JP2010142222A - 使い捨て多重ポリメラーゼ連鎖反応（ｐｃｒ）チップおよびデバイス - Google Patents

Abstract

【課題】ＰＣＲチップを保持する標本チャンバを、異なる温度ゾーンへと、外部ポンプを使用することなくシフトさせ得るポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）デバイスを提供する。
【解決手段】ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）デバイスが、チップ・アセンブリ２、前記チップ・アセンブリ内に備えられ標本を保持す複数の標本チャンバ１、加熱手段であって、その上にチップ・アセンブリが回転可能に配置されされる加熱手段、および前記チップの回転を補助する回転ホイールを含む。回転‐直線運動システムによって、チップ・アセンブリの回転時で、標本チャンバが、加熱手段における１つの温度ゾーンから別の温度ゾーンへとシフトされる。
【選択図】図５

Description

本発明は、多重ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）デバイスに関する。より詳細に述べれば、本発明は、標本チャンバを包含する使い捨てＰＣＲデバイスであって、前記チャンバが回転‐直線運動システムによって１つの温度ゾーンから別のそれへシフトする条件を有するデバイスに関する。

ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、溶液中に存在するそのほかの遺伝物質の同時増幅を伴うことなく、特定のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を指数関数的な値（２³⁰に至る）で増幅できる重要な方法である。このテクノロジは、分子生物学応用のための主要なブレークスルーであり、最初に１９８６年に紹介された。当該増幅方法は、自然界の生化学プロセスの中で規則正しく行われているＤＮＡの複製および修復、およびタンパク質の発現の自然プロセスを模している。

ＤＮＡの単鎖からのＤＮＡの複製は、ＤＮＡポリメラーゼ等の特定酵素によって実行される。二重鎖ＤＮＡの変性およびハイブリッド形成のための温度の操作を伴って、特定ＤＮＡのコピーを大量に作ることができる。

ＤＮＡをコピーするためにポリメラーゼは、２つのほかの成分を必要とする。第１は、ＤＮＡのすべての断片の構成単位である４つのヌクレオチド塩基の大量供給である。それらは、それぞれアデニン、シトシン、グアニン、およびチミンを表す文字Ａ、Ｃ、Ｇ、およびＴによって表現される。一方の鎖上のＡは、常に他方の鎖上のＴと対となり、Ｃは常にＧと対になる。これらの２本の鎖は、互いに相補であると言う。第２の成分はプライマである。それらは、ＤＮＡ鎖内の標的セクションのいずれかの側に隣接する遺伝子配列に対する相補ヌクレオチドの短い人為的な鎖である。ＤＮＡポリメラーゼは、プライマなしでＤＮＡの鎖をコピーすることはできない。プライマが標的セクションのいずれかの端にハイブリッド形成し、ポリメラーゼ酵素が、それらの間の残りの鎖を生材料（単体のヌクレオチド）から組み立てる。

単鎖ＤＮＡのコピーは、ＰＣＲとして知られる３つの主要ステップを経て行われる。ＰＣＲ混合液は、標的ＤＮＡ、プライマおよびヌクレオチド、およびＤＮＡポリメラーゼを含む。第１のステップは、変性として知られ、二重螺旋の２本鎖ＤＮＡを分離する。これは、約３０秒間にわたり、セ氏９０°〜９５°においてＤＮＡを単純に加熱することによってなされる。しかしながら、この温度においては、分離されたＤＮＡ鎖にプライマが結合することはできない。したがって当該ＤＮＡに応じて、より低いセ氏５５°〜６４°の温度まで混合液が冷却される。この温度においては、プライマがＤＮＡ鎖の端に結合またはアニーリングされるが、それに約２０秒を要する。最後のステップは、ＤＮＡのコピーの完了である。セ氏７５°周辺においてＤＮＡポリメラーゼがもっともよく作用することから、混合液の温度が高められる。この温度においては、ＤＮＡポリメラーゼが単一ヌクレオチドをプライマに堆積させるか、または積み上げ、最終的にテンプレートの相補コピーを作る（伸長として知られる）。これでＰＣＲサイクルが完了する。このサイクルの終了時に、混合液内のＤＮＡのそれぞれの断片が複製される。このサイクルを３０回またはそれを超えて反復すれば、単鎖ＤＮＡの１０億を超えるコピーを作ることが可能である。変性、アニーリング、および伸張のサイクルは、このプロセスの小型化のアイディアに貢献する温度サイクリングを通じて行われる。

１９５０年代初期におけるマイクロエレクトロニクス・チップ用集積化半導体構造の実現のためのマイクロ・テクノロジの発見の後すぐに、１９６０年代中期には、これらのリソグラフィ‐ベースのテクノロジが圧力センサ製造にも応用されている。圧力センサの次には、エアバッグ・センサおよびそのほかの機械的可動構造、流体操作デバイスが開発された。最初のラボ・オン・チップ(ＬｏＣ, Lab on Chip）分析システムは、スタンフォード大学においてＳ．Ｃ．テリー（Ｓ．Ｃ．Ｔｅｒｒｙ）によって１９７５年に開発されたガス・クロマトグラフである。しかしながら、ＬｏＣリサーチの真剣な成長は、１９８０年代の末期および１９９０年代の初期になって、ヨーロッパのいくつかの研究グループがマイクロポンプ、流れセンサ、および分析システムのための統合流体処理についてのコンセプトを開発したときに始まったに過ぎない。これらのマイクロ総合化学分析システム（μＴＡＳ）のコンセプトは、通常は実験室規模でなされる前処理ステップの統合が単純なセンサ機能を、たとえば追加のクリーニングおよび分離ステップを含めた完全な実験室分析に向けて拡張できることを立証した。リサーチおよび商的関心における大きな後押しは、μＴＡＳテクノロジが、キャピラリー電気泳動法およびＤＮＡマイクロ分析等のようなゲノミクス応用のための興味深いツールを提供することがわかった１９９０年の中期に到来した。

付加された価値は、分析のための実験室プロセスの統合に限られることなく、個別構成要素特有の可能性およびそのほかの非分析実験室プロセスにも及んだ。ＬｏＣの応用は未だ新しく、かつ控えめであるが、会社および応用研究グループの成長しつつある関心が、分析（たとえば、化学分析、環境監視、医療診断、およびセロミクス）だけでなく、合成化学（たとえば、薬剤学のための高速スクリーニングおよびマイクロリアクタ）といった様々な分野で観察される。引き続く応用開発に加えて、ＬｏＣシステムにおける研究が、ナノテクノロジの使用による流体ハンドリング構造のダウンスケーリングに向かう拡張にも期待されている。

ＬｏＣは、それらの応用についての利点を非常に特異的に提供できる。典型的な利点は次のとおりである。
・低いチップ内体積に起因する、たとえば環境汚染のために有利（より無駄が少ない）であり、高価な試薬のコストがより低く、また診断に使用される標本流体がより少ない、低い流体消費体積。
・より高い分析およびチップのコントロール速度および短い混合時間（短い拡散距離）、高速加熱（短い距離、高い壁表面積対流体体積比、小さい熱容量）に起因するより良い効率。
・よりすばやいシステムの応答に起因する、より良好なプロセス・コントロール（たとえば、発熱性化学反応のための温度コントロール）。
・機能の大規模統合および小さい体積に起因するシステムの稠密性。
・高スループット分析を可能にする、稠密性に起因した大量並列処理。
・大量生産で製造され、コスト効果的な使い捨てチップを可能にする、より低い製造コスト。
・機能の大規模統合および低い蓄積流体体積およびエネルギに起因する、より安全な化学、放射性、または生物学的研究のためのプラットフォーム。

従来的なマクロ・スケールＰＣＲデバイスは、通常、コンピュータ・サーマルサイクラーおよびＰＣＲ混合液が入った反応バイアルからなる。従来的なＰＣＲデバイスは、ＰＣＲに関連する温度範囲内において、一般に毎秒約１〜２℃の温度勾配レートを達成する。２０〜３５サイクルにわたるＰＣＲプロセスは、サーマルサイクラーの能力に依存するが、通常は３０〜１８０分内に完了可能である。より低い勾配の理由は、ＰＣＲ反応システムの材料の高い熱容量に起因する。ＰＣＲ生成物は、伝統的なスラブ‐ゲル電気泳動法を使用して分析可能である。

マイクロファブリケーションにおける進歩とともに、最初のＰＣＲチップがノースラップ（Ｎｏｒｔｈｒｕｐ）ほかによって紹介された。その後は、多くのタイプのＰＣＲチップ・テクノロジが紹介されている。ＰＣＲチップの基本は、より小さい熱容量および、ＰＣＲ混合液と温度コントロールされる構成要素の間におけるより大きな熱伝導率の結果としてもたらされる、より高速なＤＮＡ増幅レートである。これは、小さいサイズ、高速の温度勾配レート、低いコスト、より低い標本消費、および高い集積化を使用することによって達成される。

しかしながら小型化とともに、チャネルの表面への生物学的標本の非特異吸着および粘性と弾性を合わせもつ流れの振る舞いに関連する効果が、表面積対体積比の増加の結果として有意となり、それが微少溶液デバイス内におけるＰＣＲ増幅を阻害することがある。

この明細書全体を通じた従来技術のあらゆる議論は、いかなる形においても、その種の従来技術が公知であること、またはこの分野に共通した一般的な知識の一部を形成することの容認と考えられるべきではない。

この発明によれば、ＰＣＲチップを保持する標本チャンバを、異なる温度ゾーンへと、外部ポンプを使用することなくシフトさせ得るポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）デバイスが提供される。

したがって、チップ・アセンブリを含み、そのチップ・アセンブリ内に備えられて標本を保持する複数の標本チャンバを含み、且つ、加熱手段であって、その上にチップ・アセンブリが回転可能に配置される加熱手段を含み、チップ・アセンブリの回転を補助する回転ホイールを含み、そして、加熱手段が複数の温度ゾーンを有し、回転‐直線運動システムによって、チップ・アセンブリの回転で、標本チャンバが１つの温度ゾーンから他の温度ゾーンへシフトされ得る。

文脈からほかの解釈が求められない限り、説明および特許請求の範囲を通じて用語「包含する」「包含している」およびこれらの類は、排他的または網羅的という意味に対するところの、含む、の意味で解釈されるものとし、言い替えると「含むが、限定ではない」の意味で解釈される。

本発明は、いくつかの新規の特徴および部品の組み合わせからなり、以下のとおり、付随する説明および図面の中に完全に述べられ、かつ図解されているが、本発明の範囲からの逸脱または本発明の利点の何らかの犠牲を伴うことなく、詳細において多様な変更を行い得ることは理解される。

本発明は、以下に与えられている詳細な説明および、次の、図解だけのために与えられ、したがって本発明の限定ではない添付図面から完全に理解されることになろう。

ＰＣＲディスク（ＰＣＲＤｉｓｃ）ホイールに取り付けられたＰＣＲチップを図解した説明図である。 ４つの標本チャンバを伴う使い捨てポリマＰＣＲチップを図解した説明図である。 ＰＣＲディスクのヒータ・アセンブリを図解した説明図である。 組み立てられたＰＣＲディスク・ロータリ・ホイールを表す概略図である。 組み立てられたＰＣＲディスク・デバイスを図解した説明図である。

本発明は、静止チャンバおよび連続流ＰＣＲデバイスの利点を利用するポリメラーゼ連鎖反応ディスク（ＰＣＲディスク（ＰＣＲＤｉｓｃ））に関する。以下において、この明細書は、本発明の好ましい実施態様に従って本発明を説明する。しかしながら説明を本発明の好ましい実施態様に限定することが単に本発明の考察を容易にするだけのためであると理解されるべきであり、本発明の範囲から逸脱することなしに当業者が多様な修正および等価物を案出できることは企図されている。

以下の好ましい実施態様の詳細な説明が、ここでは個別に、または組み合わせにおいて添付図面に従って述べられることになる。

本発明は、標本チャンバを包含する使い捨てＰＣＲデバイスであって、前記チャンバが回転‐直線運動システムによって１つの温度ゾーンから別のそれへシフトする条件を有するデバイスに関する。異なる温度ゾーンへの標本の移動に外部ポンプを使用することに代えて、前記デバイスは、回転‐直線運動システムを使用することによって標本チャンバを１つの温度ゾーンから別のそれへシフトさせる。それぞれの個別の標本チャンバの温度は、個別にコントロールされる。この方法においては、異なるアニーリング温度を伴ういくつかの異なるデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）標本を単一プロセスの中で同時に増幅することが可能である。

本発明のこのコンセプトの特定の実施態様においては、ＰＣＲディスクが１６個の標本チャンバ１を有する。個別にコントロールされるヒータの数もまた１６ユニットである。図１は、ＰＣＲディスク・ホイール２を図解している。標本チャンバ１は、製造コストを削減するべくポリマ材料から作られた個別のカートリッジ３から作られる。それぞれのカートリッジ３は、図２に示されるとおり、合計して４つの標本チャンバ１を有する。特別なハウジングが、ヒータを収容し、かつＰＣＲディスク・ホイールをマウントするべく設計され、製造される（図３および４）。加えて独立したモータ・コントロール・ユニットのシステムが、ディスクの回転および直線の動きを可能とべく開発されている。

開示されているとおり、ディスク２は最大で１６個のチャンバ１を有することが可能である。しかしながら提案システムについては、実験のために１２個のチャンバだけが利用されている。これは、ナショナル・インストゥルメンツ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）のコントロール・システムに利用可能な物理的チャンネルの数および利用可能なヒータの数における制限によるものである。このシステムにおけるヒータ４のレイアウトは、図３に示されるとおりとなる。変性およびアニーリングの温度ゾーン／行のそれぞれのために３つのヒータが存在し、伸長温度ゾーンのために３つのヒータの行が２つ存在する。伸長温度ゾーンのために追加のヒータの行を有する理由は、総サイクル時間の最小化である。先に説明したとおり、伸長時間は、テンプレートＤＮＡの塩基対の長さに依存する。変性およびアニーリングの持続時間は極小である。必要とされる温度に到達すれば変性プロセスが生じることから、したがって追加の停止時間が必要ない。またアニーリング・プロセスについては、プライマの短い鎖に起因して、このプロセスが短い時間期間内に完了する。伸長プロセスにポリメラーゼ連鎖反応を完了させるために、必要とされる持続時間を変性およびアニーリングのプロセスのそれの２倍にすることが決定された。これは、アニーリング温度の行の後に、互いに隣り合わせて伸長ヒータの行を２つ有することによってなされる。短い塩基対のＤＮＡ増幅（１００塩基対未満）については、伸長温度行の数を１つだけに減らすことが可能である。この場合においては、４つではなく３つの温度ゾーンだけを有するようにシステムを再構成することができる。

標本チャンバ１は、それを１つの温度ゾーンから別のゾーンへ運動させる回転システムを使用して時計回りの方向に回転される（図５参照）。標本チャンバがヒータ４の上に位置決めされると、直線運動コントロール・システムの使用によってディスク２全体が下方に引き込まれ、ヒータ４を押圧する。すべての標本１チャンバがヒータ４との完全な接触に至るために、それぞれのヒータにスプリングが背設されており、それは、何らかの力で押圧されたときにそれのオリジナルの位置から数ミリメートル押し込まれる。ディスク２が下側の（ヒータに対して押圧された）位置になると、ディスク２は、それがＰＣＲプロセスを完了するべく、あらかじめ決定済みの持続時間（ＰＣＲ標本に依存）にわたってその位置に止め置かれる。その持続時間が経過すると、直線運動システムを使用してディスク２が上方に押され、その後ディスク２が、次のヒータ４の行まで９０°回転される。その後、同じ直線運動が実施される。標本は、標本チャンバが変性の行における最初の加熱から３６０°回転された後に１つの完全なＰＣＲサイクルを完了することになる。ディスクの回転運動の数をコントロールすることによって、ＰＣＲサイクルの数を設定することが可能である。したがって、総数が１２個の標本を、短い持続時間内に同時に増幅することができる。ヒータ温度が個別にコントロールされることから、アニーリング行のヒータのために３つまたは４つのアニーリング温度を設定することが可能である。この方法によれば、１つのディスク内において３または４種の異なるＰＣＲ標本を、異なるアニーリング温度を用いて増幅することができる。この方法は、適切に「ＰＣＲチップ多重化」と名付けることができる。

１ 標本チャンバ； ２ ＰＣＲディスク・ホイール、ディスク；
３ カートリッジ； ４ ヒータ。

Claims (6)

1. ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）デバイスであって、
   i) チップ・アセンブリ、
   ii) 前記チップ・アセンブリ内に備えられた、標本保持用の複数の標本チャンバ、
   iii)加熱手段であって、その上に、前記チップ・アセンブリが回転可能に配置され得る、加熱手段、
   iv) 前記チップ・アセンブリの回転を補助する回転ホイール、
   を備え、
   前記加熱手段が複数の温度ゾーンを有し、回転‐直線運動システムによって、前記チップ・アセンブリの回転で、前記標本チャンバが１つの温度ゾーンから他の温度ゾーンへシフトされる
   ことを特徴とする、ポリメラーゼ連鎖反応デバイス。
2. 前記チップ・アセンブリは、個別のカートリッジを含む、請求項１に記載のデバイス。
3. 前記カートリッジは、少なくとも４つの標本チャンバを含む、請求項２に記載のデバイス。
4. 前記デバイスは、前記回転ホイールが前記加熱手段にマウントできるようにするハウジングを含む、請求項１に記載のデバイス。
5. さらに、前記チップ・アセンブリに直線および回転運動を提供するモータ・コントロール・ユニットを含む、請求項１に記載のデバイス。
6. 前記モータ・コントロール・ユニットは、前記チップ・アセンブリを、前記加熱手段の適切な温度ゾーンへと、下方に引き込み配置する直線運動コントロール手段を含む、請求項５に記載のデバイス。

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