DE102009035270A1

DE102009035270A1 - Ein Einweg-Multiplex-Polymerase-Kettenreaktions(PCR)-Chip und Gerät

Info

Publication number: DE102009035270A1
Application number: DE102009035270A
Authority: DE
Inventors: Asma Kota Bharu Ismail; Sugumar Bukit Katil Dharmalingam; Lingxue Highton Kong
Original assignee: Universiti Sains Malaysia (USM)
Current assignee: Universiti Sains Malaysia (USM)
Priority date: 2008-12-18
Filing date: 2009-07-29
Publication date: 2010-07-01
Also published as: WO2012033396A8; TW201024423A; KR20100070977A; AU2009203047A1; US20100159582A1; CN101748056A; JP2010142222A; WO2012033396A1; SG162649A1

Abstract

Ein Polymerase-Kettenreaktionsgerät (PCR) beinhaltend eine Chipbaugruppe 2, eine Mehrzahl von in der Chipbaugruppe zur Verfügung gestellten Kammern 1, angepasst, um Proben zu halten, Heizungsmittel, worin die Chipbaugruppe auf den Heizungsmitteln angeordnet ist, wobei der Chipbaugruppe gestattet ist, auf den Heizungsmitteln drehend zu wirken, ein die Chipdrehung unterstützendes drehendes Rad und worin die Heizungsmittel eine Mehrzahl von Temperaturzonen umfassen in einer Weise, dass bei Drehung der Chipmittel die Probenkammer von einer Temperaturzone zu der anderen verschoben wird mittels einem Drehlinearbewegungssystem.

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Gerät zur Multiplex-Polymerase-Kettenreaktion (PCR). Insbesondere bezieht sich die Erfindung auf ein Einweg-PCR-Gerät, welches derartige Probenkammern umfasst, dass die Kammern die Bedingung des Verschiebens von einer Temperaturzone zu einer weiteren mittels eines Dreh-/Linear-Bewegungssystems aufweisen.
Hintergrund der Erfindung
Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) ist ein bedeutendes Verfahren, welches spezifische Desoxyribonucleinsäure (DNA) mit einem exponentiellen Betrag (Größenordnung 2³⁰) amplifizieren kann ohne einer simultanen Amplifikation von anderem in der Lösung vorliegenden genetischen Material. Diese zuerst im Jahr 1966 vorgestellte Technologie ist ein bedeutender Durchbruch für Molekularbiologie-Anwendungen. Das Amplifikationsverfahren imitiert den natürlichen Prozess der Replikation und der Reparatur von DNA und der Expression von Proteinen, was regulär bei natürlichen biochemischen Prozessen geschieht.
Die Replikation der DNA ausgehend von einem Einzelstrang, der DNA wird durch spezifische Enzyme, wie DNA-Polymerase, ausgeführt. Durch Beeinflussung der Temperatur für die Denaturierung und die Hybridisierung der doppelsträngigen DNA, können große Kopien der spezifischen DNA hergestellt werden.
Für die Kopie einer DNA werden zur Polymerase zwei weitere Komponenten benötigt. Erstens, ein reichlicher Vorrat an den vier Nukleinbasen, welche die Bausteine jedes DNA-Teilstücks darstellen. Diese werden durch die Buchstaben A, C, G und T abgebildet, entsprechend für Adenin, Cytosin, Guanin, und Thymin. Das A eines Strangs paart sich immer mit dem T eines anderen Strangs, C paart sich immer mit G. Diese zwei Stränge werden zueinander als komplementär bezeichnet. Die zweite Komponente stellen die Primer dar. Diese stellen kurze synthetische Ketten von komplementär Nukleotiden zu den genetischen Sequenzen einer der beiden Flanken des gewünschten Abschnitts in dem DNA-Strang dar. DNA-Polymerase kann keine Kette der DNA ohne die Primer kopieren. Die Primer hybridisieren an einem der beiden Enden des gewünschten Abschnitts, und das Polymerase Enzym konstruiert den dazwischen liegenden Rest der Kette aus den Rohstoffen (einzelne Nukleotiden).
Das Kopieren eines einzelnen DNA-Strangs erfolgt durch drei Hauptschritte, welche als die PCR bekannt sind. Die PCR-Mischung beinhaltet die Ziel-DNA, Primer und Nukleotiden und DNA-Polymerase. Der erste Schritt, bekannt als Denaturierung, trennt die zwei DNA-Stränge in die doppelte Helix ab. Dies wird durch einfaches Erhitzen der DNA auf 90°–95° für ungefähr 30 Sekunden erreicht. Allerdings können sich die Primer bei dieser Temperatur nicht an die abgetrennten DNA-Stränge binden. Daher wird die Mischung auf eine geringere Temperatur von 55°–64° abgekühlt, abhängig von der DNA. Bei dieser Temperatur binden sich die Primer oder legen sich an die Enden der DNA-Stränge an, was ungefähr 20 Sekunden andauert. Der letzte Schritt umfasst das Beenden des Kopierens der DNA. Da die DNA-Polymerase am besten bei einer Temperatur von 75° betrieben wird, wird die Temperatur der Mischung erhöht. Bei dieser Temperatur beginnt die DNA-Polymerase den Aufbau oder das Auffüllen der einzelnen Nukleotiden an die Primer und schafft eventuell eine Komplementär-Kopie der Vorlage (bekannt als Extention). Dies vollendet den PCR-Zyklus. An dem Ende dieses Zyklus ist jedes Teilstück der DNA in der Mischung dupliziert worden. Wenn der Zyklus dreißig oder mehrere Male wiederholt wird, können mehr als eine Million Kopien der Einzel-DNA hergestellt werden. Der Zyklus der Denaturierung, Anlagerung und Extention wird durch thermische Zyklisierung umgesetzt, was die Idee der Miniaturisierung dieses Verfahrens mit sich bringt.
Nach der Entdeckung der Mikrotechnologie in den frühen fünfziger Jahren zur Realisierung integrierter Halbleiterstrukturen für Mikroelektronikchips, wurden diese lithografisch basierenden Technologien auch bald in der Drucksensorfertigung in den mittleren sechziger Jahren angewandt. Neben Drucksensoren wurden Airbagsensoren und andere mechanisch bewegliche Strukturen und Fluidbehandlungsgeräte entwickelt. Das erste Chiplabor-Analysesystem (LoC) stellte ein Gas-Chromatograph dar, welcher durch S. C. Terry an der Stanford University entwickelt wurde. Allerdings begann erst zum Ende der achtziger Jahre, und den beginnenden neunziger Jahren die LoC-Forschung beträchtlich zu wachsen, als einige Forschungsgruppen in Europa Mikropumpen, Durchflusssensoren und die Konzepte der integrierten Fluid-Behandlung für Analysesysteme entwickelten. Diese Konzepte für Mikro-Vollanalysesysteme (μTAS) demonstrierten, dass die Integration von Vorbehandlungsschritten, welche gewöhnlich im Labor-Maßstab gemacht wurden, die einfache Sensorfunktionalität hinzu einer kompletten Laboranalyse, welche zum Beispiel zusätzliche Reinigungs- und Abtrennungsschritte beinhaltete, erweitern konnte. Ein großer Aufschwung in der Forschung und des kommerziellem Interesse erfolgte in den mittleren neunziger Jahren, als sich μTAS-Technologien zu einem interessanten Werkzeug zur Bereitstellung für genomische Anwendungen, wie Kapillar-Elektrophorese und DNA-Mikroarrays, entwickelten.
Die Wertschöpfung war nicht nur auf die Integration von Laborprozessen für die Analyse begrenzt, sondern ergab sich auch aus den charakteristischen Möglichkeiten der Einzel-Komponenten und der Anwendung von anderen, nicht analytischen, Laborprozessen. Obwohl die Anwendung von LOCs noch neu und bescheiden ist, wird ein wachsendes Interesse von Unternehmen und Anwenderforschungsgruppen in verschiedenen Feldern wie der Analyse (z. B. chemische Analyse, Umweltüberwachung, medizinische Diagnose und Cellomics), aber auch in der synthetischen Chemie (z. B. Rapid Screening und Mikroreaktoren für die Pharmazeutik) beobachtet. Neben weiteren Anwendungsentwicklungen wird erwartet, dass sich die Erforschung von LOC-Systemen auch hinsichtlich Downscaling von Fluidhandhabungsstrukturen, durch das Ausnutzen von Nanotechnologie, ausdehnt.
Mittels LOCs könnten sich sehr anwendungsspezifische Vorteile ergeben. Typische Vorteile sind:

– Geringer Flüssigkeitsvolumenverbrauch aufgrund der kleinen internen Chipvolumina, was beispielsweise förderlich für die Umweltverschmutzung (geringere Verschmutzung) ist, geringere Kosten von teuren Reagentien und geringerer Verbrauch von Proben-Flüssigkeit für Diagnosen
– Höhere Analyse- und Chip-Kontrollgeschwindigkeit und bessere Effizienz aufgrund der kurzen Mischungszeiten (kurze Diffusionsabstände), schnelles Aufheizen (kurze Distanzen, große Wandfläche für Flüssigkeitsvolumenraten, geringe Heizkapazitäten)
– bessere Prozesskontrolle infolge einer schnelleren Systemantwort (zum Beispiel thermische Kontrolle von exothermischen chemischen Reaktionen)
– Kompaktheit des Systems, infolge von großer Funktionalitätsintegration und geringen Volumina
– massive Parallelisierung infolge der Kompaktheit, was Analysen mit hohem Durchsatz erlaubt
– geringere Herstellungskosten, welche in Massenproduktion hergestellte, kostengünstige Einweg-Chips erlauben
– sichere Basis für chemische, radiologische oder biologische Studien aufgrund der großen Funktionalitätsintegrität und dem geringeren gespeicherten Flüssigkeitsvolumen und Energien

Konventionelle PCR-Geräte im Makromaßstab bestehen üblicherweise aus Computerthermocyclern und Reaktionsampullen, welche die PCR-Mischung beinhalten. Gewöhnliche PCR-Geräte erreichen üblicherweise Temperatursteigerungsraten von ungefähr 1° bis 2° Grad Celsius pro Sekunde in dem für PCR relevanten Temperaturbereich. Der PCR-Prozess für 20–35 Zyklen kann üblicherweise in 30–180 Minuten durchgeführt werden, abhängig von der Leistungsfähigkeit des Thermocyclers. Ursache für die geringere Steigerung ist die hohe thermische Kapazität des Materials des PCR-Reaktionssystems. Die PCR-Produkte können mittels der traditionellen Slap-Gel-Elektrophorese electrophoresis analysiert werden.
Mit dem Fortschreiten in der Mikroherstellung, wurde der erste PCR-Chip durch Northrup et. al. vorgestellt. Seitdem wurden viele Typen der PCR-Chip-Technologie vorgestellt. Die Basis für PCR-Chips sind schnellere DNA-Amplifikationsraten als Folge von geringeren thermischen Kapazität und den größeren Wärmeübertragungsrate zwischen der PCR-Mischung und den temperaturgesteuerten Komponenten. Dies wird erreicht durch das Nutzen geringer Größen, schnellen Temperatursteigerungsraten, geringen Kosten, geringem Probenverbrauch und hoher Integration. Allerdings könnten mit der Miniaturisierung die Effekte verbunden mit der nichtspezifischen Adsorption von biologischen Proben an die Kanaloberflächen und das viscoelastische Flussverhalten, bedeutsam werden, als eine Folge des erhöhten Oberflächen-Volumen-Verhältnis, was die PCR Amplifikation in Mikrofluid-Geräten hemmen könnte.
Jegliche Erörterung des Standes der Technik in der Beschreibung sollte in keiner Weise als ein Eingeständnis betrachtet werden, dass eine solche Vorwegnahme weithin bekannt ist oder ein allgemein übliches Wissen auf diesem Gebiet darstellt.
Zusammenfassung der Erfindung
Entsprechend wird ein Gerät zur Polymerase-Kettenreaktion (PCR), welches eine Chipbaugruppe beinhaltet, eine Vielzahl von in der Chip-Baugruppe zur Verfügung gestellten Kammern, welche angepasst sind die Proben zu halten, Heizmittel, wobei die Chip-Baugruppe auf den Heizmitteln angeordnet ist, wobei es der Chip-Baugruppe gestattet ist, auf den Heizmitteln drehend zu wirken, ein drehendes die Chipdrehung unterstützendes Rad und wobei das Heizmittel eine Mehrzahl von Temperaturzonen derart umfasst, dass bei Drehung des Chip-Mittels die Probenkammern von einer Temperaturzone zur anderen mittels eines Dreh-Linear-Bewegungssystems verschoben werden.
Sofern der Kontext nicht eindeutig anderweitiges beansprucht, sind die Wörter „umfassen”, „umfassend” und ähnliches durchwegs in der Beschreibung und in den Ansprüchen ausgelegt in einem einschließlichen Sinne im Gegensatz zu einem exklusiven oder erschöpfenden Sinne; nämlich, in dem Sinne von „beinhaltend, aber nicht begrenzt auf”.
Die vorliegende Erfindung besteht aus verschiedenen neuen Merkmalen und einer Kombination von Teilen, nachstehend umfassend beschrieben und illustriert in der begleitenden Beschreibung und Zeichnung, und es wird darauf hingewiesen, dass verschiedenartige Detail-Änderungen gemacht werden können ohne von dem Umfang der Erfindung abzuweichen oder auf einige Vorteile der vorliegenden Erfindung zu verzichten.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
Die vorliegende Erfindung wird völlig verstanden durch die gegebene detaillierte Beschreibung wie nachfolgend und die begleitenden Zeichnungen, welche nur durch eine Abbildung gegeben sind, und daher nicht limitierend für die vorliegende Erfindung sind, wobei:
1 zeigt die auf das PCR-Disc-Rad montierten PCR-Chips;
2 zeigt die Einweg-Polymer PCR-Chips mit vier Probenkammern;
3 zeig die Heizungsbaugruppe der PCR-Disc;
4 stellt das schematische Diagramm des montierten PCR-Disc-Drehrades dar;
5 zeigt das montierte PCR-Disc-Gerät.
Detaillierte Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Polymerase-Kettenreaktionsdisc (PCRDisc) nutzend die Vorteile einer stillstehenden Kammer und eines Durchlauf-PCR-Geräts. Nachstehend beschreibt diese Spezifikation die vorliegende Erfindung gemäß den bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung. Allerdings ist zu verstehen, dass ein Limitieren der Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung lediglich die Erörterung der vorliegenden Erfindung erleichtert und es ist vorgesehen, dass jene Fachleute verschiedenartige Modifikationen und Äquivalente ersinnen könnten, ohne von dem Umfang der angehängten Ansprüche abzuweichen. Die folgende detaillierte Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen wird nun beschrieben in Übereinstimmung mit den angehängten Zeichnungen, entweder einzeln oder in Kombination.
Die Erfindung bezieht sich auf einen Einwegchip-PCR-Gerät, umfassend Probenkammern, so dass die Kammern die Maßgabe des Verschiebens von einer Temperaturzone zu einer anderen haben mittels eines Drehlinearbewegungssystems. Anstatt eine externe Pumpe zu benutzen, um die Probe zu verschiedener Temperaturzone zu bewegen, verschiebt das Gerät die Probenkammer von einer Temperaturzone zur anderen durch Benutzen des Drehlinearbewegungssystems. Jede einzelne Probenkammertemperatur ist individuell gesteuert. Auf diese Art können verschiedene Deoxyribonucleinsäureproben (DNA) mit verschiedenen Anlegetemperaturen in einem Einzelprozess gleichzeitig amplifiziert werden.
In dieser besonderen Ausführungsform des erfinderischen Konzepts hat die PRCDisc 16 Probenkammern 1. Die Anzahl der einzeln kontrollierten Heizer beträgt auch 16 Einheiten. 1 zeigt die Abbildung des PCRDisc-Rades 2. Die Probenkammern 1 sind aus einzelnen Einsätzen 3 hergestellt, die aus Polymermaterial gemacht sind, um die Kosten der Herstellung zu reduzieren. Jeder Einsatz 3 hat insgesamt 4 Probenkammern 1, wie in 2 gezeigt ist. Spezielles Gehäuse ist konstruiert und hergestellt, um die Heizer aufzunehmen und das PCRDisc-Rad zu befestigen (3 und 4). Zusätzlich ist ein separates System der Motorkontrolleinheit entwickelt, um die rotierende und lineare Bewegung der Disc aufzunehmen.
Wie offenbart, kann die Disk 2 bis zu 16 Kammern 1 haben. Allerdings für das vorgeschlagene System werden nur 12 Kammern für die Experimente benutzt. Dies ist infolge der Begrenzung der Anzahl der verfügbaren Heizer und der Anzahl der verfügbaren physikalischen Kanäle des National-Instruments Steuerungssystems. In diesem System ist die Anordnung der Heizer 4 in 3 gezeigt. Es gibt 3 Heizer für jede der Denaturierung und Anlegetemperaturzone/Reihen und 2 Reihen von 3 Heizern, jede für die Extensionstemperaturzone. Der Grund für die zusätzliche Reihe an Heizern für die Extensionstemperaturzone ist zu minimieren, die Gesamtzykluszeit. Wie vorher erklärt, hängt die Extensionszeit von der Basenpaarlänge der Muster-DNA ab. Denaturierung und Anlegedauer ist minimal. Da der Denaturierungsprozess, sobald die benötigte Temperatur erreicht ist, eintritt, benötigt es nicht zusätzlicher Verweilzeit. Und für den Anlegeprozess, in Folge der kurzen Stränge der Primer, vollendet dieser Prozess innerhalb einer kürzesten Zeitdauer. Um den für Extensionsprozess die Polymerasekettenreaktion zu vollenden, ist es entscheidend, die benötigte Dauer von der des Denaturierungs- und Anlegeprozesses zu verdoppeln. Dies wird gemacht durch zwei Reihen von Extensionsheizern nebeneinander nach der Anlegetemperaturreihe. Für kurze Basenpaar-DNA-Amplifikation (weniger als 100 Basenpaare), kann die Anzahl der Extensionstemperaturreihen auf eine einzige reduziert werden. In diesem Fall kann das System rekonfiguriert werden, um nur 3 Temperaturzonen anstatt von 4 zu haben.
Die Probenkammern 1 werden im Uhrzeigersinn gedreht, nutzend das Drehsystem, um es von einer Temperaturzone zu einer anderen zu bewegen (s. 5). Sobald die Probenkammern oben auf den Heizern 4 positioniert sind, wird die Disc 2 abwärts eingezogen, um diese auf den Heizer 4 durch Benutzen des linearen Bewegungskontrollsystems zu pressen. Damit alle Probenkammern 1 in Effekten Kontakt mit den Heizer 4 kommen, ist jeder Heizer mit einer Feder belastet, um es einige Millimeter einzuziehen von seiner Originalposition, wenn mit einiger Kraft gedrückt wird. Sobald die Disc 2 in unterer Position ist (gepresst gegen die Heizer) ist der Disc 2 gestattet, in dieser Position zu bleiben, um den PCR-Prozess zu vollenden für eine vorbestimmte Dauer (abhängig von der PCR-Probe). Sobald die Dauer vorbei ist, wird die Disc 2 aufwärts gedrückt, nutzend das lineare Bewegungssystem und dann wird die Disk um 90° gedreht zu der nächsten Reihe der Heizer 4. Danach wird die gleiche Linearbewegung ausgeführt. Die Probe wird einen kompletten PCR-Zyklus vollenden, nachdem die Probenkammern 3.600 von dem anfänglichen Heizen bei der Denaturierungsreihe gedreht sind. Durch Steuerung der Anzahl der Drehbewegung der Disk kann die Anzahl der PCR-Zyklen gesetzt werden. Daher kann eine Gesamtsumme von 12 Proben gleichzeitig innerhalb einer kurzen Dauer amplifiziert werden. Da die Heizertemperaturen individuell kontrolliert werden, können die 3 oder 4 Anlegetemperaturen für die Anlegereiheheizer gesetzt werden. Mit dieser Methode können 4 oder 4 verschieden PCR-Proben mit verschiedenen Anlegetemperaturen in einer Disk amplifiziert werden. Die Methode kann treffend als „PCR Chip Multiplexing” bezeichnet werden.

Claims

Ein Gerät zur Polymerase-Kettenreaktion (PCR), welches beinhaltet: i. eine Chip-Baugruppe; ii. eine Vielzahl von in der Chipbaugruppe vorgesehenen Kammern, welche angepasst sind, Proben zu halten; iii. ein Heizmittel, wobei die Chip-Baugruppe auf den Heizmitteln angeordnet ist, wodurch es der Chip-Baugruppe gestattet ist, drehend auf den Heizmitteln zu wirken; und iv. ein die Chip-Drehung unterstützendes Drehrad; wobei das Heizmittel eine Mehrzahl von Temperaturzonen in einer Weise umfasst, dass bei Drehung der Chip-Mittel die Probenkammer von einer Temperaturzone zu einer anderen mittels eines Dreh-/Linear-Bewegungssystems verschoben wird.
Das Gerät wie in Anspruch 1 beansprucht, wobei der Chip einzelne Einsätze beinhaltet.
Das Gerät wie in Anspruch 2 beansprucht, wobei der Einsatz mindestens vier Probenkammern beinhaltet.
Das Gerät wie in Anspruch 1 beansprucht, wobei das Gerät ein spezielles Gehäuse, zum Aufnehmen des Heizmittels sowie um das Drehrad zu befestigen, beinhaltet.
Das Gerät wie in Anspruch 1 beansprucht, zusätzlich eine Motorsteuereinheit beinhaltend, welche angepasst ist, für die Chip-Baugruppe eine lineare und drehende Bewegung bereit zu stellen.
Das Gerät wie in Anspruch 5 beansprucht, wobei die Motorsteuereinheit ein lineares Bewegungssteuerungsmittel beinhaltet, welches angepasst ist, die Chip-Baugruppe abwärts zurückzuziehen, um diese auf der geeigneten Temperaturzone der Heizmittel anzuordnen.
Ein Gerät zur Polymerase-Kettenreaktion (PCR) wie im Wesentlichen hierin beschrieben, gemäß einem der in den begleitenden Zeichnungen und/oder Beispielen abgebildeten Ausführungsformen der Erfindung.