfach bereitzustellenden Analyseeinheit.
Besonders günstig ist eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, bei der die Temperierungseinheit ausgebildet ist, um zeitgleich unterschiedliche Abschnitte der Analyseeinheit auf je eine andere Temperatur zu bringen. Eine solche Ausführungsform der vorliegenden Erfindung bietet in Vorteil, dass unterschiedliche Teilreaktionen, die unterschiedliche Reaktionstemperaturen erfordern, zeitgleich in unterschiedlichen Abschnitten der Analyseeinheit ausgeführt werden können. Auf diese Weise lässt sich sehr schnell eine Analyse eines biochemischen Materials mit einer technisch einfach herzustellenden Analyseeinheit durchführen.
Ferner schafft der hier vorgestellte Ansatz ein Verfahren zum Betrieb einer Analyseeinheit gemäß einer hier vorgestellten Variante, wobei das Verfahren die folgenden Schritte aufweist:
Bereitstellen der Analyseeinheit;
Beaufschlagen der Analsyseeinheit mit einem zu analysierenden Material und/oder mit einem Katalysematerial zur Durchführung einer Reaktion in der Analyseeinheit; und
Auswerten einer Veränderung des Indikatormaterials auf dem Sondenträger.
Eine solche Ausführungsform der vorliegenden Erfindung bietet den Vorteil einer besonders schnellen und kostengünstigen Möglichkeit zur Analyse eines biochemischen Materials.
Günstig ist ferner eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, bei der die Schritte des Beaufschlagens und Auswertens zumindest teilweise zeitgleich ausgeführt werden. Eine solche Ausführungsform der vorliegenden Erfindung bietet den Vorteil, dass beispielsweise unterschiedliche Teilschritte der
Polymerase-Kettenreaktion zeitgleich oder parallel ausgeführt werden können, sodass sich einerseits sehr schnell ein Ergebnis der Polymerase-Kettenreaktion analysieren lässt und andererseits die Durchführung der Polymerase- Kettenreaktion technisch sehr einfach, d.h. insbesondere ohne manuelle
Zwischenschritte, ausgeführt werden kann.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann im Schritt des Beaufschlagens und/oder im Schritt des Auswertens ein Temperieren des zu analysierenden Materials, des Katalysematerials und/oder des
Indikatormaterials erfolgen. Eine solche Ausführungsform der vorliegenden
Erfindung bietet den Vorteil, der unterschiedliche Teilschritte der Polymerase- Kettenreaktion unterschiedliche Reaktionstemperaturen verwenden zu können, so dass die einzelnen Teilschritte dieser Polymerase-Kettenreaktion in einem für sie jeweils optimalen Umgebungsszenario ablaufen können. Ferner wird vorliegend ein Verfahren zur Herstellung einer Analyseeinheit gemäß einer hier vorgestellten Variante vorgeschlagen, wobei das Verfahren die folgenden Schritte aufweist:
Bereitstellen des Deckelelementes mit dem mit zumindest einer
Deckelausnehmung, wobei im Bereich der Deckelausnehmung das
Deckelelement eine Durchgangsöffnung aufweist, des Bodenelements, das zumindest eine Bodenausnehmung aufweist, der Folie und einem
Sondenträger, der als Sonde zumindest ein Indikatormaterial zur
Identifizierung eines biochemischen Materials aufweist, wobei das
Indikatormaterial auf dem Sondenträger einen festem Aggregatszustand aufweist;
Anordnen des Sondenträgers in der Bodenausnehmung;
Abdecken der Deckelausnehmung mit der Folie; und
Bilden des Kanalbereichs um ein Fluid in die Bodenausnehmung der
Reaktionskammer einzuleiten und/oder auszuleiten, wobei das Bilden durch Anordnen der Bodenausnehmung gegenüberliegend der
Deckelausnehmung erfolgt, um die Reaktionskammer zu bilden.
Eine derartige Ausführungsform der vorliegenden Erfindung bietet den Vorteil eine Analyseeinheit zur besonders kostengünstigen und schnellen Identifikation eines biochemischen Materials herstellen zu können.
Die vorliegende Erfindung schafft ferner ein Steuergerät, das ausgebildet ist, um die Schritte einer Variante eines hier vorgestellten Verfahrens in entsprechenden Einrichtungen durchzuführen bzw. umzusetzen. Auch durch diese
Ausführungsvariante der Erfindung in Form eines Steuergeräts kann die der
Erfindung zugrunde liegende Aufgabe schnell und effizient gelöst werden.
Unter einem Steuergerät kann vorliegend ein elektrisches Gerät verstanden werden, das Sensorsignale verarbeitet und in Abhängigkeit davon Steuer- und/oder Datensignale ausgibt. Das Steuergerät kann eine Schnittstelle aufweisen, die hard- und/oder softwaremäßig ausgebildet sein kann. Bei einer hardwaremäßigen Ausbildung können die Schnittstellen beispielsweise Teil eines sogenannten System-ASICs sein, der verschiedenste Funktionen des
Steuergeräts beinhaltet. Es ist jedoch auch möglich, dass die Schnittstellen eigene, integrierte Schaltkreise sind oder zumindest teilweise aus diskreten Bauelementen bestehen. Bei einer softwaremäßigen Ausbildung können die
Schnittstellen Softwaremodule sein, die beispielsweise auf einem Mikrocontroller neben anderen Softwaremodulen vorhanden sind.
Von Vorteil ist auch ein Computerprogrammprodukt mit Programmcode, der auf einem maschinenlesbaren Träger wie einem Halbleiterspeicher, einem
Festplattenspeicher oder einem optischen Speicher gespeichert sein kann und zur Durchführung des Verfahrens nach einer der vorstehend beschriebenen Ausführungsformen verwendet wird, wenn das Programmprodukt auf einem Computer oder einer Vorrichtung ausgeführt wird. Insbesondere schafft der hier vorgestellte Ansatz ein Computer-Programmprodukt mit Programmcode zur Durchführung oder Ansteuerung der Schritte eines hier vorgestellten Verfahrens, wenn das Programmprodukt auf einer Vorrichtung ausgeführt wird.
Die vorliegende Erfindung schafft ferner eine Vorrichtung, die ausgebildet ist, um die Schritte einer Variante eines hier vorgestellten Verfahrens in entsprechenden Einrichtungen durchzuführen bzw. umzusetzen. Auch durch diese
Ausführungsvariante der Erfindung in Form einer Vorrichtung kann die der Erfindung zugrunde liegende Aufgabe schnell und effizient gelöst werden.
Unter einer Vorrichtung kann vorliegend ein elektrisches Gerät verstanden werden, das Sensorsignale verarbeitet und in Abhängigkeit davon Steuer- und/oder Datensignale ausgibt. Die Vorrichtung kann eine Schnittstelle aufweisen, die hard- und/oder softwaremäßig ausgebildet sein kann. Bei einer hardwaremäßigen Ausbildung können die Schnittstellen beispielsweise Teil eines sogenannten System-ASICs sein, der verschiedenste Funktionen der Vorrichtung beinhaltet. Es ist jedoch auch möglich, dass die Schnittstellen eigene, integrierte Schaltkreise sind oder zumindest teilweise aus diskreten Bauelementen bestehen. Bei einer softwaremäßigen Ausbildung können die Schnittstellen Softwaremodule sein, die beispielsweise auf einem Mikrocontroller neben anderen Softwaremodulen vorhanden sind. Die Erfindung wird nachstehend anhand der beigefügten Zeichnungen beispielhaft näher erläutert. Es zeigen:
Fig. 1A eine Aufsichtdarstellung auf eine Analyseeinheit gemäß einem
Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung;
Fig. 1 B eine Querschnittdarstellung auf eine Analyseeinheit gemäß dem in Fig.
1A darstellten Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung;
Fig. 2 eine Aufsichtdarstellung auf eine Analyseeinheit gemäß einem weiteren Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung;
Fig. 3 eine Querschnittdarstellung auf eine Analyseeinheit gemäß dem in Fig.
2 darstellten Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung;
Fig. 4 eine Aufsichtdarstellung auf eine Analyseeinheit gemäß einem weiteren Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung;
Fig. 5A und 5B Aufsichtdarstellungen auf Analyseeinheiten gemäß weiteren Ausführungsbeispielen der vorliegenden Erfindung;
Fig. 6A eine Querschnittdarstellung auf einen Sondenträger gemäß einem
Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung;
Fig. 6B eine Querschnittdarstellung auf einen Sondenträger gemäß einem
weiteren Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung;
Fig. 7 eine schematische Darstellung einer Analysevorrichtung mit einer schematischen Darstellung einer in die Analysevorrichtung
eingebrachten Analyseeinheit;
Fig. 8 ein Ablaufdiagramm eines Ausführungsbeispiels eines Verfahrens zum Betrieb einer Analyseeinheit; und
Fig. 9 ein Ablaufdiagramm eines Ausführungsbeispiels eines Verfahrens zum Herstellen einer Analyseeinheit. In der nachfolgenden Beschreibung günstiger Ausführungsbeispiele der vorliegenden Erfindung werden für die in den verschiedenen Figuren
dargestellten und ähnlich wirkenden Elemente gleiche oder ähnliche
Bezugszeichen verwendet, wobei auf eine wiederholte Beschreibung dieser
Elemente verzichtet wird.
Bei dem hier vorgestellten biochemischen Ansatz ist das DNA-Mikroarray (als Beispiel eines Sondenträgers) direkt in eine PCR-Reaktionskammer
eingebunden. Die auf dem DNA-Mikroarray immobilisierten DNA-Sonden nehmen aktiv an der PCR teil und immobilisieren so spezifisch
Amplifikationsprodukt (d. h. das biochemische Material). Die
oberflächengebundenen Produkte (bzw. Zwischenprodukte) aus einem biochemischen Prozess (wie der PCR) können entweder in Echtzeit oder nach der Reaktion detektiert und/oder ausgewertet werden.
Fig. 1A zeigt eine Aufsichtdarstellung einer Analyseeinheit 100 gemäß einem Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung Fig. 1 B zeigt eine
Schnittdarstellung des in der Fig. 1A dargestellten Ausführungsbeispiels der vorliegenden Erfindung entlang A aus Fig. 1A. Dabei weist die Analyseeinheit
100 nur eine einzige PCR-Reaktionskammer 1 10 auf.
Die Analyseeinheit 100 umfasst mehrere Schichten, wie es aus der Fig. 1 B zu erkennen ist. Ein Schichtaufbau besteht aus einem ersten Polymersubstrat als Deckelelement 130, welches eine Deckelausnehmung 135 und ein
Durchgangsloch 137 aufweist, wobei an der Unterseite des Deckelementes 130 eine auslenkbare Polymermembran als Folie 140 angebracht ist. Diese Folie 140 kann beispielsweise fluiddicht mit dem Deckelelement 130 verbunden sein, sodass ein Kontakt zwischen einem durch das Durchgangsloch bewegbaren Medium nicht in einen Bereich außerhalb der Folie 140 gelangen kann.
Planparrallel zu diesem Aufbau des Deckelelementes 130 befindet sich ein Bodenelement 150, beispielsweise in der Form eines zweiten Polymersubstrats, das in einer Bodenelementausnehmung 152 die PCR-Reaktionskammer 1 10 mit einem DNA-Mikroarray als Sondenträger 155 aufweist. Auf dem Mikroarray 155 sind unterschiedliche Oligonukleotide als Sonden 157 in Form von einzelnen Spots immobilisiert. Für Befüllung und Entleerung ist an die Kammer 1 10 jeweils ein mikrofluidischer Kanal 160 (der beispielsweise durch die Reaktionskammer 1 10 in zwei Teilkanäle 160a und 160b getrennt ist) angeschlossen. Beiden Kanäle 160a und 160b weisen je ein steuerbares Ventil 165 auf, um die mit einem PCR-Reaktionsmix (d. h. mit zu analysierendem Material und/oder mit
Katalysatormaterial, welches als Hilfsmaterial zur Durchführung der
biochemischen Reaktion erforderlich ist) befüllte Kammer 1 10 während der (biochemischen) Reaktion verschlossen zu halten. In einem definierten Bereich 175, in dem die Reaktionskammer 1 10 angeordnet wird, kann durch eine nachfolgend noch näher beschriebene Analysevorrichtung thermische Energie für die Durchführung einer PCR eingebracht und entzogen werden.
Während der PCR werden bestimmte DNA-Motive einer Template-DNA zunächst in der Flüssigphase vervielfältigt. Gebildete PCR-Produkte können nun an Abschnitt-spezifische, immobilisierte Oligonukleotide anbinden. Durch
Identifikation der Spots, an die ein PCR-Produkt angebunden hat, werden Aussagen über Präsenz/Absenz bestimmter DNA-Motive möglich.
Fig. 2 zeigt eine Aufsichtdarstellung einer Analyseeinheit 100 gemäß einem Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung. Fig. 3 zeigt eine
Schnittdarstellung entlang der Schnittlinie A des in Fig. 2 dargestellten
Ausführungsbeispiels der Analyseeinheit 100, die zwei über den Teilkanal 160b miteinander fluidisch gekoppelte PCR-Reaktionskammern 1 10 und 210 aufweist. Die zweite Reaktionskammer 210 kann dabei (bis auf das Vorhandensein des Sondenträgers 155) analog zur (ersten) Reaktionskammer gebildet werden.
Beispielsweise kann zur Ausbildung der zweiten Reaktionskammer 210 das Deckelelement 130 eine weitere Deckelausnehmung 235 aufweisen, die über ein weiteres Durchgangsloch 237 mit einer Außenumgebung der Analysevorrichtung 100 fluidische verbunden ist. Auch kann die Folie die zweite Deckelausnehmung 235 an einer dem weiteren Durchgangsloch gegenüberliegenden Seite fluiddicht verschließen. Das Bodenelement 150 kann eine weitere Bodenausnehmung 252 aufweisen, durch die die zweite Reaktionskammer 210 gebildet ist.
Bei diesem Ausführungsbeispiel existieren zwei definierte Temperaturbereiche 175 und 220, in denen über die gesamte Zeit der PCR eine je eine konstante, jedoch unterschiedliche Temperatur eingestellt ist. Dadurch werden die Anforderungen an eine Temperiereinheit einer Analysevorrichtung gegenüber einer Analysevorrichtung für einen Betrieb der Analyseeinheit 100 gemäß dem in den Figuren 1 A und 1 B dargestellten Ausführungsbeispiel reduziert, bei der die Temperatur zwischen ~ 60 °C und -95 °C in einem Zeitfenster von Minuten variiert werden muss (z. B. mittels Peltier-Element). Um den PCR-Reaktionsmix unterschiedlichen Temperaturen auszusetzen, wird in dem in den Figuren 2 und 3 dargestellten Ausführungsbeispiel das Reaktionsvolumen (d. h. das Fluid mit dem zu analysierenden Material und/oder dem Katalysematerial) mittels der auslenkbaren Polymermembran 140 zwischen den beiden Kammern hin und her geschoben. Diese hin- und herbewegen kann beispielsweise durch einen Druck erfolgen, welcher über die Durchgangslöcher 137 bzw. 237 auf die Folie 140 über den jeweiligen Reaktionskammern 1 10 bzw. 210 ausübt, wobei sich durch die Auswölbung der Folie in diese Reaktionskammern 1 10 bzw. 210 die in den jeweiligen Reaktionskammern befindlichen Fluide ausfördern lassen.
Ein wichtiges Ziel des hier vorgestellten Ansatzes kann darin gesehen werden, eine Möglichkeit für geeignete Strukturen und Prozessabläufen für die
Durchführung einer PCR in einem polymeren Mehrschichtverbund zu eröffnen. Dadurch werden eine Verkürzung der Prozesszeit und eine Reduzierung von Prozessschritten beispielsweise beim Nachweis von Nukleinsäuren erreicht.
Dabei kann ein polymerer Schichtaufbau der Analyseeinheit 100 mit einem integrierten DNA-Mikroarray 155 verwendet werden. Das DNA-Mikroarray 155 ist entweder direkt in einer PCR-Reaktionskammer 1 10 oder einer separaten Arraykammer vorhanden. Durch hin- und herschieben des Reaktionsvolumens (d. h. des Fluids mit dem zu analysierenden material bzw. dem Katalysematerial) zwischen Kammern 1 10 bzw. 210, die sich auf unterschiedlichen Temperaturen befinden, wird eine PCR-Reaktion durchgeführt. Die immobilisierten
Oligonukleotide als Sonden 157 des Mikroarrays 155 nehmen aktiv an der PCR- Reaktion teil, sodass DNA-Sequenzen an bestimmten Stellen des Arrays 155 lokalisiert werden.
Durch den hier vorgestellten Ansatz ergeben sich am Beispiel einer PCR als biochemischer Reaktion folgende Vorteile:
- Das PCR-Produkt muss vor der Hybridisierung nicht mehr umgepuffert werden. - Das LoC System benötigt kein Puffer mehr für eine Hybridisierung.
- Die beschrieben Strukturen und Verfahren ermöglichen einen schnelleren Prozessablauf zusammen mit einer vereinfachten Prozessführung.
- Verkürzung der Gesamtdauer des Nachweises von genetischen Merkmalen.
Bei dem vorgestellten Verfahren werden PCR-Produkte bereits während der
PCR ortsaufgelöst und detektierbar an spezifischen Spots des Mikroarrays immobilisiert.
- Einsatz eines oberflächensensitiven Messverfahrens.
Gemäß einem weiteren Ausführungsbeispiel einer Analyseeinheit 100 findet die Reaktion in einem System aus drei über Teilkanäle 160 fluidisch miteinander verschalteten PCR-Kammern 1 10, 210 und 310 statt, wie es in der
Aufsichtdarstellung der Fig. 4 wiedergegeben ist. Dabei nun die drei
Analysekammern 1 10, 210 und 310 analog zueinander aufgebaut, wobei in den ersten beiden Analysekammern 1 10 und 210 je ein Sondenträger 255
angeordnet ist. Dadurch können für eine 3-step-PCR drei verschieden temperierte Bereiche/Kammern realisiert werden, zum Beispiel für dreischrittige PCR-Reaktionen (z. B. Anlagerungstemperatur 175 = 50 °C - 65 °C,
Verlängerungstemperatur 220 = 72 °C; Aufschmelztemperatur 320 = 95 °C). Das Array 155 bzw. 255 kann hierbei entweder in der Kammer 1 10 das auf
Anlagerungstemperatur 175 der in der Kammer 210 die auf
Verlängerungstemperatur 220 ist, positioniert sein. Weiterhin kann auch die erste Reaktionskammer 1 10 und die zweite Reaktionskammer 310 auf eine
Temperatur zwischen 55 und 72 °C temperiert sein (Anlagerungs- und
Verlängerungstemperatur), und die dazwischenliegende Kammer 210 auf Aufschmelztemperatur temperiert sein.
Für eine 2-step-PCR kann das Reaktionsvolumen zunächst (unter Verwendung des Teilkanals 160b) zwischen beispielsweise Kammern 1 10 und 210 zwischen 1 bis 40 Zyklen hin- und herbewegt werden, und im Anschluss daran (unter
Verwendung des Teilkanals 160c) zwischen den Kammern 210 und 310 zwischen 1 bis 40 Zyklen, wobei dann beispielsweise entgegen der Darstellung aus Fig. 4 nur die Kammer 310 das (zweite) Array 255 enthält. Fig. 5A zeigt eine Aufsichtdarstellung einer Analyseeinheit 1 10 gemäß einem weiteren Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung, bei der eine Reaktionskammer 1 10 (Arraykammer) das Array 155 enthält. Die Kammer 1 10 befindet sich entweder im Temperaturbereich 175 der Anlagerungstemperatur oder Verlängerungstemperatur 220 (wie dies beispielsweise auch in der
Aufsichtdarstellung aus der Fig. 5B zu erkennen ist). Dieses Ausführungsbeispiel ermöglicht, dass zunächst eine PCR in den PCR-Kammern 410, 210 oder 310 ohne das Array 155 durchgeführt wird. Nach einer Amplifikation wird dann der Reaktionsmix in die Arraykammer 1 10 überführt, sodass die PCR-Produkte spezifisch an Oligonukleotide 157 gebunden werden können. Die Anbindung kann mittels Hybridisierung oder Primerverlängerungsreaktion erfolgen, bspw. durch hin- und her bewegen des Reaktionsvolumens zwischen einer Kammer auf
Aufschmelztemperatur und der Arraykammer 1 10.
Gemäß einem weiteren Ausführungsbeispiel können die Kammerein- 160a und - auslässe 160b eines fluidischen Layouts wie in den Figuren 2, 4, 5A und 5B gezeigt mit Rückschlagventilen 165 versehen sein. Dadurch wird bei
Volumenverdrängung eine (einzige) Pumprichtung vorgegeben, was die
Aktuierung des Fluids vereinfacht.
Fig. 6A und 6B zeigt je eine Struktur um die Oberfläche des Arrays 155 (speziell die Spots der immobilisierten Oligonukleotide als Sonden 157) zu schützen. Da für die Überführung des PCR-Reaktionsvolumens von einer PCR-Kammer 1 10 in eine andere (entsprechend der Fig. 2 und der Fig. 4) die Polymermembran 140 pneumatisch ausgelenkt wird und dabei in Richtung des Bodens der
Bodenausnehmung 152 gepresst wird, können möglicherweise die im
Arrayformat 155 immobilisierten Oligonukleotide 157 beschädigt werden. Als
Gegenmaßnahme können die Spots des Arrays 155 entweder in Vertiefungen 610 oder auf einer mikroskopisch rauen Oberfläche 620 immobilisiert werden.
Die Oligonukleotide 157 können mit allen den aus dem Stand der Technik bekannten Immobilisierungschemien, wie zum Beispiel 3- aminopropyltriethoxysilane (APTES), 1 -ethyl-3(3-dimethylaminopropy1 )- carbodiimide (EDC), 1 ,4-phenylene diisothiocyanate (PDITC), s-SIAB, s-MBS, s- GMBS oder s- MBP auf den verschiedensten Materialien auf dem Sondenträger 155 fixiert werden. Die Arrays 155 können entweder direkt in einem
Polymersubstrat (d. h. dem Bodenelement 130) immobilisiert werden oder auf ein Substrat 155 gespottet werden, was dann in einem zweiten Schritt in eine PCR- Kammer 1 10 eingebracht und fixiert wird.
Fig. 7 zeigt Querschnittsdarstellung durch ein Ausführungsbeispiel einer Analysevorrichtung 700 zum Betreiben einer Analyseeinheit 100 gemäß einem Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung mit einen polymeren
Schichtaufbau. Die Analysevorrichtung 700 weist auf dessen Oberseite ein Heizbzw. Temperierelement (Temperiereinheit) 710 und auf dessen Unterseite eine Detektionseinheit 720 (Auswertungseinheit) angebracht ist. Die Anordnung aus Temperierelement 710 und Detektionseinheit 720 kann auch umgekehrt sein. Auch kann das Temperierelement 710 mehrere Teileinheiten umfassen, in denen die benachbart angeordneten Bereiche einer Analyseeinheit 100 auf zeitgleich auf unterschiedliche Temperaturen temperiert werden. Thermische Energie für die Durchführung einer temperaturgesteuerten PCR kann von der
Temperiereinheit 710 unter anderem durch die Verwendung von temperierten Heizfingern, Peltier-Elementen, Infrarotstrahler oder Konvektion eingebracht werden. Um die Analyseeinheit 100 zu halten, kann ferner ein Halter 730 vorgesehen sein, der die Analyseeinheit 100 beispielsweise auf einer Oberfläche der Temperierungseinheit 710 während des Betriebs der Analysevorrichtung fixiert.
Die auf einem Mikroarray 155 angebundenen PCR-Produkte können entweder während oder nach der Reaktion mit verschiedenen Verfahren in der
Detektionseinheit 720 identifiziert werden:
1 . Fluorometrische Detektion. Während der PCR werden Fluorophore in die entstehenden PCR-Produkte eingebaut. Nach Anregung dieser Fluorophore (z. B. mit evaneszenten Feldern, konfokal oder mit Durchlicht) können die emittierten Fluoreszenzsignale mittels CCD-Kamera, CMOS-Chips oder Photomultiplier gemessen werden.
2. Detektion von Oberflächenplasmonen. Die Oligonukleotide 157 werden beispielsweise auf Spots aus Gold immobilisiert. Nach oder während der PCR werden Oberflächenplasmonen in den Spots angeregt. In Abhängigkeit von der Menge an oberflächennahen DNA-Molekülen verschiebt sich die Plasmonenresonanzfrequenz. Durch Messung und Auswertung der von den Spots emittierten Intensitäten und/oder Frequenzen kann auf
Bindungsereignisse rückgeschlossen werden.
Der Reaktionsmix enthält die Komponenten Polymerase, Reaktionspuffer, PCR- Primer und Nukleotide sowie reaktionsverbessernde Komponenten wie z. B. BSA und/oder Tween. Werden bei der PCR biotin-dUTP Nukleotiden eingesetzt, sind die entstehenden PCR-Produkte mit biotin-Molekülen gelabelt, an die in einem weiteren Schritt Fluorophor-streptavidin Konjugate anbinden können. Alternativ können in der PCR Fluorophor-markierte Primer eingesetzt werden, sodass die generierten PCR-Produkte direkt mit einem Fluorophor gelabelt sind. Für die
Durchführung einer asymmetrischen PCR können die zwei PCR-Primer in unterschiedlichen Konzentrationen eingesetzt werden. Die nötigen Strukturen in den Polymersubstraten können beispielsweise durch Fräsen, Spritzguss, Heißprägen oder Laserstrukturierung erzeugt werden. Das Mikroarray 155 kann entweder direkt im Polymer ausgeformt sein oder als Einlegeteil, beispielsweise aus Glas hergestellt in den Polymerschichtaufbau eingebracht werden.
Materialbeispiele:
Polymersubstrat (beispielsweise für Deckel- 130 und Bodenelement 150):
Thermoplaste (z. B. PC, PP, PE, PMMA, COP, COC, PEEK)
Polymermembran (Folie 140): Elastomer, thermoplastisches Elastomer TPU, TPS, Thermoplaste, Heißklebefolien, Siegelfolien für Mikrotiterplatten, Latex
Beispielhafte Ausformung der Biomoleküle:
- Länge der Oligonukleotide 157: 5— 100 Nukleotide
- Linkermoleküle: Thiolgruppen, Aminogruppen, Gold, Glutharaldehyde,
Acrydite, beispielsweise über eine Kohlenstoff kette mit dem Oligonukleotide verbunden
- PCR Primer: Länge zwischen 5 und 100 Nukleotiden, wobei sich die
Schmelztemperatur der beiden Primer stark unterscheiden kann
- Polymerase: hot-Start Polymerasen, Proof-Reading Polymerasen
- Durchmesser einen Spots: 1— 500 μηη
Beispielhafte Abmessungen der Ausführungsbeispiele:
- Dicke Polymersubstrat: 0,5 bis 5 mm
- Kanaldurchmesser in Polymersubstraten: 10 μηη bis 3 mm Dicke Polymermembran: 5 bis 500 μηη
Volumen der Kavitäten in den Polymersubstraten: 1 mm 3 bis 1000 mm3
Beispielhafte Drücke für die Aktuierung einer Polymermembran:
- 0,2 bar— 2 bar
Die Erfindung kann für analytische Systeme, insbesondere für mikrofluidische Lab-on-Chip-Systeme zur Umweltanalytik oder medizinischen Diagnostik verwendet werden.
Fig. 8 zeigt ein Ablaufdiagramm eines Ausführungsbeispiels eines Verfahrens 800 zum Betrieb einer Analyseeinheit. Das Verfahren 800 umfasst einen Schritt 810 des Bereitstellens der Analyseeinheit und einen Schritt 820 des
Beaufschlagens der Analyseeinheit mit einem zu analysierenden Material und/oder mit einem Katalysematerial zur Durchführung einer Reaktion in der Analyseeinheit. Schließlich umfasst das Verfahren 800 einen Schritt 830 des Auswertens einer Veränderung des Indikatormaterials auf dem Sondenträger.
Fig. 9 zeigt ein Ablaufdiagramm eines Ausführungsbeispiels eines Verfahrens 900 zum Herstellen einer Analyseeinheit. Das Verfahren 900 umfast einen Schritt 910 des Bereitstellens des Deckelelementes mit dem mit zumindest einer Deckelausnehmung, wobei im Bereich der Deckelausnehmung das
Deckelelement eine Durchgangsöffnung aufweist, des Bodenelements, das zumindest eine Bodenausnehmung aufweist, der Folie und einem Sondenträger, der als Sonde zumindest ein Indikatormaterial zur Identifizierung eines biochemischen Materials aufweist, wobei das Indikatormaterial auf dem
Sondenträger einen festen Aggregatszustand aufweist. Ferner umfasst das Verfahren 900 einen Schritt 920 des Anordnens des Sondenträgers in der Bodenausnehmung und einen Schritt 930 des Abdeckens der
Deckelausnehmung mit der Folie. Schließlich umfasst das Verfahren 900 einen Schritt 940 des Bildens des Kanalbereichs um ein Fluid in die
Bodenausnehmung der Reaktionskammer einzuleiten und/oder auszuleiten, wobei das Bilden durch Anordnen der Bodenausnehmung gegenüberliegend der Deckelausnehmung erfolgt, um die Reaktionskammer zu bilden. Die beschriebenen und in den Figuren gezeigten Ausführungsbeispiele sind nur beispielhaft gewählt. Unterschiedliche Ausführungsbeispiele können vollständig oder in Bezug auf einzelne Merkmale miteinander kombiniert werden. Auch kann ein Ausführungsbeispiel durch Merkmale eines weiteren Ausführungsbeispiels ergänzt werden.
Ferner können erfindungsgemäße Verfahrensschritte wiederholt sowie in einer anderen als in der beschriebenen Reihenfolge ausgeführt werden.
Umfasst ein Ausführungsbeispiel eine„und/oder"-Verknüpfung zwischen einem ersten Merkmal und einem zweiten Merkmal, so ist dies so zu lesen, dass das Ausführungsbeispiel gemäß einer Ausführungsform sowohl das erste Merkmal als auch das zweite Merkmal und gemäß einer weiteren Ausführungsform entweder nur das erste Merkmal oder nur das zweite Merkmal aufweist.

Claims

Ansprüche
1 . Analyseeinheit (100) zur Durchführung einer Polymerase-Kettenreaktion, wobei die Analyseeinheit (100) folgende Merkmale aufweist:
ein Deckelelement (130) mit zumindest einer Deckelausnehmung (135); - ein Bodenelement (150), das zumindest eine Bodenausnehmung (152) aufweist, wobei die Bodenausnehmung (152) der Deckelausnehmung (135) gegenüberliegend angeordnet ist, um eine Reaktionskammer (1 10) zu bilden;
eine Folie (140), die zumindest im Bereich der Deckelausnehmung (135) zwischen dem Deckelelement (130) und dem Bodenelement (150) angeordnet ist;
zumindest einen Kanal (160a, 160b), der zwischen dem Deckelelement (130) und dem Bodenelement (150) ausgebildet ist, um ein Fluid in die Bodenausnehmung (152) der Reaktionskammer (1 10) einzuleiten und/oder auszuleiten; und
einem in der Bodenausnehmung (152) angeordneten Sondenträger (155), der als Sonde (157) zumindest ein Indikatormaterial zur
Identifizierung eines biochemischen Materials aufweist, wobei das Indikatormaterial auf dem Sondenträger (155) einen festen
Aggregatszustand aufweist.
2. Analyseeinheit (100) gemäß Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass die Folie (140) an dem Deckelelement (130) befestigt ist, insbesondere wobei die Folie (140) eine der Durchgangsöffnung (137) gegenüberliegende Öffnung der Deckelausnehmung (135) fluiddicht verschließt und/oder wobei im Bereich der Deckelausnehmung (135) das Deckelelement (130) eine Durchgangsöffnung (137) aufweist.
Analyseeinheit (100) gemäß einem der vorangegangenen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Deckelelement (130) zumindest eine weitere Deckelausnehmung (235) und das Bodenelement (150) zumindest eine weitere Bodenausnehmung (252) aufweist, wobei die weitere
Deckelausnehmung (235) der weiteren Bodenausnehmung (252) gegenüberliegend angeordnet ist und wobei die Bodenausnehmung (152) und die weiteren Bodenausnehmung (252) mittels des Kanals (160a, 160b) fluidisch gekoppelt sind.
Analyseeinheit (100) gemäß Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass der in der weiteren Bodenausnehmung (252) ein weiteren Sondenträger (255) angeordnet ist, der als weitere Sonde (257) zumindest ein weiteres Indikatormaterial zur Identifizierung eines anderen biochemischen Materials aufweist, wobei das weitere Indikatormaterial auf dem weiteren
Sondenträger (255) einen festem Aggregatszustand aufweist.
Analyseeinheit (100) gemäß einem der vorangegangenen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Bodenausnehmung (152) den Kanal (160a, 160b) in zumindest zwei Teilkanäle trennt, wobei zumindest ein Teilkanal (160a, 160b) eine fluidische Verbindung mit einer Außenumgebung der Analyseeinheit (100) ermöglicht, insbesondere wobei zumindest ein Teilkanal (160a, 160b) eine Ventil (165) aufweist.
Analyseeinheit (100) gemäß Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Teilkanäle an einem der Bodenausnehmung (152) abgewandten Ende fluidisch miteinander gekoppelt oder koppelbar sind, insbesondere wobei die Teilkanäle Komponenten eines ringförmigen Kanals (160a, 160b) sind.
Analyseeinheit (100) gemäß einem der vorangegangenen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Sondenträger (155) ausgebildet und derart angeordnet ist, dass während der Polymerase-Kettenreaktion eine Reaktion einer Substanz mit dem Indikatormaterial zur Identifizierung des biochemischen Materials ausführbar ist.
Analysevorrichtung (700) zum Betreiben einer Analyseeinheit (100) gemäß einem der vorangegangenen Ansprüche, wobei die Analysevorrichtung (700) zumindest folgende Merkmale aufweist:
einem Halter (730) zur Platzierung und/oder Halterung der
Analyseeinheit (100) während eines Betriebs der Analysevorrichtung; einer Temperierungseinheit (710) zur Temperierung eines Fluids oder eines Feststoffs in der von dem Halter gehaltenen Analyseeinheit (100); und
einer Auswertungseinheit (720) zur Auswertung einer Veränderung des Indikatormaterials.
9. Analysevorrichtung (700) gemäß Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Temperierungseinheit (710) ausgebildet ist, um zeitgleich unterschiedliche Abschnitte der Analyseeinheit (100) auf je eine andere Temperatur zu bringen.
10. Verfahren (800) zum Betrieb einer Analyseeinheit (100) gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei das Verfahren (800) die folgenden Schritte aufweist:
- Bereitstellen (810) der Analyseeinheit (100);
Beaufschlagen (820) der Analyseeinheit mit einem zu analysierenden Material und/oder mit einem Katalysematerial zur Durchführung einer Reaktion in der Analyseeinheit (100); und
Auswerten (830) einer Veränderung des Indikatormaterials auf dem Sondenträger (155).
1 1 . Verfahren gemäß Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Schritte des Beaufschlagens und Auswertens zumindest teilweise zeitgleich ausgeführt werden.
12. Verfahren gemäß Anspruch 10 oder 1 1 , dadurch gekennzeichnet, dass im Schritt des Beaufschlagens (820) und/oder im Schritt des Auswertens (830) ein Temperieren des zu analysierenden Materials, des Katalysematerials und/oder des Indikatormaterials erfolgt.
13. Verfahren (900) zur Herstellung einer Analyseeinheit (100) gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei das Verfahren (900) die folgenden Schritte aufweist:
Bereitstellen (910) des Deckelelementes mit dem mit zumindest einer Deckelausnehmung (135), wobei im Bereich der Deckelausnehmung (135) das Deckelelement (130) eine Durchgangsöffnung (137) aufweist, des Bodenelements (150), das zumindest eine Bodenausnehmung (152) aufweist, der Folie (140) und einem Sondenträger (155), der als Sonde (157) zumindest ein Indikatormaterial zur Identifizierung eines biochemischen Materials aufweist, wobei das Indikatormaterial auf dem Sondenträger (155) einen festem Aggregatszustand aufweist;
Anordnen (920) des Sondenträgers (155) in der Bodenausnehmung (152);
- Abdecken (930) der Deckelausnehmung (135) mit der Folie (140); und
- Bilden (940) des Kanalbereichs (160a, 160b) um ein Fluid in die
Bodenausnehmung (152) der Reaktionskammer (1 10) einzuleiten und/oder auszuleiten, wobei das Bilden durch Anordnen der
Bodenausnehmung (152) gegenüberliegend der Deckelausnehmung (135) erfolgt, um die Reaktionskammer (1 10) zu bilden.
14. Steuergerät mit Einheiten, die ausgebildet sind, die Schritte eines Verfahrens (800, 900) gemäß einem der Ansprüche 10 bis 13 anzusteuern und/oder umzusetzen.
15. Computer-Programmprodukt mit Programmcode zur Durchführung oder Ansteuerung der Schritte des Verfahrens (800, 900) nach einem der Ansprüche 10 oder 13, wenn das Programmprodukt auf einer Vorrichtung ausgeführt wird.
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