KR20100070977A

KR20100070977A - 일회용 멀티플렉스 중합효소 연쇄 반응(ｐｃｒ)용 칩 및 장치

Info

Publication number: KR20100070977A
Application number: KR1020090069276A
Authority: KR
Inventors: 아스마 이스마일; 수구마르 다르말링감; 링수 콩
Original assignee: 유니버시티 세인즈 말레이시아
Priority date: 2008-12-18
Filing date: 2009-07-29
Publication date: 2010-06-28
Also published as: SG162649A1; TW201024423A; US20100159582A1; CN101748056A; WO2012033396A8; AU2009203047A1; WO2012033396A1; DE102009035270A1; JP2010142222A

Abstract

본 발명은, 칩 어셈블리(2), 시료를 수용하도록 상기 칩 어셈블리에 구비되어 있는 복수개의 챔버(1), 상기 칩 어셈블리가 작동가능하게 회전될 수 있도록 놓여있는 가열 수단, 칩의 회전을 보조하는 회전식 휠을 포함하며, 상기 가열 수단이, 상기 칩의 회전시 상기 시료 챔버가 회전-직선 운동 시스템에 의해 어떤 온도 구역에서 다른 온도 구역으로 이동하는 방식으로 되어 있는, 복수개의 온도 구역을 포함하는 것을 특징으로 하는 중합효소 연쇄 반응 장치에 관한 것이다.

중합효소 연쇄 반응, 멀티플렉스

Description

일회용 멀티플렉스 중합효소 연쇄 반응(ＰＣＲ)용 칩 및 장치{A DISPOSABLE MULTIPLEX POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR) CHIP AND DEVICE}

본 발명은 멀티플렉스 중합효소 연쇄 반응(PCR) 장치에 관한 것이다. 더 상세하게는, 본 발명은 챔버가 회전식 직선 운동 시스템에 의해 하나의 온도 구역에서 다른 온도 구역으로의 이동가능하도록 되어 있는 시료 챔버를 포함하는, 일회용 PCR 장치에 관한 것이다.

중합효소 연쇄 반응(PCR)은, 용액내에 존재하는 다른 유전자 물질은 증폭시키지 않으면서, 특정 데옥시리보핵산만을 기하급수적으로(2³⁰배 이상) 증폭시킬 수 있는 중요한 방법이다. 이러한 기법은 분자 생물학적 이용에 주요한 발전이며, 1986년에 최초로 도입되었다. 증폭 방법은, 자연적인 생화학적 과정에서 통상적으로 이루어지는, DNA 복제 및 복구와 단백질 발현의 천연적인 과정을 모방한다.

단쇄 DNA로부터의 DNA 복제는 DNA 중합효소와 같은 특이적인 효소에 의해 수행된다. 이중 가닥 DNA의 변성 및 혼성화 온도를 조작하여, 특정 DNA를 다수 카피로 만들 수 있다.

DNA를 복제하기 위해서는, 중합효소에는 2가지 성분이 필요하다. 첫째, 각 DNA 조각의 빌딩 블럭인 4개의 뉴클레오타이드 염기를 제공하는 앰플. 각각은 A, C, G 및 T이고, 각각 아데닌, 사이토신, 구아닌 및 티민이다. 가닥에서 A는 다른 가닥의 T와 항상 쌍을 이루며, C는 항상 G와 쌍을 이룬다. 이러한 가닥 2개를 서로 상보적이라고 한다. 2번째 성분은 프라이머이다. 이것은, DNA 가닥에서 표적 부분의 양 측면의 유전자 서열에 대해 상보적인, 짧은 합성 뉴클레오타이드 체인이다. DNA 합성효소는 프라이머 없이는 DNA 체인을 복제하지 못한다. 프라이머는 표적 부분의 양 말단에 혼성화하고, 중합효소는 원료(단일 뉴클레오타이드)로부터 이들 사이에 체인 나머지 부분을 구축한다.

단쇄 DNA의 복제는 PCR이라고 하는 3가지 주요 단계를 통해 이루어진다. PCR 혼합물은 타겟 DNA, 프라이머, 뉴클레오타이드 및 DNA 중합효소를 포함한다. 제1 단계는, 변성 단계(denaturing step)로, 이중 나선의 DNA 가닥을 분리시킨다. 이는, 간단하게, 90 ℃ - 95 ℃에서 약 30초간 DNA를 가열함으로써 수행된다. 그러나, 이 온도에서, 프라이머는 분리된 DNA 가닥에 결합하지 못한다. 그래서, DNA에 따라 혼합물을 55 ℃ - 64 ℃의 보다 낮은 온도로 냉각시킨다. 이 온도에서는, 프라이머가 DNA 가닥 말단에 결합 또는 어닐링하는데, 소요 시간은 약 20초이다. 최종 단계는, DNA가 복제되면서 완료된다. DNA 중합효소는 약 75 ℃에서 가장 최적으로 작용하기 때문에, 혼합물의 온도를 증가시킨다. 이 온도에서는, DNA 중합 효소가 하나의 뉴클레오타이드를 프라이머에 조립 또는 추가하기 시작하여, 궁극적으로 주형에 대한 상보적인 카피를 만든다(이를 연장이라 함). 이것으로 PCR 사이 클은 종료된다. 사이클 종료 시점에, 혼합물내 각 DNA 조각은 복제되어 있다. 사이클을 30회 이상 반복하면, 단일 DNA를 10억 카피수로 만들 수 있다. 변성, 어닐링 및 연장 단계로 이루어진 사이클은 열 사이클링을 통해 이루어지는데, 이는 이러한 공정의 소형화 아이디어에 기여한다.

마이크로일렉트론 칩에 대한 통합형 반도체 구조를 실현시키기 위해 1950년대 초에 마이크로 기술이 발견된 후, 이러한 리소그라피(lithography) 기반 기술은 곧 1960년대 중반에 압력 센서 제조에 활용되었다. 압력 센서 다음으로, 에어백 센서와 그외 기계적으로 이동가능한 구조체, 유체 조작 장치들이 개발되었다. 최초의 랩 온 칩(LoC: Lab on Chip) 분석 시스템은 1975년에 스탠포드 대학의 S. C. 테리가 개발한 가스 크로마토그래피였다. 그러나, 1980년대 말과 1990년대 초기에, LoC 연구는 유럽에서 몇몇 연구 그룹이 마이크로펌프, 유동-센서 및 통합형 유체 처리 분석 시스템에 대한 컨셉을 개발함에 따라 크게 성장하기 시작하였다. 이러한 마이크로 토탈 화학 분석 시스템(μTAS) 컨셉은, 일반적으로 랩 규모로 행해지는 전처리 단계의 통합이, 예컨대 추가적인 세정 및 분리 단계 등을 포함하는, 완전한 실험 분석에까지 단순한 센서의 기능성을 확대시킬 수 있다는 것을, 보여 주었다. 1990년대 중반에는 엄청난 수준의 연구적 관심 및 상업적 관심이 쏟아졌으며, 이때, μTAS 기술은, 모세관 전기영동 및 DNA 마이크로어레이와 같은 제노믹스 이용에 흥미로운 도구인 것으로 판명났다.

이러한 부가 가치는 단순히 분석 랩 프로세스의 통합과, 개별 구성 요소의 특징적인 가능성 및 그외 비-분석, 랩 프로세스로의 사용으로만 한정되지 않았다. LoC의 어플리케이션은 여전히 새롭고 소규모이지만, 회사와 이용하는 연구 그룹에서의 관심 증가는분석과 같은 여러 분야(예, 화학 분석, 환경 모니터링, 의학적 진단 및 세포체학)와, 또한 합성 화학(예, 약물의 신속한 스크리닝 및 마이크로반응기) 분야들에서 관찰되고 있다. 다른 어플리케이션의 개발 외에도, LoC 시스템 연구는 나노기술을 이용함으로써, 유체 조작 구조체의 축소화 쪽으로도 확대될 것으로 예상된다.

LoC는 그것의 어플리케이션에 따라 매우 특징적인 장점을 제공할 수 있다. 전형적인 장점은 다음과 같다:

- 칩의 내부 부피가 작아 유체 소모 부피의 축소, 이는 예컨대 환경 오염(폐기물 감소), 비싼 시약에 대한 비용 감소 및 진단에 사용되는 유체 시료 절약 등의면에서 유익함.

- 짧은 혼합 시간(짧은 확산 거리), 빠른 가열(짧은 거리, 유체 용적에 대한 월(wall) 표면의 비율 높음, 낮은 열 용량)로 인한 칩의 고성능 분석 및 속도 조절, 및 보다 우수한 효율.

- 시스템의 보다 빠른 반응성으로 인한 우수한 프로세스 통제(예, 발열성 화학 반응에 대한 열 통제).

- 기능성과 부피 소형화가 통합된 시스템의 소형화.

- 고성능 분석을 가능하게 하는 소형화로 인한 대규모 병행 처리.

- 제조 단가를 낮춤으로써, 비용면에서 효율적인 일회용 칩을 대량으로 제조할 수 있음.

- 기능성, 저장 유체 부피 감소 및 에너지 감소의 대통합을 통한, 화학적, 방사성 또는 생물학적 연구에 대한 안전한 플랫폼 제공.

통상적인 마크로 규모의 PCR 장치는 일반적으로 컴퓨터 써모사이클러(thermocycler)와 PCR 혼합물이 들어 있는 반응 바이얼로 구성된다. 통상적인 PCR 장치는 통상 초당 약 1-2 ℃의 승온/냉각 속도로 PCR의 해당 온도 범위에 도달한다. 20-35 사이클의 PCR 프로세스는 일반적으로 써모사이클러의 성능에 따라 30 내지 180분에 종료된다. 온도 승온/냉각 속도가 낮은 이유는, PCR 반응 시스템의 재료의 높은 열 용량 때문이다. PCR 산물은 전통적인 슬랩-겔 전기영동을 이용하여 분석할 수 있다.

마이크로-조립 기술의 진보로, Northrup 등이 최초로 PCR 칩을 선보였다. 이후, 수많은 타입의 PCR 칩 기술이 도입되었다. PCR 칩의 기본은 PCR 혼합물과 온도 조절된 구성 요소 간에 높은 열 전달율과 열 용량 감소의 결과로서 빨라지는 DNA 증폭율에 있다. 이는, 작은 크기, 빠른 승온/냉각 속도, 저비용, 시료 소모량 감소 및 고도의 통합성을 이용하여 달성된다.

그러나, 소형화의 경우에, 채널의 표면에의 생물 시료의 비특이적인 흡착과 점탄성 유동 거동과 관련된 효과가, 미세유동성 장치에서 PCR 증폭을 저해할 수 있는 정도로 부피 대비 표면의 비율의 증가로 인해, 심각해질 수 있다.

명세서 전반에 걸쳐 논의된 종래 기술에 대한 어떠한 사항도 이들 종래 기술이 널리 공지되어 있다거나 당해 분야에 일반적인 지식의 일부분을 형성한다는 것을 인정하는 것으로 간주되어서는 안된다.

본 발명은 멀티플렉스 중합효소 연쇄 반응(PCR) 장치를 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명은 칩 어셈블리, 시료를 수용하도록 상기 칩 어셈블리에 구비되어 있는 복수개의 챔버, 칩 어셈블리가 작동가능하게 회전될 수 있도록 놓여있는 가열 수단, 칩의 회전을 보조하는 회전식 휠을 포함하는, 중합효소 연쇄 반응(PCR) 장치를 제공한다. 상기 가열 수단은 상기 칩의 회전시 상기 시료 챔버가 회전-직선 운동 시스템에 의해 어떤 온도 구역에서 다른 온도 구역으로 이동하는 방식으로 되어 있는, 복수개의 온도 구역을 포함한다.

본 발명의 장치는 회전식 직선 운동 시스템을 이용하여 시료 챔버를 어떤 온도 구역에서 다른 온도 구역으로 이동시킨다. 각각의 개별 시료 챔버의 온도는 개별적으로 조절된다. 이러한 방식으로, 어닐링 온도가 상이한, 여러개의 상이한 데옥시리보핵산(DNA) 시료를 단일 프로세스로 동시에 증폭시킬 수 있다.

발명의 개요

따라서, 본 발명은 칩 어셈블리, 시료를 수용하도록 상기 칩 어셈블리에 구비되어 있는 복수개의 챔버, 칩 어셈블리가 작동가능하게 회전될 수 있도록 놓여있 는 가열 수단, 상기 칩의 회전을 보조하는 회전 휠을 포함하는, 중합효소 연쇄 반응(PCR) 장치를 제공하며, 상기 가열 수단은 상기 칩의 회전시 상기 시료 챔버가 회전-직선 운동 시스템에 의해 어떤 온도 구역에서 다른 온도 구역으로 이동하는 방식으로 되어 있는, 복수개의 온도 구역을 포함한다.

발명의 설명 전체 및 청구항에서 명확하게 언급된 경우를 제외하고는, 용어 "포함한다", "포함하는" 및 이의 유사어는 배타적이거나 또는 제한적인 의미와는 반대되는 포괄적인 의미, 즉 제한하는 것이 아닌 포함하는 의미로 해석된다.

본 발명은, 몇가지 신규한 구성과 첨부된 발명의 설명 및 도면에 충분히 설명 및 예시된 하기 내용들의 조합으로 구성되어 있으며, 본 발명의 장점 중 어느 하나를 희생시키거나 또는 본 발명의 범위로부터 벗어나지 않으면서 구체적인 다양한 변화가 가능한 것으로 이해된다.

발명의 상세한 설명

본 발명은 고정된 챔버와 연속 유동 PCR 장치의 이점을 응용한 중합효소 연쇄 반응 Disc(PCRDisc)에 관한 것이다. 이하, 본 명세서에서는 본 발명의 바람직한 구현예를 들어 본 발명을 설명할 것이다. 그러나, 본 발명의 바람직한 구현예에 대한 제한된 설명은 본 발명에 대한 논의를 용이하게 하기 위한 것에 불과한 것으로 이해되며, 당업자는 첨부된 청구항의 범위로부터 벗어나지 않으면서 다양한 변형과 동등체를 고안할 수 있을 것으로 예상된다.

이제, 바람직한 구현예에 대한 하기 상세한 설명은, 개별적으로 또는 조합하여, 첨부된 도면을 들어, 설명될 것이다.

본 발명은 챔버가 회전식 직선 운동 시스템에 의해 어떤 온도 구역에서 다른 온도 구역으로 이동하는, 시료 챔버를 포함하는, 일회용 PCR 장치에 관한 것이다. 시료를 여러가지 온도 구역으로 이동시키기 위해 외부 펌프를 이용하는 대신, 본 발명의 장치는 회전식 직선 운동 시스템을 이용하여 시료 챔버를 어떤 온도 구역에서 다른 온도 구역으로 이동시킨다. 각각의 개별 시료 챔버의 온도는 개별적으로 조절된다. 이러한 방식으로, 어닐링 온도가 상이한, 여러개의 상이한 데옥시리보핵산(DNA) 시료를 단일 프로세스로 동시에 증폭시킬 수 있다.

본 발명의 컨셉의 특정 구현예에 있어서, PRCDisc는 16개의 시료 챔버(1)를 포함한다. 또한, 개별적으로 조절되는 히터의 수도 16 유닛이다. 도 1에 PCRDisc 휠(2)의 예를 나타내었다. 시료 챔버(1)는 제조 단가를 낮추기 위해 폴리머 물질로 제조된 각각의 카트리지(3)로 이루어진다. 각 카트리지(3)에는 도 2에 나타낸 바와 같이 총 4개의 시료 챔버(1)가 있다. 히터를 수납하고 PCRDisc 휠을 탑재하도록 하기 위한 특수 하우징이 설계 및 제작된다(도 3 및 4). 또한, 디스크의 회전 및 직선 운동을 구현하기 위한, 모터 제어 유닛의 별도 시스템이 개발된다.

개시된 바와 같이, 디스크(2)는 챔버(1)를 최대 16개 구비할 수 있다. 그러나, 제안된 시스템에서는, 챔버 12개만 실험에 이용된다. 이는, 국립 장비 제어 시스템에 이용가능한 히터와 물리적 채널의 수적 제한에 의한 것이다. 이 시스템에서, 히터(4)의 레이아웃을 도 3에 나타내었다. 각각의 변성 및 어닐링 온도 구역/열(row)에는 히터 3개가 있으며, 각 연장 온도 구역에는 3개 히터로 구성된 2열이 있다. 연장 온도 구역에 히터의 추가적인 열이 있는 이유는, 총 사이클 시간을 최소화하기 위한 것이다. 앞서 설명한 바와 같이, 연장 시간은 주형 DNA의 염기 쌍 길이에 의존된다. 변성과 어닐링 시간은 매우 짧다. 변성 과정은 필요한 온도에 도달하면 바로 이루어지기 때문에, 추가적인 체류 시간(dwelling time)이 필요하지 않다. 또한, 어닐링 과정에서와 같이, 프라이머 가닥이 짧기 때문에, 과정은 단시간내에 완료된다. 연장 과정에서 중합효소 연쇄 반응을 완료하기 위해서는, 변성 및 어닐링 과정에서 필요한 시간의 2배가 필요한 것으로 결정되었다. 이는, 어닐링 온도 열 다음에 연장 히터를 나란히 2열로 둠으로써 실현된다. 염기 쌍이 짧은 DNA를 증폭할 경우에는(100 bp 미만), 연장 온도 열의 수는 1개로 줄일 수 있다. 이 경우, 시스템은 온도 구역이 4개가 아닌 3개만 구비하도록 재설정할 수 있다.

시료 챔버(1)는 회전 시스템을 이용하여 시계 방향으로 회전하여, 어떤 한 온도 구역에서 다른 온도 구역으로 이동한다(도 5 참조). 일단 시료 챔버가 히터(4) 상단에 위치하게 되면, 디스크(2) 전체가 직선 이동 조절 시스템을 이용하여 아래로 내려가 히터(4)쪽을 누르게 된다. 시료 챔버(1) 모두 히터(4)와 완벽하게 접촉되는 상태가 되도록 하기 위해, 각 히터에는, 얼마간의 힘으로 눌려지면 그것의 본래 위치로부터 수 mm 수축되는 스프링이 적재되어 있다. 디스크(2)가 보다 낮은 위치(히터쪽으로 눌려진 위치)에 위치되면, 디스크(2)는 (PCR 시료에 따라) 미리 정해진 시간 동안 PCR 과정을 완료하도록 이 위치에 있게 된다. 이 기간이 끝나면, 디스크(2)는 직선 운동 시스템을 이용하여 위로 올라가고, 디스크는 다시 히터(4)의 다음번째 열로 90°회전된다. 그런 후, 동일한 직선 운동이 수행된다. 시료 챔버가 변성 열에서 처음으로 가열된 후 360°회전하고 나면, 시료의 1회 PCR 사이클은 완료될 것이다. 디스크의 회전 운동 횟수를 조절함으로써, PCR 사이클 수를 설정할 수 있다. 따라서, 총 12개의 시료를 짧은 시간내에 동시에 증폭시킬 수 있다. 히터 온도는 개별적으로 조절되므로, 3 또는 4가지의 어닐링 온도를 어닐링 열의 히터들에 설정할 수 있다. 이같은 방법으로, 어닐링 온도가 상이한 여러가지 PCR 시료 3 또는 4가지를 하나의 디스크에서 증폭시킬 수 있다. 이러한 방법은 "PCR 칩 멀티플렉싱(PCR chip multiplexing)"이라고 적절하게 이름 붙일 수 있다.

본 발명은, 단순히 예시로만 제공되며 본 발명을 제한하는 것은 아닌, 첨부된 도면과 하기에 기술된 발명의 구체적인 설명으로부터 충분히 이해될 것이다.

도 1은 PCRDisc 휠에 PCR 칩이 조립된 것을 예시한 것이다.

도 2는 4개의 시료 챔버가 구비된 일회용 폴리머 PCR 칩을 예시한 것이다.

도 3은 PCRDisc의 히터 어셈블리를 예시한 것이다.

도 4는 조립된 PCRDisc 회전식 휠의 개략도를 나타낸 것이다.

도 5는 조립된 PCRDisc 장치를 예시한 것이다.

Claims

중합효소 연쇄 반응(PCR) 장치로서,

i. 칩 어셈블리;

ii. 시료를 수용하도록 상기 칩 어셈블리에 구비되어 있는 복수개의 챔버;

iii. 칩 어셈블리가 작동가능하게 회전될 수 있도록 놓이는 가열 수단;

iv. 칩의 회전을 보조하는 회전식 휠을 포함하며,

상기 가열 수단이, 상기 칩의 회전시 상기 시료 챔버가 회전-직선 운동 시스템에 의해 어떤 온도 구역에서 다른 온도 구역으로 이동하는 방식으로 되어 있는, 복수개의 온도 구역을 포함하는 것을 특징으로 하는 중합효소 연쇄 반응 장치.
제1항에 있어서, 상기 칩이 개별 카트리지를 포함하는 것을 특징으로 하는 중합효소 연쇄 반응 장치.
제2항에 있어서, 상기 카트리지가 4개 이상의 시료 챔버를 포함하는 것을 특징으로 하는 중합효소 연쇄 반응 장치.
제1항에 있어서, 상기 장치가 상기 가열 수단을 수납하고 회전 휠을 탑재하도록 하기 위한 특수 하우징을 포함하는 것을 특징으로 하는 중합효소 연쇄 반응 장치.
제1항에 있어서, 칩 어셈블리에 직선 및 회전 운동을 제공하는 모터 제어 유닛을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 중합효소 연쇄 반응 장치.
제5항에 있어서, 상기 모터 제어 유닛은 상기 칩 어셈블리를 하방으로 후퇴시켜 가열 수단의 적정 온도 구역에 위치시키는 직선 운동 조절 수단을 포함하는 것을 특징으로 하는 중합효소 연쇄 반응 장치.
첨부된 도면 및/또는 예에 기술된 본 발명의 임의 구현예를 참조하여 설명된 바와 실질적으로 동일한 중합효소 연쇄 반응 장치.