KR20120031188A

KR20120031188A - 회전 ｐｃｒ 장치 및 이를 이용한 회전 ｒｔ-ｐｃｒ 방법

Info

Publication number: KR20120031188A
Application number: KR1020120005180A
Authority: KR
Inventors: 서태석; 정재환; 박병현
Original assignee: 한국과학기술원
Priority date: 2012-01-17
Filing date: 2012-01-17
Publication date: 2012-03-30

Abstract

회전 ＰＣＲ 장치 및 이를 이용한 회전 ＲＴ-ＰＣＲ 방법이 제공된다.
본 발명에 따른 회전 ＰＣＲ 장치는 상기 PCR 칩과 연결되어 상기 PCR 칩을 회전시키기 위한 회전수단; 상기 PCR 칩으로부터 이격되어, 상기 PCR 칩에 열 에너지를 인가할 수 있으며, 상기 회전하는 PCR 칩이 상이한 온도 영역을 지나가도록 구성된 온도영역 형성수단을 포함하는 것을 특징으로 하며, 본 발명에 따른 회전 PCR 장치 및 방법은 표적 물질을 포함하는 칩 자체의 회전에 의하여 원하는 온도조건 및 싸이클 수로 PCR 공정을 진행할 수 있다. 따라서 경제적인 방식으로 고수율 PCR 공정의 구현이 가능하며, 회전하는 플랫폼에 의하여 발생하는 회전력에 의하여 표적 물질을 효과적으로 분리 정제할 수 있으므로, 별도의 외부 장치에서 분리정제를 진행하는 종래 기술에 비하여 경제적이라는 장점이 있다.

Description

회전 ＰＣＲ 장치 및 이를 이용한 회전 ＲＴ-ＰＣＲ 방법{Rotational PCR apparatus and RT-PCR method using the same}

본 발명은 회전 ＰＣＲ 장치 및 이를 이용한 회전 ＲＴ-ＰＣＲ 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 칩 자체의 회전에 의하여 원하는 온도 조건으로 PCR 공정 단계를 수행할 수 있을 뿐만 아니라, 칩의 회전에 따른 회전력에 의하여 시료의 분리 정제를 효과적으로 수행할 수 있으며, 더 나아가 온도 제어에 따라 시료의 전처리 공정과 PCR 공정을 단계별로 연속적으로 수행할 수 있으므로, 경제성, 공정 효율성이 우수한 회전 ＰＣＲ 장치 및 이를 이용한 회전 ＲＴ-ＰＣＲ 방법에 관한 것이다.

일반적으로, DNA 증폭기술은 생명과학, 유전공학 및 의학 분야 등의 연구개발 및 진단 목적으로 광범위하게 활용되고 있으며, 특히 중합효소 연쇄반응 (Polymerase Chain Reaction: PCR)에 의한 DNA 증폭기술이 널리 활용되고 있다. 상기 중합효소 연쇄반응(PCR)은 유전체에 있는 특정 DNA서열을 필요한 만큼 증폭을 할 때 쓰인다. PCR의 첫 번째 단계는 DNA를 변성(Denaturation)시키는 것이다. 두 가닥의 DNA는 가열함으로써 분리시킬 수 있다. 분리된 각각의 DNA는 주형(Template)으로서 역할을 하게 된다. PCR의 두 번째 단계는 결합(Annealing)이다. 이 단계에서는 시발체(Primer)들이 주형 DNA에 결합을 하게 된다. 결합(Annealing) 온도는 반응의 정확성을 결정하는 중요한 요소인데 만약 온도를 너무 높게 하면 시발체가 주형 DNA에 너무 약하게 결합되어서 증폭된 DNA의 산물이 매우 적어진다. 또 만약 온도를 너무 낮게 하면 시발체가 비특이적으로 결합하기 때문에 원하지 않는 DNA가 증폭될 수 있다. PCR의 세 번째 단계는 신장(Elongation)단계이다. 이 단계에서 열에 강한 DNA 중합 효소가 주형 DNA에서 새로운 DNA를 만들게 된다. PCR은 DNA, RNA 그리고 단백질 수준의 PCR로 나뉠 수 있다. 보통 유전자를 얻는 실험을 할 경우, 그 유전자의 전체를 보려는 것이 아닌 유전자 안에서의 특정 유전자를 관찰하는 것이 목적이다. 하지만 DNA를 바로 PCR하게 되면 특정 유전자를 얻기 힘들고 진핵 생물의 경우, 비발현부위가 같이 나오는 등 여러 가지 문제점이 있다. 그것을 해결하기 위해 특정 유전자에 시발체를 붙인 다음, PCR을 DNA수준이 아닌 RNA나 단백질 수준에서 하는 역전사-PCR(RT(Reverse Transcriptase)-PCR)이 있다.

이와 같은 PCR 기술에서는 PCR 공정 단계별 정확한 온도 구배를 형성하고, 이를 유지하는 것이 중요하다. 이를 위하여, 대한민국 등록특허 10-0790004호는 항온금속블록을 이용한 PCR 장치 및 그 방법을 개시한다. 상기 종래 기술은 DNA합성에 필요한 온도로 미리 가열되어 항온을 유지하는 금속블록과 온도를 하강시키고 상승시키는 냉각용 금속블록 및 가열용 금속블록 사이를 PCR 튜브를 포함한 회전 PCR 칩이 회전하면서 DNA합성에 필요한 온도에 필요시간 동안 머물러 DNA합성을 하고, 온도 상승 및 하강이 필요할 때 가열용 금속블록과 냉각용 금속블록을 통과하면서 온도변화시간을 단축시킴으로써, DNA 합성에 소요되는 전체 시간을 줄일 수 있는 효과가 있는 PCR 장치 및 방법을 제공한다. 하지만, 상기 기술은 회전 블록 자체가 회전하는 방식으로 PCR 공정 단계별의 온도 조건을 제어하는데, 실제 PCR 기술에서 필요한 시료 전처리 등은 별도의 실험 장치에서 구현하여야 한다.

따라서, 본 발명이 해결하고자 하는 과제는 칩 자체의 회전에 따라 PCR 공정을 효과적으로 수행할 수 있는 새로운 개념의 회전 PCR 장치 및 방법을 제공하는 것이다.

본 발명이 해결하고자 하는 또 다른 과제는 칩 자체의 회전에 따라, 시료의 전처리와 PCR 공정을 선택적이고, 연속적으로 수행할 수 있는 새로운 개념의 회전 RT-PCR 장치 및 방법을 제공하는 것이다.

상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 PCR 공정이 진행되는 PCR 칩; 상기 PCR 칩과 연결되어 상기 PCR 칩을 회전시키기 위한 회전수단; 상기 PCR 칩으로부터 이격되어, 상기 PCR 칩에 열 에너지를 인가할 수 있으며, 상기 회전하는 PCR 칩이 상이한 온도 영역을 지나가도록 구성된 온도영역 형성수단을 포함하는 것을 특징으로 하는 PCR 장치를 제공한다.

본 발명의 일 실시예에서, 상기 온도영역 형성수단은 복수 개의 히팅블록을 포함하는 디스크 형태인 것을 특징으로 하는 PCR 장치.

본 발명의 일 실시예에서, 상기 히팅블록은 전기적 에너지에 의하여 가열되며, 상기 복수 개의 히팅블록은 독립적으로 제어될 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서, 상기 히팅블록은 광 에너지를 발생시키는 광원을 포함한다.

본 발명의 일 실시예에서, 상기 히팅블록은 3개의 단위 히팅블록으로 이루어진 히팅블록군을 적어도 하나 이상 구비한다.

본 발명의 일 실시예에서, 상기 히팅블록군은 2개 이상이다.

본 발명은 상기 또 다른 과제를 해결하기 위하여, 시료 용액을 저장하는 시료 챔버, 세척 버퍼액을 저장하는 세척 버퍼액 챔버, 용리액을 저장하는 용리액 챔버를 포함하며, 상기 시료 용액, 세척 버퍼액, 용리액을 실리카 비드로 순차적으로 흘림으로써 RNA을 분리하는 RNA 전처리 칩, 상기 분리된 RNA를 이용하여 RT-PCR을 수행하는 RT-PCR 칩 및 상기 전처리 칩 후단에 연결된 온도 반응성 밸브를 이용한 회전 RT-PCR 방법에 있어서, 상기 칩 온도를 소정 온도 이상으로 유지하여 상기 온도 반응성 밸브를 폐쇄하는 단계; 소정 온도 이상에서 상기 RNA 전처리 칩을 제 1 속도 이상으로 제 1 회전시키는 단계; 제 1 속도 이상의 제 1 회전에 따라 상기 RNA 전처리 칩의 시료 챔버로부터 시료 용액을 상기 실리카 비드로 흘리는 단계; 상기 칩을 제 2 속도 이상으로 제 2 회전시키는 단계; 제 2 속도 이상의 제 2 회전에 따라 세척 버퍼액을 상기 실리카 비드로 흘리는 단계; 및 상기 칩을 제 3 속도 이상으로 제 3 회전시키는 단계; 제 3 속도 이상의 제 3 회전에 따라 용리액을 상기 실리카 비드로 흘려 상기 실리카 비드로부터 RNA를 분리하는 단계; 및 상기 칩 온도를 소정 온도 미만으로 하강시켜, 상기 온도 반응성 밸브를 개방하여, 상기 분리된 RNA를 PCR 칩으로 유입시키는 단계; 및 상기 분리된 RNA가 유입된 PCR 칩을 복수 개로 구분된 온도 구배 영역을 지나도록 제 4 회전시키는 방법을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 회전 RT-PCR 방법을 제공한다.

본 발명의 일 실시예에서, 상기 RT-PCR 칩과 전처리 칩은 동일 RT-PCT 단위 칩에 구비되며, 상기 RT-PCR 단위 칩은 복수 개이다.

본 발명의 일 실시예에서, 상기 복수 개의 RT-PCR 단위 칩은 상기 제 4 회전에 따라 동시에 회전하며, 상기 온도 구배 영역은 상기 PCR 단위 칩의 상부, 하부방향으로 소정 거리만큼 이격된 히팅 블록에 의하여 형성된다.

본 발명의 일 실시예에서, 상기 온도 구배 영역은 상기 PCR 단위 칩의 상부, 하부방향으로 소정 거리만큼 이격된 광원에 의하여 형성된다.

본 발명의 일 실시예에서, 상기 PCR 단위 칩은 상기 온도 구배 영역의 수와 동일한 수를 갖는다.

본 발명에 따른 회전 PCR 장치 및 방법은 표적 물질을 포함하는 칩 자체의 회전에 의하여 원하는 온도조건 및 싸이클 수로 PCR 공정을 진행할 수 있다. 따라서 경제적인 방식으로 고수율 PCR 공정의 구현이 가능하며, 회전하는 플랫폼에 의하여 발생하는 회전력에 의하여 표적 물질을 효과적으로 분리 정제할 수 있으므로, 별도의 외부 장치에서 분리정제를 진행하는 종래 기술에 비하여 경제적이라는 장점이 있다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 온도영역 형성수단(100)에 대한 정면도이다.
도 2a 내지 2c는 도 1의 상기 온도영역 형성수단(100) 및 PCR 칩(220)을 포함하는 PCR 장치의 사시도이다.
도 3은 본 발명의 또 다른 일 실시예에 따른 PCR 장치의 정면도이다.
도 4는 본 발명에 일 실시예에 따른 PCR 칩의 전처리부에 대한 부분 모식도이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 용액 챔버 및 소수성 통로의 구성도이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 통합 PCR 칩의 사시도이다.
도 7a 및 7b는 본 발명의 일 실시예에 따른 PCR 칩의 전처리부의 단면도이다.
도 8은 본 발명의 또 다른 일 실시예에 따라 상기 칩을 이용한 PCR 방법의 단계도이다.

이하, 본 발명의 도면을 참조하여 상세하게 설명하고자 한다. 다음에 소개되는 실시예들은 당업자에게 본 발명의 사상이 충분히 전달될 수 있도록 하기 위해 예로서 제공되는 것이다. 따라서 본 발명은 이하 설명된 실시예들에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화될 수도 있다. 그리고 도면들에 있어서, 구성요소의 폭, 길이, 두께 등은 편의를 위하여 과장되어 표현될 수도 있다. 명세서 전체에 걸쳐서 동일한 참조번호들은 동일한 구성요소들을 나타낸다.

본 발명은 PCR 공정의 대상 물질, 즉 표적 물질(DNA, RNA)을 포함하는 칩(이하 PCR 칩)을 복수 개의 상이한 온도영역을 지나도록 하는 방식의 PCR 장치 및 방법을 제공한다. 상기 PCR 장치 및 방법은 이를 위하여 원형의 온도영역을 PCR 칩이 회전하며 지나는 회전 방식을 이용한다.

본 명세서에서 사용되는 “온도구배영역” 또는 “온도영역”은 소정 수준의 온도가 형성되어, 유지될 수 있는 공간상의 영역을 의미하는 것으로, 본 발명의 일 실시예에서 상기 온도영역은 PCR 칩의 상부 및/또는 하부로 소정 거리만큼 이격되어, 상기 PCR 칩에 일정한 열 에너지를 가해줄 수 있는 가열금속블록을 온도영역형성수단으로 사용하였다. 하지만, 본 발명의 또 다른 일 실시예에서 상기 온도영역의 형성수단으로 적외선 등의 광에너지를 발생시킬 수 있는 광원을 이용하였으나, 본 발명은 상기 예들에 의하여 제한되지 않으며, 회전하는 PCR 칩에 일정한 수준의 열 에너지를 가할 수 있는 임의의 모든 수단이 상기 온도영역 형성 수단으로 사용될 수 있으며, 이는 모두 본 발명의 범위에 속한다.

이하 도면을 이용하여 본 발명의 일 실시예에 따른 PCR 장치를 보다 상세히 설명한다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 온도영역 형성수단(100)에 대한 정면도이고, 도 2a는 도 1의 상기 온도영역 형성수단(100) 및 PCR 칩(220)을 포함하는 PCR 장치의 사시도, 도 2b는 3개의 PCR 칩이 연결된 칩 모듈, 도 2c는 회전수단에 결합된 PCR 칩 모듈의 사시도이다.

도 1을 참조하면, 본 실시예에 따른 PCR 장치의 온도영역 형성수단은 독립적으로 온도가 제어, 조절되는 복수 개의 가열금속블록(이하 히팅 블록)을 포함하는 휠 또는 디스크 형상이며, 상기 히팅블록(100a, 100b, 100c) 사이에는 상기 히팅블록간 의 열 전도를 막기 위한 절연체(100d) 및/또는 냉각블록이 구비될 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서 상기 히팅블록의 열 인가 방식은 저항 도선을 이용한 전기 히터 방식 등이 있으나, 본 발명의 범위는 이에 제한되지 않는다.

상술한 온도영역 형성수단(100)은 복수 개의 독립적인 가열 수단(즉, 히팅블록)을 포함하며, 상기 히팅블록의 온도 조건을 달리함으로써 상기 히팅블록으로부터 소정 거리만큼 이격되어 회전하는 PCR 칩의 가열 온도를 달리한다.

도 2a 및 2c를 참조하면, 본 발명에 따른 PCR 장치는 도 2b의 PCR 칩을 회전시키기 위한 회전수단을 포함하는데, 본 발명의 일 실시예에서 상기 장치는 모터(미도시)와 상기 모터와 연결되어 회전하는 샤프트(도 2c의 230)를 상기 회전수단으로 포함한다.

본 발명의 일 실시예에서 상기 샤프트(230)에는 상기 샤프트 회전에 대응하여 회전하는 PCR 칩(220)이 하나 이상 결합될 수 있다. 도 2b에서는 3개의 PCR 칩(220a, 220b, 220c)이 연결된 칩 모듈이 도시된다.

상기 PCR 칩(220)에는 증폭하고자 하는 표적 시료(예를 들면, DNA, RNA) 및 프라이머 등을 포함하는 PCR 칵테일 용액이 유동하게 되며, 이를 위하여 상기 PCR 칩(220)에는 시료 용액이 유입되고, 배출되는 입구 및 출구를 구비하며, 상기 입구, 출구 사이에서 PCR이 진행되는 챔버부가 구비될 수 있다.

상기 PCR 칩(220)으로부터 소정 거리만큼 이격된 위치에 도 1의 온도영역형성 수단인 디스크 형상의 히팅블록(210)이 구비된다. 상기 온도영역형성수단(210)은 하나의 PCR 장치에서 하나 이상으로 구비될 수 있으며, 본 발명에서는 상기 칩을 중심으로 상기 온도영역형성수단(210)이 서로 대향하는 형태이나, 본 발명의 범위는 이에 제한되지 않는다.

또한, 본 발명의 일 실시예에서 상기 히팅블록은 적어도 세 개의 온도영역을 형성시킬 수 있도록 3개의 단위 히팅블록을 갖는 히팅블록군을 적어도 하나 이상 갖는 것이 바람직하다. 그 이유는 PCR 공정의 1 싸이클이 일반적으로는 세 개의 온도 단계를 거치기 때문이다. 즉, 본 발명의 일 실시예에서 상기 복수 개의 히팅 블록(도 1 참조)에 의하여 형성되는 온도영역은 3개이며, 각각 95°C, 72°C, 55°C의 온도 영역이다. 상기 온도영역을 지나, 회전하는 PCR 칩은 지나는 영역의 온도 조건에 따라 PCR 공정이 진행된다. 도 2의 실시예에서는 히팅 블록에 의하여 형성되는 온도구배영역이 세 개이지만, 이 수는 확장가능하며, 이 경우 PCR 칩의 360도 회전에 의하여 복수 싸이클의 PCR 공정이 진행될 수 있다. 따라서 다수의 PCR 칩을 간단히 1회 회전시킴으로써 복수 개의 PCR 공정 싸이클을 동시에 진행할 수 있다.

도 3은 본 발명의 또 다른 일 실시예에 따른 PCR 장치의 정면도이다.

도 3을 참조하면, 본 발명에 따른 PCR 장치의 온도영역형성수단(310)은 3개의 단위 히팅블록으로 이루어진 히팅블록군이 복수 개 구비된다. 즉, 제 1 히팅블록군(310a, 310b, 310c)은 하나의 PCR 공정 싸이클에 대응하는 온도 조건으로 제어되며, 제 2 히팅블록군(310d, 310e, 310f) 또한 PCR 공정 싸이클에 대응하는 동일 온도 조건으로 제어되며, 이는 310g 내지 310l의 히팅블록군 또한 동일하다.

도 3의 PCR 장치에서 PCR 칩이 각각 310a에서 출발하여 310l까지 도달하는 동안 상기 PCR 칩 내의 시료는 4개의 PCR 싸이클을 거치게 된다. 또한 상기 PCR 칩을 복수 개로 구성하여, 각각 310a, 310d, 310g, 310j(이것은 PCR 공정의 최초 단계에 해당하는 온도영역임)에서 출발시켜, 회전하는 경우, 4개의 시료가 한 번의 회전으로 4번의 PCR 싸이클을 거치게 된다. 본 발명은 이와 같은 구성으로, 고수율의 칩 단위 PCR 장치를 구현한다.

본 발명에 따른 PCR 장치는 PCR 단위 칩이 회전할 때 발생하는 회전력을 이용하여, PCR 분석에 필요한 시료의 분리정제(시료 전처리)를 동일 플랫폼에서 수행할 수 있는 새로운 개념을 제공한다.

일반적으로 PCR 공정에서는 대상 물질, 예를 들면 DNA, RNA을 분리, 정제하는 전처리 공정이 요구되며, 일반적인 전처리 방식은 대상 시료만을 선택적으로 포획할 수 있는 포획 수단, 예를 들면 실리카 비드를 이용하는 고상 포획(solid phase capture)방식이다. 상기 방식은 먼저 포획하고자 하는 대상물질(표적물질)을 포함하는 시료를 상기 실리카 비드에 흘림으로써 대상물질을 포획 수단(예를 들면 실리카 비드)에 흡착시키는 제 1 단계, 증폭시키고자 하는 표적물질을 제외한 나머지 성분 등을 상기 포획수단으로부터 제거, 세척하는 제 2 단계 및 상기 포획수단에 포획된 표적물질을 분리하는 제 3 단계로 이루어진다. 일반적으로 제 2 단계는 세척 버퍼 용액을 실리카 비드에 흘리는 방식으로 수행되며, 제 3 단계는 용리액(elution buffer)을 실리카 비드에 흘리는 방식으로 수행된다.

본 발명에 따른 PCR 공정에서 RNA, DNA와 같은 표적 물질을 분리하기 위한 전처리는 표적물질을 포함하는 혼합액(시료용액)을 실리카 비드와 같은 포획수단으로 흘리는 방식으로 진행된다. 본 발명은 특히 혼합액을 흘리는 단계와 세척액을 흘리는 단계, 그리고 용리액을 흘리는 단계는 모두 하나의 포획 수단(실리카 비드) 방향으로 진행되는 점에 주목하여, 상기 용액들을 각기 함유, 저장하는 용액 챔버로부터의 용액이동 통로의 단면적을 각기 달리함으로써, 회전 속도에 따라 원하는 종류의 용액만을 상기 포획수단으로 유동, 흐르게 하는 기술구성을 제공한다. 이를 위하여 본 발명의 일 실시예는 상기 액체 이동 통로를 소수성 처리함으로써 소정 이상의 힘이 인가되는 경우에만 수용성 용액이 상기 소수성 통로로 흐르는 기술 구성을 제공한다. 하지만, 본 발명의 범위는 이에 제한되지 않으며, 회전력의 차이에 따라 액체 유동을 선택적으로 제어할 수 있는 임의의 모든 수단이 본 발명의 범위에 속한다.

본 발명에 따른 PCR 칩은 PCR 공정이 진행되는 PCR부 이외에 상기 PCR부의 전단에 연결되어, 시료 용액으로부터 표적 물질을 분리하는 전처리부를 더 포함하는데, 도 4는 본 발명에 일 실시예에 따른 PCR 칩의 전처리부에 대한 부분 모식도이다.

도 4를 참조하면, 본 발명에 따른 PCR 칩의 전처리부는 각각 세 종류의 용액을 저장하고 있는 용액 챔버(410a, 410b, 410c)가 있으며, 상기 챔버와 연결된 유체 이동 통로(420a, 420b, 420c)는 소수성 처리가 되어있다. 이로써, 수용액 상태의 세 종류 용액(시료 용액, 세척 버퍼액, 용리액)은 소수성 처리가 된 상기 통로를 통상적으로 이동하기 어렵고, 외부로부터의 소정 이상의 힘이 인가되어야만 흐를 수 있다. 도 4의 상기 소수성 통로(420a, 420b, 420c)의 확대도는 실록산계 화합물로 상기 용액 챔버로부터의 통로를 소수성 처리한 예를 나타낸다. 하지만, 본 발명의 범위는 이에 제한되지 않는다.

본 발명은 특히 액체 이동에 필요한 힘이 소수성 처리된 유체 통로의 크기(단면적)에 따라 달라지는 점에 주목하였고, 이러한 액체 이동에 필요한 힘을 상기 전처리 부를 포함하는 PCR 칩의 회전력으로부터 얻는데, 이는 이하 보다 상세히 설명한다.

상기 소수성 통로(420a, 420b, 420c)들은 표적물질이 선택적으로 결합되는 실리카 비드(430)에 함께 연결되며, 상기 소수성 통로(420a, 420b, 420c)를 거치면서 흘러 나오는 용액들은 상기 실리카 비드(430)로 유입된다. 이후, 상기 실리카 비드(430)에 포획된 표적물질은, 열에 의하여 선택적으로 개방/폐쇄될 수 있는 밸브(440)의 개방에 따라, 회전하는 PCR 칩의 회전력에 의하여 출구(450)를 통하여 후단의 PCR부로 이동하고, 이후 도 1 내지 3에서 설명한 PCR 공정이 진행된다.

본 발명은 또한 상기 실리카 비드에서 세척되는 용액을 외부로 배출하기 위한 용액 배출부(460)를 더 포함한다. 즉, 밸브(440)가 폐쇄된 상태에서 실리카 비드(430)로부터 배출되는 용액(예를 들면 세척액 등)은 상기 배출부(460)를 통하여 외부로 나가게 된다.

도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 용액 챔버 및 소수성 통로의 구성도이다.

도 5를 참조하면, 소수성 통로(420)의 단면적이 클수록 상대적으로 적은 힘(1.5kPa)으로도 용액 챔버 내 유체가 흐르게 되지만(도 5의 상부 챔버 참조), 단면적이 좁아지면, 유체 유동을 위하여 상대적으로 강한 힘이 요구된다. 본 발명은 용액 이동에 필요한 힘을 상기 전처리 부분을 포함하는 PCR 칩의 회전력에 의해서 얻는데, 이를 보다 상세히 설명하면 다음과 같다.

먼저 상기 전처리 부를 포함하는 PCR 칩의 회전 속도가 느리면, 상대적으로 적은 힘이 용액 챔버(410)에 인가되며, 그 결과 큰 단면적의 소수성 통로와 연결된 용액 챔버(도 5의 상부 챔버)로부터 용액이 먼저 흐르게 된다. 예를 들면, 도 4의 상부 용액 챔버(410a)는 2690rpm으로도 용액이 소수성 통로를 흐를 수 있지만, 중간 용액 챔버(410b)는 4100rpm, 하부 용액 챔버(410c)는 5800rpm이 요구된다.

따라서, 본 발명의 일 실시예에서는, 실리카 비드로 제일 먼저 흘러야 하는 시료 용액의 소수성 통로 단면적을 가장 크게 구성한다. 이로써, 전처리 칩의 회전 속도가 제 1 속도 이상에 도달하면 시료용액 챔버로부터 시료용액이 흘러, 실리카 비드에 시료용액이 들어가게 된다. 그 다음으로 흘러야 하는 세척 버퍼액에 연결된 소수성 통로는 두 번째로 크며, 이로써 상기 전처리 칩의 회전속도가 제 1 속도를 초과한 소정의 제 2 속도 이상에 이르면, 상기 세척 버퍼액이 소수성 통로를 지나 실리카 비드로 흐르게 되며, 이로써 실리카 비드에 흡착된 표적물질을 제외한 나머지 성분들은 모두 제거되어, 도 4의 배출부(460)를 통하여 외부로 배출된다. 그 다음으로 실리카 비드에 흡착된 표적물질을 분리하기 위한 용리액이 상기 실리카 비드로 흐르게 되는데, 상기 용리액의 소수성 통로 크기는 시료 용액, 세척 버퍼액의 통로보다 더 작다. 따라서, 제 2 속도를 초과하여 제 3 속도 이상으로 상기 전처리 칩이 회전함에 따라 용리액이 해당 챔버와 연결된 소수성 통로를 지나 실리카 비드로 흐르게 되며, 그 결과 실리카 비드에 흡착된 DNA, RNA등의 표적 물질은 실리카 비드로부터 제거된다.

본 발명은 상술한 PCR 부과 전처리 부는 모두 칩의 회전에 따라 공정이 진행된다는 점에 착안하여, 상기 PCR 부와 전처리부가 하나의 칩 형태로 결합된, 새로운 개념의 통합 PCR 칩을 제공한다.

도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 통합 PCR 칩의 사시도이다.

도 6을 참조하면, 도 4에서 설명한 전처리부(610)와 도 2a의 PCR칩(220)에 대응하는 PCR부(620)는 서로 연결되며, 상기 전처리부(610)와 PCR부(620) 사이에는 하기 설명되는 열반응성 고분자 밸브(630)가 구비된다. 열반응성 고분자 밸브(630)의 개방에 따라 분리, 정제된 표적물질은 전처리부(610) 출구로부터 PCR부(620)로 유입되며, 이후 PCR 챔버(640)에서 PCR 공정이 진행된다. 상기 PCR 공정은 PCR 칩의 회전에 따라 복수 싸이클로 진행되며, 이는 상술한 바와 같다.

본 발명에 따른 PCR 칩은 상술한 바와 같이 DNA, RNA를 분리, 정제하는 전처리부와 PCR 공정이 진행하는 PCR부로 구분될 수 있으며, 상기 전처리부에 의하여 분리된 표적 물질은 다시 온도 하강에 따라 개방되는 온도반응성 밸브(도 6의 630 참조)를 통하여 PCR부로 유입된다. 이후, 상기 PCR부로 유입된 표적 물질은 히팅 블록에 의하여 단계별로 가열되어, 상기 표적 물질에 대한 PCR 공정이 진행된다. 본 발명의 일 실시예에 따른 PCR 장치에서 PCR 칩에서 전처리부와 PCR부를 연결하는 밸브(630)는 온도상승에 의하여 폐쇄되며, 이로써 고온에서 진행되는 PCR 공정 중 회전에 의하여 표적 물질 등이 전처리부로 역유입되는 문제를 방지할 수 있음은 상술한 바와 같다.

본 발명의 PCR 칩에 사용되는 온도반응성 밸브 및 전처리부를 이하 보다 상세히 설명한다.

본 발명의 일 실시예에서 상기 온도반응성 밸브는 열 반응성 고분자를 포함하며, 보다 구체적으로는 3M 사의 Fluorinert FC40 이라는 물질을 사용하였다. 상기 열 반응성 고분자는 소정 온도, 즉, 약 40도 이상에서 팽창하며, 상기 팽창력에 의하여 열반응성 고분자와 접촉하는 가요성 멤브레인을 유체 채널 방향으로 밀어내고, 그 결과 유체 채널은 막히게 된다. 반대로 소정 온도 미만, 즉, 약 40도 미만에서는 팽창되었던 부피가 다시 줄어들게 되며, 그 결과 전처리부와 PCR부는 서로 유체 연통하게 된다.

도 7a 및 7b는 본 발명의 일 실시예에 따른 PCR 칩의 전처리부의 단면도이다.

도 7a를 참조하면, 본 발명에 따른 PCR 칩은 세 개의 레이어가 적층된 형태로서, 상기 PCR 칩은 표적 물질이 흐를 수 있는 채널이 형성된 시료층(710), 상기 온도 조건에 따라 팽창/수축하는 온도반응성 고분자를 포함하는 고분자층(730) 및 상기 시료층(710)과 상기 고분자 층(730) 사이에 구비되어, 상기 고분자층의 팽창/수축에 따라 탄력적으로 움직일 수 있는 가요성(flexibility)을 갖는, PDMS와 같은 물질로 이루어진 가요성 멤브레인(720)으로 이루어진다. 도 7a에서는 상온 조건에서 열반응성 고분자층(730)은 팽창하지 않으며, 이에 따라 하부의 시료층(710)의 채널을 통하여 시료용액은 흐를 수 있다.

하지만, 도 7b를 참조하면, 온도가 상승함에 따라 상기 열반응성 고분자층(730)은 팽창하며, 상기 고분자층(730)의 팽창력에 의하여 하부의 가요성 멤브레인(720) 또한 아래로 팽창한다. 그 결과, 시료층(710)의 유체 채널은 아래로 팽창된 가요성 멤브레인(720)에 의하여 블록되며, 시료층(710)의 유체 채널은 폐쇄된다. PCR이 진행되는 온도는 40도 이상이기 때문에 상기 온도반응성 밸브는 PCR 공정 중 폐쇄 상태를 그래도 유지하게 되며, 그 결과 전처리부로의 유체 유입 없이 안정된 PCR 공정이 PCR부에서만 진행될 수 있다.

본 발명에 따른 PCR 방법은 PCR 칩을 이용하는 방식으로, 표적 물질을 포함하는 PCR 칩을 상이한 온도가 형성된 복수 개의 온도영역을 지나도록 회전시키는 방식으로 PCR 공정이 진행된다. 이를 위하여, 본 발명의 일 실시예에서 상기 복수 개의 온도 영역은 PCR 공정의 단계별 온도가 반복하는 방식으로 배열되며, 이러한 온도 영역은 상기 PCR 칩으로부터 이격된 가열수단(예를 들면 히팅 블록)에 의하여 형성, 유지될 수 있으며, 이는 상술한 바와 같으니 이하 생략한다.

도 8은 본 발명의 또 다른 일 실시예에 따라 상기 칩을 이용한 PCR 방법의 단계도이다.

도 8을 참조하면, 먼저 표적 물질의 분리가 진행되는 전처리부와 분리된 표적 물질에 대한 PCR 공정이 진행되는 PCR부를 포함하는 PCR칩의 칩 온도를 소정 수준 이상으로 유지한 채, 제 1 속도 이상으로 제 1 회전시킨다. 상기 온도 조건에 따라 전처리부와 PCR부를 연결하는 온도반응성 밸브는 폐쇄상태를 유지하며, 전처리부의 용액은 PCR부로 흐르지 않는다.

이때 칩의 제 1 속도 이상인 제 1 회전에 의하여 가장 큰 단면적의 소수성 통로를 갖는 상기 시료용액 챔버로부터 시료용액(표적물질을 포함하는 수용성 혼합액)만이 포획수단인 실리카 비드로 흐르게 된다. 이후 상기 칩을 제 2 속도 이상으로 제 2 회전시키게 되는데, 칩의 제 2 속도 이상인 제 2 회전에 의하여 세척 버퍼액(표적물질을 제외한 나머지 물질을 실리카 비드로부터 제거하기 위한 용액)이 상기 실리카 비드로 흐르게 되는데, 상기 세척 버퍼액에 의하여 표적물질을 제외한 나머지 성분은 실리카 비드로부터 제거된다. 다시, 상기 칩을 제 3 속도 이상으로 제 3 회전시키는 데, 상기 제 3 속도 이상의 제 3 칩 회전의 회전력에 의하여 가장 적은 단면적의 소수성 통로를 갖는 용리액이 상기 실리카 비드로 흐르게 되어, 상기 실리카 비드로부터 표적물질이 분리된다. 상기 분리된 표적물질은 PCR부로 유입되는데, PCR부에 표적물질을 유입시키기 위하여, PCR 칩의 온도를 소정 온도 미만으로 하강시켜, PCR부와 전처리부 사이의 온도반응성 밸브를 개방시키는 단계가 필요하다. 상기 밸브 개방 단계는 용리액을 흘리기 이전이나, 이후, 또는 도중이어도 모두 무방하며, 적어도 용리액에 의하여 실리카 비드로부터 분리된 표적 물질이 PCR부로 유입될 수 있는 한, 이는 모두 본 발명의 범위에 속한다.

이후, 제 4 회전과 함께 PCR 공정이 진행된다. 상기 PCR 공정은 도 1 내지 3에서 설명한 바와 같이, 복수 개의 온도구배영역을 상기 PCR 칩이 지나면서 진행된다. 이때 전처리부로 용액이 역유입되는 문제를 방지하기 위하여, 상기 온도반응성 밸브는 소정 수준 이상의 PCR 칩 온도에 의하여 폐쇄된다.

본 발명은 상기 또 다른 과제를 해결하기 위하여, 상기 설명한 통합 PCR 칩과 복수의 온도영역이 형성된 회전 플랫폼(PCR 장치)을 포함하는 PCR 시스템을 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 RT-PCR 칩과 전처리 칩은 동일 RT-PCT 단위 칩에 구비되며, 상기 RT-PCR 단위 칩은 복수 개이며, 이는 상술한 바와 같다. 특히 RT-PCR 칩과 전처리 칩은 온도에 의하여 개방-폐쇄가 결정되는 온도의존성 밸브가 사용될 수 있다. 또한, 상기 복수 개의 RT-PCR 단위 칩은 상기 제 4 회전에 따라 동시에 회전하며, 복수 개의 시료에 대한 동시 PCR 처리가 가능하다.

본 발명에 따른 상기 온도 구배 영역은 상기 PCR 단위 칩의 상부, 하부방향으로 소정 거리만큼 이격된 히팅 블록이나, 상부, 하부방향으로 소정 거리만큼 이격된 광원에 의하여 형성될 수 있으며, 상기 제 4 회전에 의하여 회전하는 PCR 단위 칩은 상기 온도 구배 영역의 수와 동일한 수를 갖는다.

이상 본 발명의 바람직한 실시예를 참조하여 설명하였지만 해당 기술 분야의 숙련된 당업자라면 하기의 특허청구범위에 기재된 본 발명의 사상 및 영역으로부터 벗어나지 않는 범위 내에서 본 발명을 다양하게 수정 및 변경시킬 수 있음을 이해할 수 있을 것이다.

Claims

PCR 공정이 진행되는 PCR 칩;
상기 PCR 칩과 연결되어 상기 PCR 칩을 회전시키기 위한 회전수단;
상기 PCR 칩으로부터 이격되어, 상기 PCR 칩에 열 에너지를 인가할 수 있으며, 상기 회전하는 PCR 칩이 상이한 온도 영역을 지나가도록 구성된 온도영역 형성수단을 포함하는 것을 특징으로 하는 회전 PCR 장치.
제 1항에 있어서,
상기 온도영역 형성수단은 복수 개의 히팅블록을 포함하는 디스크 형태인 것을 특징으로 하는 회전 PCR 장치.
제 1항에 있어서,
상기 히팅블록은 전기적 에너지에 의하여 가열되며, 상기 복수 개의 히팅블록은 독립적으로 제어될 수 있는 것을 특징으로 하는 회전 PCR 장치.
제 1항에 있어서,
상기 히팅블록은 광 에너지를 발생시키는 광원을 포함하는 것을 특징으로 하는 회전 PCR 장치.
제 2항에 있어서,
상기 히팅블록은 3개의 단위 히팅블록으로 이루어진 히팅블록군을 적어도 하나 이상 구비하는 것을 특징으로 하는 회전 PCR 장치.
제 5항에 있어서,
상기 히팅블록군은 2개 이상인 것을 특징으로 하는 회전 PCR 장치.
시료 용액을 저장하는 시료 챔버, 세척 버퍼액을 저장하는 세척 버퍼액 챔버, 용리액을 저장하는 용리액 챔버를 포함하며, 상기 시료 용액, 세척 버퍼액, 용리액을 실리카 비드로 순차적으로 흘림으로써 RNA을 분리하는 RNA 전처리 칩, 상기 분리된 RNA를 이용하여 RT-PCR을 수행하는 RT-PCR 칩 및 상기 전처리 칩 후단에 연결된 온도 반응성 밸브를 이용한 회전 RT-PCR 방법에 있어서,
상기 칩 온도를 소정 온도 이상으로 유지하여 상기 온도 반응성 밸브를 폐쇄하는 단계;
소정 온도 이상에서 상기 RNA 전처리 칩을 제 1 속도 이상으로 제 1 회전시키는 단계;
제 1 속도 이상의 제 1 회전에 따라 상기 RNA 전처리 칩의 시료 챔버로부터 시료 용액을 상기 실리카 비드로 흘리는 단계;
상기 칩을 제 2 속도 이상으로 제 2 회전시키는 단계;
제 2 속도 이상의 제 2 회전에 따라 세척 버퍼액을 상기 실리카 비드로 흘리는 단계; 및
상기 칩을 제 3 속도 이상으로 제 3 회전시키는 단계;
제 3 속도 이상의 제 3 회전에 따라 용리액을 상기 실리카 비드로 흘려 상기 실리카 비드로부터 RNA를 분리하는 단계; 및
상기 칩 온도를 소정 온도 미만으로 하강시켜, 상기 온도 반응성 밸브를 개방하여, 상기 분리된 RNA를 PCR 칩으로 유입시키는 단계; 및
상기 분리된 RNA가 유입된 PCR 칩을 복수 개로 구분된 온도 구배 영역을 지나도록 제 4 회전시키는 방법을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 회전 RT-PCR 방법.
제 7항에 있어서,
상기 RT-PCR 칩과 전처리 칩은 동일 RT-PCT 단위 칩에 구비된 것을 특징으로 하는 회전 RT-PCR 방법.
제 8항에 있어서,
상기 RT-PCR 단위 칩은 복수 개인 것을 특징으로 하는 회전 RT-PCR 방법.
제 9항에 있어서,
상기 복수 개의 RT-PCR 단위 칩은 상기 제 4 회전에 따라 동시에 회전하는 것을 특징으로 하는 회전 RT-PCR 방법.
제 10항에 있어서,
상기 온도 구배 영역은 상기 PCR 단위 칩의 상부, 하부방향으로 소정 거리만큼 이격된 히팅 블록에 의하여 형성된 것을 특징으로 하는 회전 RT-PCR 방법.
제 11항에 있어서,
상기 온도 구배 영역은 상기 PCR 단위 칩의 상부, 하부방향으로 소정 거리만큼 이격된 광원에 의하여 형성된 것을 특징으로 하는 회전 RT-PCR 방법.
제 12항에 있어서,
상기 PCR 단위 칩은 상기 온도 구배 영역의 수와 동일한 수를 갖는 것을 특징으로 하는 회전 RT-PCR 방법.